Federico Marini*
Dip. Chimica, Università di Roma La Sapienza, P.le Aldo Moro 5, I-00185 Roma, Italia Presenting Author
*federico.marini@uniroma1.it
Riassunto
Le questioni relative al controllo di qualità e alla verifica delle tipicità e della genuinità dei prodotti svolgono un ruolo importante all'interno della chimica degli alimenti. Dal punto di vista analitico, dato che diversi fattori possono determinare la qualità di un alimento, gli approcci per
l'autenticazione dei prodotti si stanno sempre più dirigendo verso l'utilizzo di uno o, meglio, più tecniche di fingerprinting che permettano una caratterizzazione delle merci rapida, spesso non distruttiva e, possibilmente, olistica delle merci. Tuttavia, la complessità delle matrici alimentari fa sì che spesso i segnali registrati siano influenzati dal contributo di diverse fonti di variabilità, non sempre legate alle informazioni richieste.
In questa comunicazione, saranno presentati alcuni approcci chemiometrici innovativi per risolvere i problemi di caratterizzazione ed autenticazione dei prodotti alimentari. Queste strategie
consentono da un lato di ottenere informazioni dettagliate sull'effetto di possibili fonti di variabilità sui segnali sperimentali e dall'altro di costruire modelli matematici affidabili anche nei casi in cui la presenza di queste fonti di variabilità possa comportare la necessità di costruire modelli
matematico-statistici di elevata complessità.
Infine, verrà affrontata la possibilità di ottenere una caratterizzazione quanto più olistica possibile degli alimenti di interesse tramite strategie di fusione dati – che permettano l’integrazione dei profili ottenuti con diverse tecniche strumentali.
Considerazioni analoghe possono essere estese al caso del controllo di qualità dei prodotti farmaceutici, che sarà anche affrontato nella comunicazione.
Introduzione
Le tematiche legate al controllo della qualità delle merci, considerata anche l’ampia accezione rivestita dal concetto stesso di qualità (sicurezza d’uso, assenza di alterazioni/adulterazioni, genuinità, autenticità, capacità di soddisfare il consumatore), rappresentano la maggior parte delle problematiche merceologiche d’interesse sia in ambito alimentare che in ambito farmaceutico. Dal punto di vista analitico, la compresenza di molteplici fattori che concorrano a definire il complesso delle caratteristiche qualitative di una merce si traduce nella necessità di una caratterizzazione della merce stessa che sia quanto più olistica possibile. In questo contesto, la ricerca sempre crescente di approcci che siano in accordo con i paradigmi della green chemistry, ovvero della possibilità di operare in maniera quanto più possibile solvent-free e con metodi rapidi, economici e, soprattutto, non-invasivi/non-distruttivi, fa delle tecniche spettroscopiche (in particolare, nella regione
dell’infrarosso) lo strumento d’elezione per affrontare i problemi di autenticazione delle merci. Tuttavia, in ambito alimentare e farmaceutico, la complessità delle matrici in esame, unita alla limitata selettività delle tecniche spettroscopiche, fa sì che spesso i segnali registrati siano influenzati dal contributo di diverse fonti di variabilità, non sempre legate alle informazioni richieste.
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Sulla base di queste considerazioni, nella presente comunicazione, saranno presentati alcuni approcci chemiometrici innovativi per risolvere i problemi di caratterizzazione ed autenticazione dei prodotti alimentari e farmaceutici. Da un lato, saranno descritte strategie che permettano di ottenere informazioni dettagliate sull'effetto di possibili fonti di variabilità sui segnali sperimentali, attraverso l’elaborazione multivariata di dati raccolti secondo un opportuno disegno sperimentale. Dall'altro, sarà mostrato come sia possibile costruire modelli matematici affidabili anche nei casi in cui la presenza delle suddette fonti di variabilità possa comportare la necessità di ricorrere ad approcci più complessi della “semplice” relazione lineare tra i predittori e le risposte d’interesse. Infine, verrà affrontata la possibilità di ottenere una caratterizzazione quanto più olistica possibile dei prodotti in esame tramite strategie di fusione dati – che permettano l’integrazione dei profili ottenuti con diverse tecniche strumentali.
