6. RISULTATI
6.3 RISULTATI DELL'INFEZIONE CON TOXOPLASMA GONDII
6.3.1 Western blot
La tecnica western blot è stata impiegata anche per verificare i livelli di produzione dell'enzima GSTO1 nella linea cellulare U937 a seguito di infezione con tachizoiti di Toxoplasma gondii, con il seguente rapporto 1:5 (cellula:tachizoiti). Nella figura sottostante sono riportati i risultati riguardanti le cellule U937 a seguito di 24 e 72 ore di trattamento.
Figura 9. Immunoblot su lisati di cellule U937 infettate con Toxoplasma gondii per 24 e 72 ore, incubati con
anticorpo policlonale specifico per GSTO1 e actina. Nel grafico a barre sottostante sono riportati i dati dell'analisi densitometrica eseguita con programma "Fiji ImageJ", espressi come media percentuale +- SD e la significatività delle differenze è stata analizzata tramite il T-Test. *p<0.0001. I valori sono stati normalizzati con l'actina ed espressi come percentuale del controllo considerando il controllo il 100%.
Toxoplasma + - + -
GSTO1
actina
24hrs 72hrs*
*
D en si tà o tt ic a re la ti va %I risultati ottenuti, figura 9, mostrano un effettivo incremento dei livelli di produzione di GSTO1 nelle cellule U937 nei trattati rispetto ai relativi controlli, sia a 24 che a 72 ore dall'infezione con Toxoplasma gondii. Tali risultati sono stati confermati mediante analisi densitometrica e i dati riportati nel grafico a barre sottostante all'immunoblot.
Nella figura sottostante, figura 10, sono mostrati i toxoplasmi (indicati con le freccie) nelle cellule U937, le quali sono state citocentrifgate e quindi colorate con ematossilina-eosina, dopo 24 e 72 ore di trattamento con Toxoplasma gondii.
Figura 10. Colorazione con ematossilina/eosina di cellule U937 citocentrifugate dopo 24 e 72 ore
dall'infezione con Toxoplasma gondii. La freccia indica i toxoplasmi in ingrandimento.
6.3.2 Proliferazione cellulare
Al fine di valutare se l'infezione con T. gondii inducesse una proliferazione cellulare delle linee cellulari U937, Jurkat e i due cloni HeLa (HeLaGSTO1+ e HeLaCont) le cellule sono state contate alla fine del periodo di incubazione con il parassita (24 h).
Figura 11. Proliferazione cellulare: effetto del trattamento effettuato infettando con Toxoplasma gondii cellule
U937, Jurkat, HeLaGSTO1+ e HeLaCont. Le cellule sono state colorate con Trypan Blue e contate in camera di Burker. Il controllo non trattato è stato considerato il 100% della crescita. I dati sono espressi come media percentuale rispetto al controllo +- SD e la significatività delle differenze è stata analizzata tramite T-test. *p<0.0001.
Il grafico riportato in figura 11, mostra come sia le cellule U937 che le cellule Jurkat abbiamo un aumento significativo di proliferazione a seguito di infezione con Toxoplasma gondii.
Abbiamo anche valutato la percentuale di cellule morte, che nelle cellule U937 corrisponde ad un 20%, mentre nelle cellule Jurkat corrisponde all'incirca al 15%.
Viceversa nei due cloni HeLa non si osserva aumento di proliferazione cellulare indotta da trattamento, anzi si può osservare una elevata percentuale di morte cellulare dopo 24 ore di trattamento, che corrisponde all'incirca al 90%.
6.3.3 Immunoflorescenza
La tecnica di immunoflorescenza è stata effettuata sulle cellule U937 ed il clone HeLaCont, a seguito di infezione con Toxoplasma gondii per 24 ore.
La metodica di colorazione delle U937 è stata effettuata con diverse metodiche (vedere sez. Materiali e metodi, paragrafo 5.5.6.2) poichè essendo cellule che crescono in sospensione devono essere trasferite su vetrino. In una prima prova le cellule sono state prima citocentrifugate e poi colorate, ma al termine della procedura non c'erano più cellule attaccate al vetrino. Abbiamo provato poi, a includere il pellet cellulare in paraffina ma si perde nelle spugnette di raccolta. Abbiamo, infine,effettuato la colorazione sulle cellule in sospensione centrifugando al termine di ogni passaggio e facendo la citocentrifuga su vetrino dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario. Con questa metodica siamo riusciti a osservare alcune cellule anche se la maggior parte di esse si sono associate in agglomerati osservabili nel riquadro piccolo della fig. 12.
