UNIVERSITÀ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di laurea Magistrale in Chimica e tecnologia farmaceutiche
Tesi di Laurea
Valutazione degli effetti cardiometabolici di Oli
extravergini d’oliva agrumati in ratti trattati con dieta
High Fat
Relatori:
Prof. Vincenzo Calderone Prof.ssa Lara Testai
Candidato:
Luca Cerri
Anno accademico 2018-2019
INDICE
1-introduzione 1
1.1-EVOO 1
1.1.1-Frazione insaponificabile 2
1.1.1.1-Porzione fenolica 2
1.1.1.1.1-Effetti dei polifenoli: evidenze precliniche 4 1.1.1.1.2-Effetti dei polifenoli: evidenze cliniche 5
1.1.1.2-Vitamina E 7
1.1.1.2.1-Effetti Vitamina E: evidenze precliniche 8 1.1.1.2.2-Effetti della vitamina E: evidenze cliniche 9
1.1.2-Frazione saponificabile 11
1.1.2.1-MUFA 11
1.1.2.1.1-Effetti dell’acido oleico: evidenze precliniche 12 1.1.2.1.2-Effetti dell’acido oleico: evidenze cliniche 13
1.2-produzione e conservazione di EVOO 15
1.2.1-Composizione iniziale di EVOO 16
1.2.2-Tecnologie di estrazione 16
1.2.3-Parametri principali che influenzano la degradazione
di EVOO e soluzioni per una conservazione migliore 17 1.2.3.1-Influenza dell’atmosfera di stoccaggio 17 1.2.3.2-Caratteristiche della conservazione
in base al materiale in cui è eseguito lo stoccaggio 18 1.2.3.3-Nuovi metodi di estrazione:
aggiunta di antiossidanti naturali 19
1.3-Oli di oliva fortificati con bucce di agrumi 20
1.3.1-Agrumi di Massa-Carrara 20
1.3.1.1-Caratterizzazione dell’olio essenziale (OE)
del flavedo di limone 21
1.3.1.2- Caratterizzazione dell’olio essenziale (OE)
del flavedo di arancio 22
1.3.2-Olio di oliva di agrumi (COO) 22
1.3.2.1-Estrazione 22
1.3.2.2-Parametri di qualità e analisi sensoriale 22
1.3.2.3-Analaisi contenuto fenolico 23
1.3.2.4-Analisi contenuto di alcoli/aldeidi/acidi fenolici 23
1.3.2.5-Analisi del contenuto di flavonoidi 24
1.4-Valore nutraceutico dei flavanoni del Citrus e loro implicazioni
sulle patologie cardiovascolari 26
1.4.1-Riduzione della disfunzione endoteliale e miglioramento
della funzione vascolare 27
1.4.2-Riduzione livelli lipidici 28
1.4.3-Meccanismi d’azione responsabili dei benefici
cardiovascolari dei flavanoni del genere Citrus 29
1.4.3.2-Attività vasodilatante 30
1.4.3.3-Attività anti-ischemica 30
1.4.3.4-Tolleranza al glucosio 31
2-Scopo della ricerca 32
3-Materiali e metodi 33
3.1-Animali 33
3.1.1-Trattamenti 34
3.2-Protocollo sperimentale 37
3.2.1-Potenziale mitocondriale su tessuto cardiaco 38 3.2.1.1-Valutazione della variazione del
potenziale di membrana mitocondriale 39
3.2.2-Saggio della Citrato Sintasi su tessuto
adiposo addominale 41
3.2.3-Strumentazione per la misurazione della pressione 43
3.2.3.1-Misurazione della pressione 44
3.3-Analisi dei markers infiammatori: western blot 45
3.4-Soluzioni 46
4-Risultati e discussioni 47
5-Bibliografia 59
6-Sitografia 74
1
1-Introduzione
1.1-EVOO
Gli oli vergini ed extravergini di oliva (EVOO), colonne portanti della dieta mediterranea, sono stati descritti come alimenti funzionali dotati di un'elevata capacità nutrizionale (Visoli et al., 2019).
In generale, l'olio d'oliva è un alimento composto da una frazione saponificabile predominante dal punto di vista quantitativo (circa il 98-99%) rappresentata in maggior parte dall'acido oleico (55–83%) e altri acidi saturi e insaturi (acido linoleico, palmitico e stearico, 3–21%) e da una frazione insaponificabile minore (circa 1-2%), che contiene un elevato numero di vitamine (α-, β-, γ- e δ- tocoferoli), polifenoli (principalmente tirosolo, idrossitirosolo, oleuropeina, oleocantale) e squalene (Ghanbari, et al., 2012) (figura 1). Numerosi studi suggeriscono come gli effetti benefici di EVOO siano collegati principalmente alla frazione insaponificabile che pur espressa in quantità minime è la principale responsabile degli effetti nutraceutici. Recentemente ulteriori rapporti scientifici hanno dimostrato come anche la frazione saponificabile, abbia un impatto benefico sulla salute (Kris-Etherton, et al., 1993; Kris-Etherton, et al., 1999).
Figura 1: il grafico a torta riporta le percentuali di porzione insaponificabile e porzione saponificabile in
EVOO.
EVOO
frazione insaponificabile frazione saponificabile
Frazione saponificabile (98-98,5%):
-Trigliceridi -Gliceridi parziali -Fosfolipidi -Acidi grassi liberi -Cere Frazione insaponificabile (1,5-2%): -Idrocarburi saturi -Idrocarburi insaturi (squalene)
-Alcoli alifatici superiori -Alcoli di- e tri- terpenici -Steroli e metilsteroli -Tocoferoli e tocotrienoli -Carotenoidi (luteina e β-carotene -Clorofille -Sostanze fenoliche
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1.1.1-Frazione insaponificabile
1.1.1.1-Porzione fenolica
I principali composti fenolici presenti nell’EVOO sono: l'oleuropeina (Ole), l'idrossitirosolo (3,4-diidrossifeniletanolo, HT), tirosolo ((2-(4-idrossifenil)-etanolo, Tyr) e oleocantale (2-(p-idrossifenil)etil estere dell'acido (3S)-4-formil-3- (2-ossietil)es-4-enoico, OC) (Figura 2).
Figura 2: principali composti fenolici nell’OO
I polifenoli dell’EVOO esercitano una vasta gamma di effetti biologici, in particolare cardio-protettivi, neuro-protettivi, antitumorali, antimicrobici e anti-infiammatori (Karkovic´ Markovic´, et al., 2019; Fabiani, 2016).
Figura 3: rappresentazione schematica dei principali effetti benefici dei polifenoli dell’EVOO.
oleocantale (OC) idrossitirosolo (HT) ↑ tirosolo (TYR) oleuropeina (Ole)
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La loro attività biologica può essere associata a diversi meccanismi, quali (Fuccelli, et al., 2018; Terzuoli, et al., 2019):
• antiossidante;
• regolazione delle molecole di segnale coinvolte nell'infiammazione; • crescita cellulare;
• apoptosi e invecchiamento cellulare.
L'Ole è un glicoside fenolico costituito da un componente comunemente noto come idrossitirosolo (HT), da acido elenolico e una una molecola di glucosio. Alla porzione catecolica (1,2-diidrossibenzene) dell’Ole sono associati effetti protettivi per la salute (Hassen, et al., 2015).
A livello intestinale, la microflora batterica è responsabile della conversione di Ole in HT; quest'ultimo esplica il principale effetto biologico sulle cellule dell'intestino crasso (Imran, et al., 2018).
HT, principale composto bioattivo in EVOO, è un alcool fenolico con una scarsa biodisponibilità (emivita plasmatica di 1-2 minuti). Dopo essere stato assorbito, l'HT e i suoi derivati vengono rapidamente incorporati nelle lipoproteine plasmatiche ad alta densità (HDL), agendo come protettori cardiovascolari (Robles-Almazan et al., 2018). Tyr è un agente antiossidante che si accumula nel citoplasma cellulare, è ampiamente metabolizzato e la sua biodisponibilità è scarsa rispetto a quella dei suoi derivati (Serreli, et al., 2018).
Tyr, una volta assorbito, può essere convertito in HT nel fegato tramite metabolismo di fase I o nell'intestino dal microbiota intestinale (De las Hazas, et al., 2018; Rodríguez-Morató, et al., 2017).
I metaboliti più abbondanti di Tyr, 4′-O-glucuronide e 4′-O-solfato, sono derivati dal metabolismo di fase II.
Tra i polifenoli dell'EVOO, l'oleocantale (OC) ha riscontrato un elevato interesse scientifico a causa delle sue proprietà biologiche, anche se rappresenta solo il 10% del contenuto totale di polifenoli di olio extra vergine di oliva (100-300 mg/kg di olio d’oliva). Dalla sua scoperta, diverse proprietà biologiche e organolettiche gli sono state attribuite.
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1.1.1.1.1-Effetti dei polifenoli: evidenze precliniche
Molti studi in vivo su modelli animali di aterosclerosi hanno confermato l'effetto benefico dei polifenoli dell’EVOO sul sistema cardiovascolare.
