Messa a punto e uso del miRNA Pull-Out assay per l'identificazione degli mRNA target del soppressore tumorale miR-28-5p nella linea di tumore alla prostata DU-145

UNIVERSITÀ DI PISA

Dipartimento di Biologia

Corso di Laurea Magistrale in Biologia Applicata alla Biomedicina

T

L

Messa a punto e uso del miRNA Pull-Out assay per

l'identificazione degli mRNA target del

soppressore tumorale miR-28-5p nella linea di

tumore alla prostata DU-145

Relatore

Candidato

Dott.ssa Milena Rizzo

Berti Gabriele

SOMMARIO

RIASSUNTO

ABSTRACT

CAPITOLO 1

INTRODUZIONE

1.1.3 Meccanismo d'azione dei miRNA ………..……….………...……...5

1.2 I microRNA nel cancro………..……….………..…………...…...…...8

1.2.1 I miRNA come oncogeni…..………..……….……....9

1.2.2 I miRNA come soppressori tumorali...……….………...……..10

1.2.3 Meccanismi di alterazione del livello dei miRNA nel cancro ....…………...….11

1.2.4 Strategie terapeutiche basate sui miRNA…...………...13

1.2.5 I miRNA nel tumore alla prostata ……….………...…...15

1.2.5.1 Profilo di espressione dei miRNA nel tumore alla prostata………...…...17

1.2.5.2 miRNA soppressori tumorali nel tumore alla prostata…….…..………...………17

1.2.5.3 miRNA oncogeni nel tumore alla prostata……..………...…...……..…...18

1.2.6 miR-28-5p: un miRNA soppressore tumorale………...………20

1.3 Identificazione dei target dei miRNA ………..………...…...…22

1.3.1 Approcci bioinformatici ..………...……….…………..22

1.3.2 Approcci sperimentali………...………..…….……27

CAPITOLO 3

MATERIALI E METODI

3.1 Colture cellulari……….……….……...…...33

3.2 Analisi della proliferazione cellulare………...33

3.2.1 Conteggio……….……….33

3.2.1 Saggio di proliferazione cellulare con cristal violetto……….…………..33

3.3 Valutazione della capacità di formare colonie……….…………..…..34

3.4 Analisi del ciclo cellulare……….………..34

3.5 Saggio per l’apoptosi……….………35

3.6 Trasfezione………..….35

3.7 Estrazione RNA totale………...………36

3.8 Retrotrascrizione…...………...…….….36

3.8.1 Retrotrascrizione dei miRNA………..………….36

3.8.2 Retrotrascrizione di mRNA………..…….………36

3.9 Quantificazione relativa di miRNA e mRNA con real-time PCR…...….36

3.10 Estrazione delle proteine e Western Blot………...………..……....37

3.11 Analisi statistica………...…….…38

3.12 Preparazione del vettore pmiR-26a e pmiR-28-5p………...…….39

3.13 Saggio della luciferasi………....………...……….….41

3.14 miRNA Pull-out assay...42

3.14.1 Sintesi dei ds-miRNA.………...42

3.14.2 Protocollo del miRNA Pull-out assay...44

3.14.2.1 Trasfezione dei ds-miRNA e Cross-linking..………...……….44

3.14.2.2 Isolamento dei complessi miRNA/mRNA target….……….…….…...45

3.15 Modifiche apportate al protocollo del miRNA Pull-out assay……..…....46

3.16 Identificazione dei target tramite sequenziamento NGS………47

3.16.1 Costruzione delle libraries per RNA-seq……….………47

CAPITOLO 4

RISULTATI

4.1 Il miR-28-5p è sottoespresso in linee cellulari tumorali…………..…....…49

4.2 La ri-espressione del miR-28-5p determina la riduzione della proliferazione cellulare in diverse linee di tumore alla prostata.………...51

4.3 miRNA pull-out assay: un nuovo protocollo per l'identificazione degli mRNA target del miR-28-5p………...………..………53

4.3.1 Validazione della capacità di legame dei miRNA sintetici…………...……..54

4.3.2 Valutazione della molarità di ds-miR-26a(7+17) o ds-miR-26a(8+18) da utilizzare per la trasfezione………..……….…….………..56

4.3.3 Valutazione dell’energia da utilizzare durante la fase di irraggiamento con UV a 365 nm………...……….57

4.4 Validazione del miRNA pull-out assay mediante qRT-PCR……...……….57

4.5 Modifiche apportate al protocollo del miRNA pull-out assay…...………..59

4.5.1 Variazione della molarità di ds-miRNA ct/bio trasfettato……...….………59

4.5.2 Variazione del protocollo per la cattura dei complessi miRNA-mRNA target………...………60

4.5.3 Variazione del metodo di isolamento degli mRNA target……...……….……..61

4.6 Validazione del miRNA pull-out assay con protocollo modificato.…….61

4.7 Il miR-28-5p regola l'espressione del gene E2F-6 nella linea di tumore alla prostata DU-145………...…...………64

4.8 Identificazione del “target-oma” del miR-28-5p nelle DU-14…...68

CAPITOLO 5

DISCUSSIONE

MATERIALE SUPPLEMENTARE

Tabella S1.A Selezione dei target noti in letteratura del miR-28-5p…………..…76

Tabella S1.B Selezione dei target noti in letteratura del miR-26a……...…...…76

Tabella S2 Lista dei target del miR-28-5p ottenuta dalle analisi dei dati NGS………77

APPENDICI

Tabella A1 Sequenze dei primers usati………...…….…82

Tabella A2 Sequenze dei miRNA utilizzati per la trasfezione…...83

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

RINGRAZIAMENTI

I

RIASSUNTO

È oramai noto che perturbazioni dell'espressione dei microRNA (miRNA) possono essere causa o concausa dell'instaurarsi di patologie come il cancro, svolgendo il ruolo o di soppressori tumorali o di oncogeni. Studi preliminari effettuati nel nostro laboratorio hanno evidenziato che il miR-28-5p subisce una profonda sotto espressione nel processo di immortalizzazione nei fibroblasti embrionali murini e che la sua ri-espressione inibisce la proliferazione. Questi dati ,nel loro complesso, suggeriscono che il miR-28-5p sia un possibile soppressore tumorale.

Al fine di indagare questo aspetto abbiamo misurato il livello di espressione del miR-28-5p in diverse linee di tumore alla prostata, verificando che è marcatamente sottoespresso. Inoltre abbiamo visto che la sua ri-espressione induce una riduzione della proliferazione di tutte le linee cellulari analizzate.

Con lo scopo di determinare i geni che sono alla base dell’azione antiproliferativa del miR-28-5p abbiamo messo a punto e utilizzato il miRNA

pull-out assay nella linea di tumore alla prostata androgeno indipendente

DU-145. Questo metodo è basato sull’isolamento e l’identificazione dei complessi miRNA/mRNA target in cellule vitali. Dopo una fase iniziale durante la quale abbiamo apportato una serie di modifiche al protocollo originale, siamo riusciti ad ottenere un buon arricchimento dei complessi miRNA/mRNA target. La validazione dell’arricchimento è stata effettuata misurando, mediante qRT-PCR, l’arricchimento di target noti del miR-28-5p identificati in letteratura in altri contesti biologici. L’identificazione dei target del miR-28-5p è stata effettuata mediante tecnologia next generation sequencing (NGS) e dall’analisi dei dati sono risultati significativamente arricchiti 191 trascritti potenziali

II

Il target del miR-28-5p, noto in altri contesi biologici, risultato più arricchito dalla qRT-PCR è E2F-6. Per confermare che fosse un target del miR-28-5p anche nel tumore alla prostata, abbiamo sovraespesso il miRNA nelle DU-145 e dimostrato che la proteina di E2F-6 viene ridotta e che il processo di apoptosi, di cui E2F-6 è uno dei possibili mediatori negativi, viene indotto. Questi dati sono in linea con l'ipotesi iniziale secondo cui il miR-28-5p si comporta come TS-miRNA nel tumore alla prostata.