U937
HeLaCont
Controllo Toxoplasma
Figura 12. Immunoflorescenza. Microscopia a fluorescenza su ingrandimenti di cellule U937 e HeLaCont
infettate per 24 ore con Toxoplasma gondii. Nel riquadro piccolo sono mostrati gli agglomerati di cellule U937 che si formano durante la procedura che prevede prima la colorazione e in seguito citocentrifugazione.
Come si può osservare nella figura 12, l'enzima GSTO1 trasloca a livello nucleare, rispetto alla sua normale localizzazione citoplasmatica, a seguito dell'infezione in entrambe le linee cellulari. Nel riquadro piccolo, inoltre, si notano agglomerati di cellule U937, i quali si formano durante la metodica che prevede prima la colorazione delle cellule e seguentemente la loro citocentrifuga.
7. DISCUSSIONE
Le glutatione transferasi (GST) citosoliche umane rappresentano la famiglia più ampia ed eterogenea di GST. Si suddividono in sette classi, di cui la classe omega (GSTO) è quella di più recente identificazione (Board et al. 2000). Nell'uomo esistono due forme di GSTO: GSTO1 e GSTO2.
Le GSTO mostrano caratteristiche assai peculiari: sono prive di attività glutatione transferasica, ma sono dotate di altre attività enzimatiche, quali l'attività tioltransferasica, deidroascorbato reduttasica e monometil e dimetilarseniato reduttasica.
Precedenti studi (Bruschi et al. 2003) hanno dimostrato che i livelli di produzione della GSTO1, normalmente bassi nel tessuto muscolare scheletrico, risultavano elevati all'interno della cosiddetta NC, ossia la fibrocellula muscolare scheletrica che si è modificata nel fenotipo, dopo l'invasione da parte della larva newborn del nematode Trichinella spiralis e all'interno della quale il parassita sopravvive e cresce.
A seguito di tali osservazioni, sono stati effettuati anche studi di ibridazione in situ che hanno dimostrato come ci sia un progressivo aumento dei livelli di mRNA della GSTO1 nella NC all'aumentare dei giorni d'infezione (15,28 e 60 giorni) (Piaggi et al. in preparazione).
Partendo da tali risultati è stato valutato tramite tecniche immunoistochimiche quali fossero i livelli di produzione della GSTO1 al progredire dei giorni d'infezione.
I risultati hanno dimostrato che la GSTO1, all'interno della NC, aumenta rispetto al tessuto circostante già a 15 giorni d'infezione e rimane alta anche a 28 e 60 giorni, confermando quindi, i precedenti risultati ottenuti con l'ibridazione in situ.
AKT, responsabile della sopravvivenza delle cellule, e all'inibizione della via di JNK, generalmente coinvolta nell'induzione dell'apoptosi (Piaggi et al. 2010). I risultati ottenuti mostrano che, sovra-esprimendo la GSTO1, sia mediante transfezione stabile di cellule in coltura con il cDNA della GSTO1, sia mediante variazioni di densità cellulare (dato che l'espressione di GSTO1 è densità-dipendente), le cellule HeLa sono protette dalla tossicità del cisplatino in entrambi i modelli sperimentali. La protezione più elevata è stata riscontrata alla dose di cisplatino 20 µM; in queste condizioni si osserva l'80% di sopravvivenza nelle cellule che sovra-esprimono la GSTO1 rispetto al 20% nei controlli non transfettati e a bassa densità. Questi risultati sono ulteriormente confermati se le cellule vengono transfettate con GSTO1 siRNA, che degrada in modo selettivo l'mRNA endogeno della GSTO1, determinando di conseguenza un decremento dei livelli di espressione della proteina; in queste condizioni diminuisce la sopravvivenza cellulare a 24 ore di trattamento con il cisplatino in maniera dose-dipendente (Piaggi et al. 2010).
Abbiamo quindi valutato, tramite immunoistochimica, i livelli di fosforilazione di AKT e JNK, nella NC, sempre a 15, 28 e 60 giorni dall'infezione con Trichinella spiralis. I risultati mostrano che i livelli di fosforilazione di AKT aumentano progressivamente all'aumentare dei livelli di espressione della GSTO1 e, quindi, all'aumentare dei giorni di infezione.