Nei ratti Wistar, l'estratto di foglie di olivo ricco di Ole, Ole-aglicone e HT ha abbassato i livelli di colesterolo sierico, trigliceridi e LDL e aumentato i livelli di HDL, diminuendo il processo di perossidazione lipidica e migliorando l’attività enzimatica antiossidante (Jemai, et al., 2008).
I polifenoli dell’EVOO esercitano anche effetti protettivi sulla progressione della steatosi epatica non alcolica (NAFLD) in un modello murino (Soto-Alarcon, et al., 2017), ed esercitano effetti anti-obesità regolando l'espressione dei geni coinvolti nell'adipogenesi del tessuto adiposo viscerale di topi alimentati con dieta ricca di grassi. In particolare, la supplementazione con HT, ha contenuto i processi infiammatori associati all'insorgenza di insulino-resistenza e steatosi (Pirozzi, et al., 2016), ha attivato fattori di trascrizione come PPAR-α, -γ e Nrf2 e ha inibito NF-κB e SREBP-1c, nonché il loro geni target (Valenzuela, et al., 2017).
L'HT ha dimostrato di migliorare l'espressione dei geni coinvolti nell’efflusso del colesterolo e, nelle cellule endoteliali (EC) esposte a stimoli infiammatori o all’azione ossidante esplicata dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS), quella degli enzimi antiossidanti (Venturi, et al., 2017).
Il pre-trattamento delle cellule endoteliali con HT ha soppresso l'angiogenesi infiammatoria, ha ridotto la produzione di superossido mitocondriale e la perossidazione lipidica e ha aumentato l'attività della superossido dismutasi (SOD) (Calabriso, et al., 2018).
È stato visto come Tyr ha inibito la produzione di leucotriene B4, esercitando un ruolo protettivo sulla funzione delle EC (Perona, et al., 2006) e proteggendo il cuore e il cervello da un eventuale danno ischemico (Plotnikov et al., 2018).
I polifenoli dell’EVOO hanno anche mostrato effetti protettivi su modelli di obesità in vitro. Infatti, l'HT ha inibito la lipogenesi (Warnke, et al., 2011) e ha regolato i l’espressione genica correlata alla maturazione e alla differenziazione degli adipociti (Dagla, et al., 2018).
Allo stesso modo, Tyr ha down-regolato la sintesi lipidica negli epatociti di ratto in coltura primaria (Priore, et al., 2014) e ha anche esercitato effetti benefici nella NAFLD,
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aumentando l'espressione epatica di cistationina β-sintasi e cistationina γ-liasi e quindi la sintesi di solfuro d’idrogeno nei topi alimentati con dieta ricca di grassi (Sarna, et al., 2016).
Inoltre, HT è in grado di mostrare effetti analoghi alla restrizione calorica a livello muscolare, cerebrale, nel tessuto adiposo e nei reni attraverso la produzione e l'attivazione di sirtuine (Rigacci, et al., 2016).
Nel contesto dello studio EUROLIVE (Effetto del consumo di olio d'oliva sul danno ossidativo nella popolazione europea), è stata verificata, tramite l'assunzione di EVOO con un contenuto di polifenoli medio-alto (164-366 mg / kg), un'azione protettiva contro l'aterosclerosi, con riduzione del rapporto colesterolo totale/colesterolo HDL e stress ossidativo (Covas, et al., 2006).
L’assunzione di OC ha mostrato, come nel caso dell’ibuprofene (un farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS)), una somiglianza nella sensazione di bruciore alla gola, spingendo le indagini sulle proprietà antinfiammatorie di questo. I dati ottenuti finora hanno dimostrato chiaramente che l'OC inibisce in modo dose-dipendente l'attività della cicloossigenasi-1 e -2 (Beauchamp, et al., 2005). In realtà, l'OC è anche riconosciuto come un FANS naturale (Scotece, et al., 2018). È ben documentato da studi epidemiologici, che il consumo di EVOO riduce il rischio di vari tipi di cancro (Hodge, et al., 2004; Fortes, et al., 2003).
Sono stati valutati gli effetti di OC sui condrociti primari umani di pazienti con osteoartrite (OA) (Scotece, et al., 2018). OC inibisce la produzione di NO e di numerosi fattori pro-infiammatori indotti da LPS tra cui: NOS2, COX-2, IL6, IL-8, CCL3, LCN2 e TNF-α (Scotece et al., 2018).
1.1.1.1.2-Effetti dei polifenoli: evidenze cliniche
Gli effetti cardioprotettivi dei polifenoli dell’EVOO sono stati al centro dell’attenzione in numerosi studi clinici.
Lo "Studio europeo sugli effetti antiossidanti dell'olio d'oliva e dei suoi composti fenolici sull'ossidazione dei lipidi" (EUROLIVE) ha fornito risultati rilevanti per la ricerca degli effetti dei polifenoli di OO vergini sulla salute umana, spingendo l'EFSA a pubblicare linee guida sul ruolo cardioprotettivo esplicato da HT (Cicero, et al., 2008).
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Studi clinici più recenti hanno supportato questi risultati, osservando che il consumo di biscotti arricchiti con HT o OO vergine arricchito con HT e derivati contribuisce a ridurre i livelli plasmatici di ox-LDL (Hohmann, et al., 2015). È anche degno di nota il fatto che il claim dell'EFSA si concentri solo sulla capacità dell'HT di proteggere le LDL dall'ossidazione, sebbene il contributo di questo non sia ancora chiaro.
Altre evidenze sperimentali riguardo OO o estratto di oliva arricchito con Ole e/o HT hanno confermato il loro contributo cardio-protettivo (Lockyer, et al., 2017).
Le sperimentazioni cliniche della European Prospective Investigation in Cancer and Nutrition (EPIC) e gli studi Prevención con Dieta Mediterránea (Prevenzione con Dieta Mediterranea, PREDIMED) hanno mostrato come il consumo giornaliero di OO riduca significativamente l'incidenza di diverse malattie croniche tra cui disturbi cardiovascolari, metabolici, immuno-infiammatori e cancro (Martinez-Lapiscina et al., 2013). Tuttavia, poiché l’EVOO contiene altri composti fenolici e bioattivi, gli effetti protettivi riportati in questi studi non possono essere attribuiti esclusivamente all'HT e ai suoi derivati o precursori (De Las Hazas et al., 2018).
D’altra parte il consumo di HT di per sé è stato studiato in numerosi studi clinici randomizzati con risultati discordanti (Tome-Carneiro, et al., 2016; Xie, et al., 2018). Uno studio recente ha dimostrato che la supplementazione con estratto di folgie ricche in polifenoli (in particolare OLE) somministrata per due settimane non ha alcun effetto sulla C-IMT in uomini di mezza età sovrappeso (De Bock et al., 2013).
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1.1.1.2-Vitamina E
La vitamina E è una famiglia di otto diversi composti: quattro tocoferoli (α-, β-, γ- e δ-tocoferolo) e quattro tocotrienoli (α-, β-, γ- e δ-tocotrienolo) (Wang, et al., 1999).
Figura 4: Strutture chimiche dei tocoferoli (in alto) e tocotrienoli (in basso) presenti nell’EVOO.
Dal punto di vista strutturale i tocoferoli si possono considerare derivati del cromanolo, aventi in posizione 2 un gruppo metilico e una catena laterale alifatica a 16 atomi di carbonio (fitolo).
L'anello del cromano ha un gruppo idrossile e due gruppi metilici, la cui posizione è diversa in ciascun tipo di tocoferolo.
La differenza tra tocoferoli e tocotrienoli risiede nella regione della coda, poiché questi ultimi hanno tre doppi legami nelle loro code di fitolo (Jiang, 2014) (figura 4).
R R’’ R’’’ α-Tocoferolo CH3 CH3 CH3 β-Tocoferolo CH3 H CH3 γ-Tocoferolo H CH3 CH3 δ-Tocoferolo H H CH3 R R’’ R’’’ α-Tocotrienolo CH3 CH3 CH3 β-Tocotrienolo CH3 H CH3 γ-Tocotrienolo H CH3 CH3 δ-Tocotrienolo H H CH3
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I tocoferoli vengono assorbiti insieme ai grassi alimentari nell'intestino e vengono secreti come particelle di chilomicroni che vengono trasportate nel tessuto adiposo, nella pelle, nei muscoli, nel midollo osseo e nel cervello.
Altri tocoferoli, in particolare γ-, β- e δ-tocoferolo, subiscono ω-idrossilazione, ossidazione e β-ossidazione nel fegato per generare 13'-idrossicromanoli e carbossicromanoli, che hanno potenti proprietà antiossidanti e una forte azione anti-radicalica.
L'azione antiossidante esercitata dalle isoforme di tocoferoli è dovuta alla donazione dello ione idrogeno dal fenolo all'anello di cromanolo. Questi metaboliti hanno dimostrato di inibire gli enzimi ciclossigenasi (COX)-2 e 5-lipossigenasi (LOX) meglio delle forme non metabolizzate. Questo potrebbe essere il motivo di un'azione antinfiammatoria e antiossidante più forte di tocoferolo rispetto a α-tocoferolo. γ-tocoferolo ha un’unica posizione (C-5) non sostituita in grado di intrappolare elettrofili, incluso l'RNS (Jiang, 2014).
