Valutazione dell'attività citotossica della doxorubicina in presenza e assenza

Dati gli interessanti risultati ottenuti nel test di uptake nucleare della pirarubicina nella

serie di esteri a struttura N-cicloesil-N-alchilamminica, due tra le coppie di

stereoisomeri, ovvero cis 42A e trans 42B e cis 44A e trans 44B, sono state selezionate

per essere sottoposte ad un ulteriore approfondimento farmacologico, ovvero ad un test

di citotossicità. Questo è stato effettuato dalla Dott.ssa M. Coronnello del Dipartimento

di Scienze della Salute dell’Università di Firenze sulla stessa linea cellulare

eritroleucemica K562 utilizzata nel test dell’uptake della pirarubicina. In particolare gli

effetti dei prodotti selezionati sono stati misurati sia sulla linea cellulare parentale

sensibile (K562) che su quella resistente alla doxorubicina (K562/DOXO).

4.2.1. Citotossicità intrinseca delle due coppie di isomeri in studio

Prima di valutare la capacità revertante dei modulatori selezionati, cis 42A e trans 42B

e cis 44A e trans 44B, sono stati eseguiti esperimenti per verificare la tossicità

intrinseca dei composti alle concentrazioni standard generalmente utilizzate in questo

tipo di test. Per la prima coppia di isomeri sono state usate le concentrazioni 1 μM e 3

μM, mentre per la seconda coppia di isomeri anche la concentrazione aggiuntiva 0.1

μM. Gli esperimenti sono stati condotti sulla linea cellulare parentale (K562) e

resistente al chemioterapico antineoplastico doxorubicina (K562/DOXO).

I risultati ottenuti sono riportati in fig.4.4. Per quanto riguarda la coppia di stereoisomeri

cis 42A e trans 42B, i dati dimostrano che sulla linea parentale i composti non hanno

tossicità intrinseca a nessuna delle concentrazioni testate. La tossicità è nulla anche

nella linea resistente ad eccezione della concentrazione 3 μM che causa circa un 20% di

tossicità. Per quanto riguarda la seconda coppia di stereoisomeri cis 44A e trans 44B, si

osserva che nella linea parentale l’entità della tossicità per l’isomero cis 44A è

nell’ordine del 20% alla concentrazione 1 µM e 3 µM, come anche per l’isomero trans

44B, ma a tutte le concentrazioni testate. Nella linea resistente le due molecole non

mostrano tossicità intrinseca a nessuna delle concentrazioni testate. Si osserva lo stesso

trend anche per il tariquidar (composto di riferimento) in entrambe le linee cellulari.

Questi dati permettono di escludere che l’attività sulle cellule resistenti successivamente

trattate sia dovuta a una tossicità delle nostre molecole, ma che la loro attività è

effettivamente

correlata

al

potenziamento

dell’attività

del

chemioterapico

cosomministrato.

Figura 4.4: istogrammi relativi alla tossicità intrinseca dei modulatori in studio e del tariquidar (composto di riferimento) sulla linea parentale e sulla linea resistente. Le percentuali sono state definite rispetto al controllo non trattato a cui è stato attribuito il 100% della proliferazione cellulare. I dati sono

4.2.2. Potenziamento degli effetti citotossici della doxorubicina in

presenza delle due coppie di isomeri in studio

Le due coppie di stereoisomeri cis 42A e trans 42B e cis 44A e trans 44B sono state

testate alle concentrazioni 0.1, 1 e 3 μM in associazione alla doxorubicina per valutare

la loro attività anti-MDR.

In tabella 4.6 sono riportati i valori di IC

della doxorubicina testata sulle linee K562 e

K562/DOXO, da sola e nelle varie associazioni con i modulatori in esame, e i valori di

RF calcolati come descritto nella sezione farmacologica sperimentale (cap.6.2).

Composto K562 K562/DOXO IC50μM IC50μM RF Doxorubicina 0.025 ± 0.007 2.2 ± 0.059 Doxorubicina + 42A 0.1 μM 0.045 ± 0.001 0.79 ± 0.15 2.6 Doxorubicina + 42A 1.0 μM 0.025 ± 0.008 0.48 ± 0.12 4.3 Doxorubicina + 42A 3.0 μM 0.021 0.063 ± 0.008 32.7 Doxorubicina + 42B 0.1 μM 0.036 ± 0.012 0.66 ± 0.084 3.1 Doxorubicina + 42B 1.0 μM 0.011 ± 0.003 0.17 ± 0.055 11.9 Doxorubicina + 42B 3.0 μM 0.013 ± 0.001 0.044 ± 0.021 46.8 Doxorubicina + 44A 0.1 μM nd 1.4 ± 0.005 1.6 Doxorubicina + 44A 1.0 μM 0.013 ± 0.006 0.40 ± 0.11 5.5 Doxorubicina + 44A 3.0 μM 0.018 ± 0.009 0.15 ± 0.02 14.7 Doxorubicina + 44B 0.1 μM nd 0.97 ± 0.011 2.3 Doxorubicina + 44B 1.0 μM 0.051 ± 0.014 0.067 ± 0.04 32.8 Doxorubicina + 44B 3.0 μM 0.036 ± 0.015 0.038 ± 0.004 57.9 Doxorubicina + tariquidar 0.1 μM 0.061±0.04 0.074 ± 0.036 29.7 Doxorubicina + tariquidar 1.0 µM 0.033 ± 0.007 0.073 ± 0.02 30.1

Tabella 4.6: effetti dei modulatori in studio sulla citotossicità della doxorubicina sulle cellule K562 e K562/DOXO. Valori di IC50 ottenuti dalla media di 3 esperimenti eseguiti in quadruplicato, con il

relativo errore standard, o dalla media di due esperimenti eseguiti in quadruplicato; per la linea K562/DOXO sono riportati i valori di RF (Reversal Fold).

