Università degli Studi di Pisa
Facoltà di Ingegneria
Corso di Laurea Specialistica
In Ingegneria Biomedica
Tesi di Laurea
STUDIO MORFOLOGICO DEL FLUSSO DEL
MICROCIRCOLO: ALTERAZIONI
LEGATE ALL’ETA’
Relatori:
Prof. Luigi Landini
Prof. Leonardo Bocchi
Candidata:
Giada Straface D’Angela
Sommario
Introduzione ... 4
Capitolo 1 ... 7
Fisiologia del sistema cardiovascolare ... 7
1.1 Circolazione Sistemica ... 7
1.2 Vasi sanguigni ... 8
1.3 La microcircolazione ... 12
1.3.1 I capillari ... 12
1.3.2 Meccanismi di scambio capillare ... 14
1.3.3 Meccanismi di controllo ... 16
1.3.4 Il riscaldamento locale ... 18
1.4 Vasomotion e flowmotion ... 20
1.4.1 Meccanismi per la generazione della vasomotion ... 20
1.4.2 Flowmotion ... 21
Capitolo 2 ... 22
La flussimetria Laser-‐Doppler ... 22
2.1 L’effetto Doppler ... 23
2.2.2 Principi di funzionamento ... 26
2.2.3 Limiti e vantaggi della Flussimetria Laser-‐Doppler ... 28
2.3 Perimed – PeriFlux System 5000 ... 29
2.3.1 L’unità LDPM: PF 5010 ... 31
2.3.2 L’unità di temperatura:PF 5020 ... 33
Capitolo 3 ... 35
Analisi delle Componenti Principali (PCA) ... 35
3.1 Il metodo ... 35
3.2 Procedura formale di estrazione delle componenti principali ... 38
3.3 Standardizzazione delle variabili d’origine ... 40
3.4 Proprietà delle componenti principali ... 41
3.5 PCA e FFT ... 42
Capitolo 4 ... 44
WEKA: Waikato Environment for Knowledge Analysis ... 44
4.1 Classificazione ... 45
4.2 Ambienti operativi di Weka ... 47
4.2.1 Explorer ... 47
4.3 Classificatori utilizzati ... 49
Capitolo 5 ... 55
Materiali e metodi ... 55
5.1 Soggetti ... 55
5.2. Hardware di acquisizione ... 56
5.2.1 Scheda NI USB-‐6009 ... 57
5.3 Protocollo di acquisizione ... 58
5.4 Elaborazione e analisi dei dati ... 60
Risultati ... 66
Introduzione
La continua evoluzione della tecnologia offre sistemi sempre più avanzati per operare sul cuore e sui grandi vasi, sia a livello di analisi che a livello di terapia.
I metodi non invasivi e minimamente invasivi per la valutazione delle proprietà del sistema cardiovascolare, sono di fondamentale importanza per le ricerche biomediche e cliniche. In particolare, un grande sforzo è stato dedicato alla valutazione delle proprietà meccaniche del cuore e dei grossi vasi, nel tentativo di stimare la gittata cardiaca dal segnale di pressione acquisito sia a livello dell'aorta, che a livello dell'arteria brachiale [1].
La funzione vascolare periferica, ed in particolare la sua proprietà di adattabilità, rimane però difficile da analizzare.
Questa sua complessa dinamica è fondamentale per la gestione di vari processi correlati tra loro. Esempi propri della capacità adattativa della circolazione periferica sono la regolazione del metabolismo tissutale, la resistenza periferica, il controllo della pressione emodinamica arteriosa e l'omeotermia.
In questi ultimi anni, si sta sollevando una forte attenzione sulle proprietà del flusso del microcircolo e la sua importanza è stata riconosciuta anche nella pratica clinica [5], ad esempio in caso di sepsi [6] o diabete [7]. Recentemente, la morfologia della forma d'onda del flusso di sangue è stata analizzata in alcuni casi, in particolare nella retina [10].
Lo scopo del presente lavoro è di analizzare, dunque, la forma d'onda del flusso nel microcircolo cutaneo utilizzando metodi classici, basati sull'applicazione della Trasformata Discreta di Fourier (FFT) e dell’Analisi delle Componenti Principali (PCA), per valutare le proprietà del flusso sanguigno periferico. Come problema di esempio, è stata valutata la capacità del metodo proposto, di valutare le alterazioni correlate con l'invecchiamento del sistema vascolare.
Poiché siamo interessati a un'applicazione che permetta anche il monitoraggio a lungo termine del paziente, è stato utilizzato un Flussimetro Laser Doppler. Lo studio ha coinvolto un gruppo di 40 volontari sani.
L’acquisizione e l’elaborazione dei segnali è stata eseguita in ambiente Matlab, mentre la classificazione dei dati è stata eseguita utilizzando Weka.
L'elaborato è suddiviso in cinque capitoli, il primo dei quali descrive la fisiologia dell'apparato cardiocircolatorio soffermandosi sul microcircolo, che è l'oggetto dello studio. In particolare, vengono presentati i concetti di vasomotion e flowmotion e la loro importanza.
Nel secondo capitolo vengono esposti i principi alla base della Flussimetria Laser Doppler.
Il terzo capitolo mira a descrivere l’Analisi delle Componenti Principali (PCA) dal punto di vista matematico, ponendo anche l’attenzione sugli obiettivi, sui vantaggi e sulle proprietà di questa metodologia.
Come accennato sopra, la classificazione dei dati, è stata eseguita utilizzando Weka. Weka è un “open source software” che è stato ideato dall’ Università di Waikato in Nuova Zelanda, tutte le informazioni riguardati l’utilizzo sono disponibili nel Capitolo 4.
La parte sperimentale, con l’indicazione dei soggetti e dei pazienti, delle caratteristiche dello strumento utilizzato e delle metodiche è presentata nel Capitolo 5.
Seguono poi i risultati ottenuti, le conclusioni e alcune indicazioni per il proseguimento dell’attività di ricerca.
Ai miei genitori
“…non “lasciatevi vivere”, ma prendete nelle vostre mani la vostra vita e vogliate decidere di farne un autentico e personale
Capitolo 1
Fisiologia del sistema cardiovascolare
Prima di addentrarci nello studio oggetto di questa tesi, è necessaria una breve descrizione dell’organizzazione del sistema vascolare.
L’apparato cardiovascolare o cardiocircolatorio è costituito dal cuore che sarà la nostra "pompa", da una serie di tubi che permettono la distribuzione e la raccolta del sangue e di un’estesa rete di piccoli vasi (capillari) che consentono un rapido scambio fra i tessuti e i canali vascolari.
Nel 17º secolo fu William Harvey a dimostrare come il sistema cardiovascolare fosse una sorta di circuito chiuso, attraverso il quale il sangue veniva pompato dal cuore, dando vita a due circoli, ovvero la circolazione polmonare e la circolazione sistemica [2].
1.1
Circolazione Sistemica
Di nostro interesse è la circolazione sistemica che si compone di distinti distretti circolatori separati, che forniscono sangue ai diversi organi del corpo e sono disposti tra loro in parallelo.
La circolazione sistemica parte dal ventricolo sinistro del cuore con l’aorta, l’arteria più grande. L’aorta si dirama in due vie, la carotide destra e sinistra, che portano il sangue alla testa e in seguito tramite una rete di arterie (ascellari, splenica, renali, iliache, femorali, ecc.) il sangue, carico d’ossigeno, finisce per perfondere tutti gli organi e i tessuti.
Dopo che il sangue ha raggiunto le parti più periferiche del corpo attraverso vasi sempre più piccoli, e dopo aver effettuato gli scambi nutrizionali con i tessuti attraverso la rete capillare, torna, deossigenato, verso il cuore attraverso il sistema venoso.