1.1.1.2.1-Effetti della Vitamina E: evidenze precliniche
Per quanto riguarda le prove precliniche, è stato osservato come l'α-tocoferolo riduca perossidazione lipidica e aggregazione piastrinica (Kaul, et al., 2001), inoltre, l'adesione dei monociti alle cellule endoteliali in vitro diminuisce, probabilmente attraverso l'inibizione di NFkB (Devaraj, et al., 1998).
α-tocoferolo inibisce la produzione di superossido mediata da monociti, l’aggregazione piastrinica e la loro adesione. L'α-tocoferolo svolge anche un'interessante azione regolatrice sull'omeostasi vascolare aumentando la produzione di ossido nitrico (NO) e preservando la vasodilatazione endotelio-dipendente (Ricciarelli, et al., 1998; Keaney, et al., 1999). Anche γ-tocoferolo condivide queste proprietà.
Gli studi sulle colture cellulari e sugli animali hanno confermato il ruolo preventivo svolto dall'α-tocoferolo nella CVD a causa dei suoi importanti effetti nella modulazione delle specifiche vie di segnalazione e dell'espressione genica.
Altri risultati hanno mostrato come il trattamento di macrofagi e monociti con α-tocoferolo può inibire l'assorbimento del ox-LDL riducendo l'espressione di CD36 (Ricciarelli, et al., 2000).
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Studi in vivo hanno dimostrato che la supplementazione di α-tocoferolo ha ridotto l'espressione di CD36, che è riconosciuto come il più importante recettore “scavenger” associato a CVD e svolge un ruolo essenziale nel processo aterogenico (Febbraio, et al., 2001).
Gli effetti ateroprotettivi sono stati testati anche su modelli animali: usando diete a base di EVOO, olio di palma e olio di girasole, è stato possibile osservare una ridotta estensione della lesione aterosclerotica nell'aorta dei topi trattati (Ferré, et al., 2001). Inoltre, questi animali hanno mostrato un'attenuazione della progressione delle lesioni nell'aorta ascendente, nell'arco aortico e nell'aorta discendente (Thomas, et al., 2001). L'effetto della vitamina E è stato anche osservato nella riduzione dell'area fibrotica a livello aortico dimostrata misurando l'accumulo di collagene e la dissociazione di fibre elastiche in un modello in vivo di aterosclerosi indotta da omocisteina e colesterolo (Kirac, et al., 2013).
Gli effetti antinfiammatori dell'α-tocoferolo sono stati riportati anche in modelli cellulari e animali. Una parte importante del suo ruolo antinfiammatorio si verifica attraverso l'inibizione di NFkB, la riduzione dell'attività di PKC e della biosintesi delle molecole di adesione (Rashidi, et al., 2017; Cook-Mills, 2013).
Un effetto modulatorio dell'α-tocoferolo durante i processi infiammatori è stato identificato nella riduzione delle citochine (IL-1β, IL-6, IL-8) e nel rilascio del fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) inibendo la 5-LOX (Mathur, et al., 2015).
È stato ipotizzato che l'integrazione precoce di vitamina E (25 mg/kg/die) sia in grado di ridurre la mortalità in seguito ad infarto miocardico acuto indotto dall'occlusione dell'arteria coronarica discendente anteriore sinistra in ratti Wistar maschi (Vargas-Robles, et al., 2015; Sethi, et al., 2000). Altre indagini sperimentali hanno definito un ruolo benefico della vitamina E riducendo l'attività apoptotica nei cardiomiociti (Qin, et al., 2006).
1.1.1.2.2-Effetti della Vitamina E: evidenze cliniche
Sono stati evidenziati risultati discordanti tra l'assunzione di vitamina E (da alimenti e/o integratori) e il rischio di malattia cardiovascolare (CVD).
Diversi studi di coorte hanno riportato risultati promettenti e significativi sulla riduzione del rischio di cardiomiopatia ischemica (Knekt, et al., 1994), nonché sulla malattia
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coronarica (Muntwyler, et al., 2002), infarto del miocardio (Stephens, et al., 1996) e mortalità per insufficienza cardiaca in soggetti che assumono integratori di vitamina E (Eshak, et al., 2018).
In un altro studio, le persone che avevano assunto vitamina E per più di 4 anni hanno mostrato una riduzione del 59% della mortalità per malattia coronarica (Muntwyler, et al., 2002).
Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS) ha dimostrato come il trattamento con α-tocoferolo (400-800 mg/dL) può ridurre il rischio di infarto del miocardio in pazienti con aterosclerosi coronarica (Stephens, et al., 1996).
È interessante notare che uno studio sulla prevenzione secondaria con antiossidanti ha dimostrato che la somministrazione di α-tocoferolo (800 mg/dL) può ridurre significativamente l'endpoint dell'infarto del miocardio (fatale e non fatale) e dell'ictus, in pazienti affetti da malattia renale allo stadio finale (Boaz, et al., 2000).
Gli studi che utilizzano l'integrazione di γ-tocoferolo da solo e/o in combinazione con α-tocoferolo hanno rivelato una riduzione dei biomarcatori dello stress ossidativo nei pazienti con sindrome metabolica (Devaraj, et al.,2008).
Al contrario, l'effetto di tocotrienoli in uno studio randomizzato controllato non ha mostrato cambiamenti significativi sia nella funzione vascolare che nei fattori di rischio CVD (Stonehouse, et al., 2016).
Nonostante i risultati promettenti contro le complicanze cardiovascolari, alcuni studi clinici hanno riportato dati controversi (Myung, et al., 2013).
Allo stesso modo, uno studio collaborativo giapponese non ha trovato alcuna associazione significativa tra assunzione di vitamina A ed E con ictus, malattia coronarica e mortalità per CVD (Kubota, et al., 2011).
Un altro gruppo di ricerca ha studiato gli effetti di α-tocoferolo in combinazione con PUFA in pazienti con infarto del miocardio: nonostante gli effetti benefici contro eventi cardiovascolari grazie dell'integrazione della dieta con PUFA, il gruppo non ha mostrato alcun miglioramento con la somministrazione di Vitamina E (GISSI-PREVENZIONE INVESTIGATORS, et al., 1999).
Inoltre, uno studio sulla valutazione della prevenzione cardiaca ha mostrato che 400 UI di α-tocoferolo somministrati quotidianamente per 4-6 anni non hanno avuto effetti
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positivi sugli esiti cardiovascolari in una popolazione di pazienti anziani ad alto rischio (Chae, et al., 2012; Yusuf, et al., 2000).
1.1.2-Frazione saponificabile
Figura 5: principali componenti della frazione saponificabile.
1.1.2.1-MUFA
È noto che gli acidi grassi saturi (SFA) sono implicati nella morbidità e mortalità cardiovascolare.
Un loro aumento è associato alla patogenesi dell'obesità e delle malattie ad essa correlate (Wang, et al., 2016; Ma, et al., 2016).
Inoltre, è stato scoperto che esiste una correlazione positiva tra SFA e gravità del danno ipossico nel cervello e, infine, è emersa una proporzionalità diretta tra l'assunzione di SFA e marcatori di infarto miocardico acuto (Li, et al., 2016).
Per quanto riguarda i PUFA è risaputo, in particolare per quanto riguarda gli omega 3 (Tortosa-Caparrós, et al., 2017), che hanno un impatto positivo sul profilo lipidico e sui marker infiammatori sistemici (Roy, et al., 2013).
Sono ancora in corso numerosi approfondimenti a riguardo degli effetti dei MUFA sulla salute.
Un ampio numero di ricerche scientifiche mostra come un’alimentazione ricca di grassi possa influenzare i parametri lipidici ematici.
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Sono stati evidenziati diversi tipi di effetti benefici con la sostituzione di acidi grassi saturi con acido oleico o PUFA (Kris-Etherton, 1999; Vesseby, et al., 2001):
• riduzione del rischio di malattie coronariche del 20-40% (principalmente imputabile e un calo del colesterolo LDL);
• minore rischio di CVD (con riduzione di fattori correlati alla formazione di trombi);
• maggiore sensibilità all’insulina.
Nell’EVOO il MUFA principalmente presente e quindi più importante per la dieta è l’acido oleico (figura 5).
Nell'uomo, l'acido oleico è naturalmente presente come estere nel tessuto adiposo (Kokatnur, et al., 1979).
Di solito, l'assunzione totale di acido oleico negli adulti varia tra il 12% e il 18% di energia, ma è maggiore nei paesi dell'Europa meridionale (fino al 29%) come la Grecia, l'Italia o la Spagna che sono tradizionalmente grandi consumatori di OO (Kris-Etherton, 1999).
