Effetti del Remedier® su semenzai di piante di interesse agrario e caratterizzazione metabolica dei suoi principi attivi.

UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PISA

Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-ambientali

CdLM - Produzioni Agroalimentari e Gestione degli Agroecosistemi

Effetti del Remedier



su semenzai di piante di interesse

agrario e caratterizzazione metabolica dei suoi principi attivi

RELATORI

Prof. Giovanni

Vannacci

Dott.ssa

Sarrocco Sabrina

CORRELATORE

CANDIDATO

Dott. Lorenzo Guglielminetti

Righini Cosimo

A tu che nonostante tutto sei ancora al mio fianco e sorridi, a tu che mai come ora sei forza, coraggio, sostegno.

Indice

Riassunto 5

Biostimolanti, un quadro generale 6

Acidi umici 8

Idrolizzati proteici e aminoacidi 9

Estratti di alghe 9

Biofertilizzanti 10

Batteri benefici 10

Funghi benefici 11

Trichoderma spp. 13

Trichoderma come biopesticida 14

Micoparassitismo 16

Antibiosi e modifica della rizosfera 17

Induzione di resistenza 18

Trichoderma come biofertilizzante 22

Assimilazione dei nutrienti 22

Attività di crescita 23

Tolleranza agli stress 23

Remedier 25

T. asperellum ICC012 27

T. gamsii ICC080 27

Modalità di produzione della biomassa fungina 28

Scopo del lavoro 29

Materiali e metodi 30

Isolati fungini 30

Caratterizzazione metabolica degli isolati fungini principio attivo del Remedier e valutazione

dell’indice di Sovrapposizione delle Nicchie (NOI) 30

Valutazione dell’effetto di Remedier sull’emergenza e sulla crescita di diverse specie

vegetali di interesse agrario 32

Valutazione della capacità endofitica dei due isolati T. asperellum ICC020 e T. gamsii IC-

C080, principio attivo di Remedier 35

Messa a punto di un sistema di inoculazione artificiale di Botrytis cinerea su pomodoro e

peperone 36

Risultati e discussione 37

Valutazione della capacità di accrescimento degli isolati fungini 37

Attività di biostimolo in fase di semina 40

Solanaceae 40

Cucurbitaceae 50 Asteraceae 51 Brassicaceae 55 Liliaceae 56 Lamiaceae 57 Poaceae 60 Biostimolo in post-trapianto 61

Valutazione della capacità endofitica e della rizosfera competenza dei due isolati T.

asperellum ICC020 e T. gamsii ICC080, principio attivo di Remedier® 64 Messa a punto di un protocollo di inoculazione artificiale di B. cinerea 65

Conclusioni 66

Tavola 1 – Emergenza di pomodoro var. Principe borghese nelle rispettive tesi REM e CNT e

relative repliche 68

Tavola 2 – Emergenza di peperone var. Berlubi nelle rispettive tesi REM e CNT e relative repliche 69 Tavola 3 – Emergenza di melanzana var. Perfection nelle rispettive tesi REM e CNT e relative

repliche 70

Tavola 4 – Emergenza di fagiolo var. Purple King nelle rispettive tesi REM e CNT e relative

repliche 71

Tavola 5 – Emergenza di zucchino var. Fiesole nelle rispettive tesi REM e CNT e relative repliche 72 Tavola 6 – Emergenza di asparago var. Montina nelle rispettive tesi REM e CNT e relative repliche 73

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Riassunto

Il presente elaborato ha lo scopo di valutare l’effetto dell’applicazione di Remedier al terreno di semina di diverse colture agrarie. Remedier è un agrofarmaco, più precisamente un fungicida, prodotto e distribuito da Isagro S.p.A, commercializzato in diversi continenti e contenente un principio attivo composto da due isolati di Trichoderma, T. asperellum ICC012 e T. gamsii ICC080.

Sebbene sia noto l’effetto biofungicida di Remedier, poche sono le informazioni ad oggi a disposizione circa un suo effetto biostimolante. Attualmente viene definito biostimolante un “prodotto che contiene sostanza/e e/o microrganismi la cui funzione, quando applicato alle piante o alla rizosfera, è di stimolare processi naturali che portano ad un maggior assorbimento ed utilizzo di nutrienti, ad una aumentata tolleranza a stress abiotici e al miglioramento della qualità della coltura”. Dal punto di vista legislativo, se da una parte si sta delineando il ruolo e l’importanza, in un immediato futuro, di prodotti per la difesa alternativi ai fitofarmaci di origine chimica (DIRETTIVA 2009/128/CE DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 21 ottobre 2009 che istituisce un quadro per l'azione comunitaria ai fini dell'utilizzo sostenibile dei pesticidi) meno chiara invece appare la situazione legislativa che regola l’uso dei biostimolanti. Nel mercato sono presenti comunque numerosi prodotti ad azione biostimolante, molti dei quali composti da microrganismi tra cui isolati fungini appartenenti al genere Trichoderma. In molti isolati di questa specie è stata riscontrata non solo una capacità di contenimento di malattie quali quelle causate da patogeni tellurici, ma anche una capacità di promozione della crescita della pianta con incrementi del vigore vegetativo e delle rese.

Al fine di caratterizzarne i meccanismi d’azione, nel presente lavoro è stato effettuato uno screening dell’attività di biostimolo dei due isolati principio attivo di Remedier, valutando l’effetto del prodotto sull’emergenza e sulla biomassa di diverse specie di interesse agrario a seguito dell’aggiunta dell’agrofarmaco in semenzaio. E’ inoltre stata effettuata una caratterizzazione metabolica dei due isolati al fine di valutare l’eventuale competizione per nutrienti tramite il calcolo dell’Indice di Sovrapposizione delle Nicchie (NOI) attraverso l'utilizzo del sistema Biolog che consente la valutazione contemporanea dell’utilizzo di 95 diverse fonti di carbonio. Dopo aver valutato la capacità endofitica e la rizosfera competenza dei due ceppi fungini, è stato, infine, messo a punto un protocollo per l’infezione di Botrytis cinerea su pomodoro e peperone per verificare l’eventuale induzione di resistenza da parte dei due isolati benefici.

I risultati sin qui ottenuti non consentono di confermare in modo univoco un effetto di Remedier nella riduzione del tempo medio di emergenza o nell’aumento della biomassa per tutte le specie vegetali saggiate. I dati raccolti e sottoposti ad analisi statistica forniscono un quadro complesso: infatti se per alcune colture il trattamento anticipa l’emergenza ed aumenta la biomassa, per altre l’effetto non è percettibile o risulta addirittura negativo rispetto al non trattato. Per quanto riguarda il profilo metabolico, i due isolati non sono in competizione per i substrati e sembrano occupare nicchie ecologiche separate. Infine, i due isolati fungini non sembrano endofiti, mentre sono ottimi rizosfera competenti.

L’applicazione di prodotti a base di microrganismi per favorire lo sviluppo vegetale o migliorare le performance produttive è un interessante filone di ricerca scientifica. Studi come questo sono le premesse per nuove indagini volte ad indagare i meccanismi che intervengono nel determinare il biostimolo nelle piante sensibili.

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Biostimolanti, un quadro generale

La prima comparsa della parola biostimulants risale ad una pubblicazione su una rivista web per il mantenimento di prati seminati (http://grounds-mag.com). La definizione, fornita dai prof.ri Zhang e Shmidt del Dipartimento di Scienze Vegetali ed Ambientali dell’Università Politecnica della Virginia, intendeva un biostimolante come: materiale che in quantità minute promuove la crescita delle piante. Dieci anni più tardi la letteratura scientifica ne darà una definizione come: “un materiale , diverso da un fertilizzante, che promuove la crescita delle piante quando applicato in quantità ridotte” (Kauffman, Kneivel and Watschke, 2007). La parola biostimolante, soprattutto nella letteratura scientifica, è un termine plastico che viene generalmente attribuito a sostanze molto diverse, sia come composizione, che come modalità di azione, capaci di esercitare azioni benefiche nei confronti delle piante. Data la quantità di terminologie risulta più esplicativo definire i biostimolanti da cosa non sono, ossia: fertilizzanti o agrofarmaci (du Jardin, 2015). Occorre puntualizzare con anche il suffisso “bio-” può essere travisato: infatti all’interno di questa categoria di sostanze sono comprese anche composti od elementi di natura sintetica, non limitandosi quindi a solo composti di origine naturale (Przybysz, GawroÅ„ska and Gajc-Wolska, 2014). Se pur definiti come non fertilizzanti o pesticidi, la normativa in Europa, a seconda degli stati, segue i due regolamenti, Reg. CE No 2003/2003 o Reg. CE No 1107/2009, che normano proprio questi due categorie di sostanze. Anche l’accesso al mercato è differente all’interno dei paesi dell’unione, con procedure e richieste molto variabili all’interno del continente Tab. 1 (La Torre, Battaglia and Caradonia, 2016).