Il sangue che proviene dalla testa, dal torace e dagli arti superiori confluisce nella vena cava superiore; quello che proviene dai visceri e dalle gambe confluisce nella vena cava
inferiore.
Entrambe le vene sboccano nell’atrio destro del cuore chiudendo la circolazione sistemica.
Il sangue scorre rapidamente attraverso l’aorta e i rami arteriosi; questi si riducono progressivamente di calibro, mentre diminuisce anche lo spessore parietale e avviene tutta una serie di modificazioni istologiche man mano che ci si avvicina alla periferia. Iniziando da una struttura prevalentemente elastica, l’aorta, nelle arterie periferiche tende a prevalere il tessuto muscolare, finché a livello delle arteriole, lo strato muscolare predomina nettamente.
Il flusso arterioso pulsatile (o pulsatorio), dovuto all'intermittenza della gittata cardiaca, è smorzato a livello capillare dalla combinazione fra distensibilità delle grandi arterie e resistenza frizionale offerta delle arteriole. Molti capillari hanno origine dalla stessa arteriola, per cui l'area della sezione trasversale totale del letto capillare è notevolmente elevata, nonostante che l'area della sezione trasversale che ogni singolo capillare sia inferiore a quella di ogni singola arteriola.
Di conseguenza, il flusso ematico nei capillari diventa piuttosto lento, analogamente alla diminuzione della velocità del flusso osservabile nelle zone più larghe lungo il corso di un fiume. Poiché i capillari sono formati da corti tubi le cui pareti hanno lo spessore di una cellula, e giacché la velocità di flusso è bassa, nel letto capillare s’instaurano condizioni ideali perché si realizzi, per diffusione, lo scambio di sostanze fra sangue e tessuti.
1.2
Vasi sanguigni
Quindi ricapitolando, i vasi sanguigni si differenziano per ruolo e dimensioni e si dividono in:
Arterie
Le arterie trasportano il sangue sotto pressione dal cuore alla periferia. Ad eccezione delle arterie polmonari e ombelicali, il sangue che scorre al loro interno è ossigenato. La parete delle arterie è composta di tre strati di tessuto (tunica intima, tunica media e tunica avventizia) (Fig. 1.1a), in modo da sopportare l’alta pressione del flusso ematico
in uscita dal cuore (intorno a 100 mmHg) (Fig. 1.1b). Il loro diametro può variare da un massimo di 2,5 cm (arteria aorta) a pochi mm (piccole arterie). Smorzano le pulsazioni del flusso di sangue in uscita dal cuore e garantiscono ai tessuti un flusso ematico più continuo [2].
Arteriole
Le arteriole sono definite come le arterie di diametro inferiore a 50 µm: in generale ciascuna delle arterie destinate all’irrorazione di un organo si ramifica 6-8 volte prima di dare origine ad arterie tanto piccole da meritare il nome di “arteriola” [2]. Le pareti di questi vasi possiedono una tunica media ricca di fibre muscolari lisce (Fig. 1.1a). Per questo motivo le arteriole rappresentano i vasi che offrono la maggiore resistenza al flusso del sangue, e costituiscono il sito principale di regolazione del flusso ematico in tutti i circoli distrettuali e della distribuzione del flusso ematico tra i diversi circoli distrettuali [1]. Approssimativamente, il 70% della caduta di pressione che avviene tra cuore e circolo venoso, avviene in corrispondenza delle piccole arterie e arteriole (all’interno delle arteriole la pressione passa da circa 80mmHg a 35mmHg) (Fig. 1.1b) [2].
Capillari
I capillari, che vedremo più in dettaglio nel paragrafo successivo, sono sottili strutture tubulari la cui parete è costituita da un singolo strato di cellule endoteliali altamente permeabili (Fig. 1.1a). I capillari rappresentano i vasi deputati allo scambio di molecole tra il sangue e liquido extra cellulare. Il bilancio tra forze idrostatiche e oncotiche determina velocità di filtrazione o di riassorbimento di liquido da parte dei capillari [1]. Essendo sprovvisti di tunica media, l’unica struttura che permette l’accesso del sangue al vaso è lo “sfintere pre-capillare” (fibre muscolari lisce che circondano l’origine del capillare). Questi vasi sono così abbondanti che una qualsiasi cellula dell’organismo è distante non più di 20-30 µm da un capillare. Il calibro dei capillari (circa 5 µm) è leggermente inferiore a quello del singolo eritrocita (6-8 µm): all’interno di questi vasi i globuli rossi (e le altre cellule del sangue) possono passare uno per volta, sia pure con modificazioni reversibili della loro forma [2].
Venule
Le venule sono piccoli vasi che permettono al sangue deossigenato proveniente dal letto capillare di pervenire in vasi di calibro più grande come le vene. La parete di questi vasi è composta di uno strato di cellule endoteliali circondato da un singolo strato di fibre muscolari lisce (fig. 1.1a), essendo più sottile rispetto alla parete delle arteriole (in cui prevale la muscolatura liscia.)
Vene
Le vene sono i vasi sanguigni che riconducono il sangue dalla periferia al cuore. Ad eccezione delle vene polmonari e ombelicali, al loro interno scorre sangue deossigenato. Nonostante il calibro sia comparabile con quello delle arterie (il loro diametro varia da un massimo di 3 cm fino a pochi mm), le vene differiscono da queste ultime per struttura e funzione. La parete vasale è più sottile e povera di muscolatura liscia rispetto a quella arteriosa, a causa dei bassi valori di pressione sanguigna. Inoltre, sono presenti valvole unidirezionali che impediscono possibili ristagni di sangue (Fig. 1.1a). Le vene contengono la maggior parte del volume del sangue circolante e, grazie a presenza nelle loro parenti di muscolatura liscia e di valvole unidirezionali, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della distribuzione del volume del sangue nell’organismo.
Figura 1.1: Costituzione delle pareti dei vasi sanguigni (a) e andamento della pressione sanguigna nei vari tipi di vaso (b). Fonte: www.cvphysiology.com
1.3
La microcircolazione
La microcircolazione è la circolazione del sangue nei piccoli vasi sanguigni.
Le principali funzioni del microcircolo sono la fornitura di ossigeno e di sostanze nutritive e la rimozione del biossido di carbonio (CO 2). Serve anche a regolare il flusso di sangue e la perfusione tissutale con effetti sulla pressione sanguigna e sulla risposta infiammatoria.
I capillari si trovano al centro del sistema del microcircolo che comprende arteriole, capillari e vene.
Come vedremo, lo scambio di sostanze tra sangue e liquido interstiziale avviene mentre il sangue attraversa i capillari.
La funzione principale di arteriole e vene è di dirigere il flusso di sangue ai e dai capillari.
1.3.1 I capillari
I capillari sono una rete estesa di vasi sanguigni a parete molto sottile che consentono uno scambio diffusionale di molecole estremamente rapido. I capillari si ramificano dalle arteriole e terminano svuotandosi nelle venule. Ciascun capillare è lungo solo 1 mm ma tutti insieme essi rappresentano il più esteso punto di comunicazione tra liquido interstiziale e sangue. La rete di capillari è talmente estesa gran parte delle cellule dell’organismo si trovano a una distanza dai capillari inferiore agli 0,02 mm. Grazie queste distanze così brevi, le molecole possono muoversi per diffusioni con grande rapidità dalla cellula al capillare più vicino. Giunte nel sangue le molecole vengono poi rapidamente trasportate verso il cuore. Una seconda caratteristica dei capillari, che li rende adatti al compito dello scambio di molecole, è che la parete di questi vasi ha lo spessore di un solo strato cellulare. Ciò facilita ulteriormente lo scambio diffusionale rapido tra sangue e liquido interstiziale. I processi di scambio che avvengono a livello dei capillari sono il risultato di un equilibrio dinamico tra forze diffusionali, osmotiche e idrostatiche.