1.1.2.1.1-Effetti dell’acido oleico: evidenze precliniche
Perdomo et al., nel 2015, hanno anche dimostrato che l'acido oleico può svolgere effetti protettivi contro l'insulino-resistenza, migliorando la disfunzione endoteliale in risposta a stimoli pro-infiammatori. Infatti, i cardiomiociti esposti al trattamento con insulina aumentano significativamente la fosforilazione di Akt e quindi inattivano la chinasi proteica attivata dall'AMP (AMPK) attraverso l'auto-defosforilazione.
Gli studi effettuati hanno dimostrato che l'acido oleico riduce significativamente l'espressione delle molecole di adesione (ICAM-1 e MCP-1) indotte da stimoli infiammatori sulle cellule endoteliali. D'altra parte, nelle cellule vascolari, l'acido oleico impedisce la proliferazione e l'apoptosi, suggerendo che potrebbe migliorare la crescita e la stabilità della placca aterosclerotica, prevenendo così complicazioni come la trombosi (Perdomo, et al., 2015).
Lo studio di Chan ha evidenziato risultati discordanti osservando che l'acido oleico, nelle cellule muscolari lisce aortiche vascolari, promuove il miglioramento delle metalloproteasi della matrice (MMP) attraverso la down-regolazione di SIRT1. In
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particolare, MMP-1 e MMP-3 sono responsabili della digestione di collagene ed elastina, con conseguente rottura delle placche aterosclerotiche.
SIRT1 svolge un ruolo critico nella modulazione di MMP sotto lo stimolo dell'acido oleico; infatti, si suppone che l'acido oleico inibisca l'enzima SIRT1 e quindi promuova l'attivazione di NFkB.
È stata osservata una produzione di NO mediata da iNOS, portando all’ipotesi che l'acido oleico, a livello della placca aterosclerotica, inibisca SIRT1, che comporta l'attivazione dell'espressione di NFkB e l'attività di iNOS, che a sua volta influenza la produzione di MMP (Chan, et al., 2015).
Lim e colleghi hanno dimostrato che l'acido oleico è in grado di attivare direttamente l'enzima SIRT1, modulando la segnalazione di AMPK e PKA. Di conseguenza, il coattivatore trascrizionale PGC1α è stato deacetilato e attivato, portando ad un aumento dell'espressione di geni legati alla completa ossidazione degli acidi grassi. Nel complesso, gli autori hanno concluso che l'acido oleico può aumentare i tassi di ossidazione degli acidi grassi in modo dipendente da SIRT1-PGC1α, spiegando, almeno in parte, alcuni degli effetti protettivi di questo acido grasso contro l'infiammazione, le dislipidemie e la resistenza insulinica, che possono influenzare l’omeostasi lipidica (Lim, et al., 2013).
Thandapilly e colleghi hanno dimostrato, in un modello di roditore con obesità indotta dalla dieta, che il trattamento con acido oleico migliora la funzione cardiaca diastolica. L'acido oleico ha anche mostrato la capacità di ridurre i livelli di marker infiammatori come il TNFα, suggerendo che ciò può contribuire alla cardioprotezione (Thandapilly, et al., 2017).
1.1.2.1.2-Effetti dell’acido oleico: evidenze cliniche
Lopez-Huertas ha condotto uno studio utilizzando un latte arricchito con PUFA (in particolare, omega 3) e/o acido oleico. In particolare, gli autori hanno selezionato nove studi sul latte arricchito in cui sono stati arruolati volontari sani, soggetti con fattori di rischio aumentati e pazienti con CVD. Complessivamente i principali effetti osservati sono stati la riduzione dei lipidi nel sangue, in particolare colesterolo, LDL e trigliceridi. Bisogna considerare che, in tutti gli studi, l'acido oleico non è stato usato da solo, ma è
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sempre stato associato con omega 3, quindi qualsiasi effetto benefico sul profilo lipidico era certamente dovuto, almeno in parte, alla loro presenza (Lopez-Huertas, 2010). Recentemente, è stato condotto uno studio crossover randomizzato (NCT02145936) per confrontare diversi tipi di SFA, che variano in lunghezza della catena (in particolare acido palmitico e acido stearico), con MUFA (acido oleico) valutando fattori di rischio cardiometabolico.
Per un periodo di cinque settimane, le donne in postmenopausa con lieve ipercolesterolemia hanno ricevuto una dieta arricchita con SFA o MUFA. Il risultato della sperimentazione è stato che le diete arricchite con acido oleico hanno prodotto una concentrazione di acido biliare secondario (SBA) fecale inferiore rispetto alle diete arricchite con acido palmitico, ipotizzando che i suoi effetti ipocolesterolemici possano essere mediati attraverso effetti collaterali sul metabolismo degli acidi biliari; infatti con le concentrazioni di SBA è possibile formulare valutazioni sui livelli plasmatici di colesterolo (Meng, et al., 2019).
In contrasto, un precedente studio di coorte ha evidenziato che l'acido oleico, analogamente agli SFA, era associato ad ipertrofia ventricolare sinistra, una delle principali cause di morte cardiovascolare (Sundström, et al., 2001).
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1.2-Produzione e conservazione di EVOO
La qualità di EVOO dipende da un processo che inizia con la maturazione delle olive e finisce con l'imballaggio. Pertanto, le pratiche agronomiche, le materie prime, la raccolta, la conservazione dei frutti e la tecnologia di estrazione, nonché l'ossigeno, la luce e la temperatura durante lo stoccaggio, devono essere considerate al fine di stimare correttamente il valore nutraceutico, nutrizionale e sensoriale (figura 6).
Figura 6: rappresentazione schematica del processo produttivo di EVOO, oli di oliva agrumati (COOs) e
indicazioni per una conservazione ideale
La "shelf life" può essere definita come un periodo di tempo dopo la produzione (in alcuni casi, dopo la maturazione o l'invecchiamento) e/o il confezionamento durante il quale, applicando determinate condizioni di stoccaggio, il prodotto alimentare mantiene la sua qualità (Nicoli, 2012).
La shelf-life di EVOO dipende principalmente dai processi di ossidazione con un progressivo degrado della frazione saponificabile ed insaponificabile responsabili delle proprietà salutari e nutraceutiche. Come riportato in letteratura, la durata di conservazione di EVOO è stata valutata da 12-18 mesi (Cicerale, et al., 2013). Tuttavia, se correttamente conservato in confezioni ben sigillate, questo prodotto può raggiungere il secondo anno di conservazione, mantenendo inalterate le sue proprietà nutraceutiche e sensoriali (Piscopo, et al., 2012).
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1.2.1-Composizione iniziale EVOO
La qualità chimica e organolettica dell'EVOO dipende da diversi fattori, come la posizione geografica dell'oliveto, la cultivar (variabilità genetica), le tecniche di coltivazione (ad esempio diversi metodi di irrigazione, oltre al tempo di raccolta), la composizione chimica e microbiologica del suolo, dalle condizioni climatiche durante la maturazione dei frutti e il processo di estrazione (Rotondi, et al., 2004; Zinnai, et al., 2014).
La stabilità dell'EVOO è dovuta principalmente all'elevato rapporto MUFA/PUFA e alla presenza di composti minori (polifenoli, carotenoidi) che svolgono un ruolo principale nella prevenzione dell'ossidazione (Bendini, et al., 2009).
L'espressione dei composti fenolici nelle olive (Ole e HT i più presenti) varia principalmente in base a fattori genetici: esistono grandi differenze tra le cultivar (Vinha, et al., 2005; Charoenprasert, et al., 2012).
Durante la maturazione e la lavorazione dei frutti, possono verificarsi reazioni chimiche ed enzimatiche che causano l'accumulo di fenoli all'interno delle olive (Jiménez, et al., 2012). Di conseguenza, la qualità, le proprietà sensoriali, la stabilità ossidativa e il valore nutrizionale dell'EVOO possono cambiare considerevolmente (Dag, et al., 2011; Zinnai, et al., 2014; Vekiari, et al., 2010).
Anche le condizioni ambientali (in particolare la luce) e il tipo di fertilizzazione influenzano profondamente la biosintesi fenolica nelle piante (López-Yerena, et al., 2019).
1.2.2-Tecnologie di estrazione
Uno dei punti critici nella produzione di EVOO è la bassa efficienza delle attuali tecniche di estrazione (Clodoveo, et al., 2013; Zinnai, et al., 2015). La soluzione più utilizzata per migliorare l'estrazione di EVOO (ottenendo una resa maggiore di frazione insaponificabile) è aumentare il tempo di gramolatura e/o la temperatura (Puértolas, et al., 2015; Fregapane, et al., 2013).
I dati scientifici riportano che la macinazione e la gramolatura sono le operazioni tecnologiche che maggiormente influenzano la qualità di EVOO e quindi la
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concentrazione di composti fenolici e carotenoidi, che sono i principali antiossidanti (Di Giovacchino, et al., 2002; Hadj-Taieb, et al., 2012).
Durante la gramolatura, la pasta delle olive frantumate viene miscelata lentamente per favorire la coalescenza, in modo da migliorare l'efficienza di separazione della successiva centrifugazione. Il punto più critico di questo passaggio è la possibile ossidazione dei composti polifenolici, che porterebbero a un olio con proprietà sensoriali e nutrizionali peggiori e a una ridotta shelf-life (Vierhuis, et al., 2001; Migliorini, et al., 2006).