Tabella 1- Documentazione necessaria per la registrazione dei biofertilizzanti nei paesi europei

Normativa europea di riferimento Paesi membri Dati necessari Identificazi one della sostanza Utilizzi del prodotto Dati efficacia Modalit à di azione Metodologi e di analisi Indicazioni di sicuezza Etichettazione Classsificazione Registrazio ne come fitofarmaco (Reg. CE No 2003/2003 ) Italia X X - X - X X X Germania X X - X - X X X Spagna X - X - - - X - Paesi bassi X X - - - X - - Repubblica Ceca X X - X X X X X Slovacchia X X X - X X X X Registrazio ne come fertilizzant e (Reg. CE No 1107/2009 ) Belgio X X X - - - X - Francia X X X - - X X - Danimarca X - X - - X X - Ungaria X X X - - X X X Austria X X - - - X X X

7 L’European Biostimulants Industry Consortium (EBIC), ente che raggruppa i principali produttori di biostimolanti, fornisce la seguente definizione completa di biostimolante: “un materiale che contiene sostanza/e e/o microrganismi la cui funzione, quando applicato alle piante o alla rizosfera, è stimolo di processi naturali a beneficio dell’assorbimento di nutrienti e all’efficacia degli stessi, alla tolleranza a stress abiotici, al miglioramento della qualità della coltura; indipendentemente dal contenuto di nutrienti”. (EBIC, 2016)

Nonostante la non univoca classificazione, il mercato dei biostimolanti si è sviluppato in tutti i paesi dell’Unione Europea, coinvolgendo non solo il settore dell’agricoltura biologica, ma anche quello dell’agricoltura convenzionale. L’EBIC ha stimato che il mercato dei biostimolanti nel 2015 ha raggiunto il valore di € 578 milioni in Europa, con la previsione di raggiungere 1 milione di € nel 2019; con una crescita annuale tra il 10-12%, considerando che at- tualmente in Europa sono attive oltre 200 aziende, il 65% delle quali rappresentate da piccole e medie imprese (www.EBIC.com).

Secondo un report della Commissione Europea, i fattori responsabili dello sviluppo del mercato dei biopesticidi sono:

● la promozione di un utilizzo sempre più consapevole degli input nel sistema produttivo agricolo (oggi questo aspetto si è concretizzato con l’attuazione del PAN 2015 che ha reso obbligatoria la lotta integrata);

● la domanda di produzioni con sempre minor impatto ambientale e di elevata qualità; ● il costo spesso volatile ed elevato di input quali i fertilizzanti;

● la possibilità di accesso ai diversi mercati mondiali tramite intermediari o espandendo le proprie imprese;

● La capacità dei biostimolanti di risolvere problematiche specifiche, attraendo quindi nuovi consumatori (Malusá and Vassilev, 2014).

La normativa italiana ha regolamentato l’utilizzo dei biostimolanti mediante il D.Lgs 75/2010 e relative modifiche (La Torre, Battaglia and Caradonia, 2016). All’art.2 comma c è riportata la definizione di “prodotti ad azione specifica”, categoria in cui ricadono i biostimolanti:

«prodotti ad azione specifica»: i prodotti che apportano ad un altro fertilizzante o al suolo o alla pianta, sostanze che favoriscono o regolano l’assorbimento degli elementi nutritivi o correggono determinate anomalie di tipo fisiologico[…].

Questi sono suddivisi nell’allegato 6 del decreto in: ● Prodotti ad azione sui fertilizzanti;

● Prodotti ad azione su suolo

8 Continuando nell’allegato sono dichiarabili biostimolanti solo i prodotti sottoelencati:

● Idrolizzato proteico di erba medica; ● Epitelio animale idrolizzato (solido fluido); ● Estratto liquido di erba medica, alghe e melasso; ● Estratto solido di erba medica, alghe e melasso; ● Estratto acido di alghe della Famiglia “Fucales”; ● Inoculo di funghi micorrizici.

Per tali prodotti è obbligatorio descrivere in etichetta dosi di impiego e modalità d’uso. L’at- tività biostimolante non deve derivare dall’addizione di sostanze ad azione fitormonale al prodotto.

Alcuni autori hanno proposto una classificazione delle sostanze biostimolanti includendo, non solo sostanze, ma anche funghi, micorrizici e non, e batteri, principalmente PGPRs (Plant Growth Promoting Rizobacteria)(Calvo, Nelson and Kloepper, 2014; du Jardin, 2015; Halpern et al., 2015).

Nei prossimi paragrafi, sarà fornita un’introduzione alle varie tipologie di biostimolanti secondo la classificazione adottata da du Jardin (2015).

Acidi umici

Gli acidi umici sono naturalmente presenti nella sostanza organica del suolo (du Jardin, 2015). Derivano dai processi di decomposizione operati dai microrganismi e sono un gruppo di sostanze eterogenee classificate a seconda del loro peso molecolare e della solubilità in: umine, acidi umici e acidi fulvici. La loro capacità di associarsi per creare aggregati colloidali gioca un ruolo chiave per la struttura del suolo e la sua fertilità, ma anche nel regolare l'assorbimento di nutrienti da parte delle piante. Molti autori hanno rilevato un miglioramento della radicazione a seguito del trattamento del letto di semina con acidi umici, (Adani et al., 1998; Eyheraguibel, Silvestre and Morard, 2008; Canellas et al., 2011) mentre altri hanno dimostrato un incremento della crescita e della resa di diverse colture, sia in serra che in pieno campo (du Jardin, 2015). Una meta-analisi della letteratura disponibile ha concluso che l’incremento di biomassa è stimabile intorno al +22%. La variabilità dei dati è riconducibile a differenze nell’origine delle sostanze umiche, nelle condizioni ambientali, nelle dosi e nelle modalità di trattamento delle piante (Roe et al., 2014).

Gli acidi umici per la loro struttura chimica si comportano come chelanti di ioni metallici, favorendone quindi l’assorbimento da parte delle piante. Inoltre essi incrementano la capacità di scambio del terreno, contribuendo all’accrescimento della disponibilità di alcuni macro e microelementi ed

9 impedendo la precipitazione dei fosfati. Un’altra funzione importante delle sostanze umiche è la capacità di stimolare l’H+ ATP-asi della membrana e assicurando quindi la formazione di un potenziale di membrana essenziale per il trasporto anionico cellulare (du Jardin, 2015).

Idrolizzati proteici e aminoacidi

L’applicazione di prodotti a base aminoacidica e proteica ha mostrato un stimolo della crescita vegetale e un incremento della tolleranza a stress biotici e abiotici (Calvo, Nelson and Kloepper, 2014). I prodotti a base proteica possono essere divisi in due categorie principali:

-idrolizzati proteici, costituiti da un mix di peptidi e amminoacidi di origine vegetale o animale; -specifici amminoacidi come glutammato, glutamine, prolina e trimetilglicina;

Effetti diretti sulle piante includono la modulazione dell’assorbimento di azoto, intervenendo sulla regolazione enzimatica e l’espressione dei geni connessi al suo metabolismo, la chelazione di metalli pesanti, che assicura la protezione delle radici e l’incremento dell’attività microbica e della respirazione del suolo (du Jardin, 2015).

Schiavon et al (2008) hanno riportato la presenza di sostanze auxino-gibberellino simili in idrolizzati di erba medica (Schiavon, Ertani and Nardi, 2008).

Anche se la sicurezza degli idrolizzati proteici di origine animale è stata confermata, l'Unione Europea ha bandito l’applicazione di questi sulle parti vegetali eduli.

Estratti di alghe

L’utilizzo di alghe per le fertilizzazione è stato praticato fin dall’antichità (Tuchy, Chowańska and Chojnacka, 2013). Molto più recente è la scoperta di un effetto biostimolante da parte degli estratti liquidi, tanto che in pochi anni si sono resi disponibili una grande varietà di prodotti per uso agricolo e orticolo (Craigie, 2011). Gli estratti riportano effetto chelante, migliorando l’utilizzo dei minerali da parte delle piante, e stimolando la crescita radicale (du Jardin, 2015). Tra i principali composti presenti troviamo: laminarina, alginati e carragenina tutti principalmente estratti da alghe bruna del genere Ascophyllum, Fucus, Laminaria e Sargassum (Tuchy, Chowańska and Chojnacka, 2013).