Il fatto che E2F-6 sia stato validato come target del miR-28-5p da un lato indica che il miRNA pull-out assay è capace di identificare i target molecolari di un TS-miRNA e dall’altro suggerisce che l’analisi degli mRNA target più arricchiti, una volta validati funzionalmente, permetterà di identificare e ricostruire le reti regolative in cui il miR-28-5p è coinvolto e attraverso le quali esplica la sua attività antiproliferativa nella cellule tumorali prostatiche.

III

ABSTRACT

The alterations of microRNAs (miRNAs) expression may be the cause of diseases onset such as cancer: in fact they can act both as tumor suppressors (TS) or oncogenes.

Preliminary studies in our laboratory showed that miR-28-5p undergoes a strong downregulation during the immortalization of mouse embryo fibroblasts and that its ri-expression inhibits cells proliferation. These data suggest that miR-28-5p can act as a tumor suppressor. In order to investigate this aspect, we measured miR-28-5p expression level in different prostate cancer cell lines and we found that it is markedly downregulated. We also observed that its expression reduces proliferation of all analyzed cell lines.

With the aim to identify the genes involved in the antiproliferative action of miR-28-5p we used and modified the miRNA pull-out assay in the androgen independent prostate cancer cell line DU-145. This method allows the isolation and identification of miRNA/mRNA complexes in living cells. After an initial phase in which we changed the original protocol, we were able to get the enrichment of miRNA/mRNA target complexes. The technique was validated measuring the enrichment of known miR-28-5p targets, validated in other biological contexts, in the pull out products by qRT-PCR. The miR-28-5p targets were identified using next generation sequencing (NGS) technology and data analysis showed that 191 potential targets were significantly enriched.

The more abundant miR-28-5p known target, validated by qRT-PCR, was E2F-6. In order to confirm that E2F-6 was a miR-28-5p target also in prostate cancer, we transfected miR-28-5p in DU-145 cells and we demonstrated that its overexpression reduced E2F-6 protein level and this could be one of the mechanisms at the basis of the miR-28-5p pro-apoptotic activity.

IV

These data support the hypothesis that miR-28-5p may act as a TS-miRNAs in prostate cancer cells.

Overall data showed that miRNA pull out assay was able to identify the molecular targets of a TS-miRNA. The analysis of the more enriched mRNA targets, once functionally validated, will allow the identification of the regulatory networks in which miR-28-5p exerts its anti-proliferative activity in prostate cancer cells.

- 1 -

CAPITOLO 1

INTRODUZIONE

1.1 I microRNA

I miRNA costituiscono una famiglia di piccoli RNA endogeni, non codificanti a singolo filamento (ss), di una lunghezza compresa tra i 21 e i 25 nucleotidi, il cui ruolo è quello di regolare negativamente l’espressione genica a livello post-trascrizionale (post-transcriptional gene silencing, PTGS).

I miRNA sono stati identificati in Caernorhabditis elegans, ed inizialmente considerati uno strumento specifico impiegato dal nematode per controllare l'espressione genica di alcuni geni eterocronici (1).

Questa scoperta ha innescato nei ricercatori la curiosità di cercare questi piccoli RNA non codificanti (ncRNA) in altre specie, e nel 2001 tre gruppi indipendenti li hanno identificati sia nell’uomo che nel topo fornendo definitivamente la prova dell'esistenza di una vasta classe di piccoli ncRNA con il ruolo potenziale di regolatori dell'espressione genica, successivamente chiamati microRNA (miRNA) (2,3).

Da allora i miRNA sono stati scoperti in quasi tutte le specie animali e vegetali e hanno rivoluzionato la nostra comprensione della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica.

Secondo la versione più aggiornata (Release 21, giugno 2014) di miRbase (http://www.mirbase.org/), database online ufficiale in cui vengono annotate tutte le sequenze dei miRNA noti, sono stati scoperti ad oggi circa 2588 miRNA maturi nell’uomo.

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Considerando che ogni singolo miRNA può regolare decine o centinaia di mRNA target diversi, i miRNA possono coordinare o perfezionare l'espressione delle proteine in una cellula, agendo sulle principali vie di segnalazione che sono alla base delle più importanti funzioni, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, la proliferazione cellulare, il differenziamento, l’apoptosi e il

self-renewal/differenziamento delle cellule staminali (4). I miRNA sono coinvolti

anche nella regolazione di alcuni processi che riguardano l’intero organismo, comprendenti lo sviluppo embrionale e la risposta immunitaria (5).

1.1.1. Localizzazione genomica

I geni che una volta trascritti originano i miRNA sono distribuiti su tutti i cromosomi, eccetto il cromosoma Y, e circa il 50% di questi sono localizzati in loci vicini sullo stesso cromosoma organizzandosi in cluster genici. I miRNA organizzati in cluster generalmente formano delle unità trascrizionali (TU) policistroniche che sono sotto il controllo di uno stesso promotore e sono trascritti simultaneamente (6).

I miRNA possono essere classificati in due categorie in base alla localizzazione genomica: miRNA intergenici sono situati al di fuori delle unità geniche e sono trascrizionalmente indipendenti perché provvisti di un proprio promotore; i miRNA intragenici sono localizzati all'interno di altre unità geniche e sono trascrizionalmente dipendenti dal promotore del gene ospitante (7). Quest'ultimo è un meccanismo conveniente per l'espressione coordinata di un miRNA e di un gene codificante per una proteina. I miRNA intragenici possono trovarsi all'interno di sequenze introniche di trascritti codificanti o non codificanti, oppure all'interno di esoni di trascritti non codificanti.

- 3 -

Nei mammiferi i miRNA possono avere più isoforme (geni paraloghi): il miRNA let-7 nell'uomo possiede 8 diverse isoforme distribuite in 11 loci genomici.

Questi miRNA hanno spesso un’elevata omologia di sequenza perché frutto di duplicazioni geniche e possono, ma non sempre, essere funzionalmente correlati. In altri casi, geni che apparentemente non possiedono omologia di sequenza possono comunque essere funzionalmente correlati (8).

1.1.2 Biogenesi

La maggior parte dei miRNA è trascritta dalla RNA polimerasi II (Figura 1.1). Il trascritto primario (pri-miRNA) è lungo diverse kb e contiene strutture

stem loop. In particolare possiede uno stem di 33pb (costituito da due filamenti

di RNA parzialmente complementari), un loop terminale e due segmenti di RNA fiancheggianti a singolo filamento.

La regolazione della trascrizione dei geni che originano miRNA è molto simile a quella dei geni che codificano per proteine. Certi miRNA possono intervenire in meccanismi di feedback autoregolatori andando a reprimere l'espressione di molecole chiave implicate nella biogenesi dei miRNA stessi (9). Nel pathway canonico, il pri-miRNA viene processato in due step catalizzati da due enzimi membri della famiglia RNasi III, Drosha e Dicer.

Nel primo step, che avviene a livello nucleare, Drosha agisce tagliando lo

stem del pri-miRNA a circa 11bp dalla sua base e generando il pre-miRNA,

lungo 70 nucleotidi e presentante la classica struttura a forcina.

Alcuni pre-miRNA sono prodotti da pri-miRNA che costituiscono l’introne di un gene (mirtrons): in quel caso non è necessario il taglio di Drosha per il primo step di biogenesi che avviene durante lo splicing del gene.

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In ogni caso il pre-miRNA viene trasportato nel citoplasma attraverso l'esportina 5, membro della famiglia dei recettori di trasporto nucleare.

Il pre-mRNA viene successivamente processato a livello citoplasmatico da Dicer a formare un piccolo RNA (21-25pb) a doppio filamento (miRNA duplex) costituito dal quello che sarà il miRNA maturo e un filamento parzialmente complementare (10,11).

Nei mammiferi Dicer interagisce con le proteine argonauta (AGO1-AGO4), le quali assemblandosi con il miRNA maturo formano il complesso miRISC (microRNA Induced Silencing Complex) che guiderà il miRNA nel riconoscimento del messaggero target. Solo uno dei due filamenti (quello corrispondente al miRNA maturo) del miRNA duplex verrà mantenuto all’interno del complesso miRISC.

La scelta del filamento dipende in gran parte dalla stabilità delle estremità del miRNA duplex: il filamento che entra nel RISC è quasi sempre quello che presenta una minore stabilità all'estremità 5' dovuta alla minore energia di legame tra le basi accoppiate (12).