Zinnai et al. hanno ideato un sistema innovativo basato sull'aggiunta diretta di un criogeno (CO2,s) alle olive durante la fase di pre-molitura, osservando effetti positivi sulla
concentrazione di polifenoli e vitamina E (Zinnai, et al., 2015; Zinnai, et al., 2016).
1.2.3-Parametri principali che influenzano la degradazione di EVOO e soluzioni per una conservazione migliore
Durante lo stoccaggio, la composizione chimica dell'EVOO (rapporto MUFA/PUFA e la concentrazione di composti minori come polifenoli e carotenoidi) è influenzata principalmente dall'equilibrio finale tra degradazione ossidativa e attività antiossidante dovuta alla presenza di tocoferoli e composti fenolici.
La componente lipidica mostra la più alta sensibilità al degrado ossidativo con il successivo sviluppo di sapori sgradevoli dovuti alla produzione di composti carbonilici e aldeidici e con il verificarsi della tipica "rancidità ossidativa". Inoltre, la disponibilità iniziale di ossigeno favorisce l'auto-ossidazione, un meccanismo basato sull’azione di radicali liberi che, a partire dalla formazione di idroperossidi, causano ulteriore degradazione.
L’auto-ossidazione sembra essere un processo accelerato dalla presenza di componenti fotosensibilizzanti (come clorofilla). Le condizioni di conservazione e imballaggio dell'OO assumono un'importanza fondamentale per il mantenimento delle caratteristiche del prodotto (Gargouri, et al., 2015).
1.2.3.1-Influenza dell’atmosfera di stoccaggio
Sono stati condotti numerosi studi sperimentali per verificare l’efficacia dell'uso di gas inerti (es. azoto) nei contenitori per migliorare la stabilità e la durata di conservazione
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dell'OO immagazzinato, rallentando così la sua degradazione ossidativa (Di Giovacchino, et al., 2002).
Sanmartin et al. hanno verificato la possibilità di utilizzare Ar e CO2 come gas per lo
stoccaggio a lungo termine dell'OO al fine di rallentarne il degrado ossidativo (Sanmartin, et al., 2018).
Dopo un periodo di 250 giorni di conservazione al buio a temperatura controllata (12 ± 1 ◦C), utilizzando Ar o CO2 nella testa del contenitore al posto dell’aria, le qualità
chimiche, nutrizionali e organolettiche dell'olio si sono mantenute inalterate.
Alla fine del periodo di conservazione, nel contenitore con la CO2, è stata riscontrata
un'interferenza organolettica negativa da parte dell’EVOO; motivo per cui non se ne supporrebbe l'uso per la conservazione a lungo termine. Pertanto, il trattamento con Ar sembra essere la migliore soluzione alternativa all'azoto per preservare la qualità di EVOO nel tempo.
1.2.3.2-Caratteristiche della conservazione in base al materiale in cui è eseguito lo stoccaggio
Tra tutte le condizioni operative che possono influenzare il tasso di degradazione di un OO, la disponibilità di ossigeno sembra essere di primaria importanza, seguita dal livello di esposizione alla luce.
Anche la presenza di componenti metallici deve essere presa in considerazione in quanto possono svolgere il ruolo di attivatori di reazioni degradative ossidative (Bendini, et al., 2009; Sanmartin, et al., 2019; Sgherri, et al., 2018), riducendo così la concentrazione di composti con effetto benefico sulla salute.
Risulta quindi necessario porre attenzione alle caratteristiche del materiale di imballaggio al fine di preservare le caratteristiche iniziali del prodotto.
Nella figura 7 sono riportate le principali caratteristiche dei materiali più utilizzati per l’imballaggio e lo stoccaggio dell'OO.
I contenitori metallici possono fornire una protezione totale dalla luce, ossigeno e vapore acqueo.
Per evitare l'attivazione dell'ossidazione mediante catalisi metallica, è possibile utilizzare contenitori di latta o acciaio e/o un rivestimento interno con resine per proteggere la
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superficie metallica dalla corrosione (in questo caso è necessario porre attenzione alla lisciviazione di composti chimici non sicuri a contatto con l’alimento).
Figura 7: la tabella in figura indica i punti di forza e i punti deboli di alcuni materiali per quanto riguarda
la conservazione di EVOO durante la fase di stoccaggio.
Il vetro rappresenta una buona barriera contro l'umidità e i gas senza lisciviazione (Venturi, et al., 2019), ma le bottiglie trasparenti non possono proteggere l'OO dalla fotossidazione (Gargouri, et al., 2015). Per questo motivo, sono stati creati vetri contenenti specifici additivi adatti a ridurre significativamente la trasmittanza della luce UV (Limbo, et al., 2014).
Per determinare l’effetto del packaging sull’OO commerciale sono stati effettuati diversi studi prendendo in considerazione diversi contenitori come bottiglie chiare e scure, in polietilene o contenitori di latta (Gargouri, et al., 2015; Pristouri, et al., 2010). La stabilità di stoccaggio degli oli in contenitori di latta, acciaio inossidabile e in vetro scuro era la più alta (Gargouri, et al., 2015).
Anche la temperatura di conservazione, oltre al tipo di imballaggio, può influenzare il tasso di degradazione dell'OO stoccato (Bendini, et al., 2009; Pristouri, et al., 2010): una temperatura più bassa applicata alla fase di stoccaggio rende più lunga la shelf-life.
1.2.3.3-Nuovi metodi di estrazione: aggiunta di antiossidanti naturali
Negli ultimi anni è stata posta molta attenzione allo sviluppo di nuovi metodi di estrazione basati sulla produzione di alimenti funzionali arricchiti con antiossidanti naturali.
Nel caso dell’EVOO, l’aggiunta di antiossidanti naturali ha conferito al prodotto finale una migliore stabilizzazione, un aumento della shelf-life (Venturi, et al., 2017;
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Tarchoune, et al., 2019), oltre a miglioramenti delle caratteristiche organolettiche, nutrizionali e nutraceutiche (Ascrizzi, et al., 2019).
L'uso dei sottoprodotti del cibo nel settore industriale come fonti naturali di composti bioattivi è stato ampiamente considerato e numerosi studi si sono concentrati sullo sviluppo di prodotti innovativi (Venturi, et al., 2017). L'attenzione è stata focalizzata sulla possibilità di ottenere prodotti tipici con ulteriori composti bioattivi, attraverso il recupero di sottoprodotti (ad esempio scorze di limone e arancia che, contenenti alti livelli di polifenoli, hanno attirato l'interesse scientifico a causa delle loro potenti attività antimicrobiche e antiradicali; Papoutsis, et al., 2018).
1.3-Oli di oliva fortificati con bucce di agrumi
Ascrizzi e colleghi hanno caratterizzato degli oli fortificati con bucce di agrumi toscani, in particolare limone (COOL) e arancio (COOA), provenienti dalla provincia di Massa. Il flavedo di queste specie è stato utilizzato per la produzione oli di oliva di agrumi (COOs) ottenuti con un metodo innovativo, in cui le bucce vengono criomacerate e quindi pressate con le olive (Ascrizzi, et al., 2019).
La presenza di carotenoidi, naringenina e composti fenolici, classifica questi COOs come nutraceutici in grado di promuovere una salutare alimentazione.
Inoltre, la maggiore presenza di Tyr e HT in COOs rispetto all'olio non aromatizzato, evidenzia ulteriormente il loro valore nutrizionale.
Le bucce di agrumi, ricche di composti bioattivi, sono state così utilizzate trasformandole da rifiuto in una risorsa innovativa.
1.3.1-Agrumi di Massa-Carrara
La coltivazione degli agrumi ha una lunga tradizione nella provincia di Massa-Carrara (Toscana, Italia) (Toscana, R. Prodotti Vetrina Toscana: Arancio Massese. http://www.vetrina.toscana.it/ prodotti/arancio-massese/; Giampaoli, 1976). Grazie al clima di questa zona, dalle temperature miti date alla vicinanza del mare e dalla posizione geografica che garantisce protezione dal vento, questi agrumi possiedono
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caratteristiche peculiari che li distinguono da quelli coltivati in altri luoghi (Tintori, Limone massese-Oscar Tintori-Gli Agrumi In Toscana-Sito Ufficiale e Online Shop. https://www.oscartintori.it/prodotto/limone-massese).
I limoni (C. limon (L.) Osbeck) sono frutti di forma rotonda e di dimensione media. Le loro caratteristiche principali sono la buccia fine e il sapore agrodolce, per cui possono anche essere consumati freschi. Sono dotati di una vita post-raccolta relativamente lunga, con decomposizione lenta (Toscana, R. Prodotti Agroalimentari Tradizionali Della Toscana- scheda identificativa limone massese:
http://prodtrad.regione.toscana.it/LIB_ProdTrad/Prodotto.php?ID=116).