Materiali e Metodi
In questa comunicazione saranno presentati diversi esempi tratti dalle ricerche recenti dell’autore. Dal punto di vista strumentale, tutti i campioni sono stati analizzati con uno spettrometro NIR a trasformata di Fourier Thermo Nicolet 6700 equipaggiato con una sfera integratrice ed un rivelatore
InGaAs, raccogliendo 82 scansioni nell’intervallo 4000-10000 cm-1 alla risoluzione nominale di 4
cm-1. Di seguito, sono riportate le caratteristiche delle diverse matrici alimentari e farmaceutiche
analizzate.
Pasta. Campioni di pasta sono stati preparati nel nostro laboratorio, mescolando farina di grano
duro, uova e, quando necessario per migliorare la lavorazione della pasta, acqua. L’impasto è quindi stato tagliato per ottenere la forma desiderata (fettuccine) e i campioni sono stati essiccati in forno a temperatura controllata. Siccome eravamo interessati a sviluppare un metodo affidabile per la quantificazione del contenuto di uovo, i campioni sono stati preparati a diverso contenuto percentuale di uova (20.25%, 22.53%, 25.15%, 27.00%, 29,92%, 33,50%), nell’intervallo di valori normalmente utilizzato dai produttori industriali.
Allo stesso tempo, per verificare l’effetto dei fattori produttivi sul segnale sperimentale, diversi tempi di essiccazione (4, 6 e 8 ore) e temperature (40, 52, e 65? C) sono stati utilizzati per la preparazione, secondo un disegno fattoriale completo multi-livello.
Caffè. Trenta campioni (circa 80 g ciascuno) di chicchi di caffè verde (20 Arabica e 10 Robusta)
provenienti da diverse origini geografiche sono stati gentilmente forniti dall’Agenzia delle Dogane italiana. Ogni campione è stato tostato in laboratorio a differenti condizioni, in modo da riprodurre il più fedelmente possibile il processo industriale. In particolare, sulla base di alcuni esperimenti preliminari e della letteratura, si è deciso di lavorare ad una temperatura fissa di 180 ° C e considerare il tempo di tostatura come unico fattore da controllare (a quattro livelli: 0 min – ovvero, caffè verde, 25 min, 50 min e 75 min).
Birra. 60 campioni di birra provenienti da diversi produttori sono stati raccolti per lo
studio. In particolare, 31 campioni provenivano da Birra del Borgo (Borgorose,
Italia), il birrificio artigianale di interesse e i restanti 29 erano rappresentativi di diversi produttori in Italia e nel resto d’Europa. Delle 31 birre da Birra del Borgo, 19 campioni sono stati di "Reale" che è considerata la birra di bandiera del birrificio e la cui autenticazione è stato lo scopo principale della ricerca, mentre gli altri 12 erano rappresentativi del resto della loro produzione.
L-Dopa. Sono state preparate, a partire dal solido racemico e dall’enantiomero puro (L-DOPA), 33 miscele a composizione nota e differente che coprissero l’intero intervallo di eccesso
enantiomerico. Queste miscele sono state, successivamente, separate in due gruppi: il primo, contenente 21 campioni, per la costruzione e l’ottimizzazione del modello e per la scelta del pretrattamento spettrale più adatto (“training set”); il secondo, contenente 11 campioni, per
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verificare la capacità predittiva (e quindi l’affidabilità) del modello ottenuto su campioni incogniti nella fase di validazione esterna (“test set”).