L’applicazione fogliare di estratti di alghe ha mostrato un incremento della sviluppo radicale in numerose specie, oltre alla riduzione degli stress abiotici causati da siccità, salinità e temperatura (Calvo, Nelson and Kloepper, 2014). La presenza di microelementi, polisaccaridi e ormoni vegetali all’interno degli estratti potrebbero giustificare il loro ruolo biostimolante, ma le modalità di azione e il ruolo degli specifici composti non è ancora stato determinato.

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Biofertilizzanti

Il termine biofertilizzante, come visto precedentemente per biostimolante, non trova attualmente una definizione legale in nessun sistema giuridico (Malusá and Vassilev, 2014). Vessey (2003) propose una definizione di biofertilizzante come: una sostanza contenente organismi vivi, che qualora applicata al seme, alla pianta o al suolo sia capace di colonizzare la rizosfera o la pianta e promuovere la crescita incrementando la disponibilità di nutrienti. L'Inoculo microbico è spesso costituito da un singolo organismo o una combinazione di questi; una distinzione tra i biofertilizzanti può riguardare la tipologia di microrganismo utilizzato a seconda che si parli di batteri o funghi (Reddy and Saravanan, 2013).

Batteri benefici

Con riguardo all’utilizzo dei batteri come biofertilizzanti possono essere identificati due principali gruppi distinti per tassonomia, fisiologia e ecologia: batteri simbionti endofiti, Rhizobium, e batteri simbionti rizosfera-competenti, spesso denominati come PGPRs (plant growth-promoting rhizobacteria). I batteri del genere Rhizobium sono noti azotofissatori in grado di instaurare con le piante appartenenti alla famiglia delle Leguminose una simbiosi mutualistica che permette alla pianta l’utilizzo dell’azoto atmosferico (du Jardin, 2015).

Il termine PGPR include tre tipologie di batteri presenti nel suolo distinti in base alla loro ubicazione rispetto alla pianta: batteri rizosfera competenti, batteri del filloplano e batteri endofiti (Ruzzi and Aroca, 2015). I generi più rappresentativi sono: Bacillus, Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Alcaligenes, Arthobacter, Agrobacterium, Burkholderia, Comamonas, Pantoea, Rhizobium, Serratia, and Variovorax (Kloepper, Lifshitz and Zablotowicz, 1989). L’attività di biostimolo e i meccanismi d’azione special modo, sono variabili a seconda dei generi e delle specie (du Jardin, 2015). Molti autori hanno correlato la promozione della crescita espressa da alcuni PGPRs con la produzione o l’inibizione di alcuni ormoni chiavi nel- lo sviluppo delle piante (Chen and Murata, 2011; Van de Poel and Van Der Straeten, 2014). Alcuni PGPR hanno mostrato la capacità in vitro di produrre auxine (Khalid, Arshad and Zahir, 2004), altri invece di indurre un’espressione dei geni legati alla modulazione della risposta all’ormone (du Jardin, 2015). L’attività di biostimo della pianta da parte di PGPRs può essere anche correlata alla loro capacità di ridurre il contenuto di etile (Van de Poel and Van Der Straeten, 2014) e acido abscissico (Belimov et al., 2009), due ormoni noti per deprimere la crescita vegetale.

L’incremento dell’assimilazione e della disponibilità di nutrienti è stato correlato a l'inoculazione di PGPR (Canbolat et al., 2006); infatti se alcuni isolati hanno dimostrato la capacità di azotofissazione, da cui consegue un incremento netto dell’elemento nel suolo, altri hanno dimostrato l’incremento dell’espressione di geni correlati al suo assorbimento (Ruzzi and Aroca, 2015). Analogamento per quanto riguarda l’azoto N, alcuni PGPRs possono aumentare la disponibilità di fosforo (Ruzzi and Aroca, 2015), elemento spesso presente in forme non biodisponibili, ed incrementare l’uptake del potassio (Singh and Satyanarayana, 2011).

11 Infine, una ulteriore attività di biostimolo può essere legata all’aumento della tolleranza a stress abiotici, come l’incremento dell’attività della catalasi, enzima coinvolto nella difesa dallo stress ossidativo, o dell’espressione di geni legati alle acquaporine in condizioni di siccità (Ruzzi and Aroca, 2015).

Funghi benefici

I funghi sono riconosciuti per essere in grado di interagire con la pianta originando diverse categorie di simbiosi (du Jardin, 2015). Seppur ad uso comune riferirsi al termine simbiosi con una accezione positiva, la parola, in termini ecologici, assume un significato molto più complesso. Per simbiosi si intende: un’associazione intima, spesso obbligata, fra organismi (animali o vegetali) di specie diverse, che generalmente comporta fenomeni di coevoluzione. A seconda del tipo di relazione che si instaura tra i vari organismi (simbionti), si possono definire diverse modalità di simbiosi: mutualismo, commensalismo, inquilismo e parassitismo (www.treccani.it). Si ha quindi che i funghi patogeni instaurano con le piante simbiosi parassitiche, mentre quelli benefici, simbiosi mutualistiche.

Come per i batteri anche nei funghi è possibile fornire una classificazione dei funghi simbionti (simbiosi mutualistiche) sulla base della loro ecologia, si hanno quindi: funghi micorrizici, capaci di instaurare una associazione simbiotica mutualistica con le radici delle piante defi- nita micorriza (Rouphael et al., 2015) e funghi non micorrizici, che pur non formando micorrize possono vivere come endofiti all’interno dei tessuti radicali (du Jardin, 2015).

Il termine micorriza significa letteralmente radice di fungo, dal greco myco- fungo e –rhiza radice (www.treccani.it). La simbiosi permette un vantaggio diretto per entrambi gli organi- smi: la pianta ottiene nutrienti, principalmente fosforo, dal sistema ifale del fungo, mentre quest’ultimo riceve principalmente carboidrati prodotti dall’attività fotosintetica (Gorzelak et al., 2015). La micorrize sono diffuse in tutti gli ambienti, oltre 6000 specie di funghi micorrizici sono riconosciuti tra Ascomyceti, Basydiomiceti e Glomeromyceti (Reddy and Saravanan, 2013). Gli “Arbuscular mycorrhizal fungi” (AMF), biotrofi obbligati all’interno del Glomeromyceti, rappresentano la classe più ubiquitaria tra i funghi micorrizici (Gorzelak et al., 2015). Le simbiosi con AMF risultano particolarmente importanti per l’assimilazione del fosforo e di altri cationi come Ca2+_{, Fe}3+ _{e Al}3+ _{(Rouphael et al., 2015). AMF possono} formare micorrize con quasi tutte le piante coltivate, non è pertanto possibile associare un determinato isolato ad una coltura, tuttavia tra i prodotti in commercio i generi più utilizzati appartengono a Rhizophagus e Funneliformis (Rouphael et al., 2015). Come biotrofi obbligati, i funghi micorrizici non possono crescere e svilupparsi senza la presenza di una radice con cui instaurare la simbiosi. La crescita senza la pianta ospite è stentata e se la mancanza è protratta il fungo entra in quiescenza con la formazione di clamidospore (Giovannetti et al., 1993). La produzione di inoculi commerciali risulta quindi complessa, richiedendo l’utilizzo di tessuti vegetali per la crescita (Malusá and Vassilev, 2014). Gli inoculi commerciali sono ottenuti mediante la coltivazione di piante ospiti all’interno di serre su terreni sterili inoculati con spore, micelio o residui colturali; applicando queste tecniche è possibile

12 ottenere una densità di inoculo sufficiente per l’applicazione in campo (Rouphael et al., 2015). Sul mercato sono disponibili diversi formati quali argille, polveri, pellettati o soluzioni liquide (Malusá and Vassilev, 2014).