Le arance (C. sinensis (L.) Osbeck) sono frutti di forma rotonda, con un colore arancione chiaro sia nella buccia che nella polpa, e una dimensione medio-piccola. La polpa è ricca di succo, caratterizzata da un sapore agrodolce e un odore gradevole (Toscana, R. Prodotti Agroalimentari Tradizionali della Toscana-Scheda identificativa Arancio massese: http://prodtrad.regione.toscana.it/LIB_ProdTrad/Prodotto.php?ID=113). Una strategia per il settore agroalimentare degli agrumi potrebbe essere il recupero dei suoi sottoprodotti, in particolare bucce e semi, da utilizzare per l’ottenimento di alimenti innovativi in grado di combinare proprietà nutrizionali e salutari, e quindi di soddisfare le esigenze dei consumatori. Ciò potrebbe garantire lo sfruttamento di tutte le parti del frutto, senza sprechi.
I COOs sono stati ottenuti attraverso l'aggiunta diretta di bucce di agrumi crio-macerate nel frantoio, insieme alle olive fresche durante l'estrazione dell'olio (Zinnai, et al., 2011; Zinnai, et al., 2015).
1.3.1.1-Caratterizzazione dell’olio essenziale (OE) del flavedo di limone
Sei composti sono stati identificati nella frazione volatile ottenuta dalla spremitura manuale del limone, tutti appartenenti alla famiglia dei monoterpeni.
Il limonene rappresentava oltre il 70% della composizione totale, seguito da β-pinene (14,9%) e γ-terpinene (9,6%).
L’OE dell’idrodistillato di flavedo di limone era composto per oltre il 75% da monoterpeni e i composti più abbondanti erano gli stessi della frazione volatile spremuta manualmente: limonene (50,2%), β-pinene (10,6%) e γ-terpinene (9,6%).
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1.3.1.2-Caratterizzazione dell’olio essenziale (OE) del flavedo di arancia
La frazione volatile ottenuta dalla spremitura manuale era maggiormente rappresentata da monoterpeni (oltre il 98%), tra i quali il limonene era il più abbondante (91,4%), seguito dal sabinene (3,2%) e dal mircene (2,6%).
L'OE dell’idrodistillato di flavedo di arancia era composto per oltre il 90% da monoterpeni e il composto più abbondante era lo stesso della frazione volatile spremuta manualmente: limonene (85,7%). Altri composti presenti a quantità significative erano rappresentati da sabinene (1,9%), mircene (2,2%), ottanale (2,0%) e linalolo (3,5%).
1.3.2-Olio di oliva di agrumi (COO)
I campioni di agrumi sono stati raccolti da un agricoltore individuale (Aldo Fiorentini) in provincia di Massa.
Gli EVOO aromatizzati e quelli di controllo (non aromatizzati) sono stati prodotti a partire più varietà di olive: Frantoio, Moraiolo, Leccino.
1.3.2.1-Estrazione
Le bucce di agrumi durante la notte sono state criomacerate con anidride carbonica solida (1:1 in peso) e successivamente aggiunte direttamente (22% in peso) alle olive prima della molitura.
L'estrazione è stata effettuata utilizzando un micro oleificio (Oliomio Baby®, prodotto da “Toscana Enologica Mori”, Tavernelle Val Di Pesa, Firenze, Italia) in grado di macinare 20-30 kg di olive.
1.3.2.2-Parametri di qualità e analisi sensoriale
Gli acidi grassi liberi, indice dei perossidi e gli indici spettrofotometrici (K232, K270 e ∆K) sono stati determinati secondo i metodi analitici ufficiali dell'UE descritti nel regolamento CEE/2568/91. L'aggiunta di sottoprodotti della produzione di agrumi alle olive durante il processo di estrazione non ha influito sulla qualità dell'OO.
Entrambi gli oli hanno mostrato una buona intensità di aroma, anche se con profumi diversi.
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I parametri del gusto sono stati valutati globalmente come simili dai giudici del panel test, raggiungendo valori relativi all'amaro e al piccante piuttosto bassi rispetto a un OO generico.
Viste le loro caratteristiche entrambi i COOs potrebbero essere usati non solo come condimento per cibi salati, ma anche come ingrediente interessante per l'applicazione in pasticceria, grazie alla loro nota dolce. Infine, entrambi i campioni hanno avuto risultati positivi dall’analisi sensoriale: nessun giudice di panel ha attributo un giudizio negativo (parametro importante per definirne la classe commerciale secondo i limiti legali per l’EVOO, previsto dal regolamento CEE/2568/91 e successive modifiche e integrazioni (REGULATION, H. Commission Regulation (EEC), 1991)).
1.3.2.3-Analisi contenuto fenolico
La determinazione dei fenoli totali è stata eseguita secondo il metodo colorimetrico di Folin-Ciocalteau, usando acido gallico come standard.
I composti fenolici possiedono una vasta gamma di funzioni biologiche attribuite alle loro attività antiossidante.
I COOs, rispetto all’EVOO di controllo, hanno mostrato una ridotta quantità di fenoli continuando a mantenere una buona attività antiossidante.
Per quanto riguarda il contenuto totale di carotenoidi, i risultati erano molto diversi tra i due COOs, poiché COOL presentava un valore quasi sei volte superiore rispetto al COOL. Questo può essere spiegato visto il fatto che i carotenoidi sono responsabili della colorazione della buccia e della polpa dell’arancia (Alquezar, et al.,2008; Rodrigo, et al., 2004). Il processo di criomacerazione, usato per la produzione di COOs, potrebbe incidere positivamente sull’estrazione di carotenoidi. La quantità di carotenoidi, molecole dotate di spiccata attività antiossidante, può essere un parametro importante da considerare poichél'assunzione di questi nella dieta comporta minore incidenza di numerosi disturbi di salute cronici, tra cui malattie cardiache, deterioramento maculare legato all'età e alcuni tumori (Cooper, et al., 1999).
1.3.2.4-Analisi del contenuto di alcoli/aldeidi/acidi fenolici
Entrambi i COOs hanno mostrato valori 3 volte più alti nel contenuto totale di alcoli/aldeidi/acidi fenolici dell’EVOO usato per controllo.
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Gli acidi fenolici possono vantare un potenziale ruolo protettivo contro le malattie che possono essere correlate al danno ossidativo (malattia coronarica, ictus e cancro) (Masaki, et al., 1997). Oltre alle proprietà antiossidanti e salutari, gli acidi fenolici sono stati associati al colore e alle qualità sensoriali dell’alimento (Maga, 1978). Inoltre, questi composti possono essere considerati potenziali marcatori di origine geografica o varietà di olivo.
Entrambi i COOs hanno mostrato un aumento del livello di HT e un aumento di 3 volte di quello del Tyr.
L’attività antiossidante, notoriamente riconosciuta a Tyr e HT, ha fatto in modo di avviare degli studi di questi composti per la prevenzione delle malattie cardiovascolari (Covas, et al., 2006). Inoltre sono state attribuite anche a composti minori (Fernández-Mar, et al., 2012) un’attività antitumorale, antimicrobica, antidiabetica e neuroprotettiva.
Aumenti marcati del contenuto di acido vanillico, p-cumarico e ferulico, che sono stati visti in COOL, potrebbero essere attribuiti all'aggiunta di scorze di agrumi (Mallek-Ayadi, et al., 2017).
Molte attività benefiche per la salute umana sono state attribuite a questi composti fenolici a causa della loro forte attività antiossidante. Uno studio condotto da Zang et al. (Zang, et al., 2000) ha dimostrato che l'acido p-cumarico può agire come uno “scavenger” diretto delle specie reattive dell'ossigeno al fine di prevenire la perossidazione lipidica.
L'impiego di scorze di agrumi nel processo di estrazione dell’OO, consente di ottenere COOs più ricchi di composti fenolici: composti ad alta attività antiossidante (Wang, et al., 2011).
1.3.2.5-Analisi del contenuto di flavonoidi
La presenza di flavonoidi nell’ EVOO di controllo ha rappresentato il 5% del contenuto fenolico.
In particolare, la luteolina è uno dei principali flavonoidi rilevati nell’EVOO di controllo (tabella 1) (Peres, et al., 2016; Franco, et al., 2014).
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L’altro flavonoide presente in buona quantità (39%) è il kaempferolo. Meno presenti sono luteolina-7-O-glucoside, rutina, quercetina-3-O-glucoside, apigenina-7-O-glucoside, quercitrina, quercetina-3- O-glucuronide e quercetina.
La diversa procedura di estrazione ha influenzato la composizione flavonoidica di COO rispetto al controllo.
Infatti nei COOs la luteolina è ancora rilevata in grandi quantità (tabella 1), ma il profilo flavonoidico dei COOs è caratterizzato dalla presenza di naringenina (26% e 22% del contenuto di flovonoidi rispettivamente in COOL e COOA). Questa molecola essendo peculiare degli agrumi, deriva necessariamente dall'aggiunta di scorze di agrumi durante la frangitura, e potrebbe aggiungere valore nutraceutico ai COOs. (Tripoli, et al., 2007).
Tabella 1: Cambiamenti nella composizione dei flavonoidi (µg/mg fenoli) EVOO di controllo, COOL e COOA.