La distribuzione dei capillari è diversa tra i vari tessuti del corpo: essi sono molto numerosi nei tessuti con elevata attività metabolica (cuore, muscoli, ghiandole), e scarsi nei tessuti meno attivi (ossa, cartilagini). Inoltre, non tutti i capillari presentano la stessa permeabilità e lo stesso diametro.
Sebbene i capillari veri e propri non contengano muscolatura liscia, in molti casi all’inizio del capillare si trova un piccolo manicotto di muscolo liscio che è chiamato sfintere pre-capillare.
L’entità del flusso di sangue attraverso i capillari è stabilita dal grado di contrazione della muscolatura liscia delle arteriole e dello sfintere capillare. Se osservassimo con un microscopio il flusso del sangue nei capillari, noteremo che esso si verifica solo sporadicamente. Ciò è conseguenza della contrazione e del rilasciamento degli sfinteri pre-capillari che tendono a essere completamente chiusi o completamente aperti (vasomotilità). Tale vasomotilità è fortemente influenzata dallo stato metabolico del tessuto. Quando gli sfinteri sono rilasciati, il diametro dei capillari è appena sufficiente per permettere che gli eritrociti passino, compressi, in fila indiana.
Nel loro passaggio per i capillari, gli eritrociti assumono una forma a ditale o a paracadute con la concavità nel senso del flusso. Questa configurazione sembra dovuta semplicemente alla pressione nel centro del vaso, indipendentemente dal fatto che i bordi dell’eritrocita siano o no in contatto con le pareti del vaso.
La cute contiene due tipi diversi di sistemi di microcircolazione. Il sistema più superficiale e simile a quello sopra descritto. Il secondo sistema consiste di una serie di anastomosi artevenose, di grande diametro e dotate di pareti muscolari, che si trovano prevalentemente nelle dita delle mani, nelle dita dei piedi e nella faccia. Questo tipo di vasi non è coinvolto nello scambio di molecole, ma piuttosto, è specializzato nello scambio di calore tra sangue e superficie corporea. La riduzione del tono simpatico che agisce su questi vasi provoca vasodilatazione che, a sua volta, produce lo spostamento di una parte del flusso di sangue verso la superficie del corpo dove è facilitata la perdita di calore da parte dell’organismo.
Come già accennato, la parete dei capillari (di spessore pari a 0,5 µm) è formata da un singolo strato di cellule endoteliali che poggia su una sottile membrana vasale. Nella parete, così formata, s’intervallano diversi piccoli passaggi che permettono la comunicazione tra l’interno dei capillari e l’esterno (fessure intercellulari) (Fig. 1.3). Questi pori sono costituiti dagli interstizi situati tra cellule endoteliali adiacenti e hanno una larghezza pari a 6-7 nm (leggermente inferiore ad una molecola di albumina); permettono, tuttavia, la diffusione di molecole di acqua e della maggior parte degli ioni idrosolubili. Le dimensioni dei pori capillari varia in base alle funzioni dell’organo di cui fanno parte i vasi. Nell’encefalo, per esempio, le giunzioni tra cellule endoteliali dei capillari sono molto ridotte, permettendo il passaggio nei tessuti cerebrali solo di
molecole assai piccole (acqua, ossigeno, anidride carbonica). Questa disposizione costituisce la cosiddetta “barriera ematoencefalica”.
Nelle cellule endoteliali sono inoltre presenti piccole vescicole plasmalemmali, originate dall’inglobamento di minuscole porzioni di plasma o di liquido interstiziale. Tali vesciche possono migrare lentamente attraverso la cellula endoteliale, trasportando rilevanti quantità di sostanza da una parte all’altra della parete capillare [4].
1.3.2 Meccanismi di scambio capillare
Gli scambi di sostanze tra plasma e liquido interstiziale avvengono attraverso due meccanismi: la diffusione e la filtrazione.
La diffusione rappresenta il passaggio diretto attraverso le membrane ed è il meccanismo principale mediante il quale si attuano gli scambi di sostanze tra plasma e liquido interstiziale [3,4]. Durante il passaggio di sangue nei vasi della microcircolazione, si assiste alla diffusione di un elevato numero di molecole di acqua e particelle disciolte, da una parte all’altra della parete capillare. La diffusione netta di una determinata sostanza è proporzionale alla differenza di concentrazione tra i due lati della membrana capillare, come indicato nella seguente equazione:
𝐽 = −𝑃𝑆 𝐶
!− 𝐶
!(1.1)
dove J rappresenta la quantità di sostanza che si muove nell’unità di tempo, P è la permeabilità del capillare ad una determinata sostanza, S è l’area della superficie capillare, Ce e Ci sono rispettivamente la concentrazione esterna ed interna al capillare della sostanza considerata. Poichè l’ossigeno risulta maggiormente concentrato nel sangue, secondo la 1.1 è presente un trasporto netto verso l’esterno dei capillari. Viceversa, l’anidride carbonica, essendo maggiormente concentrata nei tessuti, diffonderà principalmente dal liquido interstiziale verso il sangue.
Quando la permeabilità è elevata, l’equilibrio di concentrazione è raggiunto rapidamente, la quantità di sostanza che passa dipende dall’entità di flusso ematico (perfusione).
Quando la permeabilità è ridotta, la quantità di sostanza che passa dipende dalla diffusione.
La permeabilità dei pori capillari ad una determinata sostanza dipende dalle dimensioni delle molecole presenti nella sostanza stessa. Le proteine sono di poco più grandi dei pori, mentre le molecole di acqua, avendo un diametro 20 volte inferiore a quello delle fessure, fluiscono da una parte all’altra della parete senza problemi. Altre sostanze come ioni cloro, sodio, glucosio e urea, hanno dimensioni intermedie tra quelle della molecola di acqua e quelle delle molecole proteiche [1].
Inoltre a livello capillare esistono forze (pressioni) che favoriscono il movimento di liquido dal vaso all’interstizio (filtrazione) e forze che facilitano il movimento di liquido dall’interstizio al vaso (riassorbimento).
L’equazione di Starling (1.2) mette a confronto queste forze. Dal prevalere delle une o delle altre dipende se il liquido è filtrato o riassorbito.
Le forze che favoriscono la filtrazione sono: - Pressione capillare (𝑃!);
- Pressione colloido-osmotica interstizio (𝜋!, dovuta alla concentrazione interstiziale delle proteine).
Le forze che favoriscono il riassorbimento: - Pressione idrostatica interstizio (𝑃!);
- Pressione colloido-osmotica capillare (𝜋!, dovuta alla concentrazione plasmatica delle proteine).
𝑃
!""= 𝑘[ 𝑃
!+ 𝜋
!− 𝑃
!+ 𝜋
!] (1.2)
dove k è una costante di filtrazione per la membrana capillare. La filtrazione avviene quando la somma algebrica è positiva, mentre il riassorbimento si verifica quando è
negativa [3]. La pressione di filtrazione (13 mmHg all’estremo arteriolare) risulta maggiore di quella di riassorbimento (7 mmHg all’estremo venulare); questa differenza è dovuta alla maggiore numerosità e permeabilità dei capillari venosi rispetto a quelli arteriosi. A causa di questo sbilanciamento dei valori di pressione tra i due estremi del capillare, una quantità di liquido filtra fuori dal vaso all’estremo arteriolare, per essere riassorbita a valle in corrispondenza dell’estremo venulare.
