I dati di densità ottica (OD) misurati nel tempo hanno permesso di valutare la capacità di crescita dei due funghi T. asperellum e T. gamsii su 95 diverse fonti di carbonio. Dall’analisi della varianza delle regressione delle curve di crescita su ciascuno dei substrati rispetto al controllo (acqua, per cui si assume una crescita minima) è risultato che T. asperellum è in grado di crescere su 39 substrati, mentre T. gamsii su un numero maggiore di fonti di carbonio, pari a 69. L’analisi ha inoltre evidenziato che 29 substrati sono stati metabolizzati da entrambi i funghi (Fig. 10).
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Figura 10- Heatmap dei substrati assimilati dai due microrganismi benefici presenti in Remedier.
A ciascuna casella, all’interno della heatmap, corrisponde uno dei 96 substrati presenti nelle piastre FF utilizzate per il test Biolog. Al verde corrispondono i substrati non utilizzati, mentre al rosso quelli metabolizzati.
39 Indice di sovrapposizione delle nicchie (NOI)
Il NOI (Niche Overlapping Index) permette di calcolare se due organismi condividono la stessa nicchia ecologica. Utilizzando i dati di OD misurati nella prova di accrescimento è stata applicata la formula mostrata nei materiali e metodi, ottenendo i valori riportati in Tab.7.
Tabella 7- Niche Overlapping Index (NOI) di T. asperellum ICC012 e T. gamsii ICC080 calcolato sulla base dell'accrescimento dei funghi su 95 fonti di carbonio (test Biolog, piastre FF).
Isolato B
Isolato A T. asperellum ICC020 T. gamsii ICC080
T. asperellum ICC020 1.00 0.74
T. gamsii ICC080 0.42 1.00
Il NOI assume valori tra 1 e 0. Due organismi: occupano la stessa nicchia se NOIA/B e NOIB/A> 0.9; occupano nicchie separate se NOIA/B e NOIB/A< 0.9;
l’isolato A è dominante se NOIA/B >0.9 e NOIB/A < 0.9.
Dai valori di NOI si può concludere che i due isolati di Trichoderma occupano nicchie separate in quanto i valori di NOI sono inferiori a 0.9. Si può inoltre concludere che nessuno dei due isolati è dominante rispetto all’altro; pertanto i due principi attivi presenti nel Remedier non sono in competizione per le fonti di carbonio saggiate e hanno esigenze nutrizionali differenti. La coesistenza di due microrganismi è infatti inversamente correlata alla similarità ecologia: tanto meno sono simili, tanto più è possibile una loro esistenza all’interno di un ecosistema (Wilson and Lindow, 1994). L’esclusione di una possibile competizione per i substrati appare estremamente importante nel caso di un prodotto a base di due o più organismi. Questo consente non solo di escludere una competizione tra i principi attivi del prodotto, ma permette di assicurare una più ampia probabilità di successo nel caso in cui i fattori nutritivi dovessero essere una fonte di stress. Avere esigenze nutrizionali diverse garantisce che almeno uno degli organismi presenti nel prodotto possa essere attivo quando l’altro (o gli altri) si trovano in un ambiente poco favorevole al loro sviluppo.
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Attività di biostimolo in fase di semina
Per facilità di lettura nei prossimi paragrafi con la sigla REM si farà riferimento alla tesi dove il terreno è stato inculato con Remedier, mentre con CNT si riferirà alle piante coltivate su terricio non inoculato.
Solanaceae
Pomodoro var. Principe Borghese
La duplice applicazione di Remedier, dapprima al terreno, poi alla semina ha mostrato un incremento della precocità dell’emergenza delle piante rispetto al controllo (Tavola 1). Al termine della prova la media delle piante germinate per le tre repliche è stata 150 per REM e 140 per CNT.
L’analisi statistica effettuate sulle curve di crescita ha confermato la precocità dell’emergenza delle piante inoculate con il prodotto a base di Trichoderma spp. La precocità di emergenza è correlabile alla Pelevation tra le curve che infatti risultata significativa (P<0,05) a conferma del- lo stimolo dell’emergenza dovuto alla presenza dei funghi. La velocità di germinazione, correlabile alla Pslope, invece non ha mostrato differenze tra le due tesi, questo a indicare che la presenza dei microrganismi non modifica l’andamento della germinazione, ma semplicemente ne anticipa l’inizio Tab.8.
Tabella 8- Analisi statistica sulla Pslope e Pelevation delle curve di crescita per Principe borghese nelle due tesi considerate.