L’utilizzo di AMF in condizioni di stress idrico o salino applicato ha dimostrato un incremento delle rese di pomodoro (Solanum lycopersicum L.), peperone (Capsicum annum L.) e altre colture arboree ed erbacee (Rouphael et al., 2015). Gli autori suggeriscono tra le possibili modalità di azione, la produzione di enzimi antiossidanti, che proteggono la pianta da danni ossidativi, e che portano ad un aumento del potenziale osmotico a seguito di un accumulo di zuccheri solubili. Per quanto riguarda lo stress salino, alcuni autori hanno collegato l'incremento dello sviluppo delle tesi inoculate con AMF in Dianthus caryophyllus e Euonymus japonica con l’effetto di accumulo e compartimentazione degli ioni tossici all’interno delle radici micorrizate. Impedita la traslocazione degli ioni tossici ai germogli le piante hanno mostrato un maggior sviluppo e un concentrazione di nutrienti (N,P, Ca) all’interno dei tessuti (du Jardin, 2015).

Effetto simile è stato ottenuto con la crescita di piante in terreni contenenti metalli pesanti come cadmio, nichel e piombo; i funghi arbuscolari hanno manifestato la capacità di immobilizzare i contaminanti all’interno della biomassa ifale, riducendo la quantità assorbita dalle radici e quella traslocata nella parte epigea (Giovannetti et al., 1993).

Nonostante i benefici apportati, le difficoltà nell’ottenimento di un inoculo e la difficoltà nella selezione di isolati specifici, rappresentano i maggiori limiti alla diffusione dell’utilizzo delle AMF come biofertilizzanti (du Jardin, 2015).

Oltre alle micorrize sono oggi presenti in commercio numerosi prodotti contenenti funghi non micorrizici, ma comunque endofiti. Tra questi il genere Trichoderma spp. è sicuramente tra quelli maggiormente studiati e tra i più interessanti risvolti pratici; nel successivo capitolo si fornirà quindi una introduzione dettagliata alla biologia e alle caratteristiche del genere.

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Trichoderma spp.

Al genere Trichoderma appartengono più di 200 specie identificate; ubiquitario, le varie specie hanno colonizzato ambienti molto differenti, dalla lettiera in decomposizione alle spugne marine, ma prevalentemente sono state isolate all’interno di suoli o in associazione con piante erbacee e arboree (López-Bucio, Pelagio-Flores and Herrera-Estrella, 2015).

Appartenente al gruppo degli Ascomycota, la maggior parte delle specie si riproducono agamicamente e in natura la forma asessuale del fungo permane come colonia, spesso eterocariote, come popolazione o come singolo individuo che evolve indipendentemente (Gary E. Harman et al., 2004).

Le varie specie sono da lungo tempo utilizzate come agenti biologici di controllo per le patologie vegetali e come biostimolanti per la crescita delle piante. Il loro utilizzo diffuso in ambito orticolo è attribuibile alla loro rizosfera competenza, intesa come la capacità di crescere in associazione con lo sviluppo delle radici (Harman, 2000). E’ noto come gli essudati radicali siano capaci di variare la composizione della rizosfera favorendo lo sviluppo di microrganismi capaci di promuoverne lo sviluppo o di incrementarne la resistenza ai patogeni (Berendsen, Pieterse and Bakker, 2012). Il rilascio di pectine ed emicellulose, in particolare ramnogalatturonani e arabinoxilani, stimola la crescita di Trichoderma in quanto direttamente utilizzabili come fonte carboniosa per il fungo; inoltre risultano molecole rilasciate durante l’attività di funghi patogeni di cui il genere è micoparassita (Druzhinina et al., 2011). Le strutture che Trichoderma forma quando entra in contatto con la radice, sono simili a quelle che sono utilizzate durante il micoparassitismo, argomento trattato nei paragrafi successivi (Fig. 1).

Figura 1- Interazione tra T. asperellum T-203 e radice di cetriolo.

L’addizione di T. asperellum è avvenuta su cetriolo coltivato in idroponica. a) apressorio di Trichoderma; b) coiling dell’ifa di Trichoderma intorno ad un pelo radicale di cetriolo; c) penetrazione all’interno della radice: la penetrazione è comunque limitata allo strato del cortex radicale.

La capacità di penetrare all’interno dei tessuti radicali, seppur limitata al primo o secondo strato cellulare, è definita endofitismo ed è stato spesso associata all’induzione di resistenza dimostrata da alcuni isolati (Gary E. Harman et al., 2004; Kubicek et al., 2015). Nonostante la capacità di penetrare all’interno dei tessuti vegetali il genere Trichoderma non è conosciuto come agente eziologico di malattie delle piante; danni sono invece riscontrati sulla produzione di funghi eduli come Pleorotus

14 ostreatus o Agaricus bisporus a conferma comunque di una attività antifungina espressa dal genere (Prisa et al., 2014).

Trichoderma come biopesticida

In letteratura sono presenti numerose pubblicazioni sull’utilizzo di Trichoderma come agente di controllo biologico (BCA) (Verma, Satinder K Brar, et al., 2007). L’elenco, non esaustivo, di patogeni comprende: Botrytis cinerea (Sci and Cultus, 2011), Fusarium spp (Sarrocco et al., 2013), Rhizoctonia solani (Anees et al., 2010), Pythum ultimum (Benítez et al., 2004), Xanthomonas sagittifolium (Mbarga et al., 2012), complesso del mal dell’esca (Reggiori et al., 2015) e altre malattie (Verma, Satinder K Brar, et al., 2007).

Il successo nell’utilizzo di questo fortunato, quanto vario, genere consiste nella sua elevata capacità riproduttiva, nell’abilità di accrescersi in condizioni sfavorevoli, nell’efficiente utilizzazione dei nutrienti, la rizosfera competenza e lo stretto rapporto che è in grado di instaurare con le piante (Benítez et al., 2004). Lorito et al (2010) hanno riscontrato l’utilizzo di questo fungo in 60 paesi per proteggere un'ampia varietà di colture, arboree, erbacee, ornamentali in diversi condizioni di crescita quali: serra, pieno campo, idroponica (Fig. 2).

Figura 2- Stima dell'utilizzo di prodotti a base di Trichoderma nel mondo. La grandezza dei punti rossi rappresentano proporzionalmente il loro uso (Lorito et al., 2010).

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Tabella 2- Prodotti a base di Trichoderma, nelle parentesi indicata l'azienda produttrice. I fungicidi con la medesima specie possono utilizzare isolati diversi. (Fonte: http://www.fitosanitari.salute.gov.it/fitosanitariwsWeb_- new/FitosanitariServlet)

Prodotto (Azienda)

Specie di Trichoderma

T. asperellum T. atroviride T. gamsii T. harzianum Bioten, Radix, Remedier, Bio

Tam, Tenet, Tellus (Isagro X X

Spa)

Trianum (Koppert) X

Money go, Xedasper (Xeda X

international) T34 Biocontrol (Fargro) X Tusal (Newbiotechinc ) X X Vendina (Euroagro) X Rootshield (Bioworks) X Tricodex (Adama) X

L’attività di biocontrollo esercitata è il risultato della combinazione di diverse modalità di azione, che agiscono simultaneamente e sinergicamente (Harman, 2006).

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Micoparassitismo

Il micoparassitismo può essere definito come un attacco diretto al micelio fungino seguito da una sottrazione di nutrienti ad opera del parassita; è un interazione fungo-fungo che si attua mediante l’avvolgimento dell’ifa dell’ospite, in inglese coiling Fig. 3 (Viterbo and Horwitz, 2010). Si possono definire due tipologie di micoparassitismo: biotrofico o necrotrofico, a seconda che l’interazione porti l’ospite alla morte o meno. Il micoparassitismo necrotrofico, è generalmente non ospite-specifico ed è caratteristica dei funghi del genere Trichoderma (Viterbo and Horwitz, 2010).

Figura 3- A) Micoparassitismo necrotrofico. Trichoderma asperellum su Rhizoctonia solani (Viterbo and Horwitz. 2010). B) Rappresentazione grafica del micoparassitismo di Trichoderma (Verma et al., 2007).

I meccanismi che regolano il micoparassitismo sono complessi e prevedono una sequenza di azioni successive (Gary E. Harman et al., 2004). La produzione di enzimi litici, come proteasi e esochitinasi, è utilizzato per l’individuazione della preda a seguito del rilascio di oligopeptidi da parte delle membrane cellulari (Druzhinina et al., 2011). La crescita del micoparassita è chemiotropica, direzionata verso la preda (Viterbo and Horwitz, 2010).