Somministrazioni di naringenina mostravano attività antiinfiammatorie e antiossidanti. Un numero crescente di ricerche suggerisce che l'integrazione di naringina sia benefica per il trattamento di obesità, diabete, ipertensione e sindrome metabolica (Karim, et al., 2018). Inoltre, la naringina e la naringenina hanno un ruolo importante nella protezione dallo stress ossidativo, essendo entrambi potenti agenti anti-radicali liberi e prevenendo la perossidazione lipidica (Fuhr, et al., 2013; Alam, et al., 2014).
Composto EVOO di controllo COOL COOA
Luteolin-7-O-glucoside 1.10 ± 0.02b 2.92 ± 0.07a 1.13 ± 0.09b Rutin 0.05 ± 0.00b n.d. n.d. Quercetin-3-O-glucoside 0.11 ± 0.00a n.d. n.d. Apigenin-7-O-glucoside 3.45 ± 0.04a 0.04 ± 0.00b 0.01 ± 0.00b Quercitrin 4.30 ± 0.07a 2.13 ± 0.09c 2.72 ± 0.08b Quercetin-3-O-glucuronide 2.22 ± 0.08a 0.18 ± 0.00b 0.07 ± 0.00c Quercetin 1.23 ± 0.03a 0.01 ± 0.00c 0.08 ± 0.00b Luteolin 18.88 ± 0.32b 22.72 ± 0.30a 18.14 ± 0.67b Kaempferol 20.37 ± 0.69a 2.70 ± 0.13b 0.18 ± 0.03c Naringenin n.d. 10.53 ± 0.49a 6.11 ± 0.59b Total 51.71 ± 0.37a 41.22 ± 0.63b 28.45 ± 1.46c
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1.4-Valore nutraceutico dei flavanoni del Citrus e le loro implicazioni sulle patologie cardiovascolari
Figura 8: Principali composti flavonoidici risconstrabili nei frutti del genere Citrus.
Evidenze cliniche e precliniche evidenziano che i flavanoni appartenenti ai frutti del genere Citrus svolgono un’attività benefica nei confronti delle patologie cardiovascolari (Dauchet, et al., 2015; He, et al., 2006).
Un recente studio epidemiologico condotto su circa 70.000 donne ha evidenziato che esiste una correlazione inversa tra rischio di ischemia cerebrale e assunzione di flavanoni. Questa è apprezzabilmente significativa considerando donne che consumano
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alti livelli di flavanoni (> 63 mg /giorno) rispetto quelle che ne consumano a bassi livelli (<13,7 mg/giorno) (Cassidy, et al., 2012).
Un altro studio condotto in Finlandia su circa 10.000 uomini e donne volto alla considerazione della correlazione tra rischio cardiovascolare e assunzione di flavanoni, ha rilevato una riduzione del 20% delle malattie cerebrovascolari in coloro che hanno consumato i livelli maggiori di flavanoni (4,7-26,8 mg di aglicone/giorno) (Knekt, et al., 2017).
Cassidy et al. hanno riportato studi eseguiti su donne e uomini di mezza età e su anziani negli Stati Uniti in cui è stata esaminata l'associazione tra assunzione abituale di diverse sottoclassi di flavonoidi e incidenza di ipertensione. Questa analisi ha confermato che l'assunzione abituale di flavonoidi (principalmente dal consumo di flavanoni presenti in pompelmi, arance e succhi di agrumi) è correlata a una ridotta incidenza di ipertensione (Cassidy, et al., 2011).
1.4.1- Riduzione della disfunzione endoteliale e miglioramento della funzione vascolare
La correlazione tra ipertensione e disfunzione endoteliale è stata ampiamente dimostrata, così come quella tra la riduzione dell'integrità endoteliale e i processi aterosclerotici.
L'endotelio vascolare è responsabile della regolazione del tono vascolare attraverso gli effetti di mediatori sintetizzati localmente, in particolare ossido nitrico (NO),NO sintasi endoteliale (eNOS) e superossido. Quindi, l'integrità e la reattività dell'endotelio devono essere garantite per prevenire la progressione delle malattie cardiovascolari (Bleakley, et al., 2015).
Numerosi studi riportano una correlazione tra l’assunzione di flavanoni del Citrus e vasodilatazione oltre alla riduzione della disfunzione endoteliale.
Uno studio della durata di 4 settimane di trattamento con 292 mg di esperidina ha mostrato una riduzione della pressione diastolica di 4 mmHg in uomini moderatamente sovrappeso. Inoltre, esperidina può influenzare positivamente la funzione endoteliale. Sulla base di questi risultati, gli autori incoraggiano il consumo di alimenti combinati con agrumi (Morand, et al. 2011).
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Uno studio clinico sulla sindrome metabolica condotto su 25 pazienti affetti ha evidenziato come, con il trattamento con 500 mg al giorno di capsule contenenti il 98% di esperidina pura per 3 settimane, si verifica una ridotta espressione di E-selectina, un biomarcatore di disfunzione endoteliale. Questo effetto clinico è stato accompagnato da un miglioramento della produzione endogena di NO, facendo ipotizzare un miglioramento della funzione endoteliale (Rizza, et al., 2011, Roohbakhsh, et al., 2015).
1.4.2-Riduzione livelli lipidici
Livelli elevati di LDL sono la causa principale della progressione dell'aterosclerosi, causa di complicanze cardiovascolari, tra cui infarti, ictus ischemico e malattie coronariche (Grundy, et al, 2014).
Numerosi studi clinici randomizzati con terapie basate su statine e non, hanno dimostrato che una riduzione dei livelli di LDL riduce i rischi cardiovascolari (Naci, et al., 2013).
È interessante notare che la naringenina promuove una diminuzione delle LDL, dei trigliceridi e inibisce l'assorbimento del glucosio. Inoltre aumenta le HDL, migliorando le difese antiossidanti, riducendo al minimo i geni correlati all'aterosclerosi (Orhan, et al., 2015).
Uno studio ha dimostrato che dei topi nutriti HF più naringina, mostravano una significativa riduzione (41%) della placca aterosclerotica rispetto al gruppo alimentato con solo HF (Chanet, et al., 2012).
Per quanto riguarda degli effetti dei flavanoni del Citrus su pazienti ipercolesterolemici, uno studio condotto su 25 volontari con livelli elevati di LDL e colesterolo ha dimostrato che 4 settimane di alimentazione con 600 mL/giorno di succo d'arancia sono in grado di ridurre significativamente i livelli plasmatici di marcatori di stress ossidativo e livelli di apo A (Constans, et al., 2015).
Uno studio clinico effettuato somministrando 500 mg di naringina più 800 mg di esperidina non ha mostrato un significativo miglioramento del profilo lipidico in pazienti con ipercolesterolemia moderata. Inoltre, in un ulteriore lavoro svolto su pazienti sovrappeso a cui è stata somministrata 292 mg di esperidina e 47,5 mg di narirutina per 4 settimane non si sono evidenziati miglioramenti delle LDL (Morand, et al., 2011).
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Secondo alcuni autori, queste discrepanze sono dovute al diverso tipo di formulazione oltre alla variabilità inter-individuale soggettiva nel profilo farmacocinetico.
1.4.3-Meccanismi d'azione responsabili dei benefici cardiovascolari dei flavanoni del genere Citrus
1.4.3.1-Azione antiossidante e antiinfiammatoria
Meccanismi ossidativi e infiammatori possono favorire la progressione della aterosclerosi e quindi l'insorgenza delle malattie cardiovascolari. In soggetti sani, i flavanoni del Citrus non hanno mostrato significativi effetti antiossidanti, il che suggerisce che la loro azione antiossidante sia trascurabile in condizioni normali. Nei soggetti anemici con ipercolesterolemia, è stato dimostrato che la naringina, somministrata per 8 settimane alla dose di 400 mg/die, ha aumentato significativamente i livelli di SOD e catalasi (Jung, et al., 2003), suggerendo che i flavanoni del genere Citrus abbiano un effetto benefico nei confronti di dislipidemie oltre a contribuire ad un aumento delle difese antiossidanti endogene.
È stato dimostrato che l'esperidina sia in grado di aumentare le difese antiossidanti promuovendo l'espressione di Nrf2, suggerendo un effetto anti-invecchiamento di questo flavonoide sui cuori di ratto senescente (Elavarasan, et al., 2012).
I flavanoni possono ridurre le chemochine, molecole infiammatorie e di adesione, la cui espressione è strettamente regolata dal fattore pro-infiammatorio NF-kB (Yamamoto, et al., 2013; Park, et al., 2012).
500 mg di esperidina possono contribuire a ridurre i valori plasmatici dei fattori infiammatori e dell'espressione genetica delle proteine coinvolte nella proliferazione cellulare, chemiotassi e adesione piastrinica (Reshef, et al., 2005). Sulle cellule endoteliali umane, l'esperetina e i suoi principali metaboliti hanno inibito la migrazione cellulare indotta da TNF-α (Giménez-Bastida, et al., 2015).