Principe borghese
Slope R² P P slope P elevation
CNTL 6,103 0,6178 0,0005
0,132 0,0003041
REM 3,925 0,8629 <0,0001
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Figura 11- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Principe borghese.All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
La biomassa prodotta, sia quella fresca che secca, è risultata maggiore nelle tesi REM, sebbene non in maniera statisticamente significativa. Questi risultati risultano compatibili con il significativo aumento della precocità dell’emergenza nelle tesi REM che si traduce quindi in un aumento dello sviluppo vegetativo a parità di giorni dalla semina.
Pomodoro costoluto var. Canestrino di Lucca
In questa varietà di pomodoro l’omogeneità di crescita e la sua rapidità ha determinato che l’emergenza fosse contemporanea in entrambe le tesi. Pertanto non è stato possibile effettuare un’analisi statistica che potesse valutare eventuali differenze nella precocità o andamento del- l’emergenza. La medie delle piante germinate è stata: 147 su REM e 146 su CNT.
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Figura 12- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Canestrino di Lucca. All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
L’applicazione di Remedier comporta un incremento della biomassa, fresca e secca, prodotta, anche se l’aumento non risulta significativo (Fig. 12); il peso medio delle piante è 0,48 g nelle tesi REM e 0,41 g in CNT. In questa fase le piante trattate risultano più sviluppate, con una altezza maggiore e un apparato radicale più sviluppato Fig. 13.
43 Pomodoro var Cuore di bue
L’emergenza della varietà in analisi è stata uniforme e contemporanea per entrambe le tesi, REM e CNT. Il numero di piante mediamente germinate per le due tesi è: 150 su REM e 145 su CNT.
Al termine della prova nelle tesi REM è stato riscontrato un aumento della biomassa fresca e secca in comparazione con la tesi CNT Fig. 14. La differenza tra le due tesi risulta statisticamente rilevante; infatti per le tesi inoculate con Trichoderma i pesi per singola pianta sono nettamente superiori: 0,58 g/pianta per le tesi REM contro lo 0,44 g/pianta per le tesi CNT.
Figura 14- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Cuore di bue.All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
Riguardo all’applicazione di Trichoderma nelle prime fasi di produzione di pomodoro, il presente lavoro di tesi evidenzia una notevole variabilità nei risultati. Le tre varietà saggiate hanno dimostrato un comportamento notevolmente diverso a seguito del trattamento con Remedier. La varietà Principe borghese sembra beneficiare di un incremento della velocità di emergenza, a dieci giorni dalla semina nelle tesi REM è già presente il 77% delle piante, mentre in quelle CNT il 68%. Questi risultati concordano con altre pubblicazioni che dimostrano un incremento della germinazione a seguito del trattamento del terreno con Trichoderma spp (Baker, 1989; Ousley, Lynch and Whipps, 1994; Rasool Azarmi, 2011). Al contrario, per le varietà Canestrino di Lucca e Cuore di bue, se prese singolarmente, l’applicazione di Remedier non sembra influenzare l’emergenza, che è stata omogenea e contemporanea. A dieci giorni dalla semina per entrambe le tesi l’emergenza rilevata è stata del 73% per il costoluto e 95% per il cuore di bue. Mastouri et al., 2010 hanno riportato risultati simili sulla varietà jubilee la cui emergenza non è stata influenzata
44 dall’applicazione di T. harzianum. I risultati ottenuti, come la letteratura consultata, sembrano suggerire che l’effetto sull’emergenza in pomodoro, a seguito dell’inoculo di Trichoderma nel terreno, sia variabile a seconda della cultivar in esame e verosimilmente anche al tipo di isolato utilizzato.
Per quanto riguarda la biomassa prodotta i risultati sono concordi con la letteratura consultata. Infatti, seppur non significativi per tutte le varietà saggiate, per le tesi trattate con Remedier è stato riscontrato un aumento della biomassa prodotta, sia fresca che secca. L’analisi della varianza effettuata considerando le tre varietà assieme ha confermato che l’utilizzazione di Remedier in semenzaio porti un incremento nella biomassa fresca e secca in pomodoro Fig. 15.
Figura 15- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in piante di pomodoro. All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
Come riportato precedentemente in questo elaborato, per molti isolati di Trichoderma è stata dimostrata un’efficacia come biofertilizzante spiegabile con numerosi meccanismi. Tra questi, alcuni dei più comuni sono la capacità di produrre sostanze ormone-simili (Martínez-Medina et al., 2014) e l’incremento dell’assimilazione di nutrienti (Rudresh, Shivaprakash and Prasad, 2005; Zhao et al., 2014).