Anche se generalmente il filamento del miRNA duplex che viene inserito in miRISC è solo uno, studi dimostrano che in alcuni vertebrati e negli insetti entrambi i filamenti di alcuni miRNA, avendo una stabilità paragonabile, si accumulano con frequenze simili, suggerendo che entrambi potrebbero essere inseriti nel miRISC ed esplicare un'attività. Questi casi sono più rari rispetto al caricamento asimmetrico (13).

Le proteine Ago fanno parte di una famiglia presente in tutti gli eucarioti e caratterizzata dalla presenza di motivi specifici (i domini PAZ e MID) che sono utili per l’ancoraggio dell’mRNA target al 3’ e 5’ e da un dominio PIWI che è implicato nel taglio.

Nel complesso del miRISC sono state trovate proteine della famiglia GW182 (TNRC6A, TNRC6B, TNRC6C nei mammiferi), del peso di 182 kDa, che agiscono come cofattori di miRISC nella repressione trascrizionale mediata dai miRNA (14).

- 5 -

Figura 1.1 Biogenesi dei miRNA. Tratta da: Winter J.et al. (15).

1.1.3 Meccanismo d'azione dei miRNA

Una volta avvenuta la formazione del miRISC contenente il miRNA maturo può avvenire l’appaiamento di questo con il messaggero target.

Nei metazoi la maggior parte dei siti di legame per i miRNA conosciuti risiedono nella regione 3’UTR del messaggero target e sono spesso presenti in copie multiple, condizione che per certi miRNA è necessaria affinchè si abbia un’efficiente repressione della traduzione (16).In alcuni casi i miRNA tendono ad agire cooperativamente soprattutto in messaggeri che presentano siti multipli di legame, per lo stesso o per diversi miRNA, situati vicini tra loro (10-40b).

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Sebbene la maggior parte degli studi confermino che nei metazoi i miRNA si appaiano nella regione del 3'UTR, evidenze sperimentali (17,18) così come analisi computazionali (19-21) dimostrano che in alcuni casi il legame dei miRNA può verificarsi anche a livello del 5'UTR o nella sequenza codificante (ORF) del messaggero target. Uno dei motivi per cui le regioni 5'UTR e ORF risultano essere meno adatte per il targeting da parte dei miRNA è che i complessi di silenziamento legati a queste regioni risultano essere distanti dal macchinario traduzionale (7).

Negli animali l’appaiamento del miRNA con il target avviene di solito in maniera imperfetta: la complementarità deve essere perfetta solo in una specifica regione al 5’ del miRNA, detta seed, dal secondo all’ottavo nucleotide del miRNA maturo. Una volta associato all’mRNA bersaglio, la funzione inibitoria del complesso RISC si esplica mediante due meccanismi: la repressione traduzionale (Figura 1.2 A-B) o la destabilizzazione del messaggero target (Figura 1.2 C) (22).

La repressione traduzionale può avvenire sia nella fase iniziale della traduzione (Figura 1.2 A) che durante la fase di allungamento (Figura 1.2 B).

All’inizio della traduzione il miRISC può: a) interferire con il riconoscimento della struttura CAP (m7GpppN) al 5’ del messaggero target da parte del fattore d’inizio traduzione eIF4F impedendo il reclutamento della subunità ribosomale minore; b) interferire con l’assemblaggio del ribosoma competendo con la subunità ribosomale maggiore; c) legarsi alle proteine legate alla coda di poli A (PABP) del messaggero target impedendo il legame PABP-eIF4G essenziale per l’inizio traduzione. Durante la fase di allungamento miRISC può: a) inibire il ribosoma in fase di allungamento; b) causare il rilascio del ribosoma.

La destabilizzazione del messaggero target è dovuta al reclutamento/attivazione di enzimi che promuovono o la rimozione della struttura CAP al 5' (decapping) o la deadenilazione all'estremità 3', rendendo il messaggero più sensibile alla degradazione da parte delle ribonucleasi citoplasmatiche. La deadenilazione è mediata da GW182, una proteina che ha

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la capacità di interagire sia con AGO sia con le PABP, reclutando gli enzimi di deadenilazione CCR4 e CAF1 (22-23). Il processo di decapping è catalizzato dall'enzima DCP2, che richiede ulteriori cofattori quali DCP1 , HPAT , EDC4 e la proteina DEAD-box Me31B (nota anche come DDX6 o RCK/P54) (24).

Figura 1.2 Meccanismo d'azione dei miRNA. Repressione traduzionale all'inizio del

processo di traduzione (A) o nella fase di allugamento della traduzione (B) Destabilizzazione del mRNA target (C). (25).

Gli enzimi della deadenilazione e del decapping si trovano spesso localizzati in strutture subcellulari presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche definiti P Bodies, dove sono localizzate sia le proteine del catabolismo degli mRNA che proteine funzionali al processo di repressione traduzionale (AGO, GW182) (14). I P Bodies potrebbero quindi rappresentare sia siti di deposito di trascritti la cui traduzione è momentaneamente repressa

A)

B)

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sia siti in cui viene accelerata la degradazione di trascritti. E' stato dimostrato che gli mRNA repressi dai miRNA possono essere successivamente rilasciati dai P Bodies ed essere velocemente tradotti (26). E’ stato osservato che la traduzione del messaggero target viene bloccata da parte dei miRNA e riattivata a seconda delle condizioni energetiche cellulari, come per il miR-122 e il suo target CAT1 (27) nelle cellule di epatoma, o come per il miR-134 e LIMK1 nei neuroni (28).

1.2 I microRNA nel cancro

I miRNA sono in grado di reprimere l’espressione di geni implicati nella regolazione della maggior parte dei processi cellulari come il ciclo cellulare, il differenziamento e l’apoptosi. Non sorprende quindi che alterazioni di espressione e/o di attività di questi elementi regolatori possano essere implicate nell'insorgenza e progressione di patologie umane tra cui il cancro.

La prima indicazione che i miRNA svolgono un ruolo importante nella patologia umana è derivata da studi computazionali e funzionali compiuti sulle cellule tumorali. Uno studio pioneristico di Croce e colleghi ha dimostrato che il cluster miR-15a/16-1 era spesso deleto in pazienti affetti da leucemia linfatica cronica (LLC): in questo lavoro è stato suggerito che questi miRNA svolgessero un'attività di soppressori tumorali (29). Questa scoperta ha spinto numerosi gruppi negli ultimi anni ad investigare il profilo di espressione dei miRNA nei pazienti oncologici, dimostrando non solo che l’espressione dei miRNA è profondamente alterata nel cancro, ma anche che questa alterazione è discriminante di diversi tipi tumorali (30). In particolare il fatto che alcuni miRNA risultavano sotto o sovra espressi in più di un tipo tumorale ha portato a pensare che la deregolazione dei miRNA non fosse un evento random e che

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potessero giocare un ruolo causale nello sviluppo del cancro agendo come veri e propri oncogeni o soppressori tumorali (31).

1.2.1 I miRNA come oncogeni

Nonostante la generale riduzione di espressione dei miRNA nei tumori alcuni sono sovraespressi e molti di questi giocano un ruolo cruciale nell'iniziazione e nella progressione tumorale agendo da veri e propri oncogeni. Generalmente gli onco-miRNA reprimono l'espressione di geni considerati soppressori tumorali e molto spesso si ritrovano maggiormente espressi nelle cellule tumorali (32).

Tra gli onco-miRNA un esempio significativo è il cluster miR-17-92 che comprende sei miRNA: miR-17-5p, -18, -19a, 19b, -20 e -92. E' stato osservato che i miRNA appartenenti al cluster miR-17-92 sono sovraespressi in campioni di linfomi a cellule B e agiscono regolando l'espressione di E2F1, fattore di trascrizione pro-proliferativo e pro-apoptotico (33).

Un altro miRNA con azione pro-tumorale è il miR-155 che è sovra-espresso in diversi tipi di tumore solidi tra cui il tumore al seno, colon, polmone (32) e tumori ematopoietici (34). Questo miRNA reprime l'espressione di molti geni correlati con il processo di iperplasia come ad esempio Bach1, Sla, Cutl1, Csf1r, Jarid2, Cebpβ. L'espressione transgenica del miR-155 è sufficiente ad attivare il processo di linfomagenesi nei modelli murini (35).