L'aumento dei livelli di fosforilazione di AKT nella NC è stato descritto in topi knock out per il gene RAG1 (sono ablati di cellule B e T) anche da Huang et al, 2015.
In particolare, gli autori hanno osservato un aumento del trasportatore del glucosio GLUT4 e un aumento dei livelli di fosforilazione di AKT a 13 giorni d'infezione.
Relativamente ai livelli di fosforilazione di JNK, noi abbiamo osservato un inziale incremento dei suoi livelli di fosforilazione a 15 giorni di infezione, che diminuiscono al progredire dei giorni di infezione, ossia a 28 e 60 giorni.
Dato che AKT fosforilata ha un ruolo anti-apoptotico, un aumento dei suoi livelli di fosforilazione nella NC, potrebbe indicare una possibilie strategia adottata dal parassita per far soppravvivere la nurse cell, dove esso può crescere. Tale dato è supportato anche dall'osservazione che i livelli di JNK fosforilato diminuiscono al progredire dei giorni d'infezione. Questi risultati sono in accordo con precedenti studi che hanno esaminato il processo apoptotico all'interno della NC, analizzando l'espressione di geni pro-apoptotici e anti-apoptotici durante la formazione del nuovo fenotipo di cellula invasa da Trichinella spiralis (Boonmars et al. 2004).
In particolare è stato osservato che l'espressione dei geni mitocondriali legati all'apoptosi (proteina X associata al Bcl-2, apoptotic protease activating factor 1, Caspasi 9 e serina/treonina protein chinasi=PKB), è aumentata nel muscolo infettato da T. spiralis durante il processo di incapsulamento. Questi risultati sono stati confermati mediante reverse transcription polymerase chain reaction, effettuata previa microdissezione del complesso NC-parassita, che ha consentito di localizzare l'aumento dell'espressione proprio a livello della NC. Le indagini immunoistochimiche hanno evidenziato che i fattori pro-apoptotici (BAX, Apaf-1 e Caspasi 9) sono particolarmente presenti nel citoplasma basofilo (che corrisponde alla cellula muscolare infettata), mentre il fattore anti-apoptotico PKB nel citoplasma eosinofilo (che deriva dalle cellule satelliti) della NC. Questi risultati suggeriscono che la cellula muscolare infettata si trasforma per poi morire per un processo apoptotico, innescato da fattori derivati dai neoprodotti mitocondriali. Il fattore anti- apoptotico potrebbe aiutare la componente citoplasmatica eosinofila della NC a sopravvivere per poter garantire la funzione di cellula nutrice.
Per verificare il significato dei risultati ottenuti in vivo, e verificare l'effetto dei prodotti ES sulle cellule dell'ospite sono stati effettuati esperimenti in vitro, utilizzando ES di T. spiralis su differenti linee cellulari: cellule U937 e due distinti cloni HeLa: i) HeLa/GSTO1+, che
sovraesprime la GSTO1 e, ii) HeLaCont, clone di controllo che non sovraesprime la GSTO1. Tale trattamento aveva lo scopo di valutare se l'ES aveva degli effetti di up- regolazione della GSTO1 e di alcune MAP-chinasi, come è stato appunto osservato in vivo.
Per quanto riguarda il trattamento sulle cellule U937 abbiamo valutato i livelli di GSTO1 e delle seguenti MAP-chinasi: ERK1/2, AKT e JNK a seguito di 24, 48 e 72 ore di trattamento. I risultati indicano che i livelli di GSTO1 sono più alti nei trattati rispetto ai controlli ad ogni tempo. Anche i livelli di fosforilazione di ERK1/2 aumentano in seguito al trattamento con ES ad ogni tempo analizzato. Dato che ERK1/2 è una MAP-chinasi coinvolta in processi proliferativi, il risultato ottenuto potrebbe quindi confermare che le cellule U937 proliferino a seguito di trattamento con ES.
AKT, invece, mostra una lieve attivazione a 48 e 72 ore, ma non si notano differenze tra trattamento con ES e controllo.
Per quanto riguarda JNK si può osservare un lieve aumento dei livelli di fosforilazione nel controllo a 72 ore di trattamento ed un aumento molto marcato dei livelli di fosforilazione nel trattato con ES sempre a 72 ore di trattamento. L'aumento di JNK fosforilato potrebbe verosimilmente non dipendere dal trattamento con ES ma dal fatto che a 72 ore di incubazione il numero delle cellule sia diventato troppo elevato.