Figura 1.2 Fenomeno di filtrazione e riassorbimento
1.3.3 Meccanismi di controllo
La circolazione periferica è sottoposta sostanzialmente ad un doppio controllo: un controllo centrale, dovuto al sistema nervoso, e un controllo locale a livello tissutale, dovuto alle condizione ambientali in prossimità dei vasi sanguigni. L’importanza relativa dei due meccanismi di controllo non è la stessa per tutti i tessuti. In alcune aree dell’organismo, quali l’epidermide e le regioni splancniche, predomina la regolazione nervosa del flusso ematico, mentre in altre, quali il cuore e l’encefalo, tale meccanismo svolge un ruolo minore [1].
Il doppio controllo della circolazione periferica (dovuto a meccanismi intrinseci ed estrinseci) consente tutta una serie di modificazioni vascolari miranti a dirigere il flusso sanguigno nelle aree in cui esso è maggiormente necessario, riducendolo invece nelle
aree il cui fabbisogno immediato è inferiore. In alcuni tessuti esiste una potenza relativa più o meno fissa dei meccanismi estrinseci ed intrinseci, mentre in altri il rapporto fra tali meccanismi è variabile, a seconda delle condizioni di attività.
1.3.3.1 Controllo intrinseco o locale del flusso periferico
In molti tessuti il flusso sanguigno sembra dipendere dall’attività metabolica ivi presente; inoltre, alterazioni indotte nella pressione di perfusione (pressione arteriosa) in presenza di livelli costanti di metabolismo tissutale (misurate sulla base del consumo di ossigeno) inducono variazioni delle resistenze vascolari che tendono a mantenere costante il flusso ematico: tale meccanismo viene comunemente definito
autoregolazione del flusso ematico.
Il meccanismo responsabile dell’invarianza di flusso, pur in presenza di alterazioni della pressione di perfusione, non è noto; sono state suggerite tre possibili spiegazioni:
• L’ipotesi della pressione tissutale; • L’ipotesi miogenica;
• L’ipotesi metabilica.
Secondo la prima teoria, l’aumento della pressione di perfusione induce un aumento del volume sanguigno nel tessuto e un passaggio netto di fluido dalla regione intravascolare a quella extravascolare: l’aumento conseguente della pressione tissutale (turgore) si ritiene possa comprimere i vasi a parete sottile, riducendo in tal modo il flusso verso il tessuto stesso [1]. La riduzione della pressione di perfusione avrebbe invece l’effetto opposto.
Secondo l’ipotesi miogenica, la muscolatura vascolare liscia si contrae in risposta ad un aumento di tensione, mentre si rilascia al ridursi della tensione stessa [1]. La pressione transmurale è definita come la differenza di pressione attraverso la parete del vaso sanguigno. La regolazione miogenica del tono vascolare consiste nell’abilità della muscolatura liscia vasale di rispondere attivamente a variazioni di tale pressione. In particolare, si ha vasocostrizione delle arteriole quando la pressione transmurale aumenta e vasodilatazione quando diminuisce.
Secondo l’ipotesi metabolica, il flusso sanguigno è regolato dall’attività metabolica tissutale e qualunque intervento che riduca l’apporto di 𝑂! rispetto al fabbisogno dei tessuti provoca la formazione dei metaboliti vasodilatatori. Tali metaboliti vengono
liberati dai tessuti e agiscono localmente dilatando i vasi di resistenza; quando il tasso metabolico dei tessuti aumenta, oppure si riduce l’apporto di 𝑂! ai tessuti stessi, una maggiore quantità di vasodilatatori viene immessa in circolo ed aumenta la concentrazione tissutale di metaboliti. Uno degli aspetti più interessanti della ipotesi metabolica è che, nella maggior parte dei tessuti, il flusso sanguigno segue l’andamento dell’attività metabolica; pertanto, anche se la pressione resta sostanzialmente costante, l’attività metabolica e il flusso sanguigno nei vari tessuti dell’organismo presentano variazioni analoghe in condizioni fisiologiche (per esempio, durante uno sforzo).
1.3.3.2 Controllo estrinseco del flusso sanguigno periferico
Il sistema nervoso simpatico costituisce la branca del sistema nervoso autonomo responsabile della regolazione neurogenica della microcircolazione. I vasi del microcircolo sono innervati da fibre nervose di tipo C (amieliniche e di piccolo calibro). Rispetto all’innervazione motoria, la via simpatica è formata da un neurone pre-gangliare e da uno post- pre-gangliare. I neuroni pre-gangliari simpatici sono tutti colinergici, mentre quelli post- gangliari sono adrenergici (ad eccezione delle fibre che innervano ghiandole sudoripare e i muscoli piloerettori). I neurotrasmettitori vanno ad agire sulle cellule muscolari lisce vascolari previa combinazione con i recettori presenti in queste cellule effettrici. I recettori dell’acetilcolina possono essere di due tipi (nicotinici e muscarinici), mentre i recettori adrenergici possono essere di tipo 𝛼 o 𝛽. A loro volta, i recettori adrenergici possono essere suddivisi in: recettori 𝛼!e 𝛼!, recettori 𝛽! e 𝛽! . La noradrenalina agisce principalmente sui recettori 𝛼 e in lieve misura su
quelli 𝛽, mentre l’adrenalina agisce in egual misura su entrambi. La maggior parte dei vasi del microcircolo periferico (arteriole sistemiche), subiscono costrizione per effetto della stimolazione simpatica. Nei vasi sanguigni, la stimolazione dei recettori 𝛼 provoca vasocostrizione, mentre la stimolazione dei recettori 𝛽 (in particolar modo 𝛽! ), causa
vasodilatazione [4].
1.3.4 Il riscaldamento locale
Il livello di perfusione cutanea è soggetto sia a una reazione termoregolatrice controllata sia all’influenza degli effetti diretti di riscaldamento e raffreddamento della pelle. Gli effetti dei cambiamenti locali in temperatura sono in grado di accentuare la
vasocostrizione e vasodilatazione della pelle. Questi effetti sono provocati da una combinazione di meccanismi che coinvolgono l’endotelio, i nervi adrenergici e sistemi sensoriali.
Il riscaldamento locale avvia una vasodilatazione transitoria dovuta al riflesso assonico seguita da una fase di plateau dovuta in gran parte al rilascio di ossido nitrico.
Negli anni ’40 vennero fatti i primi studi sul controllo termico locale della circolazione, fu evidenziata una relazione non lineare tra il flusso sanguigno nell’avambraccio e la temperatura della pelle [5]. Il flusso sanguigno subiva incrementi relativamente piccoli tra in 20° e i 35°C raggiungendo un valore massimo in corrispondenza di temperature prossime ai 42°C. Fu, inoltre, osservato che un prolungato riscaldamento a un elevata temperatura costante causasse una iniziale vasodilatazione, seguita da un ritorno basale; il fenomeno “die-way”. Le osservazioni di Barcroft e Edholm [2] hanno costituito la base per gli studi successivi effettuati dalla seconda metà del XX secolo in poi. In generale, un riscaldamento locale della pelle produce una risposta del flusso sanguigno cutaneo caratterizzata da un picco iniziale, seguito da una fase di plateau prolungata e, infine, da un ritorno ai valori pre-riscaldamento [3]. Gli attori principali di questo meccanismo sono: l’ossido nitrico, i nervi simpatici adrenergici e i nervi sensoriali, ognuno dei quali ricopre un ruolo ben specifico nella risposta vasodilatatoria da stimolo termico locale.