Risultati e Discussione
Pasta. La ricerca [1] ha avuto come oggetto la possibilità di sviluppare un metodo che consentisse
di determinare in maniera rapida, semplice ed economica il contenuto di uovo in pasta all'uovo secca, usando la spettroscopia nel vicino infrarosso accoppiata alla chemiometria. Tuttavia, siccome è molto probabile che l'impronta digitale spettroscopica possa essere influenzata dalle caratteristiche del processo di fabbricazione del prodotto, in particolare, dalla temperatura e dalla durata dell’essiccazione, l'effetto del processo di lavorazione sul profilo spettrale di campioni di pasta all'uovo è stato oggetto di studi approfonditi, utilizzando un disegno sperimentale fattoriale accoppiato ad una tecnica analitica esplorativa multivariata chiamata ANOVA-Simultaneous Component Analysis (ASCA). L’utilizzo di ASCA ha dimostrato che tutti e tre i fattori (tempo, temperatura e tenore di uovo) e un’interazione binaria (temperatura/concentrazione) hanno un effetto statisticamente significativo sul segnale. In particolare, è stato evidenziato come la regione intorno a 1400 nm e gli intervalli 1600-1700, 1800-2000 e 2200-2400 nm siano le frequenze spettrali più interessate. Successivamente, l'uso di un metodo localmente lineare, ovvero locally weighted PLS (LWR-PLS), per costruire un modello di calibrazione per la quantificazione del contenuto di uovo, ha permesso di affrontare le possibili non linearità derivanti, per esempio, dall'interazione tra la concentrazione e la temperatura evidenziata da ASCA. Infatti, l'uso di LWR- PLS ha portato ad un’ottima capacità predittiva, valutata su un test set esterno (assenza di errore sistematico e RMSEP = 1.25) significativamente migliore di quella risultante dall’utilizzo di un modello globalmente lineare, come PLS (RMSEP> 1.7) o da altri lavori di letteratura.
Caffè. In questo studio [2], si è investigata la possibilità di verificare i cambiamenti indotti sui
chicchi di caffè da differenti condizioni di tostatura. In particolare, dal momento che sono stati analizzati campioni dalle due principali specie di interesse commerciale, Arabica e Robusta, è stato anche possibile verificare se ci potessero essere delle differenze nel comportamento di torrefazione delle due varietà. L’elaborazione dei NIR dati con l'analisi ASCA ha permesso di affermare che sia il fattore "specie" e che quello "tempo di torrefazione”, e la loro interazione binaria influenzino significativamente il profilo spettrale. In particolare, nel caso di tempo di tostatura (anche tenendo in considerazione l’interazione) sono state evidenziate due principali tendenze longitudinali: quella principale (che dà conto di quasi tutta la varianza osservata) corrispondente ad una variazione monotona, cioè un impoverimento o arricchimento progressivo in sostanze specifiche man mano che aumenti il tempo di tostatura, e un secondo contributo minore, che potrebbe essere ascritto alla formazione di intermedi.
Avendo verificato un effetto significativo della specie sul fingerprint strumentale, nell'ultima parte della ricerca è stata affrontata la possibilità di costruire modelli di classificazione per l'autenticazione dell'origine varietale dei campioni di caffè. Utilizzando l'approccio discriminante (PLS-DA), il miglior pretrattamento (derivata prima) ha portato ad un tasso di previsione corretta sul test set esterno del 100% per i campioni Arabica e di 95% per i Robusta. D'altra parte, quando si è applicato un approccio modellante (utilizzando SIMCA), i valori di sensibilità e specificità ottenuti per entrambe le classi (con SNV + derivata prima nel miglior pretrattamento) sono risultati molto elevati (92.5% e 95.8%, rispettivamente, per Arabica e 76.7% e 95.5% per Robusta in validazione esterna).