Una volta stabilito il contatto con l’ospite, il micelio del parassita avvolge quello della preda e si formano delle strutture, definite appressori, per la penetrazione meccanica all’interno del tessuto fungino Fig(3) (Viterbo and Horwitz, 2010). Quest’ultima è accompagnata, non secondariamente, dalla produzione di endochitinasi e altri enzimi litici, in grado di dissolvere i tessuti e facilitare la penetrazione all’interno dell’ospite (Gary E. Harman et al., 2004). Le endochinasi prodotte dal genere Trichoderma sono riconosciute come le più efficaci, a supporto della tesi circa la specializzazione di questo genere nell’attacco di altri funghi (Be- nítez et al., 2004). La morte della preda è determinata dall’azione sinergica di metaboliti antimicrobici secondari e enzimi litici (chinasi, glucanasi e proteasi)(Benítez et al., 2004).

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Antibiosi e modifica della rizosfera

L’antibiosi è un processo di secrezione di composti antimicrobici da funghi antagonisti per la soppressione di altri individui in prossimità dell’area di crescita (Wijesinghe et al., 2010). Molti isolati di Trichoderma producono metaboliti tossici volatili e non per impedire la colonizzazione di possibili antagonisti (Benítez et al., 2004). Mbarga et al. 2012 hanno riscontrato una riduzione della crescita di Pyhium mytiotylum se accresciuto in vitro con isolati di T. asperellum Fig. 4 .

Oltre alla produzione di molecole ad attività antimicrobica, il genere Trichoderma risulta in grado di modificare il pH della rizosfera e di ridurre la virulenza dei patogeni (Benítez et al., 2004). I fattori di patogenicità sono infatti prodotti all’interno di range di pH determinati e specifici, una conseguente modifica dell’acidità porta quindi all’impossibilità di sintetizzare (Rey, Delgado-Jarana and Benítez, 2001).

Altro meccanismo di azione importante per il biocontrollo esercitato da Trichoderma è la competizione per i nutrienti (Verma, Satinder K Brar, et al., 2007) . Spesso la presenza di nutrienti rappresenta l’elemento limite per la crescita microbica, pertanto una diretta competizione è spesso presente all’interno dei substrati di crescita (Chet and Inbar, 1994). Tra gli elementi nutritivi il ferro è presente in forma disponibile solo a pH bassi. La concentrazione passa da 10-6 _{M a pH 3,3 a 10}-17 _{M a pH=7.}

Figura 4- T. asperellum vs Pythium mytiotylim (Mbarga et al., 2012).

e), f) e g) accrescimento sulla medesima piastra di isolati di T. asperellum e Pythium mytiotylim con netta sovracrescita di Tricoderma. Nelle fotografie sottostanti gli isolati di Trichoderma utilizzati nella prova di crescita congiunta.

18 Monocotiledoni e alcuni microrganismi sono capaci di produrre specifiche molecole ad azione chelante sui cationi di ferro Fe, chiamate siderofori (Marschner, 1988).

Alcune specie di Trichoderma utilizzate come agenti di biocontrollo sono in grado di produrre siderofori molto efficienti in grado di interferire con la crescita di altri microrganismi (Chet and Inbar, 1994). Segarra et al, (2010) hanno ipotizzato che alla base dell’azione di biocontrollo esercitata da T. asperellum T 34 nei confronti di Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici su piante di pomodoro ci sia proprio una competizione per il Fe. La produzione di siderofori più efficienti deprimerebbe lo sviluppo di F. oxysporum f.sp. lycopersici e sarebbe un fattore chiave nell’attività di biocontrollo che si affianca all’attività di biostimolo esercitata sulle piante (Segarra et al., 2010).

Matarese at el. 2012 hanno confermato la capacità di alcuni ceppi di Trichoderma,in partico- lare T. gamsii 6085, non solo di crescere il presenza di micotossine, ma anche di ridurre lo sviluppo di funghi correlati alla loro produzione Fusarium graminearum e F. culmorum.

Induzione di resistenza

L’induzione di resistenza è definibile come una stimolazione prolungata delle difese di tutta la pianta, accompagnata da cambiamenti fisiologici e morfologici, a seguito di una elicitazione locale da parte di stimoli ambientali (Pieterse et al., 1998). Le due forme più chiaramente definite di induzione di resistenza sono: resistenza biologicamente indotta (o systemic acquired resistance SAR) o induzione sistemica di resistenza (induced systemic resistance ISR (Gary E. Vallad and Robert M. Goodman, 2004). Per comprendere i meccanismi che attivano l’induzione di resistenza è opportuno riassumere in breve i meccanismi “immunitari”, termine improprio in quanto le piante non possiedono un sistema immunitario complesso come quello animale, tramite cui la pianta realizza la resistenza.

Le piante contano su un sistema di difesa innato presente in ogni cellula o attivato sistemi- camente dal sito di infezione (Jones and Dangl, 2006). Attualmente sono noti due tipologie di risposta immunitaria; la prima si basa sul riconoscimento da parte di specifici recettori transmembrana di microorganism-associated molecular patterns (MAMPs, denominato anche PAMPs), cioè molecole come lipopolisaccaridi, peptidoglicano, flagellina o chitina presenti ubiquitariamente all’interno dei microrganismi (Spoel and Dong, 2012). La risposta immunitaria è chiamata PAPMs triggered immunity (PTI) e comporta modifiche fisiologiche come l'ispessimento delle pareti cellulari e il deposito di callosio (Jones and Dangl, 2006). I microrganismi patogeni, tramite apposite proteine definite effettori, possono silenziare questa risposta immunitaria ed esprimere la loro virulenza (Spoel and Dong, 2012). Una seconda risposta immunitaria è basata quindi sul riconoscimento di queste molecole ed è chiamata effector-triggered immunity (ETI) (Druzhinina et al., 2011). Con l’evoluzione i microrganismi patogeni hanno sviluppato nuovi effettori in grado di sopprimere questa risposta immunitaria e parallelamente le piante hanno sviluppato recettori in grado di scatenarla, determinando un continuo adattamento di entrambi, microrganismi e piante (Jones and Dangl, 2006); in Fig. 5 è mostrato il risultato del sistema “immunitario” delle piante.

19 La SAR è tipicamente indotta a seguito dell’attivazione del ETI (Spoel and Dong, 2012); determinata dall’esposizione della pianta ad una agente definito induttore, un patogeno attenuato o suoi elicitori, è quindi in grado di trasmettere per via floematica tramite acido salicilico lo stimolo immunitario (Gary E. Vallad and Robert M. Goodman, 2004) permettendo una “immunizzazione” che può durare anche 20 giorni (Spoel and Dong, 2012), Fig.6.

Figura 5- Modello a zigzag della risposta immunitaria delle piante e i due livelli di difesa (Jones and Dangl, 2006).

Nella prima fase la pianta intercetta e reagisce alle PAMPs tramite l’attivazione della PAMP-triggered immunity, questa risposte è aspecifica. Nella seconda fase, i patogeni penetrati rilasciano effettori in grado di attivare la ETI. Nella terza fase la presenza di una particolare effettore determina l’attivazione del pattern responsabile per la reazione di ipersensibilità.

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Figura 6- Rappresentazione schematica della SAR e degli effetti fisiologici (Vallad and Goodman, 2004).

L’ISR, a differenza della SAR, è realizzata come risultato di una colonizzazione delle radici da parte di PGPR o funghi benefici quali Trichoderma sp che, mediante l’attivazione promossa dall acido jasmonico e dall’etilene, sono in grado di elicitare PAPMs triggered immunity (Druzhinina et al., 2011). A differenza della SAR, la manifestazione di una induzione di resistenza è ceppo-dipendente e cultivar-dipendente, non tutti gli isolati/ceppi fungini/batterici sono in grado di indurre resistenza e questa dipende anche dalla specie/varietà di riferimento (Gary E. Vallad and Robert M. Goodman, 2004). Alcuni isolati endofitici di Trichoderma hanno dimostrato di ridurre la virulenza dei patogeni elicitando le difese della pianta, realizzando quindi una ISR (Walters, Ratsep and Havis, 2013). La prima sperimentazione che ha dimostrato una induzione di resistenza da parte di un ceppo di Trichoderma risale al 1997, prima di allora la ricerca sull’attività di biocontrollo del genere si era concentrata su altri meccanismi di azione(Gary E. Harman et al., 2004). I meccanismi su cui si basa l’ISR promossa da Trichoderma non sono del tutto noti (Harman, 2000). Un’ipotesi corrente è che vi sia un continuo scambio molecolare tra il fungo e la pianta che inizia prima del contatto tra ife e radici (Tucci et al., 2011). La pianta percepisce il fungo come un potenziale patogeno e attiva una risposta locale basata sulla produzione di fitoalessine (Jones and Dangl, 2006) e sistemica che coinvolge l’acido jasmonico e l’etilene per la trasduzione del segnale (Tucci et al., 2011). La colonizzazione radicale da parte di T. asperellum T22 su cetriolo determina un incremento del contenuto di acido salicidico, jasmonico e di proteine antimicrobiche come le perossidasi (Segarra et al., 2007). Una riduzione dell’80%

21 del danno da P. syringae pv. Lachrymans è stata ottenuta con l’applicazione di T. asperellum T-203 mostrando anche un accumulo sistemico di fitoalessine (Yedidia et al., 2003).

