VALUTAZIONE ANATOMOPATOLOGICA

I campioni prelevati durante gli interventi chirurgici sono stati esaminati tutti dallo stesso patologo dopo fissazione in formalina e dopo colorazione della superficie mesorettale con inchiostro di china. Per preservare l’integrità del mesoretto sono state tagliate delle trance assiali del pezzo che sono state analizzate macroscopicamente. Per l’esame microscopico sono stati preparati dei campioni colorati con ematossilina-eosina. Tutte le aree sospette, come ad esempio zone ulcerate o ispessite della parete rettale, sono state accuratamente esaminate, inclusi i linfonodi presenti nel mesoretto e quelli del mesosigma. Per essere

45 certi di non tralasciare nessuna cellula tumorale durante l’esame, sono stati preparati diversi campioni istologici da ogni trancia e in casi particolarmente complessi è stato effettuato anche un esame immunoistochimico.

In ogni referto il patologo ha descritto i seguenti reperti: - tipo istologico;

- grado istologico: G1 se il tumore è ben differenziato, G2 se moderatamente differenziato e G3 infine se scarsamente differenziato;

- estensione dell'invasione tumorale a livello della parete rettale, nel mesoretto ecc.; - pattern di crescita tumorale: infiltrativa, espansiva;

- invasione vascolare: assente/presente; - invasione perineurale: assente/presente;

- tumor budding (Budding= infiltrazione di cellule e gruppi di cellule che si distaccano da strutture ghiandolari e dissociano lo stroma): assente/presente; - infiltrato linfocitario peritumorale: assente/presente;

- infiltrato linfocitario intratumorale: assente/presente;

- margini di resezione chirurgica prossimale e distale: indenni da infiltrazione neoplastica o meno;

- numero e stato dei linfonodi;

- grado di Quirke, che valuta l’escissione del mesoretto: completa, parzialmente completa, incompleta (Grado 1, 2, 3 di Quirke);

- margine radiale (CRM): è il margine di tessuto sano compreso fra qualsiasi struttura neoplastica presente nel mesoretto ed il margine di resezione mesorettale stesso. Se è inferiore a 1 mm il patologo indica che il CRM è raggiunto;

- TRG (secondo Dworak): TRG0 = assenza di regressione tumorale; TRG1 = massa tumorale con fibrosi inferiore al 25% della massa; TRG2 = fibrosi nel 26-50% della massa residua; TRG3 = fibrosi superiore al 50% della massa residua; TRG4 = regressione completa (assenza di cellule tumorali, solo massa fibrotica); - ypTNM secondo l’American Joint Commettee on Cancer.

46

4.6 ANALISI STATISTICA

Per i calcoli statistici è stato usato il software commerciale Statistical Package for Social Sciences (v. 14.0; SPSS, Chicago, IL).

I pazienti sono stati suddivisi in 5 gruppi secondo il TRG ottenuto dopo la valutazione anatomopatologica. Per ogni gruppo è stato calcolato, prima e dopo la terapia neoadiuvante, il volume massimo del tumore, il volume minimo del tumore, il volume medio e la deviazione standard, il diametro massimo maggiore e minore, il diametro massimo medio e la deviazione standard. Per ogni gruppo è stato calcolato il TVRR e la percentuale di riduzione del diametro massimo. Il coefficiente di correlazione per ranghi di Spearman è stato adoperato per valutare la correlazione lineare tra il TVRR e il TRG e tra la percentuale di riduzione del diametro massimo e il TRG. Un valore di p inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

47

5. RISULTATI

Un downstaging del T, definito come yp T0-T2, è stato ottenuto in 24 pazienti (72,7%), compresi 7 pazienti (21,2%) con risposta completa (TRG4) all’esame istologico, che hanno mostrato un TVRR superiore all’80% misurato tramite volumetria con risonanza magnetica.

In particolare 2 pazienti (6,1%) avevano un TRG 0, 6 pazienti (18,2%) un TRG 1, 6 pazienti (18,2%) un TRG 2, 12 pazienti un TRG 3 (36,4%) e 7 un TRG 4 (21,2%). [Fig.6]

Figura 6: Suddivisione dei pazienti secondo il TRG.

Suddividendo i pazienti in base al TRG ottenuto all’esame istologico, nei pazienti con TRG 0 il volume medio pre-CRT è di 17,9±4 cm3, di 40±28,5 cm3 nei pazienti con TRG1 , di 8,7±6 cm3 _{nei pazienti con TRG 2, di 13,3±13 cm}3 _{nei pazienti con TRG 3 e di 13,1±7} cm3 _{nei pazienti con TRG 4.}

Il volume medio post-CRT è di 14,5±1 cm3 nei pazienti con TRG 0, di 11,2±9,6 cm3 nei pazienti con TRG 1, di 2,6±2,7 cm3 _{nei pazienti con TRG 2, di 3,6±4,7 cm}3 _{nei pazienti} con TRG 3 e di 1,3±1,1 cm3 nei pazienti con TRG 4.