Di particolare interesse è il miR-21 la cui sovraespressione nei tumori umani è stata ampiamente dimostrata (36). La delezione del miR-21 nel topo induce una riduzione delle dimensioni del tumore al polmone in vivo (37) e la sua sovraespressione è sufficiente a indurre lo sviluppo di linfomi (38).

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1.2.2 I miRNA come soppressori tumorali

Alcuni miRNA, in base ai target che regolano possono svolgere un ruolo di soppressore tumorale (TS). I TS-miRNA generalmente si ritrovano sottoespressi nel cancro e hanno la funzione di inibire l'espressione di geni che favoriscono il processo tumorale, gli oncogeni. La perdita di specifici miRNA o la loro ridotta espressione nelle cellule tumorali contribuisce in maniera rilevante alla patogenesi e alla progressione del cancro.

E' stato dimostrato che i membri della famiglia del miR-34 (comprendente il miR-34a, -34b e -34c) sono target diretti di p53 e la loro espressione induce arresto del ciclo cellulare e apoptosi (39). Sono stati identificati diversi geni regolati da questo miRNA in differenti contesti biologici tumorali, come ad esempio il gene pro-apopotico BCL2 e c-MYC nel neuroblastoma (40).

In molti tipi di tumori la perdita del TS-miR-15a e del TS-miR-16-1 è cruciale per l'acquisizione di alcune delle caratteristiche tumorali. E' stato dimostrato che questi miRNA sono regolatori negativi di BCL2 e di altri oncogeni e la loro ri-espressione nelle cellule tumorali è in grado di ridurre la capacità proliferativa e di indurre apopotosi. La riespressione del miR-15a e miR-16 riduce fortemente la capacità di supporto al tumore delle cellule stromali in vitro e in vivo regolando l'espressione di FGF-2 e del suo recettore che in entrambe le cellule tumorali e stromali stimolano la sopravvivenza (41).

Altri miRNA che svolgono chiaramente la funzione di TS sono ad esempio la famiglia let-7, un gruppo di miRNA conservati in D. melanogaster, C.

elegans e in molti vertebrati. Nel genoma umano vi sono 12 omologhi di let-7

organizzati in 8 cluster distinti. Almeno quattro di questi cluster sono associati a regioni frequentemente delete in vari tipi di tumori umani (31). Nell'uomo let-7 controlla tre potenti oncogeni RAS (HRAS, KRAS e NRAS) e la perdita di let-7 promuove l'acquisizione del fenotipo tumorale. I membri della famiglia miR-200 (miR-200a, -200b, -200c, -141, e -429) sono sottoespressi nelle cellule

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tumorali umane e nei tumori solidi. Questi miRNA giocano un ruolo cruciale nella soppressione delle capacità EMT (transizione epitelio-mesenchima) modulando l'adesione cellulare, la migrazione, le capacità di invasione e di metastasi (42). Questi miRNA, regolando l'espressione di ZEB1 e ZEB2 (repressori della E-caderina), promuovono l'espressione della E-caderina e l'inibizione della migrazione delle cellule murine di tumore mammario(43,44).

Molti miRNA non possono essere semplicemente descritti come oncogeni o geni oncosoppressori a meno che non sia specificato il tipo di tessuto o il tipo cellulare in esame. Diversi miRNA, infatti, possono essere considerati come oncogeni o oncosoppressori a seconda del contesto biologico. I miR-221 e miR-222 sono considerati soppressori tumorali nelle cellule leucemiche in cui i due miRNA regolano l'espressione dell'oncogene c-KIT, inibendo la proliferazione cellulare (45). Al contrario in diversi tipi di tumore solido questi miRNA reprimono l'espressione di almeno quattro importanti soppressori tumorali: PTEN, p27, p57 e TIMP3 (Inibitore tissutale delle metallo-proteinasi 3) (46).

1.2.3 Meccanismi di alterazione del livello dei miRNA nel

cancro

La causa della diffusa alterazione di espressione dei miRNA tra cellule maligne e quelle sane può essere attribuita a diversi meccanismi che comprendono sia alterazioni geniche e cromosomiche che alterazioni della regolazione epigenetica e del macchinario di biogenesi ed editing dei miRNA.

E' stato dimostrato che circa il 52.5% dei geni dei miRNA sono localizzati in regioni genomiche frequentemente riarrangiate nei tumori, come siti fragili, regioni delete (minimal region of loss of heterozigosity, LOH) o amplificate (minimal amplicons) (47). Alcuni esempi sono il cluster miR-15a/16-1 precedentemente citato. Questo cluster è localizzato in un locus genomico

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frequentemente deleto nei casi di leucemia cronica a cellule B (B-CLL) (41) o i miRNA let-7g/miR-135-1 anche questi deleti in diversi tumori umani (31). Il cluster miR-17-92 si trova nella regione 13q3 spesso amplificata in molte forme di mielomi e tumori solidi (48).

L'espressione aberrante dei miRNA nel cancro può essere dovuta anche ad alterazioni della funzionalità dei geni implicati nei meccanismi epigenetici, provocando, per esempio, ipermetilazione dei soppressori tumorali o un'estensiva ipometilazione del DNA genomico o alterazioni dei pattern di modificazione degli istoni (49). In molti tipi di cancro è stata osservata un ipermetilazione delle regioni in cui è localizzato un miRNA oncosoppressore, come ad esempio la famiglia del miR-34 (39), rappresentando una delle cause della loro rilevante sottoespressione nel cancro. Un altro esempio in tal senso è il miR-127, che per questo motivo risulta essere profondamente sottoespresso nelle cellule di cancro alla colicisti (50), e il miR-124a, che subisce un ipermetilazione che ne determina la sottoespressione nel cancro al colon (51).

Anche le mutazioni o le alterazioni di espressione delle componenti delle proteine che sono implicate nella biogenesi dei miRNA o che ne regolano il processo di editing contribuiscono alla variazione di espressione dei miRNA. E' stato dimostrato che il 27% dei tumori possiede delezioni in emizigosi a carico del gene DICER1 e questo contribuisce alla perdita di espressione dei miRNA (52). E' stato dimostrato che nei modelli murini la riduzione di espressione di DICER1 è associato lo sviluppo iniziale del tumore al polmone e del retinoblastoma (53).

L'inibizione di DICER1 e del cofattore DGCR8, portando alla repressione globale dei miRNA, accelera la formazione del tumore e aumenta il potenziale oncogenico delle cellule già trasformate (54).

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1.2.4 Strategie terapeutiche basate sui miRNA

Dato il ruolo fondamentale dei miRNA come regolatori dell'espressione dei geni e considerando che la loro espressione aberrante può essere considerata una delle cause dello sviluppo e della progressione tumorale, non sorprende che sia nato un forte e progressivo interesse nell'utilizzo dei miRNA come target terapeutici o come molecole terapeutiche per la cura del cancro.

Esistono due principali strategie (dirette e indirette) che permettono di intervenire sull'espressione patologica dei miRNA del cancro.

Le strategie dirette sono quelle basate sull'uso di oligonucleotidi o su costrutti virali perchè sono capaci di bloccare l'espressione di un miRNA oncogene particolarmente espresso nei tumori o di ripristinare i livelli di espressione di un TS-miRNA. Le strategie indirette sono mediate dall'utilizzo di farmaci specifici che sono in grado di interferire con il processo di trascrizione e processamento dei miRNA.

Le strategie dirette che possono essere utilizzate per l'inibizione dei miRNA oncogeni vanno dall'uso di a) oligonucleotidi antisenso, antagomiR, che funzionano da inibitori di specifici miRNA legandosi alla sequenza del miRNA maturo e mediando la sua degradazione, all'utilizzo di b) miRNA

sponge, sequenze che presentano diversi siti di legame per il miRNA da

silenziare e ne permettono il sequestro (55). Quest'ultima strategia è stata utilizzata da Loya e colleghi in uno studio recente per inibire l'attività di miRNA in vivo in modelli transgenici di Drosophila (56).

miR-mask (miRNA-masking antisense oligonucleotides technology) è un approccio che consente di inibire la repressione mediata da un miRNA su uno specifico mRNA. Questa strategia, sviluppata da Xiao e colleghi (57) consiste nell'utilizzo di un oligonucleotide antisenso modificato, perfettamente complementare al sito di legame del miRNA presente nel 3'UTR dell' mRNA

target. L'oligonucucleotide, legandosi al mRNA target impedisce la sua

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Esistono strategie che permettono di restaurare i livelli di espressione di TS-miRNA basate sull'introduzione di oligonucleotidi che riproducono fedelmente il miRNA in questione (miRNA mimic). Sebbene non esistano dati riguardanti l'uso dei miRNA mimic somministrati per via endovenosa, è stato dimostrato che l'iniezione intratumorale del miR-29 mimic riduce significativamente le dimensioni del tumore nei modelli murini (58-60).

