Valutazione della metilazione del promotore del gene

TIME PCR

La valutazione dello stato di metilazione del gene MGMT è stata effettuata mediante un’analisi con PCR quantitativa utilizzando lo strumento ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems).

La Real-Time PCR monitorizza la fluorescenza emessa durante la reazione come indicatore della produzione di amplificati durante ogni ciclo.

Il sistema della Real-Time PCR è basato sull’analisi e la quantificazione di un

reporter fluorescente. Questo segnale aumenta in maniera direttamente

proporzionale alla quantità di prodotto di PCR ad ogni ciclo.

Per l’analisi quantitativa sono state utilizzate delle sonde fluorescenti di tipologia TaqMan che sfruttano l’attività 5’-esonucleasica della Taq polimerasi, per misurare la quantità delle sequenze del target nei campioni di

DNA. Le sonde TaqMan sono oligonucleotidi, più lunghi dei primer e con una temperatura di melting più alta, che contengono un dye fluorescente (reporter) sulla base al 5’ e un dye silenziatore (quencher) sulla base al 3’. Quando irradiato, l’energia emessa dal dye fluorescente eccitato viene captata della vicina molecola di quencher (questo comportamento è definito FRET=

fluorescence resonance energy transfer). La stretta vicinanza del reporter e del quencher previene quindi l’emissione di ogni fluorescenza quando la sonda è

intatta. Le sonde TaqMan sono disegnate per appaiarsi ad una regione interna del prodotto di PCR. (Figura 7).

Figura 7. Appaiamento della sonda TaqMan.

Quando la polimerasi, che duplica un templato arriva alla sonda TaqMan, la sua attività 5’-esonucleasica la digerisce; ciò allontana il dye reporter dal

quencher, il quale comincia ad emettere una quantità di fluorescenza che

aumenta ad ogni ciclo in maniera proporzionale alla percentuale di sonda digerita. (Figura 8).

Figura 8. Funzionamento della sonda TaqMan.

L’accumulo dei prodotti di PCR viene determinato dal monitoraggio dell’aumento della fluorescenza del dye reporter. Poiché il taglio avviene solo se la sonda è legata al target, la fluorescenza rilevata origina solo da amplificati specifici. Il processo di ibridazione e taglio non interferisce con l’accumulo esponenziale di prodotto. Una richiesta specifica per le sonde fluorogeniche è che non ci siano G all’estremità 5’. Una “G” adiacente al dye reporter spegne la fluorescenza del reporter anche dopo il taglio.

Il ciclo soglia (Cycle-Threshold Ct) è il ciclo al quale si osserva il primo significativo aumento della fluorescenza. Il ciclo soglia si verifica quando il sistema di rivelazione inizia a captare un aumento nel segnale associato ad una crescita esponenziale dei prodotti di PCR durante la fase logaritmica-lineare. (Figura 9).

Questa fase ci fornisce le informazioni più utili circa la reazione. Maggiore è la quantità iniziale di DNA, prima verrà rilevato l’aumento di fluorescenza relativo al prodotto accumulato durante la PCR, e più basso sarà il valore di Ct. La scelta del ciclo soglia, che determinerà il valore di Ct, è determinata in modo automatico dalla macchina ma può essere effettuata anche dall’operatore. La coppia di primers e la sonda per lo studio della metilazione del promoter del gene MGMT sono state selezionate sulla base delle sequenze geniche fornite da Gene Bank, utilizzando l’apposito software Methyl Primer Express® 1.0. I primers e la sonda sono stati disegnati secondo i seguenti criteri:

 Localizzazione all’interno di un’isola CpG (i primers devono contenere almeno tre doppiette CpG e un numero massimo di C)

 Vicinanza al sito di inizio trascrizione

 Specificità per il DNA metilato trattato con bisulfito.

In particolare, sono state selezionate coppie di primers che amplificano una regione a cavallo del sito di inizio traduzione. Le sequenze dei primers e della sonda sono le seguenti:

5' TTTGCGTTTCGACGTTCGTA 3' (primer F) 5' ACTCCGCACTCTTCCGAAAA 3 (primer R) 6-FAM-TCGCGGTGCGTATC-MGB (sonda).

Un frammento della -actina privo di regioni CpG è stato amplificato per la normalizzazione dei dati.

Per lo studio di Real time PCR di ogni campione sono state preparate 2 provette, una per MGMT e una per il gene di riferimento β-Actina (ACTB), in cui sono stati posti 7 μl di DNA precedentemente trattato con Sodio-bisulfito,

12,5 μl di TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 μl di

probe 5 µM, 2,25 µl di primer forward (F) 100 µM, 2,25 µl di primer reverse

(R) 100 µM, in modo da ottenere un volume finale di 25 μl.

La TaqMan Universal PCR Master Mix contiene, oltre alla polimerasi AmpliTaq Gold DNA, un’AmpErase uracil-N-glicosilasi (UNG), un pool di deossinucleotidi con deossiuridina trifosfato (dUTP), ed altri componenti del tampone enzimatico opportunamente ottimizzati. La presenza della AmpErase UNG permette di prevenire fenomeni di contaminazione e carry-over (comuni a causa della ripetitività della reazione polimerasica) perché, durante un passaggio di incubazione a 50°C per 2 minuti, l'enzima determina la degradazione di eventuali prodotti di precedenti PCR che contengono dUTP (Tabella 1). La successiva incubazione a 95°C per 10 minuti permette quindi da un lato di inattivare la UNG, e dall'altro di innescare la reazione di PCR per mezzo dell'attivazione della polimerasi e della denaturazione del DNA presente nei campioni.

Tabella 1. Passaggi della reazione di PCR.

Passaggio Incubazione con UNG Attivazione della AmpliTaq Gold CICLO di PCR (40 cicli) Denaturazione Estensione Temperatura 50°C 95°C 95°C 59°C

Tempo 2 min 10 min 15 sec 1 min

Il contenuto delle provette, preparato in duplicato per ciascun campione, è infatti posto mediante piastre da 96 pozzetti nello strumento ABIPRISM 7900HT, che è in grado di riscaldare i campioni alle temperature programmate per ciascuna fase dei 40 cicli della reazione di PCR. In particolare, la fase di denaturazione è effettuata a 95°C per 15 secondi, mentre quella di appaiamento dei primers ed estensione è condotta a 59°C, per 1 minuto. La quantificazione dello stato di metilazione di MGMT è stata valutata rapportandola all’espressione del gene di riferimento interno Housekeeping β-Actina (ACTB).

Poi la stessa analisi quantitativa è stata eseguita su un DNA completamente metilato e standardizzato. Anche in questo caso abbiamo preparato due mix, una per il gene MGMT e una per il gene di riferimento interno β-Actina. In questo modo abbiamo ottenuto dei cicli soglia di riferimento esterni utili per il calcolo del PMR, cioè la percentuale di metilazione del promotore MGMT. Infatti, sulla base del rapporto tra ciclo soglia della β-Actina e ciclo soglia di MGMT, nel campione e nel DNA completamente metilato, è possibile ottenere una stima della percentuale di metilazione del promoter MGMT. La formula impiegata per la valutazione del livello di metilazione (PMR) del gene in studio è la seguente:

(C) campione e (M) DNA completamente metilato.

PMR= (ciclo soglia di MGMT (C)/ ciclo soglia della -actina(C))