Altre pubblicazioni riguardanti l’utilizzo di diversi isolati hanno mostrato una induzione di resistenza su:

cotone vs. seedling disease (Howell and Puckhaber, 2005),

pomodoro/lattuga/peperone/fagiolo/tabacco vs. B. cinerea (G. De Meyer et al., 1998), mais vs. Colletotrichum graminicola (Gary E Harman et al., 2004), Arabidopsis vs. Cucumber mosaic virus (CMV-Y) (El- sharkawy et al., 2013).

La produzione di acido jasmonico, fitoalessine ed etile, nonché in generale l’induzione di resistenza della pianta è legata alla produzione di elicitori da parte di Trichoderma sp che agiscono come MAMPs (Druzhinina et al., 2011). Sono stati identificate tre classi di composti elicitori: proteine, oligosaccaridi e altre molecole a basso peso molecolare che sono rilasciate dall’attività del fungo (Gary E. Harman et al., 2004). La Fig. 7 riassume tutti i meccanismi di biocontrollo di Trichoderma nei confronti delle patologie vegetali.

Figura 7- Processo di interazione: pianta-Trichoderma-patogeno con evidenza sui meccanismi di biocontrollo di Trichoderma

(Gary E Harman et al., 2004).

La figura fornisce una panoramica dei principali meccanismi di azione di Trichoderma, esaminando le specifiche interazioni tra i tre soggetti coinvolti: pianta, fungo benefico e patogeno. a) Sinistra: Il fungo interagisce con la pianta che risponde attivando una compartimentalizzazione del micelio fungino. Trichoderma colonizza la la superficie radicale e la parte esterna del cortex; insediatosi rilascia molecole bioattive che inducono MAMPs triggered immunity. Destra: pianta controllo. b) Sinistra: il patogeno in blu può attaccare le radici o le parti aeree della pianta. Nel rettangolo in bassa le possibili interazioni: in basso il micoparassitismo indicato come il coiling tra i due funghi, in alto il rilascio di sostanze antimicrobiche (in viola) o stimolare le difese locali della pianta. La freccia indica l’induzione di resistenza sistemica che si trasmette con ac. Jasmonico ed etilene Destra: pianta controllo in il patogeno risulta virulento. c) Sinistra: nonostante l’infezione la pianta non mostra malattia Destra: pianta controllo dove infezione ha avuto successo evidenziando sintomatologie patologiche.

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Trichoderma come biofertilizzante

Il genere Trichoderma spp è un noto biopesticida, circa il 60% dei biopesticidi in commercio è a base di isolati di questo genere (López-Bucio, Pelagio-Flores and Herrera-Estrella, 2015). Tuttavia al controllo delle malattie, a seguito del suo utilizzo, è associato un maggior sviluppo della biomassa vegetale (Haque, Ilias and Molla, 2012) e alla resistenza a stress abiotici (Shukla et al., 2012; Zhao et al., 2014). La combinazione dei due effetti, biocontrollo e biostimolo, è così stretta che risulta impossibile separarli; tanto che fenomeni come l’incremento dello sviluppo radicale è imputabile alla concomitanza tra biofertilizzazione e controllo degli organismi patogeni o deleteri (Gary E. Harman et al., 2004). Volendosi soffermare sui principali meccanismi alla base del biostimolo esercitato da Trichoderma quello che si ottiene è una fotografia delle conoscenze attuali non sufficientemente chiara (López-Bucio, Pelagio-Flores and Herrera-Estrella, 2015); infatti i meccanismi della promozione della crescita delle piante da parte di questo genere di funghi benefici non sono ancora noti (Gary E Harman et al., 2004). Uno dei possibili meccanismi di biostimolo della crescita delle piante è legato all’aumento dell’assimilazione dei nutrienti da parte delle ra- dici mediato tramite il fungo benefico, analogamente a quanto avviene nelle AFM (Ousley, Lynch and Whipps, 1994); ulteriore similitudine alle più famose simbiosi è il trasferimento di saccarosio dalla pianta al fungo (Mendoza-Mendoza et al., 2018).

L’esistenza di un dialogo tra la pianta e il fungo porta a pensare che il biostimolo sia legato alla produzione di metaboliti in grado di promuovere la crescita o all’eliminazione degli input negativi che la inibiscono (Ousley, Lynch and Whipps, 1994).

Assimilazione dei nutrienti

Trichoderma spp. aumentano l’assimilazione e la concentrazione di molti macronutrienti, azoto e fosforo, (Molla et al., 2012) e micronutrienti, ferro (Zhao et al., 2014), manganese e rame (Gary E. Harman et al., 2004).

Il fosforo non solo rappresenta uno degli elementi più importanti nella nutrizione vegetale, ma è anche quello che desta maggiore preoccupazione per il futuro. Le riserve minerali di questo elemento, alla base di tutti i fertilizzanti chimici in commercio si stima che si esauriranno nell’arco di 100 anni (Gilbert, 2009). La combinazione dell’inoculazione di Rhizobium e Trichoderma virens ha mostrato un maggior assorbimento di fosforo P rispetto al controllo a seguito di una concimazione minerale in cece (Rudresh, Shivaprakash and Prasad, 2005). I risultati, ottenuti prima in serra, sono stati confermati anche in pieno campo, non mostrando competizione tra i due microrganismi nella colonizzazione degli apparati radicali (Rudresh, Shivaprakash and Prasad, 2005).

Altro elemento deficitario, nei terreni alcalini special modo, è il ferro (López-Bucio, Pelagio- Flores and Herrera-Estrella, 2015). Zhao et al. hanno dimostrato l’aumento dell'assimilazione di questo elemento da parte di cetriolo mediato da T. asperellum. I meccanismi tramite cui questo può avvenire sono

23 complessi e prevedono: la produzione di siderofori in grado di chelare il Fe2+_{, l’attività della ferro} riduttasi microbica capace di ridurre il Fe3+ _{a Fe}2+_{, la produzione di acidi organici in grado di solubilizzare} il ferro tramite la formazione di sali (Zhao et al., 2014).

L’applicazione di formulati di Trichoderma incrementa l’efficacia delle fertilizzazioni, au- mentando lo sviluppo vegetativo, la resa e la qualità nutrizionale in pomodoro (Molla et al., 2012). Nel medesimo studio è stato previsto un risparmio del 50% delle concimazione ternario, NPK, combinando la fertilizzazione con il trattamento di formulati contenenti Trichoderma spp.

Attività di crescita

La colonizzazione da parte di Trichoderma è accompagnata dal maggiore sviluppo di radici laterali (López-Bucio, Pelagio-Flores and Herrera-Estrella, 2015).

La capacità esercitata da alcuni microrganismi di modificare l’architettura radicale è legata alla produzione di auxine, o di precursori di queste così come o di molecole che ne mimino il segnale (Contreras-Cornejo et al., 2009; López-Bucio, Pelagio-Flores and Herrera-Estrella, 2015). Il contenuto di ormoni vegetali è stato quantificato nei germogli delle piante colonizzate da differenti isolati di Trichoderma. Agli isolati che hanno mostrato un incremento della crescita vegetale si è accompagnato un incremento delle auxine e una riduzione di citochinine e acido abscissico (Martínez-Medina et al., 2014). T. virens è in grado di produrre acido indol-3-acetico, indol-3-acetaldeide e indol-3-etanolo, composti precursori delle auxine. Inoltre l'inoculazione con il fungo, nella sperimentazione, ha mostrato l’attivazione dei geni coinvolti nel riconoscimento e nella trasduzione dello stimolo auxínico (Contreras-Cornejo et al., 2009).