Un'altra strategia per ripristinare l'espressione di TS-miRNA è l'uso di AAV (adenovirus associated vectors, AAV). Questi vettori non si integrano nel genoma e non sono tossici come mostrano i dati di trial clinici di fase 1 e di fase 2 di circa 200 pazienti (61, 62). Il primo lavoro che ha mostrato che la ri-espressione di un TS-miRNA in vivo è in grado di inibire la progressione tumorale è stato eseguito da Kota e colleghi (63) che ha dimostrato che l'iniezione endovena del miR-26a clonato in un vettore AVV sopprime la tumorigenesi inducendo apoptosi e inibendo la crescita tumorale in un modello murino di cancro epatico.

Gli approcci indiretti non agiscono direttamente sul miRNA maturo ma sono basati sull'uso di farmaci che hanno la capacità di modulare pathways che regolano i fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione dell'espressione di miRNA. In base al farmaco utilizzato è possibile modulare i meccanismi che contribuiscono alla maturazione o alla degradazione dei miRNA.

Allo stato attuale esistono numerose limitazioni nell'uso di terapie che influenzano l'espressione dei miRNA e le principali riguardano la tessuto-specificità del farmaco e l'efficienza di assorbimento cellulare di una quantità di farmaco sufficiente per indurre un effetto biologico (61, 64). Per questi motivi sono in corso numerosi studi al fine di creare una metodologa efficiente e sicura.

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1.2.5 I miRNA nel tumore alla prostata

Nell’ultimo decennio il carcinoma prostatico è diventato il tumore più frequente fra la popolazione maschile dei Paesi occidentali. In Europa è il terzo tipo di cancro più comune in assoluto ed è la seconda causa di mortalità per cancro dopo il tumore del polmone, con circa 417.000 nuovi casi diagnosticati nel 2012 e una mortalità del 9.5% (65).

Il cancro alla prostata è diagnosticato clinicamente come localizzato o avanzato. I trattamenti per il tumore localizzato sono generalmente efficaci e vanno dalla prostatectomia radicale o radioterapia alla sorveglianza attiva in pazienti con basso rischio o breve aspettativa di vita (66). Il trattamento per pazienti con tumore alla prostata in stadio avanzato o metastatico è la deprivazione androgenica (ADT) che riduce i sintomi di circa il 70-80%. Purtroppo la maggior parte dei pazienti sottoposti ad ADT progredisce ad un stato di ormone indipendenza detta resistenza alla castrazione (CRPC). A questo stadio l’alternativa terapeutica più efficace è il docetaxel, un taxano semisintetico (67).

L'amplificazione del gene c-MYC nella regione 8q24 è riconosciuta come l'evento principale correlato alla progressione del tumore della prostata (68). Pochi altri sono stati descritti come i principali geni che subiscono la perdita di eterozigosi nel tumore alla prostata, tra cui NKX33-1 (8p21), PTEN (10q23.3) e KLF5 (13q21) (69).

Nonostante siano stati identificati e caratterizzati alcuni pathways cruciali implicati nell'iniziazione e progressione del tumore alla prostata, il meccanismo molecolare responsabile del processo di tumorigenesi rimane poco chiaro.

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Per quanto riguarda i miRNA, tutti gli studi riguardanti i loro profili di espressione sia in linee tumorali sia in pazienti, effettuati dal 2006 in poi, hanno chiaramente dimostrato non solo che il tumore alla prostata è caratterizzato da una ampia disregolazione dei miRNA (70-73), ma anche che i miRNA con un'alterata espressione svolgono un ruolo cruciale nella patogenesi del cancro alla prostata, in particolare nell’apoptosi, sopravvivenza cellulare, invasività e metastasi nei vari stadi della progressione tumorale (Figura 1.3)(74).

Figura1.3 Esempi di miRNA che svolgono un ruolo rilevante nel tumore alla prostata. (74).

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1.2.5.1 Profilo di espressione dei miRNA nel tumore alla prostata. In letteratura sono presenti dati contrastanti e un profilo conclusivo di espressione dei miRNA nel cancro alla prostata non può essere disegnato. In effetti, alcuni studi indicano una diffusa sottoregolazione di miRNA nei tumori (75), mentre altri riportano che nel tumore alla prostata la maggior parte dei miRNA differenzialmente espressi risultano sovraregolati (48).

Uno studio più mirato condotto da Ambs e collaboratori (71), in cui è stato analizzato l'RNA totale estratto da 60 tumori della prostata e da 16 tessuti circostanti non tumorali, ha rilevato la sovraregolazione di miR-32, miR-196a, miR-181, miR-25, miR-93, miR-92 e let-7i e una sottoregolazione di miR-218 e miR-128.

Risultati diversi sono stati mostrati da altri gruppi, che hanno osservato una generalizzata sottoespressione dei miRNA nel carcinoma della prostata (70). In questo studio sono stati analizzati small RNA ottenuti da 6 linee cellulari di tumore alla prostata, 9 xenotrapianti tumorali e 13 tessuti prostatici clinici. Sono stati identificati 51 miRNA differenzialmente espressi, 37 sottoespressi and 14 sovraregolati.

A seconda degli studi effettuati, molti miRNA mostrano caratteristiche di soppressori tumorali o di oncogeni.

1.2.5.2 miRNA soppressori tumorali nel tumore alla prostata

Il cluster miR-15a/16-1, descritto precedentemente, dispone di due miRNA funzionanti come soppressori tumorali che si trovano nella regione cromosomica 13q14, deleta nella maggior parte dei casi di leucemia linfocitica cronica (29). Questa regione è deleta anche nel 50% dei tumori della prostata (76). Analisi di qRT-PCR di 20 campioni di tumore alla prostata derivati da colture primarie e analisi di ibridazione in situ di 15 biopsie di tumori della prostata rivelano che i livelli di miR-15a/miR-16 risultano essere sottoregolati nella stragrande maggioranza dei casi (85% dei campioni).

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L'inibizione dell'attività di questi due miRNA provoca iperplasia prostatica nei topi e un aumento della proliferazione cellulare e invasione (76,77).

I loci del miR-101 sul cromosoma 1 (miR-101-1) e sul cromosoma 9 (miR-101-2) sono deleti nel 37,5% dei casi di carcinoma prostatico localizzato e nel 66,7% di casi di patologia metastatica. La sovraespressione del miR-101 riduce significativamente la proliferazione in vitro e in vivo e compromette notevolmente il potenziale invasivo nella linea cellulare di cancro alla prostata androgeno indipendente DU-145.

L'espressione di miR-34 è notevolmente indotta in seguito a danno al DNA e da stress oncogeno in maniera p53-dipendente. L'attivazione del miR-34 induce arresto del ciclo cellulare e apoptosi (78,79). Questi effetti sono stati osservati anche nel cancro della prostata, dove miR-34 è assente nelle cellule delle linee tumorali PC3 e DU-145. La ri-espressione del miR-34 in queste cellule compromette la crescita cellulare e la resistenza alla camptotecina (80).

1.2.5.3 miRNA oncogeni nel tumore alla prostata

Alcuni specifici miRNA sono noti per la loro attività di oncogeni nel cancro alla prostata, tra cui il miR-21 che è sovraespresso nelle PC3 e DU-145 (81). L'inibizione dell'attività del miR-21 non influenza la proliferazione, ma sensibilizza le cellule all'apoptosi indotta da staurosporina e riduce la motilità cellulare e capacità invasiva (82).