TRG 0 6,1% TRG 1 18,2% TRG 2 18,2% TRG 3 36,4% TRG 4 21,2%

33 PAZIENTI

48 Il TVRR è del 17,5% nei pazienti con TRG 0, del 71,5% nei pazienti con TRG 1, del 65,3% nei pazienti con TRG 2, del 75,4% nei pazienti con TRG 3 e dell’89,2% nei pazienti con TRG 4 [ Tab.6 e Fig.7].

Il volume medio delle lesioni neoplastiche prima della terapia neoadiuvante è di 18,6 cm3 (range 71-1,1 cm3_{) mentre il volume medio dopo la terapia neoadiuvante è di 6,6 cm}3 (range 26,6-0,01 cm3), ridotto del 65% rispetto a quello pre-CRT.

Il TVRR medio è del 63,8% con un TVRR > 60% in 26 pazienti (78,8%), e in 14 su 26 (42.4%) è stato osservato un TVRR > 80%. Il range del TVRR è tra il 4.6% e il 99.3% e nei 7 casi con TRG 4 è del 96%, 94.2%, 93.4%, 92.5%, 88.1%, 80.3% e 80.0%.

E’ stata osservata una correlazione statisticamente significativa tra il TVRR e il TRG (rs = 0.3626, p = 0.0189).

TRG0 TRG1 TRG2 TRG3 TRG4

Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Volume minimo (cm3 ₎ 15,1 13,8 2,7 0,9 1,7 0,4 2,16 0 1,1 0,2 Volume massimo (cm3₎ 20,7 15,2 71 26,6 18 7,1 42,75 16,95 19,3 3,5 Volume medio (cm3₎ 17,9±4 14,5±1 40±28,5 11,2±9,6 8,7±6 2,6±2,7 13,3±13 3,6±4,7 13,1±7 1,3±1,1 TVRR 17,5% 71,5% 65,3% 75,4% 89,2%

49

Figura7: Grafico che rappresenta il volume medio pre-CRT e post-CRT per ogni classe di TRG. Le percentuali sono i diversi TVRR.

Suddividendo i pazienti in base ai criteri RECIST ottenuti misurando il diametro massimo di ciascuna lesione neoplastica sulle immagini RM T2 pesate, otteniamo che nessun paziente ha una progressione di malattia, 11 pazienti (33,3%) hanno una malattia stabile, 19 pazienti (57,6%) hanno una risposta parziale al trattamento e 3 (9,1%) pazienti hanno una risposta completa [Fig.8].

17,5% 71,5% 65,3% 75,4% 89,2% 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 TRG0 TRG1 TRG2 TRG3 TRG4 Volum e (c m 3) TRG Pre-CRT Post-CRT

50

Figura 8: Suddivisione dei pazienti secondo i criteri RECIST. MS= malattia stabile. RP=risposta parziale.RC=risposta completa

Suddividendo i pazienti in base al TRG ottenuto all’esame istologico, nei pazienti con TRG0 il 100% presenta una malattia stabile. Nei pazienti con TRG1 il 50% presenta una malattia stabile e l’altro 50% una risposta parziale. Nei pazienti con TRG2 il 50% presenta una malattia stabile, il 33,3% una risposta parziale e il 16,7% una risposta completa. Nei pazienti con TRG3 il 25% presenta una malattia stabile, il 58,3% una risposta parziale e il 16,7% una risposta completa. Nei pazienti con TRG4 il 100% presenta una risposta parziale [Tab.7].

TRG0 TRG1 TRG2 TRG3 TRG4 No _{di pazienti 2 6 6 12 7} RC 0 0 1(16,7%) 2(16,7%) 0 RP 0 3(50%) 2(33,3%) 7(58,3%) 7(100%) MS 2(100%) 3(50%) 3(50%) 3(25%) 0 PM 0 0 0 0 0

51 Suddividendo i pazienti in base al TRG ottenuto all’esame istologico, nei pazienti con TRG0 il diametro massimo medio pre-CRT è di 57,5±25 mm, di 69,8±29,8 mm nei pazienti con TRG1, di 33,5±11 mm nei pazienti con TRG2, di 40,9±13 mm nei pazienti con TRG3 e di 41,9±13 mm nei pazienti con TRG4. Il diametro massimo medio post- CRT è di 57,5±25 mm nei pazienti con TRG0, di 43,1±25 mm nei pazienti con TRG1, di 18,8±11,6 mm nei pazienti con TRG2, di 21,8±16,6 mm nei pazienti con TRG3 e di 17,6±8 mm nei pazienti con TRG4. La percentuale di riduzione del diametro massimo (Δ DM) è di 0 nei pazienti con TRG0, del 36,1% nei pazienti con TRG1, del 39,8% nei pazienti con TRG2, del 50% nei pazienti con TRG3 e del 56,4% nei pazienti con TRG4 [Tab.8 e Fig.9].