Figura 1.3 Andamento tipico del flusso in seguito a riscaldamento locale
termocettori del caldo o dai nocicettori, che agiscono mediante un riflesso assonico locale. In particolare, il picco iniziale della risposta sembra essere causato dai nervi sensoriali, mentre il successivo plateau è dovuto in gran parte al rilascio di ossido nitrico (Fig. 1.7); infatti, l’inibizione del NOS influenza maggiormente la fase di plateau (ritardando o riducendo di poco il picco iniziale), mentre l’utilizzo di anestetici topici influenza solo il picco iniziale, lasciando inalterato il plateau [3].
Anche il sistema nervoso simpatico risulta coinvolto nel controllo del microcircolo cutaneo in seguito ad uno stimolo termico locale. L’attività simpatica può supportare o modificare la vasodilatazione, ma non risulta essenziale per l’esistenza della risposta. Sembra chiaro, però, che il fenomeno di die away dipenda proprio dalla funzione simpatica adrenergica.
1.4
Vasomotion e flowmotion
Per vasomotion s’ intende l’insieme delle oscillazioni spontanee del tono vascolare che portano a variazioni del diametro dei vasi e, di conseguenza, a oscillazioni del flusso sanguigno (flowmotion).
1.4.1 Meccanismi per la generazione della vasomotion
Per la generazione della vasomotion è necessaria la presenza di una sorta di pacemaker cellulare. Un meccanismo di questo tipo è la fluttuazione della concentrazione di Ca2+ intracellulare. Un pre-requisito fondamentale per la fluttuazione della concentrazione di Ca2+, è l’oscillazione del potenziale di membrana cellulare. Infatti, la depolarizzazione periodica della membrana induce un influsso periodico di Ca2+ (tramite i canali voltaggio-dipendenti) che, a sua volta, induce una corrente di depolarizzazione. La corrente di depolarizzazione “recluta” le cellule muscolari lisce limitrofe, mediante i contatti intercellulari (gap junction), portando all’apertura simultanea dei canali del calcio voltaggio-dipendenti e, dunque, ad un influsso di Ca2+ nelle cellule vicine [8].
1.4.2 Flowmotion
La vasomotion può essere osservata in vivo solo con un microscopio intravitale, strumento che non è sempre facilmente applicabile all’oggetto di studio.
Poichè la vasomotion, quindi, risulta di difficile valutazione in vivo, la maggior parte degli studi nel settore si sono concentrati sull’osservazione della flowmotion mediante tecniche di indagine non invasiva (come la flussimetria laser- Doppler - LDF). Questa tecnica non invasiva permette di quantificare il flusso di globuli rossi all’interno di un piccolo volume di tessuto. Un problema legato a questo tipo di misure è che sono influenzate dai vasi vicini e da fattori della circolazione principale, come le fluttuazioni della pressione sanguigna. La flowmotion misurata non è necessariamente una conseguenza delle attività ritmiche del vaso specifico dove si effettua la misura, ma rappresenta l’integrazione di diverse attività periodiche di differente origine.
La misura della perfusione cutanea mediante LDF, fornisce un segnale che può essere analizzato in frequenza. In generale, lo spettro risultante fornisce informazioni circa la presenza di varie componenti oscillatorie (comprese tra 0.0095 Hz e 2 Hz), ognuna delle quali ha un significato fisiologico ben preciso [8]:
• attività cardiaca (0.6 Hz - 2 Hz). La spinta residua esercitata dal cuore sugli eritrociti è stata individuata nel microcircolo periferico, mediante l’acquisizione simultanea del tracciato ECG e del flusso sanguigno. Si nota una componente con frequenza pari a quella cardiaca (circa 1 Hz a riposo) [8];
• attività respiratoria (0.145 - 0.6 Hz). L’inspirazione, stimolando il ritorno venoso verso l’atrio destro, induce una componente oscillatoria nel flusso sanguigno di frequenza pari a quella respiratoria (a riposo vale circa 0. 3 Hz) [8];
• attività miogenica (0.052 Hz - 0.145 Hz). Manifesta la capacità della muscolatura liscia di rispondere a variazioni della pressione transmurale [8];
• attività neurogenica (0.021 Hz - 0.052 Hz). È stato dimostrato che il controllo simpatico sulla circolazione periferica si esplica in questo intervallo di frequenze, poichè su lembi cutanei denervati si nota una diminuzione significativa di questa componente [8];
• attività endoteliale (0.0095 Hz - 0.021 Hz). Questa componente spettrale riflette il ruolo vasoattivo dell’endotelio nella regolazione locale del flusso sanguigno [8].
Capitolo 2
La flussimetria Laser-‐Doppler
La Flussimetria Laser Doppler è una tecnica che valuta la perfusione dei tessuti, a livello della microcircolazione, sfruttando il principio fisico dell’effetto Doppler della luce laser (Fig. 2.1).
Figura 2.1: Sezione della cute in cui è rappresentata la profondità di penetrazione della luce laser. Le anse formate delle arteriole ascendenti e dalle venule
discendenti del plesso superficiale sono raggiunte dal fascio, mentre la rete di vasi più in profondità, che costituisce il secondo plesso
orizzontale, non è oggetto alla misura
Il Flussimetro Laser Doppler (LDF) emette un fascio laser (Light Amplifcation by Stimulated Emission of Radiation) monocromatico a bassa energia (circa 1 mW) che penetra nel tessuto in esame: le onde riflesse dalle superfici sottostanti vengono registrate da un sensore. I corpuscoli in movimento (eritrociti) provocano una variazione della lunghezza d'onda della luce laser che li illumina, proporzionale alla loro velocità media (effetto Doppler). La luce riflessa è captata da un fotorivelatore ed istantaneamente analizzata dallo strumento.
Questo metodo, essendo di semplice implementazione e non invasivo, viene largamente usato in medicina per lo studio della dinamica dei vasi anche di dimensioni ridottissime.
Secondo la teoria dell’effetto Doppler, le onde che colpiscono oggetti in movimento subiscono uno shift in frequenza: in questo tipo di applicazione, tali oggetti sono i globuli rossi che circolano nei microvasi. Monitorando l’andamento del microcircolo nel tempo, oltre all’intensità dei singoli impulsi, il LDF è in grado di registrare le variazioni ritmiche che avvengono nel flusso ematico cutaneo, ovvero la flowmotion.
La microcircolazione cutanea è organizzata in due plessi orizzontali: uno superficiale situato circa 1.0-1.5 mm sotto la superficie della pelle e uno più profondo, situato nella zona di collegamento tra cute e sottocute. Arteriole ascendenti e venule discendenti si ramificano in entrambi i plessi. Il LDF rileva il movimento di alcuni degli elementi corpuscolari del sangue transitanti nel microcircolo del plesso superficiale, ma non si estende al di là di questi vasi alla profonda del plesso orizzontale sotto il derma (Fig.2.1). I vasi raggiunti sono arteriole, venule e capillari aventi una sezione trasversale di 0.002-0.008 mm2 [3].
Per quanto riguarda l'applicabilità pratica del metodo, bisogna tenere conto delle condizioni ambientali e posturali del soggetto, che devono seguire un protocollo standard. Per evitare artefatti, ad esempio, si chiede al paziente di sostenersi e mantenere la massima immobilità della zona in esame.
2.1 L’effetto Doppler
L’effetto doppler è un fenomeno fisico che consiste nel cambiamento, rispetto al valore originario, della frequenza f o della lunghezza d’onda λ percepita da un osservatore raggiunto da un’onda emessa da una sorgente che si trovi in movimento rispetto all’osservatore stesso.
Questo fenomeno venne analizzato per la prima volta da Christian Andreas Doppler nel 1845, il quale verificò la sua analisi ponendosi in prossimità di un binario e ascoltando il suono emesso da un vagone pieno di musicisti, mentre si avvicinava e poi mentre si allontanava.