Peperone var. berlubi F1
L’utilizzo di Remedier alla semina ha dimostrato un incremento della precocità dell’emergenza (Tavola 2). Le plantule mediamente rilevate dopo 20 giorni dalla semina nelle due tesi erano: 152 per la tesi REM 125 per CNT. A conclusione della prova, dopo 50 giorni di coltivazione la ger- minazione totale è stata del 98% tra le repliche REM, 90% per le repliche CNT.
L’analisi della varianza della regressione delle curve di crescita ha confermato come significativa
g
g
a
b
a
b
45 la precoce emersione delle piante seminate su terreno contenente Trichoderma spp, inoculato come Remedier (Tab.9), come dimostrato dai valori di P elevation. L’applicazione del prodotto, come riportato anche per le precedenti piante investigate, non modifica l’andamento dell'emersione che pertanto non risulta statisticamente differente, Pslope >0,05.
Tabella 9-Analisi statistica sulla Pslope e Pelevation delle curve di crescita per peperone var. Berlubi nelle due tesi considerate.
Peperone
Slope R² P P slope P elevation
CNTL 13,53 0,7754 <0,0001
0,2243 0,0022090
REM 16,73 0,8957 <0,0001
La letteratura consultata, che pur risulta di modesta entità, non fornisce dati univoci sull’effetto biostimolante di Trichoderma su peperone. Mentre Kleifeld and Chet (1992) riportano un aumento della geminazione a seguito dell’applicazione di T. harzianum, Diniz et al. (2009) non riportano differenze tra le tesi trattate con T. viride; questo porta a concludere che la variabilità dell’effetto sia legata all’isolato inoculato e alla varietà utilizzata.
Figura 16- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Berlubi F1.
All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
I risultati presentati in Fig.16 mostrano un aumento della biomassa prodotta sia fresca che secca per le piante accresciute in terreno con Trichoderma, sebbene queste differenze non risultano statisticamente
46 significative probabilmente a causa della elevata variabilità dei dati.
Peperoncino var. habanero orange
L’emergenza e l'accrescimento in entrambe le tesi sono risultati stentati e non uniformi. I dati raccolti non sono quindi da considerarsi utilizzabili per effettuare delle corrette valutazioni del- l’applicazione di Remedier sulla specie considerata.
Melanzana var. Perfection
L’andamento dell’emergenza in melanzana è stato influenzato dall’applicazione di Remedier (Tavola 3). Come riportato in Tab. 10 gli effetti dell’aggiunta in semenzaio del prodotto sono significativi e portano non solo ad una emergenza più precoce, ma anche un riduzione del suo tempo medio (Fig. 17); infatti al ventesimo giorno dopo la semina nelle tesi REM le plantule presenti sono state 147 contro le 120 del CNT. Alla conclusione della prova la germinazione è stata del 93% sul terreno inoculato e dell’86% sul terreno di controllo.
Questi risultati sono stati rilevati da altri autori utilizzano isolati e varietà diverse rispettivamente di Trichoderma e melanzana (Rao, Reddy and Nagesh, 1998; Lingyun, Dongwei and Ming, 2017).
Tabella 10--Analisi statistica sulla Pslope e Pelevation delle curve di crescita per melanzan var. Perfection nelle due tesi considerate.
Melanzana
Slope R² P P slope P elevation
CNTL 9,674 0,9743 <0,0001
0,01474 <0,0001
47
Figura 17- Semenzaio di melanzana con plantule di 20 giorni, a destra la tesi REM a sinistra la tesi CNT.
Si noti il differente stadio della plantule nelle due tesi: allo stadio F1 le piante inoculate, mentre allo stadio cotiledonale le piante controllo.
Dopo 50 giorni di coltivazione la biomassa prodotta risulta significativamente maggiore nelle tesi REM rispetto a quelle CNT (Fig. 18); questo è coerente con i dati relativi all’emergenza. Le plantule coltivate su terreno con Trichoderma essendo germinate prima, si presentavano al termine della prova in uno stadio di sviluppo maggiore rispetto a quelle di controllo. Faruq et al. (2014) hanno ottenuto un incremento della biomassa trattando il terreno del semenzaio con spore di T. harzianum; tuttavia l’attività di biostimolo è stata riscontrata anche a seguito dell'incorporazione di ammendanti organici.