Il diametro massimo medio delle lesioni neoplastiche prima della terapia neoadiuvante è di 48,7mm ( range 120-20mm) mentre il diametro massimo medio dopo la terapia neoadiuvante è di 31,8 mm (range 85-0 mm), ridotto del 34,7% rispetto a quello pre- CRT.

Il Δ DM medio è del 36,5% con un Δ DM > 30% in 22 pazienti (66,6%). Nei 7 casi con TRG4 è del 63%, 50%, 44,44%, 80%, 55%, 40%, 63% rispettivamente.

Non è stata osservata una correlazione statistica significativa tra il Δ DM e il TRG (rs = 0.214, p = 0,1158).

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TRG0 TRG1 TRG2 TRG3 TRG4

Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post Pre Post DM maggiore (mm) 75 75 120 85 50 31 57 50 57 29 DM minore (mm) 40 40 35 15 20 0 23 0 20 10 DM medio (mm) 57,5± 25 57,5±25 69,8±29,8 43,2±25 33,5±11 18,8±11,6 40,9±13 21,8±16,6 41,9±13 17,6±8 Δ DM 0 36,1% 39,8% 50% 56,4%

Tab.8: Diametro Massimo maggiore, minore e medio prima e dopo la terapia neoadiuvante e percentuale

di riduzione del diametro massimo (Δ DM).

Figura 9:Grafico che rappresenta il diametro massimo medio per ogni classe di TRG misurato prima e dopo la terapia neoadiuvante. Sono indicate le percentuali di riduzione del diametro massimo.

53

6. DISCUSSIONE

Il downstaging dopo la terapia neoadiuvante è uno dei più importanti fattori prognostici nel LARC, per questo sono necessari parametri per una valutazione oggettiva e riproducibile della risposta tumorale.

Secondo Atkinson et al. [73] un biomarker è “una caratteristica misurabile oggettivamente e stimata come un indice di un normale processo biologico, o di un processo patologico, o di una risposta a un intervento terapeutico.”. In generale i biomarker possono essere utilizzati per valutare la prognosi e per predire quale sia il trattamento ottimale per il paziente, permettendo così un approccio terapeutico sempre più personalizzato. I biomarker ad oggi disponibili si dividono in due categorie: i campioni biologici prelevati dai fluidi o dai tessuti dal paziente e i biomarker elettrofisiologici o di imaging; in questa seconda categoria non viene prelevato nessun campione, ma vengono rilevati e analizzati biosegnali acustici o elettromagnetici emessi dal paziente. I recenti progressi tecnologici nel campo dell’imaging hanno offerto la possibilità di estrarre dalle immagini informazioni anatomiche, fisiologiche, funzionali, biochimiche e metaboliche, che riflettono la composizione molecolare dei tessuti normali o patologici. Con una calibrazione appropriata, la maggior parte delle tecniche di imaging può fornire informazioni quantitative su specifiche proprietà del tessuto in esame [74]. Nel nostro studio la riduzione del volume tumorale in percentuale (TVRR) è stata indagata quale possibile biomarker di risposta alla terapia neoadiuvante nel tumore del retto localmente avanzato. È dimostrato che il TRG correla significativamente con il controllo locale e sistemico della malattia [75]: questo parametro è interessante, quindi, per una correlazione con il TVRR.

Anche se la misurazione del volume tumorale è operatore-dipendente e richiede tempo, nel nostro studio un TVRR > 75 %, osservato in 17 pazienti, correla in modo significativo con un TRG 3 e 4. Questo significa che esiste una soglia del TVRR che indica una risposta completa (TRG 4) o parziale (TRG 3) alla terapia neoadiuvante, in particolare nei 7 pazienti con pCR (TRG 4), il TVRR era superiore all’ 80%.

54 I nostri risultati sono in accordo con i dati presenti in letteratura: Yeo et al.[76] e Kim et al. [77] hanno dimostrato che il TVRR correla in modo statisticamente significativo con il TRG. Kang et al. [78] e Curvo-Semedo et al.[79] hanno riportato una correlazione significativa tra una pCR e un TVRR superiore all’ 80%.