Il cluster miR-17-92 contiene sei miRNA (miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b-1, e -92a-1sul cromosoma 13) che sono processati da Drosha come unico trascritto. Questi miRNA sono sovraespressi nel cancro della prostata e in altri tipi di tumore (83). Il miR-20a è sovraespresso in campioni di cancro alla prostata e la sua inibizione in vitro induce la morte cellulare e apoptosi nelle PC3. (48, 84)

Il miR-125b è sovraregolato in campioni clinici e linee cellulari tumorali. Studi funzionali rivelano che la sovraespressione del miR-125 è correlata

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all'acquisizione dell'indipendenza agli androgeni e favorisce la sopravvivenza delle cellule tumorali (85,86).

Riassumendo, miRNA possono agire sia come soppressori tumorali o oncogeni svolgendo un ruolo importante nell' iniziazione e nella progressione del tumore alla prostata (Figura 1.4). Specifici miRNA sembrano giocare un ruolo cruciale regolando la crescita, resistenza a trattamenti terapeutici, resistenza alla castrazione, EMT (transizione epitelio-mesenchima) e metastasi nel tumore alla prostata e possono essere considerati bersagli attraenti per potenziali applicazioni cliniche, tra cui la diagnosi, il trattamento e la prognosi del tumore.

Figura 1.4 Rappresentazione schematica dei miRNA soppressori tumorali (in blu) e miRNA oncogeni (in rosso) con ruolo determinante nella iniziazione e progressione del tumore alla prostata. Tratto da U-Ging Lo et al. (25).

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1.2.6 miR-28-5p: un miRNA soppressore tumorale

Il miR-28-5p è un miRNA intronico che si trova nel sesto introne del gene LPP (lipoma-preferred partner) localizzato sul cromosoma 3q28. Il gene LPP subisce spesso una traslocazione cromosomica che tipicamente è osservata nei lipomi. Il riarrangiamento promuove la formazione di una proteina chimerica implicata nel processo di cancerogenesi (87).

Anche se il gene che genera il miR-28 è completamente conservato tra uomo e topo, secondo le predizioni di mirSVR meno del 15% dei suoi target sono condivisi, suggerendo che il miR-28 possa agire con meccanismi di azione diversi nelle due specie.

E’ stato dimostrato il miR-28-5p è sovraregolato durante la senescenza cellulare nei fibroblasti embrionali di topo (MEF, mouse embryo fibroblasts) (88). Inoltre la sovraespressione del miR-28-5p riduce la proliferazione cellulare delle MEF inducendo senescenza e apoptosi (89). In questo contesto cellulare è stato identificato l'oncogene ASF/SF2 come uno dei target del miR-28-5p. Inoltre è stato dimostrato che l’oncogene LRF

(leukemia/lymphoma-related factor), è in grado di inibire direttamente l'attività del gene LPP, e

quindi del miR-28-5p (89). Infine, è stato dimostrato che il miR-28-5p riveste un ruolo nel processo di immortalizzazione delle MEF (90). In particolare, durante il processo di immortalizzazione, in coincidenza con l'aumento della proliferazione cellulare successivo all’inattivazione della p53, il miR-28-5p subisce una forte riduzione di espressione. La ri-espressione di miR-28-5p nelle MEF immortalizzate è sufficiente a ridurre la loro capacità proliferativa. Anche in questo caso uno dei mediatori dell'effetto antiproliferativo del miR-28-5p è l’oncogene ASF/SF2 .

Anche nell'uomo il miR-28-5p sembra giocare un ruolo fondamentale nel processo di cancerogenesi e la sua attività varia a seconda dei target e quindi dei pathways che sono sotto la sua regolazione. Almeida e collaboratori (91) hanno dimostrato che sia il miR-28-5p che il miR-28-3p sono sottoespressi in

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campioni di tumore al colon-retto (CRC) umani rispetto al tessuto normale adiacente. Inoltre la sovra espressione del miR-28-5p, ma non del miR-28-3p, in linee di CRC, inibisce la proliferazione inducendo apoptosi e rallentando il ciclo cellulare. In modelli murini, tumori derivati da linee di CRC che esprimono stabilmente il miR-28-5p crescono molto più lentamente rispetto a tumori che non lo esprimono. In questo contesto genetico alcuni dei target regolati dal miR-28-5p sono: la ciclina D1, sovraespressa in molti tipi di tumori, compreso il CRC, e HoxB3 che è stato dimostrato essere un regolatore positivo della crescita del tumore sia in vitro che in vivo.

Dal lavoro di Schneider e collaboratori (92) condotto su pazienti affetti da linfoma non Hodgkin (NHL) è emerso che l'espressione del miR-28 è fortemente repressa nelle cellule B trasformate del centro germinale. La ri-espressione di miR-28-5p in linee cellulari di linfoma di Burkitt (una forma molto aggressiva di NHL), oltre a ridurne la capacità proliferativa e la formazione di colonie in agar, determina un aumento delle cellule in apoptosi. Questi effetti biologici sono dovuti alla regolazione miR-28-5p dipendente di diversi geni tra cui BAG1, un attivatore della via di ERK, e MAD2L1, un componente del checkpoint del fuso mitotico. In questo contesto cellulare, MYC è stato identificato come regolatore negativo dell'espressione del miR-28-5p: questo risultato ha suggerito agli autori che la sovraespressione di MYC (promossa dalla sua traslocazione cromosomica tipica dei NHL) possa essere la causa della sottoregolazione del miR-28-5p in questo tipo di tumore. E’ stato infatti dimostrato che il miR-28-5p è in grado di inibire la trasformazione indotta dalla sovraespressione di MYC: Questa osservazione è in linea con l'ipotesi che il miR-28-5p possa svolgere il ruolo di soppressore tumorale.

Sebbene il miR-28 sia generalmente sottoespresso in vari tipi di tumore umano, ci sono evidenze sperimentali che dimostrano che in alcuni tipi tumorali, quali il tumore dell’esofago, renale e della cervice, il suo livello aumenta (93-95). In particolare Giradot e colleghi (96) hanno dimostrato che l'espressione del miR-28 potrebbe giocare un ruolo cruciale nella patogenicità delle neoplasie mieloproliferative impedendo il normale differenziamento dei

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megacariociti e svolgendo quindi in questo contesto un azione oncogenica. Queste osservazioni apparentemente incongruenti non sono sorprendenti, perché è noto che lo stesso miRNA può agire sia come soppressore tumorale sia come oncogene a seconda del contesto cellulare.

Considerando gli effetti esplicati e il suo potenziale di miRNA soppressore tumorale, la ri-espressione del miR-28-5p può essere considerata un promettente approccio terapeutico (miRNA replacement) nei confronti di quei tipi tumorali caratterizzati dalla sottoregolazione del miR-28-5p.

In tal senso è particolarmente importante identificare tutti i target mediante i quali il miR-28-5p esplica la sua attività antiproliferativa.

1.3 Identificazione dei target dei microRNA

Uno dei maggiori ostacoli della ricerca nel campo dei microRNA è l’identificazione degli mRNA target, soprattutto su larga scala. A tal scopo sono stati sviluppati e implementati numerosi approcci computazionali, anche se purtroppo continuano a presentare notevoli limitazioni. Recentemente sono stati sviluppati approcci sperimentali per l’isolamento dei target dei miRNA.

1.3.1 Approcci bioinformatici

Nel 2002 Lai e collaboratori (97) hanno comparato le sequenze di 11 microRNA con i motivi K box e Brd BOX che erano noti mediatori dei processi di regolazione post-trascrizionale in Drosophila. Essi hanno dimostrato che i primi otto nucleotidi del miRNA, ora noti come regione seed, erano perfettamente complementari a questi motivi e ha concluso che questa

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complementarità poteva essere essenziale nella regolazione post-trascrizionale mediata dai miRNA.

Questa semplice analisi bioinformatica ha stabilito uno dei più forti elementi predittivi utilizzati ad oggi nella previsione degli mRNA target ed è stato la base per la creazione di algoritmi che hanno permesso il forte incremento della caratterizzazione funzionale dei miRNA.

Il punto di partenza di molti algoritmi di predizione per identificare i possibili target di miRNA è dunque considerare mRNA che nel 3’ UTR possiedono regioni di perfetto appaiamento (Watson-Crick) con la sequenza che va dal nucleotide 2 al nucleotide 8 del miRNA.