Con questo esperimento, Christian Andreas Doppler confermò che l'altezza del suono era più alta quando l'origine del suono si stava avvicinando, e più bassa quando si stava allontanando. In seguito nel 1848 Hippolyte Fizeau scopri che lo stesso fenomeno valeva anche per le onde elettromagnetiche [2].
Lo shift Doppler è definito come uno spostamento della frequenza dell’onda che avviene quando vi è movimento relativo tra la sorgente e il ricevitore. Quando ricevitore e sergente si muovono sulla stessa linea, sussiste la seguente relazione:
𝑓
!=
! ! !!! ! !!
𝑓
! (2.1)
in cui vr è la velocità del ricevitore (positiva se esso si muove verso la sorgente), vs è la velocità della sorgente (positiva se la sorgente si allontana dal ricevitore), fr e fs sono le frequenze rispettivamente dell’onda ricevuta e inviata, e c è la velocità di propagazione dell’onda. Nel caso in cui la velocità c sia significativamente superiore a vr e vs, come nel caso qui trattato in cui c è la velocità della luce, in prima approssimazione la (2.1) può essere espressa come:
𝑓
!= (1 −
!!!!!!
)𝑓
! (2.2)Che dipende dalla velocità relativa tra l’emettitore e il ricevitore. Lo shift Doppler fr - fs in questo caso vale:
∆𝑓 = −
!!! !!!
𝑓
!= −
!!!!!!!
(2.3)
dove λs è la lunghezza d’onda del segnale inviato. Il valore di Δf è in questo caso direttamente proporzionale alla velocità relativa tra l’emettitore e il ricevitore. Nel caso in cui sorgente e ricevitore si muovano in direzioni diverse, influiscono sull’effetto Doppler solo le proiezioni sulla retta passante per la sorgente e il ricevitore dei vettori velocità.
Chiamando α e β gli angoli formati da tali vettori con la retta passante sorgente e ricevitore, e la (2.2) diventa:
𝑓
!= (1 −
!!!"# ! !!!!"# !
2.2 Il Laser-‐Doppler in campo vascolare
L’utilizzo dell’effetto Doppler in campo vascolare è stato introdotto da Stern nel 1975, che per primo dimostrò che lo shift Doppler della luce può essere utilizzato per quantificare il movimento dei globuli rossi nella pelle. Il segnale retrodiffuso attraversava un collimatore pinhole e, successivamente, veniva rivelato da un fotomoltiplicatore [3].
Per ottenere un segnale Doppler da un fluido, questo deve contenere corpuscoli in grado di riflettere le onde incidenti: nel caso del sangue, i globuli rossi, che si muovono ad una velocità di 0.01-10 mm/s, costituiscono i principali agenti riflettenti. La luce laser ha la caratteristica di essere coerente e monocromatica, il che significa che viene emessa in un fascio concentrato e ad una singola frequenza fs. La dimensione di un globulo rosso è circa 7-8 µm: poiché la radiazione viene solitamente emessa ad una lunghezza d’onda di circa 0.7 µm, il fatto che i corpuscoli sui quali incide il segnale siano più grandi della sua lunghezza d’onda limita i fenomeni di dispersione, favorendo la riflessione .
Per la (2.4), la componente del vettore velocità dei globuli rossi che contribuisce all’effetto Doppler è quella perpendicolare alla cute. I globuli rossi che scorrono nelle parti ascendenti e discendenti delle anse contribuiscono quindi in modo più consistente di quelli che percorrono la parte superiore e parallela alla cute.
Nell’acquisizione del segnale del microcircolo cutaneo il principio della (2.2) viene applicato due volte:
1) una sonda emettitrice, ferma (vs = 0), trasmette la luce laser attraverso la cute. I globuli rossi che scorrono nel sangue (con velocità dei globuli rossi, positiva se si avvicinano alla cute) ricevono il segnale con una frequenza fg, che per la (2.2) vale:
𝑓
!= 1 −
!!! !𝑓
!= (1 +
!! !)𝑓
! (2.5)2) una sonda ricettrice, ferma (vr = 0), riceve attraverso la cute la luce laser riflessa
dai globuli rossi, avente frequenza fg. I globuli rossi, che ora sono gli emettitori, hanno ancora velocità vg, in questo caso positiva se si allontanano dalla cute, quindi con segno opposto alla equazione precedente. La frequenza del segnale ricevuto vale:
𝑓
!= 1 +
!!!𝑓
!= 1 +
!!!1 +
!!!𝑓
!= (1 +
!!!!!+ 2
!!!)𝑓
!(2.6)
che sotto l’ipotesi che c >> vg, da:
𝑓
!= 1 + 2
!!!
𝑓
!(2.7)
La differenza di frequenza tra il segnale inviato e quello ricevuto, cioè lo shift Doppler, per la (2.7) vale:
𝑓
!− 𝑓
!= 2
!!!
𝑓
!= 2
!!!!
(2.8)
ed è quindi proporzionale alla velocità dell’agente riflettente e inversamente proporzionale alla lunghezza d’onda del segnale emesso.
La luce complessivamente riflessa ricevuta dalla sonda si compone di due porzioni: • una porzione è costituita della luce che ha colpito oggetti fissi e a causa della
natura elastica del fenomeno, risulta alla stessa frequenza della luce trasmessa; • l’altra porzione è quella luce che viene riflessa dagli oggetti in movimento, che
ha subito uno shift in frequenza. La frequenza di questa parte del segnale sarà, per la (2.8), proporzionale alla velocità media dei globuli rossi che hanno riflesso il raggio laser e l’ampiezza del segnale è proporzionale al loro numero.
2.2.2 Principi di funzionamento
La luce laser emessa dalla sorgente è trasmessa mediante fibre ottiche che scorrono attraverso una sonda: la testa della sonda viene posta a contatto con la pelle. Le strutture sottostanti possono riflettere, assorbire o disperdere i fotoni incidenti. Un’altra fibra ottica a contatto con la superficie della pelle (Fig 2.2) raccoglie la luce riflessa o diffusa dalle strutture sia fisse che in movimento.
Figura 2.2 Testa della sonda a contatto con la pelle.
A muoversi sotto la cute però non sono unicamente i globuli rossi, anche le onde riflesse da tessuti in movimento come la parete vascolare possono subire uno shift Doppler. La riflessione dovuta ai tessuti di solito dà un segnale di ampiezza molto più grande rispetto a quella dovuta agli elementi corpuscolari del sangue, a causa del maggior numero di onde incidenti su di essi; la velocità di movimento del tessuto è generalmente molto inferiore a quella del sangue, vi sarà per questo un contributo associato alla bassa frequenza che può essere soppresso da un filtro passa-alto.
Il segnale risultante, composto dalle due porzioni di luce riflessa, presenta il fenomeno della frequenza di battimento. Questo fenomeno è ciò che avviene quando si sovrappongono segnali aventi frequenze simili ma non identiche. L’onda risultante ha come frequenza la media delle frequenze, ma la sua ampiezza è modulata dallo sfasamento dovuto alla diversità delle frequenze: ciò che risulta è un segnale con ampiezza che oscilla tanto più velocemente quanto più le frequenze differiscono [4]. Questo campione misto contenente le frequenze di battimento viene poi analizzato e scomposto nelle sue due componenti shiftate e non-shiftate. La parte contenente informazioni sullo shift viene filtrata attraverso il passa-alto per eliminare i contributi dovuti al movimento dei tessuti: ogni campione del segnale di uscita dallo strumento è proporzionale ai valori di frequenza e ampiezza di questo segnale. Essendo questi parametri legati rispettivamente alla velocità dei globuli rossi e al loro numero, essi sono in grado di quantificare la fornitura ematica tissutale, cioè la perfusione. Ciò che viene misurato è detto flux., che a differenza del flow, non è una misura assoluta della velocità di cellule del sangue. Nessuna versione corrente dello strumento laser Doppler è in grado di fornire valori di perfusione assoluti, come ad esempio ml/min/g di tessuto.