48
Figura 18- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio nella varietà Perfection. All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
Fabaceae
Fagiolo var. Purple king
La germinazione delle plantule di fagiolo è iniziata dopo 12 giorni dalla semina. Per tutto il periodo di coltivazione il numero di piante emerse nelle tesi REM è stato maggiore rispetto a quelle CNT (Tavola 4). Al termine dei rilievi, dopo 20 giorni dalla semina il numero di piante emerse è stato pari a: 146 su REM (92% di germinazione) e 134 su CNT (83% di germinazione).
L’analisi statistica dell’andamento delle due curve di emergenza è riportata in Tab. 11.
Tabella 11-Analisi statistica sulla Pslope e Pelevation delle curve di crescita per fagiolo var. Purple king nelle due tesi considerate.
Fagiolo
Slope R² P P slope P elevation
CNTL 18,88 0,8949 <0,0001
0,3988 0,3330
REM 20,88 0,9729 <0,0001
Nonostante una maggiore germinazione riportata dalle tesi trattate con Remedier non vi è una differenza statisticamente significativa sia nel tempo che nell’andamento dell’emergenza.
49 la biomassa fresca né tantomeno quello secca (Fig. 19). Altri studi hanno ottenuto risultati simili riscontrando uno scarso effetto di Trichoderma sull’emergenza e sull’incremento della biomassa su queste piante ed inoltre evidenziando una isolato-specificità per il biostimolo in fagiolo (Hoyos-Carvajal, Orduz and Bissett, 2009; Sheila, Jane and James, 2011).
Figura 19- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Purple king.
All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANO- VA, P<0.05).
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Cucurbitaceae
Zucchina var. Fiesole
Per questa pianta la precocità di emergenza delle tesi REM è stata evidente fin dal primo rilievo effettuato. A dieci giorni dalla semina nelle tesi trattate con Remedier la media delle piante emerse nelle tre repliche era di 31 contro le 12 delle repliche di controllo (Tavola 5). Al termine della prova la media delle piante emerse è stata per replica di 151 in entrambe le tesi (93% di germinazione). La differenza nell’inizio dell’emergenza è stata confermata anche dall’analisi della varianza della regressione delle curve di germinazione (Tab. 12), dove la Pelevation delle due tesi risulta significativa, ad evidenziare una maggiore precocità per le tesi trattate con Trichoderma.
Tabella 12-Analisi statistica sulla Pslope e Pelevation delle curve di crescita per zucchina var. Fiesole nelle due tesi considerate.
C Zucchina
Slope R² P P slope P elevation
CNTL 23,81 0,9347 <0,0001
0,9725 0,0001700
REM 23,92 0,9452 <0,0001
Tuttavia, questa precocità di sviluppo delle tesi REM non trova corrispondenza in un aumento della biomassa prodotta. L’analisi della varianza, sia del peso fresco che del peso secco, per le due tesi non evidenzia differenze statistiche tra il terreno inoculato e non (Fig. 20).
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All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
L’applicazione di diversi biofertilizzanti commerciali, a base di Trichoderma spp, su zucchina non ha portato ad un aumento statisticamente rilevante della biomassa prodotta (Centro Orticolo Campano, 2011). Ciò nonostante, è possibile ipotizzare un effetto dose legato all’applicazione di Trichoderma: l’inoculazione di T. longibrachiatum alla concentrazione di 108 ha portato un incremento rilevante nella biomassa prodotta su zucchino (Sokhandani, Moosavi and Basirnia, 2016) contrariamente a quanto avvenuto per inoculi più ridotti (105-106) ugualmente testati. A supporto di questa ipotesi è opportuno precisare che i biofertilizzanti contenenti Trichoderma utilizzati nella sperimentazione del Centro Orticolo Campano (2011) contenevano 106-107 UFC, come peraltro il Remedier.
Asteraceae
Lattuga Iceberg var. Donovan
L’uniformità dell’emergenza in questa varietà non ha permesso di apprezzare eventuali effetti del trattamento con Trichoderma. Tuttavia nelle tesi REM la germinazione è stata del 100% rispetto alle tesi CNT che si sono fermate all’89%. Lynch et al. (1991) hanno riportato risultati simili applicando isolati diversi di T. harzianum; tuttavia i medesimi autori hanno notato un effetto depressivo dell’emergenza di altri isolati, questo a conferma di una isolato-specificità per la promozione dell’emergenza (Lynch et al., 1991). L’analisi della varianza della biomassa, fresca e secca, prodotta è stata effettuata per evidenziare le differenze significative tra le due tesi: REM e CNT (Fig. 21).