Un isolato di T.asperellum ha dimostrato la capacità di produrre l’enzima in grado di metabolizzare il precursore dell’etilene, ACC (1-amminociclopropano-1-carbossilato) deaminasi; l’attività di questo enzima è stato associata all'incrementi della crescita vegetale nell’utilizzo di PGPR in grado anch’essi di produrlo (Viterbo et al., 2010).

Tolleranza agli stress

Temperatura, siccità, salinità sono le maggiori fonti di stress abiotici in grado di provocare cali produttivi non secondari rispetto a gli agenti abiotici (Marasco et al., 2012). Come è noto, la pianta è capace di modificare la rizosfera in modo da favorire la sviluppo di una comunità microbica utile in grado di aumentare la resistenza agli stress (Berendsen, Pieterse and Bakker, 2012).

Pertanto, la presenza di Trichoderma harzianum all’interno delle radici di riso sembra incrementare la resistenza alla siccità; questa tolleranza a prolungati periodi di assenza di acqua è archiviata mediante numerosi meccanismi. Le piante colonizzate presentano una conduzione stomatica modificata e un

24 incremento maggiore della fotosintesi, accompagnato da una riduzione della concentrazione di metaboliti relativi allo stress idrico come prolina, perossido di idrogeno e altri (Shukla et al., 2012). Contreras-Cornejo et al. (2015) hanno dimostrato l’influenza di due isolati di Trichoderma dell'apertura stomatica modulata dall'accumulo di acido abscissico (ABA) (Contreras-Cornejo et al., 2015). Oltretutto l’utilizzo di Trichoderma hamatum su cacao ha permesso un incremento della crescita della pianta, una modifica dell'espressione genica e un ritardo nella risposta alla siccità giustificato con una maggiore capacità della pianta di acquisire acqua dal terreno; questa scoperta risulta particolarmente interessante per una importante coltura tropicale la cui resa è fortemente influenzata dalla disponibilità d’acqua (Bae et al., 2009).

A conclusione del paragrafo in Fig. 8 sono riportati i principali meccanismi di biostimolo del genere Trichoderma.

Figura 8- Principali meccanismi della fitostimolazione di Trichoderma spp (Lopez-Bucio et

al.2015)

La figura mostra graficamente i risultati di numerose ricerche su isolati di trichoderma e i meccanismi attraverso il quale essi esplicano l’attività di biostimolo:

a) Regolazione della conduttività stomatica tramite ABA (Contreras-Cornejo et al.2014); b) Aumento dell’assimilazione di N, P (Molla et al.2012) e Fe (Zhao et al., 2014);

c) Produzione di ormoni e relativi precursori (Viterbo et al., 2010; Contreras-Cornejo et al., 2009; Martínez-Medina et al., 2014)

a

b

25

Remedier



Remedier un agrofarmaco biologico a base di Trichoderma asperellum ICC012 e Trichoderma gamsii ICC080 ad azione antagonistica per la prevenzione di malattie fungine del terreno (vedasi etichetta Allegato I), registrato presso il Ministero della Salute con il n°013158 dal 07/03/2006. Le sostanze attive sono costituite da i due isolati presenti, ciascuno alla concentrazioni di 2g su 100 g di prodotto pari a unità formanti colonia (UFC) 3 x 107 _{per grammo.}

Da etichetta:

“Remedier è particolarmente indicato nella prevenzione degli attacchi di funghi parassiti dell’apparato radicale e del colletto quali: Rhizoctonia solani, Pythium spp., Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae, Thielaviopsis basicola, Sclarotium rolfsii, Phytophtora spp., Armillaria mellea. I funghi antagonisti, dopo l’applicazione, colonizzano il terreno e le radici delle colture e agiscono sottraendo spazio ed elementi nutritivi ai funghi patogeni e at- tando per via enzimatica le loro pareti.

Remedier è altresì indicato per prevenire l’ingresso dei funghi responsabili del comples- so dell’esca nelle ferite di potatura della vite.”

L’efficacia del formulato contro Phaeomoniella chlamydospora, uno degli agenti del complesso del mal dell’esca, è stata saggiata in ambienti mediterranei trattando le ferite da potatura. Il trattamento è stato effettuato precedentemente l'inoculazione del patogeno che è avvenuta in concentrazioni superiori a quelle naturali. Nei tre anni delle prove è stata osservata una riduzione delle infezioni con una protezione efficace anche nei mesi successivi all’applicazione del prodotto (Reggiori et al., 2014). La formulazione dei due funghi si è rilevata efficace anche in comparazione con l’utilizzo di isolati non formulati. Liu et al., 2009 hanno riscontrato un’infezione solo del 5% di Pythium ultimum in semenzaio di cetriolo, contro infezioni ben più consistenti su isolati singoli.

I risultati confermano quanto già emerso dalla letteratura e riportato in parte nei precedenti paragrafi, dove sono presenti informazioni circa l’utilizzo delle specie T. asperellum e T. gamsii come biopesticidi e biofertilizzanti Tab. 3. A livello globale sono presenti 18 prodotti commerciali contenenti T. asperellum e 7 contenenti T. gamsii (Woo et al., 2014).

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Tabella 3-Applicazione di T. asperellu e T. gamsii

Specie

e isolato

Pianta

Patogeno

Meccanismo

d’azione-effetti

Applicazione

Efficacia

Autori

T. asperellum

T-203

Cucumis sativus

- Cetriolo Pseudomonas syringae pv. lachrymans

Protezione dell’apparato aereo a seguito dell’induzione di resistenza; rilascio di composti antimicrobici

5 giorni dopo la semina

Fino all’80% di riduzione del danno delle foglie. Riduzione del 100% del patogeno sulla superficie fogliare. (Yedidia et al., 2003) T. asperellum TI e TII Solanum lycopersicum – Pomodoro

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Induzione di resistenza. Alla 2-3 foglia vera. Applicazione

su diversi substrati di crescita.

Riduzione del 27% dell’infeione rispetto al controllo. (Cotxarrera et al., 2002) T. asperellum T34 Solanum lycopersicum – Pomodoro su fuorisuolo

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Competizione per I nutrienti in particolare per il Fe quando questo è presente in condizioni limitate.

Aggiunto su perlite 2 settimane prima della messa a dimora di pomodoro

Le piante inoculate presentano concentrazioni di ferro più elevate e una maggiore resistenza a F.

oxysporum. (Segarra et al. 2010) T. asperellum T34 Cucumis sativus

– Cetriolo Rhizoctonia solani

Micoparassitismo, competizione per i nutrienti e produzione di sostanze antimicrobiche.

Aggiunto al substrato di crescita 2 settimane prima della semina

Riduzione dell’incidenza del damping-off fino al 5%. (Trillas et al., 2006) T. asperellum T203 Hananas comsus - Ananas

Thielaviopsis paradoxa Micoparassitismo.

Applicazione su frutto dopo 10/30 minuti dall’inoculazione del patogeno Assenza di sintomatologia patologica. (Wijesinghe et al., 2010)

T. gamsii 6085 Frumento Fusarium Head Blight (FHB)

Produzione di sostanze antimicrobiche, micoparassitismo e competizione per i nutrienti.

In pieno campo e sui residui vegetali.

Riduzione dell’incidenza della malattia fino al 50%. (Sarrocco et al., 2013) T. gamsii YIM PH30019 Panax notoginseng – Ginseng

Phoma herbarum (YIM PH30340), Fusarium flocciferum (YIM PH30355), Scytalidium lignicola

(YIM PH30094),

e Epicocum nigrum (YIM PH30306)

Micoparassitismo, produzione di sostanze antimicrobiche; biostimolo.

Applicazione in vitro su radice a seguito dell’inoculazione dei patogeni. Applicazione in campo su coltura seminata.

Aumento dell’emergenza rispetto al non trattato, 57% contro 14%. Maggiore resistenza nelle fasi di crescita successive. (Chen et al., 2016) T. gamsii NFCCI 2177 Lens esculenta – Lenticchia

Alternaria alternata (ITCC1920), Cladosporium

oxysporum (ITCC3714), Fusarium oxysporum

(ITCC4219), Fusarium pallidoroseum (ITCC3886),

Fusarium solani (ITCC5017), Pythium afertile

(ITCC4217), e Phomopsis archeri (ARIFCC1445);

Competizione per i nutrienti e produzione

di sostanze antimicrobiche. Co-crescita in piastra.

Riduzione della crescita radiale dei funghi.