Attualmente, le misurazioni sono espresse come unità di perfusione (PU), che sono arbitrarie [4].
Il volume di misura, fissato nella sua componente di area superficiale ma variabile in profondità, è influenzato dai seguenti fattori [4]:
• le caratteristiche del tessuto, come struttura e densità dei letti capillari, pigmentazione, ossigenazione;
• la lunghezza d’onda della sorgente luminosa, in quanto più breve è la lunghezza d’onda più superficialmente si esaurisce la sua capacità di penetrare il tessuto; ciò si verifica a causa della maggior probabilità che le onde a frequenza superiore hanno di collidere con particelle riflettenti;
• la configurazione della sonda, in particolare la separazione delle fibre, in quanto a una maggior distanza tra le fibre di trasmissione e ricezione corrisponde una maggior profondità di tessuto analizzato.
Il LDF utilizza un sistema ad onda continua: le onde riflesse o retro diffuse possono provenire indifferentemente da riflessioni avvenute all’altezza di qualsiasi sezione del raggio laser penetrante. Avendo lo scopo di valutare complessivamente la perfusione tissutale, e non ad esempio di localizzare i vasi, il LDF non fornisce informazioni sulla posizione degli oggetti riflettenti: nel caso in cui si desideri disporre di questo tipo di informazioni è necessario utilizzare un sistema a onde pulsate.
2.2.3 Limiti e vantaggi della Flussimetria Laser-‐Doppler
Un problema insito nell’utilizzo della LDF è la mancanza di una misurazione dello zero assoluto da parte dello strumento. Infatti, quando il flusso di globuli rossi viene ridotto a zero, sperimentalmente o da escissione chirurgica, spesso lo strumento rileva comunque una lettura di flusso. In passato, questo zero biologico è stato attribuito sia al moto browniano nel compartimento vascolare che alla motricità della parete cellulare dei globuli rossi. Più recentemente, la fonte principale dello zero biologico è stata identificata come il moto browniano delle macromolecole presenti in sospensione nel compartimento interstiziale [4].
Altro problema, è la sensibilità della sonda ai movimenti della zona sulla quale è fissata; se il soggetto sul quale si sta effettuando la misura si muove, al segnale vengono sommati i contributi dovuti al movimento del paziente che, non corrispondono a caratteristiche del microcircolo e potrebbero falsare la misura. Essi sono facilmente
riconoscibili nel caso in cui il movimento sia breve e veloce, presentandosi come picchi che si esauriscono in un paio di secondi ed hanno ampiezza chiaramente distinguibile dal resto del segnale. Nel caso in cui il movimento sia sufficientemente lento, il suo contributo al segnale potrebbe però essere confuso con i contributi dovuti al microcircolo, e quindi portare a risultati fuorvianti.
I principali vantaggi di questa tecnica sono la non invasività e la facilità di utilizzo, che ne permettono l'impiego senza un particolare addestramento e rendono le misure operatore-indipendente. Altri vantaggi sono: la relativa economicità e la buona validazione in ambito clinico, che da anni pone questa metodica all'avanguardia nella diagnosi di malattie che coinvolgono il microcircolo [5].
2.3 Perimed – PeriFlux System 5000
Lo strumento utilizzato, in questo studio, per acquisire segnali di perfusione cutanea è il PeriFlux System 5000 (Perimed Inc.). Il sistema PF 5000 della Perimed (Svezia) viene utilizzato negli ambulatori specialistici di tutto il mondo per valutazioni precise a livello micro e macrovascolare.
La struttura è costituita da quattro moduli principali (unit) e consente il monitoraggio simultaneo del flusso sanguigno (tramite LDF) e di ossigeno e/o anidride carbonica transcutanea (tcpO2, tcpCO2). Assieme al sistema vengono forniti anche i moduli per la stimolazione termica, per il controllo della pressione e una vasta gamma di sonde laser Doppler.
Il sistema PF5000 offre soluzioni complete e altamente personalizzabili per la valutazione della microcircolazione, sfruttando la cooperazione tra la macchina e il proprio software dedicato.
I quattro moduli di cui dispone il sistema PF 5000 sono: • Unità LDPM: PF 5010
L'unità PF 5010 LDPM (Laser Doppler Perfusion Monitoring) viene utilizzata per misurazioni di perfusione sanguigna basata sulla tecnologia Laser Doppler precedentemente illustrata. Grazie a questa unità si può valutare in toto il flusso microvascolare locale, ovvero in capillari, arteriole, venule e shunt. Con l'unità PF 5010 LDPM è possibile infatti seguire da vicino i cambiamenti dinamici
della microcircolazione. Il sistema è utile anche per studiare le risposte a stimoli come il riscaldamento, l'occlusione, la somministrazione di farmaci, la postura, la stimolazione elettrica e così via. L'interfaccia tra l'unità ed il paziente è data da una delle apposite sonde Laser Doppler fornite. Le sonde flessibili sono a fibre ottiche e si applicano sulla superficie della zona in esame. Ogni sonda contiene due fibre ottiche, una trasporta la luce laser sul tessuto e una rileva la luce riflessa con lunghezza d'onda variata dall'effetto Doppler.
• Unità di temperatura: PF 5020
L'unità PF 5020 è dedicata alla temperatura. Essa viene utilizzata per eseguire stimolazioni termiche locali, e/o misure di temperatura. L'unità PF 5020 è dotata di due connettori, per sonde termostatiche Laser Doppler e sensori di misura della temperatura. Queste particolari sonde termostatiche consentono il riscaldamento preciso del tessuto nel sito di misura. Tale operazione, per esempio, viene utilizzata per studiare la capacità di riserva del tessuto [8].
• Unità tcpO2/pCO2: PF 5040
L'unità PF 5040 tcpO2/pCO2 misura, a livello locale, l'ossigenazione o la tensione di anidride carbonica. L'ossigeno deriva unicamente dalla perfusione sanguigna del capillare nutritivo locale. Il livello di anidride carbonica invece è influenzato sia dai processi metabolici locali che dalla capacità del flusso sanguigno di eliminare tale gas. Per l'indagine in questione l'unità sfrutta un sensore di Clarke come sonda [8].
• Unità di pressione: PF 5050
L'unità di pressione PF 5050 è utilizzata per controllare linearmente o istantaneamente lo sgonfiamento del bracciale per la misura della pressione. Il PF 5050 è stato sviluppato per semplificare e standardizzare i test come la misurazione della pressione periferica (pressioni nell'alluce e nella caviglia), della pressione di perfusione della cute (SPP) e l'iperemia reattiva post occlusiva (PORH). Questa unità di pressione può anche essere usata per effettuare il test PVR (Pulse Volume Recording), usato per valutare il flusso ematico a livello periferico [8].
2.3.1 L’unità LDPM: PF 5010
Il funzionamento del modulo laser-Doppler (LDPM unit) si fonda sui principi dell’effetto Doppler, costituisce il fulcro dell'intero sistema di acquisizione. La radiazione viene emessa da un diodo laser con lunghezza d'onda pari a 633 nm (rosso). La potenza di questa radiazione (nell'ordine del mW) è talmente bassa da risultare non pericolosa per il paziente; infatti, il dispositivo viene classificato, secondo la norma CEI EN 60825-1 (che suddivide i dispositivi laser in classi di sicurezza), come laser di Classe 1, per il quale non è necessaria alcuna precauzione [3].