Figura 21- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Donovan.
All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANO- VA, P<0.05).
52 L’applicazione di Remedier in questa fase dello sviluppo riduce il peso fresco (in modo signifi cativo) e secco delle piante. Questo trova riscontro anche in altre pubblicazioni che hanno riportato una diminuzione della resa a seguito dell’applicazione di Trichoderma (Lynch et al., 1991; Raveendran et al., 2000; Bal and Altintas, 2008) su questa specie vegetale. Tuttavia gli stessi autori hanno riportato per alcuni isolati, T. harzianum IMI 298374 (Lynch et al., 1991) e T. longipile 6Sr4 (Rabeendran et al., 2000), un incremento della resa. Sembra quindi che le diverse specie ed isolati di Trichoderma manifestino una “affinità” con le diverse specie vegetali, che può portare ad un incremento delle resa o ad una sua diminuzione (Bal and Altintas, 2008).
Inoltre la semente utilizzata è stata trattata con thiram, un fungicida noto per la sua scarsa compatibilità con Trichoderma spp (Khirallah et al., 2016).
Carciofo var. Romanesco
La velocità di emergenza della coltura ha fatto sì che non fosse possibile sottoporre i dati ad un’analisi statistica per valutare eventuali effetti dell’applicazione di Remedier (R2<50%).
Dopo 20 giorni di coltivazione le piante seminate su terreno inoculato hanno mostrato un peso fresco significativamente maggiore (Fig. 22); tuttavia dopo l’essiccamento la differenza tra i pesi non è stata più apprezzabile. Questo sembra indicare un contenuto maggiore di acqua all'interno dei tessuti nelle piante inoculate con Remedier .
Figura 22- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio nella varietà Romanesco.
All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANO- VA, P<0.05).
53 terreno utilizzato per la crescita del carciofo: è stato però effettuata una concia del seme con T. atroviride e micorrize del genere Glomus (AMF) (Rouphael et al., 2017). Nello studio le rese delle piante conciate risultavano diminuite, mentre è stato registrato un aumento del contenuto di minerali e acidi fenolici. Questi dati tuttavia non possono essere comparati ai risultati qui presentati in quanto riguardanti una fase fenologica diversa.
Il possibile effetto di biostimolo di Trichoderma, ancorché di Remedier, su carciofo dovrebbe essere valutato più approfonditamente anche in base a quanto emerso dai dati ottenuti e consi- derando che la coltura è la seconda a livello italiano per superficie coltivata (49.577 ha) (fonte:ISTAT).
Carota var. Dolciva ks
L’analisi dell’emergenza non ha riportato per carota una differenza significativa tra le due tesi, questo essenzialmente è stato dovuto alla rapidità e all'omogeneità della germinazione della coltura; germinazione che si è conclusa a 11 giorni dalla semina con 80% di piante germinate in entrambe le tesi.
Figura 23- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in Dolciva ks.
All’interno dello stesso grafico a lettere uguali corrispondono valori statisticamente non differenti (ANOVA, P<0.05).
Al contrario di quanto effettuato per le altre specie, per carota il peso considerato è stato sia della parte epigea, che di quella ipogea che in questa coltura rappresenta la parte prevalente. In Fig. 23 sono riportati i valori di peso fresco e secco sottoposti ad analisi della varianza per evidenziare l’eventuale significatività delle differenze dei pesi. La biomassa prodotta nella tesi CNT è superiore rispetto a quella REM, tuttavia queste differenze non sono risultate significative (P>0,05). In questa coltura l’aggiunta di Remedier al terreno non ne modifica l’emergenza e sembra ridurre la crescita. Non vi sono in letteratura applicazioni
54 simili di Trichoderma, ma è presente un lavoro dove T. viride è stato utilizzato nel bio-priming di carota (Bennett, Mead and Whipps, 2009). Nello studio di Bennett et al. (2009) l’emergenza dei semi trattati (primed seed) è risultata più veloce rispetto ai non trattati (unprimed), tuttavia il priming non ha influenzato il peso del germoglio rilevato dopo 8 settimane di crescita in temperatura controllata.
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Brassicaceae
Rucola coltivata e Rucola selvatica
L’emergenza nella rucola coltivata non è risultata modificata dall’aggiunta di Remedier al terreno di semina; per la rucola selvatica, invece, il numero di piante emerse è stato minore nelle tesi REM rispetto a quelle CNT.
Figura 24- Effetto di Remediersulla biomassa espressa come peso fresco (a) e secco (b) medio in rucola selvatica e