Uno dei problemi centrali di questi algoritmi è il fatto che forniscono come output un elevatissimo numero di probabili target che nella maggior parte dei casi risultano essere dei falsi positivi. Parallelamente all'acquisizione di nuove conoscenze sulle caratteristiche e variabili che regolano le interazioni miRNA-mRNA, tali algoritmi sono stati modificati e aggiornati. Ad esempio valutare la conservazione della sequenza seed predetta tra specie imparentate lontanamente può ridurre efficientemente il numero di falsi positivi (98).

Poiché la maggior parte dei geni umani codificanti hanno un sufficiente grado di conservazione nella regione 3'UTR da permettere il confronto con i rispettivi 3’UTR di specie vicine, questo approccio può essere utile per filtrare i

target predetti in base alla sola omologia di sequenza del seed (99).

TargetScan (http://www.targetscan.org/), uno degli algoritmi predittivi più usato, si basa proprio sulla conservazione della sequenza seed nelle regioni 3'UTR di 28 specie di vertebrati. La lista dei probabili target identificati viene filtrata in base ad un punteggio attribuito in base alla posizione all'interno del 3'UTR e alla composizione delle sequenze adiacenti. Sebbene il sito web fornisca anche i probabili target che non sono conservati, questo approccio è di scarsa utilità nel rilevare siti di legame specie-specifici.

I recenti progressi nella previsione computazionale delle strutture secondarie dell'RNA sono stati utilizzati anche per prevedere la stabilità dei siti di legame dei miRNA.

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Algoritmi quali RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/ rnahybrid) valutano la probabilità che esista un dato duplex combinando i dati empirici di interazioni di RNA con modelli che considerano la loro stabilità a livello termodinamico (100).

Miranda (http://www.microrna.org/microrna/home.do) è uno strumento di previsione dei target di miRNA che tiene in considerazione la stabilità termodinamica tra il miRNA e il suo target assegnando differenti punteggi di energia in base alla presenza di coppie C:G, A:U, e G:U (101). Viene impostata una soglia per eliminare i duplex potenzialmente instabili al fine di ridurre il numero di target falsi positivi .

Anche l'algoritmo PITA (http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/) considera la stabilità termodinamica di un putativo duplex miRNA:mRNA, ma la confronta con la stabilità delle strutture secondarie all'interno del 3'UTR dell' mRNA bersaglio (102). I duplex che sono previsti essere localizzati in regioni del 3'UTR già coinvolte nella formazione di una struttura secondaria stabile non saranno considerati. Purtroppo questi algoritmi sono limitati dall'accuratezza delle previsioni delle strutture secondarie stabili che in certi casi risultano inaffidabili.

Sempre allo scopo di aumentare la verosimiglianza dei target proposti, algoritmi come TargetScan prendono in considerazione variabili che determinano l'accessibilità del seed dell'mRNA target, come ad esempio la posizione del sito di interazione mRNA-miRNA all'interno del 3'UTR e l'arricchimento in AU intorno al seed. Viene tenuta in considerazione anche la possibile presenza di siti di legame per le proteine o per altri RNA non codificanti nel putativo sito di interazione dell'mRNA con il miRNA; questi influenzerebbero la capacità di legame del miRNA rendendo il sito di interazione, e quindi il target, meno probabile.

Dato che una buona parte dei miRNA reprime l'espressione genica destabilizzando il messaggero e quindi favorendone la degradazione (Paragrafo 1.1.3) alcuni approcci combinano le previsioni computazionali con le correlazioni di espressione miRNA/mRNA target.

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A tal scopo vengono analizzate le correlazioni miRNA e mRNA in numerosi campioni e vengono selezionate quelle coppie i cui livelli di espressione sono correlati negativamente (103). Poiché questo metodo è indipendente da qualsiasi analisi di sequenza, esso può essere utilizzato come filtro dei dati ottenuti da qualsiasi altro approccio computazionale. Un altro vantaggio di questo approccio è che esso non è limitato ai siti situati nel 3'UTR.

Lo svantaggio è che il solo uso dei database di espressione non permette di distinguere, tra i trascritti identificati, quali possano essere target diretti o indiretti del miRNA in analisi. Inoltre, esiste comunque una porzione di miRNA che agiscono regolando l’espressione genica solo a livello post-trascrizionale, non inficiando il livello del trascritto target (vedi paragrafo 1.1.3).

Oltre alle tecniche che hanno l'obiettivo di identificare i target in base alla loro sequenza, può essere utilizzato un approccio più globale che tiene conto della funzione biologica dei target putativi come ad esempio mirBridge

(104). Il limite di questo approccio, che è più adatto allo studio di singoli miRNA, può essere l’assenza di dati in letteratura riguardanti la funzione dei

target di quel miRNA.

Diversi studi hanno dimostrato che numerosi mRNA possiedono più di un sito di legame per lo stesso miRNA all'interno della regione del 3'UTR (105). Se i siti sono sufficientemente vicini è stato osservato che il legame di più copie del miRNA (multi-targeting) può aumentare la capacità di repressione del target (106,107): questa caratteristica può essere sfruttata come parametro di selezione.

Pertanto mRNA che hanno più di un sito previsto per lo stesso miRNA nel 3'UTR saranno selezionati aumentando la solidità delle previsioni dei diversi algoritmi (105). Sebbene questo approccio non prenda in considerazione numerosi target che presentano un solo sito di legame per lo stesso miRNA ha il vantaggio di produrre un elenco di geni che con minore probabilità presenteranno falsi positivi.

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Nonostante esistano numerose e diverse tipologie di approcci computazionali per la predizione dei target dei miRNA, l'identificazione dei reali target rimane ancora molto difficoltosa.

Esistono diversi problemi nell’utilizzo negli algoritmi predittivi, primo tra tutti il fatto che forniscono liste estremamente ampie di candidati, molti dei quali non risultano validati sperimentalmente. Recenti studi hanno dimostrato che la funzionalità dei miRNA, coadiuvata da una serie di proteine regolatorie, è strettamente controllata dalla stechiometria relativa di tali proteine e del miRNA stesso (108).

Le variazioni di abbondanza relativa dei miRNA e delle proteine che ne regolano la biogenesi e l'attività, come ad esempio una insufficiente quantità di Argonauta, in un determinato contesto biologico, alterano l'efficienza di legame dei miRNA ai target tanto da non riuscire a regolarli. Questo può in parte essere la causa del fatto che molti target predetti dagli algoritmi non risultano validati sperimentalmente in specifici contesti cellulari. Secondo questa considerazione l'efficienza di inibizione del miRNA su cui si basa la validazione sperimentale potrebbe dipendere dal trascrittoma della cellula.

Un altro problema è la mancanza di coerenza tra le liste di target ottenute dai diversi algoritmi predittivi. Uno dei motivi è che diversi algoritmi utilizzano diversi database di riferimento (105). Inoltre gli algoritmi non usano gli stessi criteri per la selezione di target: per esempio alcuni richiedono il perfetto appaiamento delle basi nella regione seed, mentre altri tollerano un disallineamento o un appaiamento imperfetto del duplex.

Recenti studi hanno dimostrato che esistono diversi tipi di appaiamento della regione seed (109): la mancanza di una regola univoca nell’appaiamento e la non completa conoscenza di tali regole rendono difficile la predizione degli algoritmi che si basano solo sull’allineamento miRNA-mRNA target, anche se di per sé nessuno di loro utilizza un modello non corretto.

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1.3.2 Approcci sperimentali

Gli approcci sperimentali che si propongono di identificare gli mRNA

target di specifici miRNA sono spesso disegnati e interpretati usando algoritmi

predittivi e questi, a loro volta, sono modificati in base ai risultati sperimentali. Gli approcci sperimentali a disposizione possono essere suddivisi in due categorie in base alla possibilità di identificare solo target diretti o anche indiretti del miRNA.

Gli approcci sperimentali “indiretti” consistono solitamente nel perturbare l'espressione del miRNA sotto studio e osservare l'effetto indotto sui livelli di espressione degli mRNA o delle proteine utilizzando tecniche ad ampio spettro come microarrays o spettrometria di massa. Il problema di questi approcci è che le variazioni di espressione degli mRNA o delle proteine non sono frutto della sola regolazione diretta da parte del miRNA, ma possono essere anche il risultato di effetti indiretti (103).