Per quanto riguarda il trattamento con ES sul clone HeLaCont, abbiamo valutato i livelli di GSTO1 a seguito di 24 ore di trattamento. Il risultato indica un lieve incremento dei suoi livelli.
Successivamente, abbiamo trattato i due cloni HeLa: HeLaGSTO1+ e HeLaCont, con ES per 24 ore, per poter quindi verificare se vi fossero delle differenze tra i due cloni per quanto riguarda i livelli di GSTO1 e JNK fosforilata a seguito del trattamento. I risultati mostrano, ovviamente, livelli maggiori di GSTO1 nel clone HeLaGSTO1+, il quale
sovraesprime la proteina, rispetto al clone di controllo HeLaCont. In entrambi i cloni si può notare un aumento dei livelli di GSTO1 nel trattato rispetto al relativo controllo, confermando quindi che il trattamento induce un aumento di espressione della GSTO1. Per quanto riguarda JNK si può osservare invece che i livelli di fosforilazione sono più alti nelle cellule HeLaCont rispetto alle cellule HeLaGSTO1+ ma non variano dopo il trattamento con ES.
Inoltre ES è risultato capace di stimolare la proliferazione cellulare, in particolare con le cellule Jurkat ed U937, alla più alta concentrazione di ES impiegata. Questi risultati confermano l'attività stimolante la proliferazione cellulare da parte di ES ottenuti su altre linee cellulari come mioblasti murini (Bai et al. 2012). In questo studio i prodotti ES di larve muscolari di T. spiralis sono risultati capaci di promuovere la proliferazione dei mioblasti in maniera dose-dipendente e di aumentare l'espressione del regolatore del ciclo celluare ciclina D1, come pure dell'antigene nucleare della cellula in proliferazione.
Per contro, questi prodotti sono risultati capaci di inibire il differenziamento cellulare con una riduzione dei livelli della catena pesante della miosina e dell'espressione di fattori di trascrizione muscolo-specifici (MyoD e miogenina) come pure della p21. I prodotti ES sono risultati inibenti la fosforilazione della p38 MAPK nei mioblasti in corso di differenziazione. Al fine di valutare il processo di proliferazione cellulare è stato utlizzato il saggio di proliferazione WST-1 su cellule Jurkat, U937 ed il clone HeLaCont, con dosi crescenti di ES (1 μg/ml, 10 μg/ml e 50 μg/ml).
I risultati dell'incubazione con ES delle diverse linee cellulari mostrano che a basso dosaggio, 1 μg, vi è un aumento di proliferazione significativo solo nelle cellule Jurkat; mentre ad alto dosaggio (50 μg) si ha un aumento di proliferazione significativo sia nelle cellule Jurkat che nelle U937. Al contrario nel clone HeLaCont la percentuale di proliferazione cellulare non varia di molto rispetto al relativo controllo.
Lo studio del ruolo della GSTO1 è stato poi esteso anche ad un'altro modello d'infezione parassitaria ossia Toxoplasma gondii, che permette di realizzare studi d'infezione in vitro. Allo scopo di valutare se, come con il trattamento con ES, si osservasse proliferazione cellulare indotta dall'infezione con Toxoplasma gondii, abbiamo infettato le linee cellulari U937, Jurkat e i due cloni HeLa (HeLaGSTO1+ e HeLaCont), per 24 ore a tachizoiti di T. gondii. I risultati mostrano come sia le cellule U937 che le cellule Jurkat abbiano un significativo aumento di proliferazione a seguito di infezione con Toxoplasma gondii. La percentuale di cellule morte nelle cellule U937 corrisponde ad un 20%, mentre nelle cellule Jurkat corrisponde all'incirca al 15%.
Viceversa nei due cloni HeLa non si osserva aumento di proliferazione cellulare indotta dal trattamento, anzi si può osservare una elevata percentuale di morte cellulare dopo 24 ore di trattamento, che corrisponde all'incirca al 90% . Tali risultati ottenuti sono in linea con quelli osservati nel trattamento con ES , in entrambi i casi vi è un aumento di proliferazione nelle cellule U937 e Jurkat, ma non nelle cellule HeLa.