Birra. In questo studio [3], si è voluto dimostrare il potenziale di un approccio di fingerprinting
strumentale multipiattaforma mediante termogravimetria e quattro tecniche spettroscopiche (MIR, NIR, UV e VIS) per caratterizzare una birra artigianale italiana ad alto valore aggiunto (Reale di Birra del Borgo) e differenziarla da altri concorrenti di qualità inferiore. In particolare, è stato dimostrato come l'autenticazione della birra Reale possa essere effettuata con un’accuratezza
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relativamente buona utilizzando ciascuna delle impronte digitali registrate per caratterizzare il campione. D'altra parte, è stato dimostrato anche che, considerando che i nessuno dei modelli individuali costruiti sui profili registrati con le diverse tecniche strumentali poteva permettere una perfetta classificazione di tutti i campioni, l'uso di una strategia di fusione dei dati porta ad un miglioramento significativo della capacità predittiva; in particolare, utilizzando la mid-level data fusion, che ha dimostrato di essere il miglior protocollo di fusione, è stato possibile ottenere il 100% corretta classificazione su tutte le birre sia del training che del test set.
L-Dopa. In questo lavoro è stata esplorata la possibilità di quantificare l’eccesso enantiomerico di
un principio attivo chirale (L-DOPA, un precursore dei neurotrasmettitori dopamina, norepinefrina e epinefrina utilizzato nel trattamento del morbo di Parkinson) tramite spettroscopia nel vicino e medio infrarosso realizzando modelli di regressione tramite l’algoritmo PLS (Partial Least Squares). In particolare, si è proceduto in primo luogo calcolando i modelli individuali a partire dai dati delle singole tecniche (ottenendo quindi un modello per il vicino infrarosso e un altro modello per il medio infrarosso) e, successivamente, integrando le informazioni presenti nei due blocchi tramite una tecnica di fusione dei dati spettrali (la Mid Level Data Fusion), ovvero costruendo un unico modello di regressione partire dagli scores estratti dalle due matrici dei dati.
Per gli spettri registrati al MIR, il pretrattamento ideale è risultato essere l’applicazione della derivata prima ed SNV (un algoritmo di riduzione del rumore spettrale) allo spettro trasformato in assorbanza: per quanto riguarda il NIR, l’applicazione della derivata seconda allo spettro trasformato in pseudo-assorbanza ha dato risultati molto promettenti.
Infine si è voluto migliorare ulteriormente i risultati ottenuti applicando ai due modelli di regressione un algoritmo di Data Fusion, con lo scopo di ottenere un modello di predizione realizzato a partire dai dati di entrambe le tecniche. In questo lavoro la tecnica di Data Fusion utilizzata è stata il “Mid Level”, che consiste nella realizzazione del modello a partire da una matrice di dati ottenuta concatenando gli scores dei modelli delle singole tecniche piuttosto che utilizzando gli spettri tal quali. I risultati ottenuti mostrano precisione e affidabilità superiori alle singole tecniche, a dimostrazione dell’utilità di processi chemiometrici multisensoriali.
Conclusioni
I risultati descritti in precedenza mostrano come approcci chemiometrici avanzati, accoppiati a tecniche strumentali rapide, economiche e non-invasive/non-distruttive, come la spettroscopia infrarossa, permettano di affrontare con successo problematiche anche molto complessi in ambito alimentare e farmaceutico.
Bibliografia
1. M. Bevilacqua, R. Bucci, S. Materazzi, F. Marini (2013) Application of near infrared (NIR)
spectroscopy coupled to chemometrics for dried egg-pasta characterization and egg content quantification. Food Chemistry, 140, 726-734.
2. S. De Luca, M. De Filippis, R. Bucci, A.D. Magrì, A.L. Magrì, F. Marini (2016)
Characterization of the effects of different roasting conditions on coffee samples of different geographical origins by HPLC-DAD, NIR and chemometrics. Microchemical Journal, 129, 348-
361.
3. A. Biancolillo, R. Bucci, A.L. Magrì, A.D. Magrì, F. Marini (2014) Data-fusion for
multiplatform characterization of an italian craft beer aimed at its authentication. Analytica
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