Un ulteriore bersaglio infiammatorio centrale è rappresentato dalle metalloproteasi della matrice: in particolare MMP9 coinvolto nelle lesioni aterosclerotiche. Uno studio ha dimostrato che naringenina e la naringina hanno ridotto l'espressione di MMP9, riducendo la migrazione delle cellule muscolari lisce. Tale azione potrebbe essere, almeno in parte, correlata alla soppressione dell'attivazione di NF-kB (Lee, et al., 2009).
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1.4.3.2-Attività vasodilatante
L’azione sui vasi da parte dei flavonoidi del genere Citrus è stata oggetto di numerosi studi che ne confermano l’attività.
Rizza et al. hanno valutato l’azione dell'esperetina sui vasi. Questa, attraverso la produzione endoteliale di ossido nitrico (NO), induce vasodilatazione e il suo derivato glicosilato (glicosil-esperedina), somministrato per 8 settimane a ratti ipertesi spontaneamente, è stato in grado di ridurre i parametri di pressione del 3% oltre a migliorare la risposta endoteliale (Rizza, et al., 2011; Yamamoto, et al., 2008; Yamada, et al., 2006).
L'esperetina ha causato vasodilatazionein arterie coronarie isolate di roditori, attivando canali di calcio voltaggio dipendenti e le correnti di potassio (Liu, et al., 2014).
Gli effetti vasorilassanti mediati da naringenina, sono probabilmente collegati all'apertura di un canale di potassio attivato dal calcio (BKCa) situato sulla membrana sarcolemmatica delle cellule muscolari lisce (Saponara, et al., 2006; Calderone, et al., 2004).
1.4.3.3-Attività anti-ischemica
Il rischio cardiovascolare può essere causa, spesso fatale, dell’infarto del miocardio. È necessario studiare agenti in grado di prevenirlo oltre ad agenti utili per contenere il danno.
Numerosi studi preclinici hanno dimostrato la cardioprotezione conferita dai flavonoidi degli agrumi.
In modelli vivo o ex-vivo di ischemia-riperfusione (I/R), la somministrazione di naringenina poteva conferire cardioprotezione e questa azione sembrava essere mediata dall'attivazione dei canali BKCa espressi sulla membrana mitocondriale interna. Questo canale, coinvolto nella vasodilatazione, una volta attivato, a livello mitocondriale, svolge un ruolo cruciale negli eventi I/R. La naringenina ha promosso a livello mitocondriale un ridotto assorbimento di calcio e una lieve depolarizzazione, oltre a limitare la probabilità di formazione di pori di transizione permeabilità mitocondriale (MPTP) e morte apoptotica dei cardiomiociti (Testai, et al., 2013; Testai, et al., 2015).
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1.4.3.4-Tolleranza al glucosio
L’integrazione per 4 o più settimane con flavanoni, è in grado di ridurre la glicemia, l'insulinemia e migliorare la tolleranza al glucosio negli animali diabetici o insulino-resistenti che conducono un’alimentazione con una dieta ricca di grassi.
La naringina e dell'esperidina hanno evidenziato proprietà insulino-simili in quanto sono risultate in grado di ridurre l'espressione di PPAR-γ e l'attività della glucochinasi (enzima chiave coinvolto nel metabolismo del glucosio) (Sharma, et al., 2011; Jung, et al., 2006).
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2-Scopo della ricerca
Gli EVOO, colonne portanti della dieta mediterranea, sono stati descritti come alimenti funzionali dotati di un'alta qualità nutrizionale.
In generale, l'olio d'oliva è un alimento composto da una frazione saponificabile (circa il 98-99%, di cui l’acido oleico è l’acido grasso più rappresentativo) e da una frazione insaponificabile (circa 1-2%, composta da polifenoli, vitamina E ed altre componenti). Numerosi studi suggeriscono come gli effetti benefici di EVOO siano collegati principalmente ai polifenoli.
A tal proposito sono stati messi a punto OO fortificati ottenuti tramite particolari metodi di estrazione con aggiunta di altre componenti vegetali (come bucce di agrumi) al fine di conferire caratteristiche organolettiche, di conservazione, nutraceutiche e nutrizionali migliori, ipotizzando un effetto sinergico in grado di contribuire agli effetti benefici sulla salute.
In particolare, lo scopo di questo lavoro di Tesi, è stato quello di verificare l’effetto di EVOO fortificati con bucce di agrumi (COOs) quali arancia e limone sui parametri cardiometabolici su ratti alimentati con una dieta high fat (HF).
Al fine di valutare tali effetti sono stati considerati i seguenti parametri: incremento percentuale di peso corporeo, intake di cibo, BMI, peso degli organi (cuore, fegato, tessuto adiposo viscerale e tessuto adiposo bruno), panel lipidico, profilo glicemico, attività enzimatica della Citrato Sintasi nel tessuto adiposo, potenziale di membrana mitocondriale a livello cardiaco e pressione sistolica.
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3-Materiali e metodi
3.1-Animali
Gli esperimenti sono stati condotti su 40 ratti wistar (figura 9) di sesso maschile e peso di 346,3 ± 3,6 g.
Figura 9: ratto maschio albino, ceppo wistar.
Prima di iniziare la sperimentazione, gli animali sono stati pesati quotidianamente e monitorati fino a raggiungimento di età e peso corporeo ideali per l’inizio del trattamento.
Successivamente sono stati stabulati singolarmente in gabbie trasparenti di plexiglass, al fine di permettere diverse tipologie di trattamento.
La sperimentazione è stata condotta in conformità alla normativa comunitaria (direttiva CEE 750/2013) e alla normativa italiana (DL n° 26/2014), autorizzazione n° 12/2019-PR rilasciata in data 10/01/2019. Quindi gli animali sono stati monitorati quotidianamente per quanto riguarda le condizioni igieniche e fornendo acqua e cibo ad libitum durante il periodo di osservazione ed assicurando un intake preciso di acqua durante il periodo di trattamento.
Nello stabulario erano inoltre garantite condizioni controllate con cicli di luce/buio di 12 ore, ad una temperatura stabile di 22 ± 1°C, e tasso di umidità del 50 %.
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3.1.1-Trattamento
Gli animali sono stati suddivisi in 5 gruppi e trattati per 21 giorni a seconda del tipo di dieta utilizzata:
• Standard (STD) (figura 10); • High Fat (HF (figura 11); • HF + EVOO (EVOO) (5,5% p/p);
• HF + EVOO fortificato con bucce di limone (COOL) (5,5% p/p); • HF + EVOO fortificato con bucce di arancia (COOA) (5,5% p/p);
La quantità di EVOO aggiunta all’alimentazione è stata del 5,5% p/p, calcolata considerando il claim pubblicato dall’EFSA, riportante l’intake quotidiano di polifenoli consigliato per avere benefici. Il cibo è stato somministrato sotto forma di mangime triturato. Giornalmente è stato valutato l’intake di cibo, e 3 volte alla settimana il peso dei singoli animali.
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3.2-Protocollo sperimentale
Alla fine del trattamento, 24 ore prima del sacrificio, ciascun animale è stato privato di cibo.
Quindi l’animale è stato anestetizzato con un’iniezione intraperitoneale di tiopentale sodico (60 mg/Kg) per eseguire la misurazione della pressione; successivamente è stato eseguito il test della glicemia (Glucocard G meter, Menarini Diagnostics), attraverso il prelievo caudale di sangue.
Quindi gli animali sono stati sacrificati con overdose di anestetico, e si è proceduto con l’esportazione degli organi; in particolare, dopo aver esposto la cavità addominale, è stato eseguito il prelievo di sangue intracardiaco e trasferito in provette con EDTA come anticoagulante (BD Vacutaine). Il sangue intero è stato utilizzato subito per la valutazione di panel lipidico (colesterolo, HDL, LDL, trigliceridi) e i livelli di emoglobina glicata con lo strumento Cobas b101 (Roche Diagnostics), e il rimanente è stato centrifugato a 3200 RPM per 10 minuti ottenendo il plasma, che è stato congelato a -20°C per analisi successive.
In seguito sono stati prelevati cuore, fegato e tessuto adiposo addominale e tessuto adiposo bruno.
Il fegato, dopo l’asportazione, veniva lavato in soluzione PBS 1X a pH 7,4 e a 4 °C, asciugato con carta assorbente e fotografato per l’acquisizione macroscopica. È stato poi pesato e un lobo tagliato in 3 parti, due delle quali sono state congelate a -80 °C per svolgere successivamente una valutazione dei livelli di citochine pro-infiammatorie mentre la terza è stata fissata in paraformaldeide al 4 % permettendone la valutazione istologica.
Il tessuto adiposo addominale e quello bruno, venivano rimossi e lavati in una soluzione di STE a pH 7,4 e a 4 °C, asciugati con carta assorbente e pesati. Del tessuto adiposo addominale sono state preparate poi delle aliquote da 500 mg e congelate a -80 °C, utilizzate in seguito per la valutazione dell’attività enzimatica della Citrato Sintasi. Il cuore è stato lavato in una soluzione di STE a pH 7,4 e a 4 °C per rimuovere l’eventuale sangue rimasto e annessi; successivamente è stato pesato e preparato per la valutazione del potenziale mitocondriale.