Successivamente sono state infettate le cellule U937 con T. gondii per valutare i livelli di GSTO1 a 24 e 72 ore dall'infezione, tramite WB.
I risultati ottenuti mostrano un effettivo incremento dei livelli di GSTO1 nelle cellule U937 nei trattati rispetto ai relativi controlli, sia a 24 che a 72 ore dall'infezione con Toxoplasma gondii. Quindi anche il trattamento con Toxoplasma gondii induce un aumento dei livelli di GSTO1 nella linea cellulare U937.
E' noto che Toxoplasma gondii protegga differenti tipi cellulari dall'apoptosi indotta da vari stimoli (Goebel et al. 2001; Keller et al. 2006). E' stato dimostrato un aumento dei livelli di espressione della heat shock protein 65 che correlano con un aumento della resistenza all'apoptosi in macrofagi peritoneali di topo infettati dal parassita (Hisaeda et al. 1997). La proteina anti-apoptotica A1, membro della famiglia di Bcl-2, è sovraespressa nei
macrofagi in seguito all'infezione con T. gondii (Orlofsky et al. 1999). Il parassita è inoltre in grado di inibire il rilascio del citocromo c e la successiva attivazione delle caspasi così come sembra in grado di alterare i livelli di espressione della proteina PARP (Goebel et al. 2001).
T. gondii sembra quindi aver evoluto diverse strategie per impedire l'apoptosi delle cellule, i meccanismi molecolari alla basa di tale protezione non sono stati ancora completamente chiariti e la sovraespressione della GSTO1 potrebbe quindi far parte di tali meccanismi. Tramite immunoflorescenza abbiamo inoltre osservato che infettando con Toxoplasma gondii, per 24 ore, le cellule U937 e il clone HeLaCont, l'enzima GSTO1 trasloca a livello nucleare. La GSTO1 è un enzima citosolico che però in alcune condizioni può traslocare nel nucleo. La traslocazione è considerata un marker di progressione neoplastica dell'esofago di Barrett e pure lo shock termico induce traslocazione nucleare della GSTO1 (Piaggi et al. 2009).
I nostri risultati mostrano per la prima volta la traslocazione nucleare dell'enzima in cellule infettate da un protozoo. Il significato biologico della traslocazione nucleare della GSTO1 è al momento sconosciuto, studiarne il ruolo dell'infezione con T. gondii sarà oggetto del prosieguo della ricerca.
Attualmente lo studio sta proseguendo e stiamo valutando, tramite metodica EMSA, se vi sia un'attivazione del fattore di trascrizione nuclare NF-kB , nelle cellule U937 e sui due cloni HeLa a seguito di infezione con Toxoplasma gondii.
8. CONCLUSIONI
In base ai risultati ottenuti, sia a seguito di studi condotti in vivo che studi in vitro, si può, quindi, osservare che i livelli di espressione dell'enzima GSTO1 aumentano a seguito di infezioni parassitarie sostenute sia da un nematode intracellulare come T. spiralis che da un protozoo quale T. gondii. Inoltre, a seguito della sua aumentata espressione, l'enzima sembra coinvolto nella regolazione dei livelli di fosforilazione di alcune MAP-chinasi, che sono implicate in processi cellulari di fondamentale importanza, come soppravvivenza, apoptosi e prolifezione cellulare.
Altro dato importante riguarda l'aumento di proliferazione cellulare nelle linee U937 e Jurkat a seguito di infezione con Toxoplasma gondii e a seguito del trattamento con ES fresco di Trichinella spiralis.
Infine risultato sicuramente interessante, in quanto mai osservato in altri modelli di infezione parassitaria, è la traslocazione a livello nucleare della GSTO1, a seguito di infezione con Toxoplasma gondii sulla linea cellulare U937 e sul clone HeLaCont. Il motivo di tale traslocazione nucleare non è attualmente noto, e sarà oggetto di indagini future.
BIBLIOGRAFIA
Allen M, Zou F, Chai HS, Younkin CS, Miles R, Nair AA, Crook JE, Pankratz VS, Carrasquillo MM, Rowley CN, Nguyen T, Ma L, Malphrus KG, Bisceglio G, Ortolaza Al, Palusak R, Middha S, Maharjan S, Georgescu C, Schultz D, Rakhshan F, Kolbert CP, Jen J, Sando SB, Aasly JO, Barcikowska M, Uitti RJ, Wszolek ZK, Ross OA, Petersen RC, Graff-Radford NR, Dickson DW, Younkin SG, Ertekin-Taner N. (2012). Glutathione S- transferase omega genes in Alzheimer and Parkinson disease risk, age-at-diagnosis and brain gene expression: an association study with mechanistic implications. Mol Neurodegener. 7(1):13.