Gli approcci sperimentali “diretti” sono quegli approcci che si basano sull’isolamento e la successiva identificazione dei target che in un dato momento sono fisicamente legati al miRNA in analisi.

Recentemente sono stati compiuti progressi in materia di approcci sperimentali diretti su larga scala. L'avvento della Ago CLIP-seq (Argonaute

Cross-linking immunoprecipitation) o anche Ago HITS-CLIP (Argonaute high throughput sequencing cross-linking immunoprecipitation) (110), tecnica che

prevede il cross-linking e l’immunoprecipitazione di Argonauta seguita da digestione dell’RNA co-precipitato (solo la porzione legata ad argonauta è protetta dalla digestione) e dal sequenziamento di nuova generazione per l’identificazione dei frammenti di mRNA e miRNA legati ad Argonauta, ha contribuito all'identificazione dei target dei miRNA con maggiore precisione. Utilizzando la Ago CLIP-seq si possono identificare i miRNA e gli mRNA target che in un determinato momento fanno parte del complesso miRISC, anche se non è possibile identificare quale miRNA è legato ad ogni mRNA target isolato.

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Tuttavia, perturbando l'espressione di singoli miRNA mediante sovraespressione e analizzando successivamente gli mRNA co-precipitati con argonauta, è possibile arricchire gli mRNA co-precipitati di target direttamente legati dai miRNA sovraespressi. Uno dei principali svantaggi della Ago CLIP-seq è la scarsa efficienza del trattamento UV 254 nm (cross-linking) nell'indure la formazione del legame proteina-RNA, che si riflette in una scarsa efficienza di recupero degli RNA legati ad Ago (Hafner 2010)(111). Anche la bassa stringenza del processo di immunoprecipitazione determina una scarsa efficienza nella purificazione di complessi proteina-RNA (112).

Per ovviare ad alcuni di questi svantaggi è stata proposta la Ago PAR-CLIP (Argonaute photoactivatable ribonucleoside enhanced cross-linking

immunoprecipitation) (111). La principale differenza risiede nell’

incorporazione di tiouridine negli mRNA target e nel trattamento con UV 365 nm: l’utilizzo di questi nucleosidi fotoattivabili aumenta la forza del legame RNA-proteina e determina un aumento del recupero dell’RNA target da 100 a 1000 volte rispetto al normale cross-linking con UV 254 nm, a parità di energia (Hafner 2010). Un altro vantaggio è che il legame con la tiouridina determina la transizione dei residui di timina (T) a citosina (C), quindi il punto di legame con Ago, nonché il sito di legame del miRNA, è riconoscibile per la presenza di mutazioni da T a C.

Molto recentemente è stata proposta la Ago CLASH (Argonaute

cross-linking, ligation, and sequencing) (113), che differisce dalla Ago CLIP solo per

l’utilizzo di una ligasi dopo la fase di digestione dell’RNA co-precipitato: questa reazione permette la formazione di un legame tra i miRNA e i propri target che in quel momento si trovano legati ad Argonauta, determinando la formazione di molecole “chimera” formate dal miRNA e dalla porzione dell’mRNA target legata al miRNA.

Attraverso l'uso di queste metodologie sperimentali è stato possibile identificare l'intero panorama delle interazioni mRNA-miRNA in diversi contesti biologici, anche se tali approcci ad ampio spettro non sono la migliore

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opzione quando l’interesse è quello di identificare tutti i target di uno specifico miRNA.

A questo scopo nel laboratorio del prof. Lund è stato recentemente sviluppato un nuovo metodo per la purificazione e identificazione dei target di specifici miRNA, il miRNA pull-out assay (114). Tale procedura si basa sulla trasfezione in cellule vive di un miRNA sintetico, fedele riproduzione del miRNA endogeno e provvisto di una molecola di biotina al 3' del filamento senso. La fotoattivazione, mediante irraggiamento con raggi UV a 365 nm, di molecole di tiouridina presenti sulla sequenza del miRNA sintetico, permette il legame covalente irreversibile con i propri mRNA target. Successivamente i complessi miRNA/mRNA vengono catturati utilizzando delle beads che presentano molecole di streptoavidina sulla superficie.

Mediante l’utilizzo di questa tecnica è possibile isolare tutti i target reali di uno specifico miRNA sotto studio, che vengono identificati mediante

microarray. Il miRNA pull out assay, a differenza degli algoritmi predittivi e di

molti approcci sperimentali, permette di identificare direttamente tutti i target di un solo miRNA in specifici contesti cellulari vitali.

Il miRNA pull-out assay è stato inizialmente utilizzato da Martjn Kedde e collaboratori (115) per dimostrare che la proteina Dnd1 (dead end 1) legandosi a livello del 3'UTR di messaggeri, tende a ridurre l'affinità di legame di questi mRNA per i miRNA che li regolano. In particolare hanno dimostrato che Dnd1, occupando regioni al 3'UTR dell'mRNA del gene p27, ostacola il legame con il miR-221, proponendo il modello secondo cui Dnd1 regola positivamente l'espressione genica inibendo la repressione mediata dai miRNA.

Successivamente la tecnica è stata utilizzata da Orom e collaboratori (116) per identificare i target del miR-10a, che è sovraespresso in diversi tipi di cancro e gioca un ruolo cruciale nella progressione tumorale (117).

Mediante questo approccio gli autori hanno dimostrato che il 50% dei 100 target più arricchiti nel miRNA pull-out assay del miR-10a legano mRNA di proteine ribosomiali nella sequenza 5'UTR, in specifiche regioni conservate che sono note per regolare il processo di traduzione.

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Sorprendentemente il miR-10a legandosi in tali posizioni non reprime come consueto il processo di traduzione ma piuttosto lo facilita. Questo risultato sottolinea il fatto che mediante l'uso di questa tecnica è possibile identificare sia nuovi siti di legame non canonici sia nuovi meccanismi di azione dei miRNA.

Il miRNA pull-out assay è stato utilizzato anche per l'identificazione dei

target del miR-492, miRNA implicato nel processo di angiogenesi in vitro e

coinvolto nella regolazione della proliferazione (118). Analisi microarray applicate sul prodotto del pull-out hanno permesso di identificare 357 mRNA, e 9 di questi sono stati selezionati e validati come reali target del miR-492. Anche in questo caso questa tecnica ha consentito l'identificazione di target che la maggior parte degli algoritmi predittivi non avrebbero potuto evidenziare.

Infatti, dei 9 geni validati, solo 3 presentano un seed per il miR-492 nella sequenza del 3'UTR, mentre gli altri hanno presentato da 1 a 12 siti di appaiamento non canonici.

Oltre alla possibilità di identificare nuovi target di miRNA questo metodo permette la validazione sperimentale di target putativi mediante analisi di qRT-PCR e può quindi essere utilizzato per irrobustire validazioni di interazione effettuate con altre procedure sperimentali. Christoffersen e collaboratori (119), studiando il processo di senescenza cellulare indotta dall'attivazione aberrante di oncogeni, hanno individuato MYC come target del miR-34a e validato la loro interazione con saggi di attività della luciferasi. Per irrobustire tale validazione è stato trasfettato il miR-34a biotinilato e dopo la purificazione dei target è emerso un forte arricchimento dell'mRNA di MYC nel prodotto del pull-out, dimostrando definitivamente il legame diretto miRNA/mRNA.

Oltre a poter identificare nuovi target di miRNA e siti di interazione con mRNA, il miRNA pull-out assay può essere utilizzato per validare le previsioni di interazioni tra miRNA e varie tipologie di RNA. Leucci e collaboratori (120) hanno utilizzato questo approccio per validare l'interazione del miR-9 e

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MALAT1, un long non-coding RNA (lncRNA) nucleare di circa 7kb implicato nella regolazione del processo di splicing, la cui espressione è spesso associata a metastasi nel tumore al polmone. Il legame tra i due RNA è stato dimostrato dall'arricchimento dei trascritti di MALAT 1 nel prodotto del pull out derivato dalla trasfezione del miR-9 biotinilato.