(Rinu, Sati and Pandey, 2014)

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T. asperellum ICC012

Inizialmente classificato come T. harzianum I252 e successivamente riclassificato è stato isolato dal terreno soppressivo per Sclerotinia sp. e Sclerotium sp. nel 1987 (Vannacci G. and Pecchia S., unpublished 1987). Per l’isolamento sclerozi di Sclerotinia minor sono stati inoculati all’interno dei suddetto terreno e successivamente, dopo una sterilizzazione superficiale, trasferiti su PDA. I funghi cresciuti dagli sclerozi sono stati isolati e tra questi è stato identificato T. asperellum; l’isolato si è dimostrato capace di esercitare un’attività anatgonistica nei confronti di Sclerotinie sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Sclerotium rolfsii e Botrytis tulipae e ha mostrato una elevata capacità di competizione per i nutrienti rispetto agli altri antagonisti testati. Dal 01/05/2009 T. asperellum ICC012 è stato approvato come fungicida in UE secondo il Reg. (EC) No 1107/2009 ed è presente all’interno del database europeo dei pesticidi. Gli organismi bersaglio sono funghi patogeni del terreno noti come “soil- borne plant-pathogenic fungi” del genere: Pythium spp., Rhizoctonia spp. e Fusarium spp. Le modalità di azione, già citate per il genere Trichoderma nei precedenti paragrafi a cui si rimanda per approfondimento, sono: competizione per i nutrienti ed i siti d’infezione, micoparassitismo, produzione di sostanze antimicrobiche, ISR e promozione della crescita (EFSA, 2013a). Non risulta essere patogeno per l’uomo, vista l’incapacità di crescere a temperature superiori a 35°C, né per altri organismi non bersaglio, ivi compresi insetti e soprattutto api. (EPA, 2010a).

T. gamsii ICC080

Inizialmente classificato come T. viride, questo ceppo è stato isolato, in Sardegna, da Migheli et al. (2009) a seguito di uno studio sulla biodiversità del genere Trichoderma nell’isola. La specie T. gamsii è tra le più rappresentative all’interno dei suoli, in totale 32, analizzati nel- lo studio (Migheli et al., 2009). Dal 01/05/2009 T. gamsii ICC080 è stato approvato come fungicida in UE. Non presenta una specificità d’ospite e risulta attivo verso un ampio numero di funghi, principalmente patogeni che è in grado di contrastare sia per competizione per i nutrienti sia tramite il micoparassitismo (EFSA, 2013b). L’optimum di crescita è a pH 4-5 con una concentrazione di 0.1 M di NaCl. E’ capace di crescere già a 10°C, mentre il limite termico superiore è di 35°C. Non risulta essere patogeno per l’uomo né per altri organismi non bersaglio, ivi compresi insetti e special modo api. (EPA, 2010b).

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Modalità di produzione della biomassa fungina

Le due modalità più diffuse per la produzione di inoculo sono: fermentazione su substrato solido (SSD) o su substrato liquido (LF). Verma et al., 2007 riportano che la combinazione tra le due tecniche fermentative è quella più usata per la produzione industriale; alla LF, con- dotta per 2-3 giorni, segue una SSF effettuata su crusca, riso o melasso.

Il processo produttivo di Remedier è coperto da segreto industriale; tuttavia segue in prin- cipio quanto sopra riportato, partendo da uno specifico brodo di crescita viene fermentato su liquido per 3 giorni a 24°C, dopo di che si ha una fermentazione su solido, melasso di barbabietole, per 3 giorni a 28°C. I due funghi sono accresciuti singolarmente e miscelati in forma di spore al momento del confezionamento (Isagro, comunicazione personale).

Altro fattore importante è l’impiego di coformulanti. In generale, l’attività di biocontrollo di Trichoderma è dipendente dal tipo di formulazione (Verma, Satinder K. Brar, et al., 2007); Inoltre alcuni coformulanti utilizzati per Trichoderma, quali bentonite-vermiculite, sfarinato mais e melasso di canna, hanno mostrato una capacità di biostimolo della crescita vegetale (López-Bucio, Pelagio-Flores and Herrera-Estrella, 2015).

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Scopo del lavoro

Il presente lavoro di tesi ha lo scopo di studiare alcuni dei possibili meccanismi d’azione degli isolati T. asperellum ICC020 e T. gamsii ICC080, principi attivi del prodotto biologico per la difesa Remedier.

Particolare attenzione è stata rivolta alla:

- caratterizzazione metabolica dei due isolati al fine di verificare un’eventuale competizione per nutrienti; - attività di promozione della germinazione e di stimolo della crescita, da parte di Remedier, nei confronti di diverse specie vegetali di interesse in agricoltura, con particolare riferimento ad orticole;

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Materiali e metodi

Isolati fungini

Le prove condotte al fine della valutazione del profilo metabolico degli isolati costituenti il principio attivo di Remedier sono state effettuate utilizzando colture pure di T. asperellum ICC020 e T. gamsii ICC080, già descritti nell’introduzione. I due isolati sono stati mantenuti su PDA, sotto olio minerale, a 4°C ed allevati su PDA a 24°C, 12 ore di alternanza luce/buio.

Le prove in serra, sulle diverse specie di interesse agrario, sono state effettuate utilizzando direttamente il Remedier nella sua formulazione commerciale.

L’isolato di Botrytis cinerea (utilizzato per la messa a punto del sistema di inoculazione artificiale di pomodoro e peperone), gentilmente fornito da ISAGRO S.p.A., è stato allevato in piastre Petri contenenti PDA addizionato di glucosio (60 g/L).

Caratterizzazione metabolica degli isolati fungini principio attivo del Remedier e

valutazione dell’Indice di Sovrapposizione delle Nicchie (NOI)

Il profilo metabolico dei due isolati, T. asperellum ICC020 e T. gamsii ICC080, principio attivo del Remedier, è stato valutato attraverso l'impiego del sistema BIOLOG. La metodologia prevede l’inoculazione di piastre multipozzetto (tipo FF, mostrate in Fig.9) contenenti 96 substrati, 95 fonti diverse di carbonio e acqua, inoculando ciascun pozzetto con 100 L di una sospensione di spore in acqua sterile alla concentrazione di 106 _{spore mL}—1_{. Per ciascun isolato, la sospensione è stata ottenuta da piastre di PDA} allevate fino a sporulazione a 24°C, 12 ore luce/12 ore buio. Sono state allestite 3 repliche biologiche per ogni isolato.

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Figura 9- Fonti di C contenute delle piastre Biolog FF MicroPlateTM. (http://www.biolog.com/pdf/milit/

00A%20010rB%20FF%20Sell%20Sheet%20Mar07.pdf)

Le piastre sono state incubate il camera di crescita a 24°C con alternanza luce/buio di 12 ore. La crescita dei funghi è stata valutata mediante lettura allo spettrofotometro BioRad, alla lunghezza d’onda di 595 nm, effettuando 4 letture giornaliere. La prova è stata considerata terminata quando i valori di densità ottica ottenuti per ciascun substrato sono risultati stazionari.

I valori di OD (ottick density) sono stati utilizzati per creare le curve di crescita per ciascuno dei 96 substrati (95 fonti di carbonio e acqua), mediante l’utilizzo del software Sigmaplot 11.0 e per calcolare i valori di slope (pendenza delle curve) relative alla fase lineare di crescita. Questi valori sono stati utilizzati per creare, per ciascun isolato, una heatmap che ha fornito una fotografia qualitativa della capacità di crescita dei due funghi su ciascuna delle 95 fonti di carbonio. La heatmap è stata creata e visualizzata mediante l’impiego del programma “Heatmap Package” (Kolde, 2015) in R (Chimalakonda, 2012).

I dati utilizzati per descrivere la fase lineare delle curve di crescita su ciascun substrato, per ogni fungo, sono stati utilizzati per l’analisi della varianza della regressione, al fine di confrontare le pendenze delle curve (slope) su ciascun substrato con quella su acqua per individuare quali fossero i substrati su cui ciascun isolato era in grado di crescere in modo significativamente più veloce rispetto all’acqua. L’analisi della varianza della regressione è stata effettuata mediante l’impiego del software GraphPad (CA, USA), assumendo Pslope 0,05 come valore significativo.

Questi risultati sono stati utilizzati per il calcolo del NOI (Indice di Sovrapposizione delle Nicchie).

Il NOI di due individui è generalmente definito come il numero di risorse di carbonio che entrambi sono in grado di utilizzare (Wilson and Lindow, 1994). In ecologia permette di valutare la competizione trofica e