Appleford P J, Smith J E (1997). Toxoplasma gondii : the growth characteristics of three virulent strains. Acta Trop. 65:97-104.
Auron PE, Webb AC, Rosenwasser LJ, Mucci SF, Rich A, Wolff SM, Dinarello CA. (1984). Nucleotide sequence of human monocyte interleukin 1 precursor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81(24):7907-11.
Bai X, Wu X, Wang X, Liu X, Song Y, Gao F, Miao Y, Yu L, Tang B, Wang X, Radu B, Vallee I, Boireau P, Wang F, Zhao Y, Liu M. (2012). Inhibition of mammalian muscle differentiation by excretory secretory products of muscle larvae of Trichinella spiralis in vitro. Parasitol Res. 110(6): 2481-90.
Bhakdi S, Muhly M, Korom S, Schmidt G (1990). Effects of Escherichia coli hemolysin on human monocytes. Cytocidal action and stimulation of interleukin 1 release. J Clin Invest.
85(6):1746-53.
Bianchi J, Rose RC. (1986). Dehydroascorbic acid and cell membranes: possible disruptive effects. Toxicology. 40(1):75-82.
Board P. G., Coggan M., Chelvanayagam G., Easteal S., Jermiin L.S., Schulte G.K., Danley D.E., Hoth L.R., Griffor M.C., Kamath A.V., Rosner M.H., Chrunyk B.A., Perregaux D.E., Gabel C.A., Geoghegan K.F., Pandit J. (2000). Identification, characterization, and crystal structure of the Omega class glutathione transferases. J Biol Chem. 275(32): 24798-806.
Bonhomme A., Pingret L., Pinon J. M. (1992). Toxoplasma gondii cellular invasion. Review. Parassitologia 54:31-43.
Boonmars T., Wu Z., Nagano I., Takahashi Y. (2004). Expression of apoptosis-related factors in muscles infected with Trichinella spiralis. Parasitology 128 (Pt3): 323-32.
Bruschi F., Saviozzi M., Piaggi S., Malvaldi G., Casini A. (2003). Up-regulation of the 31 kDa dehydroascorbate reductase in the modified skeletal muscle cell (nurse cell) during Trichinella spp. infection. Int J Parasitol. 33(10):1035-42.
Bruschi F., Chiumento L. (2012). Immunomodulation in Trichinellosis: does Trichinella really escape the host immune system? . Endocrine, Metabolic & Immune Disorders-Drug Targets. 12:4-15.
Cerretti DP, Kozlosky CJ, Mosley B, Nelson N, Van Ness K, Greenstreet TA, March CJ, Kronheim SR, Druck T, Cannizzaro LA. (1992). Molecular cloning of interleukin-1 beta converting enzyme. Science. 256(5053):97-100.
Chiappino M. L., Nichols B. A., O'Connor G. R. (1984). Scanning electron microscopy of Toxoplasma gondii: parasite torsion and host-cell responses during invasion. J. Protozool. 31:288-292.
Chrestensen CA, Eckman CB, Starke DW, Mieyal JJ. (1995). Cloning, expression and characterization of human thioltransferase (glutaredoxin) in E. coli. FEBS Lett. 374(1):25- 8.
Cullen W.R., McBride B.C., Manji H., Pickett A.W., Reglinski J. (1989). The metabolism of methylarsine oxide and disulfide. Appl. Organomet. Chem. 3:71-78.
De Carneri. Parassitologia medica e diagnostica parassitologica. Edizione 2014. "Casa Editrice Ambrosiana".
Dinarello CA. (1998). Interleukin-1 beta, interleukin-18, and the interleukin-1 beta converting enzyme. Ann N Y Acad Sci. 856:1-11. Review.
Dubey J. P., Miller N. L., Frenkel J.K. (1970). The Toxoplasma gondii oocyst from cat feces. J. Exp. Med. 132:636-662.
cyste-forming coccidia of man and animals, p. 101-237. In J. P. Kreier (ed.), Parasitic