Valutazione della localizzazione e dell’infettività di HAdV5 in seguito

all’internalizzazione ed ai trattamenti con NaClO

Per poter indagare la posizione di HAdV5 dopo la co-coltura con A. polyphaga e la disinfezione con NaClO siamo ricorsi alla tecnica di immunofluorescenza diretta, usando IgG di topo anti-adenovirus.

Il protocollo è stato precedentemente spiegato al paragrafo 3.8 ed è la fusione degli esperimenti di co-coltura e delle prove sperimentali di disinfezione di Acanthamoeba; in pratica le amebe sono state messe a contatto con 2 sospensioni virali differenti, in una erano presenti anche i detriti cellulari mentre nell’altra solo virus liberamente sospeso, dopodiché il monostrato è stato staccato dal pozzetto della 24 well, lavato con acqua sterile deionizzata e messo a contatto con diverse concentrazioni di Cl libero. A questo punto, un’aliquota di ogni campione è stata utilizzata per l’indagine al microscopio a

fluorescenza ed un’altra per la valutazione dell’infettività, grazie a titolazione virale TCID50. I nostri risultati con l’immunofluorescenza hanno confermato i dati ottenuti negli esperimenti precedenti (senza la disinfezione), in cui l’internalizzazione del virus è stata osservata solo se adsorbito a particelle nutritive per i trofozoiti. Quindi, la sintomatica fluorescenza verde all’interno delle amebe trattate con il Cl libero è stata visualizzata solo per i trattamenti in cui A. polyphaga è stata co-coltivata con la sospensione virale contenente virus + HeLa (a qualsiasi concentrazione di Cl libero sperimentata, compreso il controllo).

Figura 4.12. A. polyphaga co-coltivata con virus+HeLa e trattata con 5 mg/l di Cl attivo

Figura 4.13. A.poliphaga co-coltivata con virus+HeLa e trattata con 2,5 mg/l di Cl attivo

Figura 4.14. A.polyphaga co-coltivata con virus liberamente sospeso e trattata con 5 mg/l di Cl attivo

Figura 4.15. A. polyphaga co-coltivata con virus liberamente sospeso e non trattata con il Cl attivo

Figura 4.16. A.polyphaga co-coltivata con virus + HeLa e non trattata con Cl attivo Figura 4.17. A.polyphaga co-coltivata con

virus + HeLa e non trattata con Cl attivo

Figura 4.17. A.polyphaga co-coltivata con virus + HeLa e trattata con 5 mg/l di Cl attivo

Per capire se il virus osservato all’interno delle amebe avesse conservato l’infettività è stato valutato il titolo virale con metodo TCID50.

La titolazione virale è stata effettuata con la sospensione ricavata lisando le amebe dopo 4 cicli di congelamento-scongelamento. Abbiamo riscontrato virus infettivo solo se le amebe lisate erano state precedentemente co-coltivate con virus e detriti cellulari, confermando i dati riportati con la tecnica di immunofluorescenza. Inoltre, la quantità di virus presente nel controllo non è significativamente differente rispetto a quella riscontrata nei trattamenti, portandoci ad ipotizzare che il numero di virus adsorbiti sulla parte esterna della membrana dei trofozoiti non sia molto consistente e che i trattamenti con il Cl libero, a qualsiasi concentrazione, non danneggino particolarmente le amebe. Durante le 24 ore di co-coltivazione con adenovirus, le amebe hanno fagocitato particelle proteiche a cui era attaccato il virus, internalizzandolo, ed in seguito quando sono state messe a contatto con il disinfettante l’hanno protetto dalla sua potente azione ossidante, infatti abbiamo rilevato virus infettivi dopo la fagocitosi e la conseguente disinfezione. I valori del titolo virale sono vicini alla soglia minima rilevabile dal metodo di Spearman- Karber per TCID50 e sono simili tra loro, per questo motivo abbiamo intenzione di confrontare i valori ottenuti con la titolazione virale con quelli della Q-PCR, in modo da capire quanto virus è stato internalizzato e di questo quale percentuale ha conservato l’infettività.

Figura 4.16. Titolo di HAdV 5 dopo la lisi dei trofozoiti co- coltivati con la sospensione virale contenete detriti cellulari

5. Conclusioni

La capacità di predazione di Acanthamoeba su altri microrganismi, o la sua abilità ad internalizzarli, dipende da numerosi fattori, come la taglia, il movimento e la struttura molecolare (de Moraes e Alfieri, 2008).

Nel nostro lavoro è stato dimostrato che A. polyphaga non internalizza adenovirus sierotipo 5 liberamente sospeso nell’ambiente.

Le amebe a vita libera fagocitano il virus solo se adsorbito a detriti cellulari o all’interno di cellule; questa scoperta ha delle implicazione nella trasmissione ambientale dei virus, in quanto l’internalizzazione nelle amebe porta ad un’aumentata resistenza ai trattamenti di disinfezione. Infatti, la maggiore suscettibilità al Cl libero di HAdV5 rispetto ad A.

polyphaga è ben documentata in letteratura ed è stata confermata dai risultati dei nostri

esperimenti, eppure, se il virus è internalizzato nei trofozoiti ne abbiamo rilevato l’infettività anche in seguito alla disinfezione.

È stato riportato (Mattana et al., 2006) che se i trofozoiti infettati si incistano, poiché sottoposti a condizioni ambientali sfavorevoli, la resistenza ai trattamenti di disinfezione chimici o fisici viene ulteriormente aumentata ed è stato dimostrato che, dopo un ciclo completo di incistamento-excistamento, coxsackievirus conserva la sua infettività. Il nostro lavoro sottolinea, quindi, che ci sono nuove ed importanti implicazioni per la sicurezza igienica delle acque.

Prossimi studi potrebbero valutare:

 Se Acanthamoeba è in grado di internalizzare il virus adsorbito al biofilm.

 Quanto tempo il virus persiste all’interno del citoplasma ameboide.

 La correlazione ambientale tra Acanthamoeba e Adenovirus attraverso il monitoraggio di campioni d’acqua.

 Eventuali co-infezioni dovute alle amebe a vita libera ed Adenovirus analizzando campioni clinici.

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