Nella linea sensibile (tabella 4.6, fig.4.5) tutti i composti testati in associazione alla

doxorubicina non hanno determinato variazioni significative sui valori di IC

dell’antraciclina a nessuna delle tre concentrazioni di modulatore, attestando una buona

selettività in vitro di questa classe di chemiosensibilizzanti nei confronti della linea

resistente. Le curve di citotossicità relative alla linea sensibile sono mostrate nella

fig.4.5.

Figura 4.5: curve di citotossicità della doxorubicina, ottenute con la linea parentale. Le curve sono rappresentative di una serie di almeno tre esperimenti eseguiti in quadruplicato. In ciascun grafico sono

riportate le curve della doxorubicina testata da sola e in associazione ai modulatori in studio.

Per quanto riguarda la prima coppia di isomeri cis 42A e trans 42B, dai risultati si

evince che nella linea resistente K562/DOXO hanno mostrato diversa attività

chemiosensibilizzante, specialmente a concentrazioni superiori allo 0.1 μM (tabella 4.6,

fig.4.6). I due isomeri presentano un'attività dose-dipendente che risulta paragonabile

alla concentrazione più bassa (0.1 μM) con valori di RF che si attestano al di sotto di 5.

Alla concentrazione intermedia (1 μM) e a quella più alta (3 μM) l’isomero trans 42B

mostra un'attività nettamente maggiore rispetto all’isomero cis 42A. Dal confronto dei

valori di RF, l’isomero trans 42B alla concetrazione 1 M risulta tre volte più attivo

rispetto all’isomero cis 42A e questa differenza si riduce alla concetrazione 3M alla

quale trans 42B è circa 1,5 volte più attivo rispetto al cis 42A. Le curve di citotossicità

relative alla linea resistente sono mostrate nella fig.4.6.

Riguardo alla seconda coppia di isomeri cis 44A e trans 44B, nella linea resistente

(tabella 4.6, fig.4.6), analogamente alla coppia di isomeri precedenti, hanno mostrato

diversa attività chemiosensibilizzante con un andamento dose-dipendente. Alla

concentrazione 0.1 µM entrambi gli isomeri hanno un’attività molto bassa con valori di

RF di circa 2. L’isomero trans 44B risulta essere più potente, con valori di RF di 32.8

alla concentrazione 1 µM e 57.9 a 3µM, attestandosi 6 e 4 volte più attivo dell’isomero

cis 44A alla concentrazione 1 µM e 3 µM.

Confrontando i due isomeri cis, ovvero cis 42A e cis 44A (tabella 4.6), si nota come

l’attività anti-MDR sia equivalente alle concentrazioni 0.1 µM e 1 µM, ma alla

concentrazione 3 µM cis 42A risulta essere 2 volte più attivo di cis 44A. Confrontando i

2 isomeri cis con i 2 isomeri trans, si nota che gli isomeri cis sono meno attivi dei trans.

La comparazione dei due isomeri trans è sempre a favore di trans 44B con valori di RF

di circa 3 volte superiori alla concentrazione 1 µM e quasi sovrapponibile alla

concentrazione 3 µM.

Figura 4.6: curve di citotossicità della doxorubicina ottenute con la linea resistente. Le curve sono rappresentative di una serie di almeno tre esperimenti eseguiti in quadruplicato. In ciascun grafico sono

riportate le curve della doxorubicina testata da sola e in associazione ai modulatori in studio.

Il tariquidar, composto di riferimento (tabella 4.6, fig.4.7), testato alle concentrazioni

0.1 e 1 µM, mostra un comportamento indipendente dalla concentrazione con un valore

di RF di 29.7 alla concentrazione 0.1 µM e di 30.1 alla concentrazione 1 µM.

Confrontando i valori di RF del tariquidar con quello degli isomeri oggetto di questo

paragrafo, si vede come gli isomeri cis 42A e cis 44A e l’isomero trans 42B siano meno

attivi ad entrambe le concentrazioni. Invece l’isomero trans 42B risulta essere il più

interessante tra quelli testati in quanto alla concentrazione 1 M è equipotente col

tariquidar.

Figura 4.7: curve di citotossicità della doxorubicina ottenute con le linee cellulari parentale e resistente. Le curve sono rappresentative di una serie di almeno tre esperimenti eseguiti in quadruplicato. In ciascun grafico sono riportate le curve della doxorubicina in presenza e in assenza del tariquidar