Anche i nostri risultati riguardanti l’assenza di una correlazione significativa tra il TRG e la percentuale di riduzione del diametro massimo della neoplasia sono in linea con i dati presenti in letteratura. Patel et al.[80] hanno dimostrato l’assenza di correlazione significativa tra criteri RECIST e il TRG. Milou H. Martens et al. [81] in un recente studio hanno condotto una revisione completa della letteratura disponibile sulla misurazione del volume tumorale come stima della risposta alla terapia neoadiuvante nel LARC (14 articoli) e hanno identificato 3 possibili metodi di misura utilizzati nei diversi lavori:

- diametro massimo; - 3 diametri;

- misura di tutto il volume tumorale delineando manualmente i margini della neoplasia in ogni segmento e moltiplicando l’area di ciascun segmento per lo spessore dello strato, includendo gli intervalli tra gli strati (metodo a ROI). Hanno estratto da questi lavori i cut-off ottimali per identificare la risposta completa (ypT0) dei 3 metodi di misura. I cut-off sono stati validati in uno studio di coorte prospettico multicentrico su 146 pazienti e dai risultati è emerso che solo il metodo di misura a ROI dell’intero volume neoplastico è utile per determinare la risposta alla terapia neoadiuvante. Inoltre hanno individuato che il cut-off ottimale del TVRR per individuare la risposta completa è un valore superiore all’80%.

Comunque, anche se esiste una correlazione significativa con il TRG, il TVRR non può essere considerato un parametro soddisfacente per stratificare i pazienti al fine di attuare la wait-and-see-policy [82]. Infatti, anche se consente di distinguere agevolmente i pazienti non-responders dai pazienti con risposta parziale o completa (TVRR superiore al 75%), non è idoneo da solo a distinguere i pazienti con risposta parziale (ypT1-T2) dai pazienti con risposta completa (ypT0). Inoltre il tessuto neoplastico residuo potrebbe non essere presente nella parete rettale, ma nei linfonodi e un’accurata valutazione linfonodale è difficile da fare con le sole tecniche di imaging [83].

55 La strategia di wait-and-see richiede tecniche di restaging molto accurate, motivo per cui sono numerosi gli studi in corso per il miglioramento delle performance della RM nella valutazione della risposta alla terapia. Secondo i risultati del nostro studio il TVRR può essere considerato uno dei biomarker utilizzabili per valutare la risposta alla terapia neoadiuvante, insieme ad altri biomarker che sono attualmente oggetto di ricerca scientifica come il DWI, l’analisi della texture e il Dynamic Contrast Enhancement (DCE); ad esempio, la volumetria calcolata su immagini DW ha dato risultati promettenti nello studio di Lambregts et al. [84]. L’uso combinato di questi biomarker probabilmente permetterà in futuro di migliorare ulteriormente l’accuratezza nella stratificazione dei pazienti così da permettere un approccio terapeutico sempre più personalizzato.

Un aspetto particolare del nostro studio è stato l’utilizzo della risonanza magnetica 3T e delle sequenze CUBE, infatti negli studi sopra citati [76,77,78,79,81] è stata utilizzata una risonanza magnetica da 1,5T e la volumetria è stata ottenuta su sequenze T2 pesate FSE convenzionali.

Studi condotti con la risonanza magnetica 3T hanno riportato eccellenti livelli di accuratezza diagnostica sia durante lo staging, sia nel restaging dopo terapia neoadiuvante, superiori a quelli ottenibili con un magnete da 1,5T [85,86] poichè la RM 3T ha un rapporto segnale rumore più alto rispetto alla 1,5T e una migliore risoluzione spaziale.

Per quanto riguarda le sequenze CUBE, come dimostrato da Fütterer et al. [87] le sequenze 3D non possono sostituire le sequenze 2D nella stadiazione locale del tumore del retto, ma sono molto utili per studiare la complessa anatomia della pelvi al fine di pianificare al meglio il trattamento.

56

7. CONCLUSIONI

Stabilire il valore dei predittori di risposta alla terapia neoadiuvante nel LARC rappresenta ad oggi una sfida. I criteri RECIST non sono un valido strumento per valutare la risposta alla terapia neoadiuvante nel LARC, nonostante siano ad oggi i più utilizzati. Altri biomarcatori sia molecolari che anatomo-patologici sembrano invece molto promettenti e il TVRR si inserisce tra questi, perchè ha una correlazione statisticamente significativa con il TRG, attualmente considerato un importante parametro predittivo di outcome dei pazienti trattati con CRT neoadiuvante. Ulteriori studi sono auspicabili al fine di stimare il valore di altri biomarcatori basati sull’imaging: tali valutazioni nel complesso potrebbero migliorare sia il planning chirurgico che il successivo management di questi pazienti.

57

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