Figura 2.3: Perimed, PeriFlux System 5000. I quattro moduli sono, da sinistra a destra: PF 5010, PF 5020, PF 5040, PF 5050
Dalla Figura 2.3, sul pannello frontale sono presenti vari tasti e indicatori, come: il pulsante per la calibrazione (CAL), il pulsante per la selezione della costante di tempo (τ), il tasto di stand-by e di rimozione degli allarmi, i connettori per le fibre ottiche, il display per la visualizzazione dei valori di perfusione e l'indicatore del funzionamento del laser (active laser indicator).
Calibrazione
La calibrazione viene eseguita per garantire che le unità del PeriFlux misurino in tutto il mondo gli stessi valori. Lo strumento e le sonde sono tarati per i punti di misura 0 PU e 250 PU. La procedura di calibrazione standardizzata è fornita dal produttore e consiste ne misurare il flusso in un recipiente contenente una soluzione colloidale con particelle di lattice in sospensione (il dispositivo per la calibrazione viene fornito dal fabbricante). Se il flussimetro è calibrato correttamente si misura un valore prossimo a 250 PU (PU -
Perfusion Unit, l'unità arbitraria utilizzata nel Periflux System 5000), 1 PU equivale a
1/250 volte il valore di perfusione misurato nella fase di calibrazione. Un altro passo della calibrazione prevede la misura del flusso su un oggetto statico (zeroing disc); in caso di corretta calibrazione, la misura effettuata risulta prossima a 0 PU.
Costante τ
Il pulsante τ permette di selezionare l'intervallo temporale su cui effettuare uno smoothing del segnale acquisito. Come illustrato in figura 2.4 è possibile scegliere fra tre valori: 0.03 s, 0.2 s e 3.0 s. In questo lavoro, è stato scelto un valore di τ pari a 0.2 s; tale scelta permette di visualizzare le pulsazioni di flusso indotte dall'attività cardiaca (con periodo nell'ordine del secondo), che costituiscono le oscillazioni di frequenza più alta nei segnali di perfusione cutanea.
Il display per la visualizzazione dei segnali di perfusione si compone di tre display a sette segmenti. Questa disposizione permette la misura di valori di perfusione in un range compreso tra 0 PU e 999 PU. Oltre ai valori di perfusione, possono essere visualizzati anche codici di errore o problemi dovuti alla disposizione della sonda. Il messaggio più frequente è LLL (Low Light Level): la luce retrodiffusa ha un'intensità troppo bassa per essere rivelata. Questa condizione si verifica soprattutto quando la sonda si trova a qualche cm di distanza dalla superficie cutanea. Il tasto di stand-by e rimozione degli allarmi è utilizzato sia per porre l'unità in stand-by (il display viene
spento e gli altri tasti divengono inattivi), che per rimuovere dal display i messaggi di errore meno importanti. Sul pannello frontale sono presenti due connettori per le fibre ottiche: una fibra è utilizzata per trasportare la luce dalla sorgente alla sonda di acquisizione, mentre l'altra convoglia la luce retrodiffusa dagli eritrociti verso il fotorivelatore.
Secondo la norma EN 60601-1 relativa agli apparecchi elettromedicali, questo strumento è classificato come CF (Cardiac Floating), ovvero: apparecchio per applicazioni cardiache dirette, avente un alto grado di protezione (con particolare riguardo per le correnti di dispersione ammissibili) ed avente una parte applicata ottante; infatti, poichè la luce è trasportata dalla sorgente mediante fibra ottica, esiste un accoppiamento ottico tra il dispositivo e la parte applicata [3].
2.3.2 L’unità di temperatura:PF 5020
La temp unit peremette di misurare la temperatura e l’erogazione di stimoli termici sul tessuto d’interesse. La sonda utilizzata per sfruttare questa funzione di riscaldamento locale della temp unit, è costituita da una piastrina di metallo posta sulla superficie inferiore che trasmette lo stimolo calorifico al tessuto con cui è in contatto (Fig.2.5)
Figura 1.5 Sonda doppler utilizzata per le misure di perfusione cutanea
Sul pannello frontale del modulo di temperatura (figure 2.6) si possono individuare: il tasto che attiva o disattiva il riscaldamento della sonda, il tasto per l'impostazione della temperatura.
Figura 2.6 Pannello frontale del modulo di temperatura
Premendo il tasto del riscaldamento, la sonda raggiungerà una temperatura, in pochi secondi, di circa 43° C. La temperatura raggiunta rimarrà costante a quel valore fino a che il tasto non verrà premuto nuovamente.
L’andamento della temperatura nel riscaldamento cutaneo è approssimabile con un segnale a gradino.
Un conduttore elettrico collega il modulo di temperatura con la sonda, alla quale arrivano due cavi: uno proveniente dal modulo laser-Doppler e contenente le fibre ottiche, l'altro proveniente dalla temp unit. Questo modulo viene classificato come BF (Body Floating), ovvero come apparecchio di tipo B (per applicazioni interne ed esterne esclusa l'applicazione cardiaca, con grado di protezione adeguato), con parte applicata flottante.
Capitolo 3
Analisi delle Componenti Principali (PCA)
L’analisi delle componenti principali, noto con l’acronimo di PCA (Pearson, 1901, Hotelling, 1933), è uno dei pilastri della moderna analisi dei dati, è una tecnica statistica utilizzata abbondantemente in tutte le forme di analisi, dalle neuroscienze alla grafica, perché è un metodo semplice, non-parametrico per estrarre informazioni rilevanti da un set di dati “confuso”, ossia ridondante e rumoroso.
Le sue origini risalgono agli studi antropometrici di fine 1800 di Galton ed Edgeworth e a quelli di Pearson dell’inizio del 1900. La sua formulazione attualmente più nota è dovuta ad Hotelling nel 1933 [19].
L’obiettivo è di trovare un modo più significativo per ri-esprimere questo insieme di dati “confuso” che elimini la ridondanza, filtri il rumore e quindi riveli dinamiche nascoste.
Geometricamente l’obiettivo della PCA è presentare i dati, nel riferimento che evidenzia maggiormente la loro struttura. Ciò avviene tramite una trasformazione lineare delle variabili che proietta quelle originarie in un nuovo sistema cartesiano nel quale le variabili vengono ordinate in ordine decrescente di varianza: pertanto, la variabile con maggiore varianza viene proiettata sul primo asse, la seconda sul secondo asse e così via. La riduzione della complessità avviene limitandosi ad analizzare le principali (per varianza) tra le nuove variabili.
Il presente capitolo mira a descrivere tale metodologia dal punto di vista matematico.
3.1 Il metodo
Data una matrice di dati di dimensione 𝑛 × 𝑝 con variabili tutte quantitative: 𝑋!, 𝑋!, … , 𝑋!, … , 𝑋! 𝑐𝑜𝑛 𝑖 = 1,2, … , 𝑝 (vettore casuale multivariato), la PCA è una metodologia statistica multivariata che consente di sostituire alle 𝑝 variabili (tra loro correlate) un nuovo insieme di 𝑝 variabili (diverse dalle prime e chiamate componenti principali) 𝑌!, 𝑌!, … , 𝑌!, … , 𝑌! 𝑐𝑜𝑛 𝑖 = 1,2, … , 𝑝 (vettore multivariato), che godono delle
• sono combinazioni lineari delle variabili di partenza; • sono tra loro incorrelate;
• sono in ordine decrescente rispetto alla loro varianza.
Ad esempio, la prima componente principale 𝑌! è la combinazione lineare delle 𝑝
variabili avente massima varianza, la seconda componente principale 𝑌! è la combinazione lineare delle 𝑝 variabili avente varianza immediatamente inferiore soggetta al vincolo di essere non correlata alla componente precedente. In modo analogo si definiscono le componenti principali successive.
L’obiettivo di questa operazione, consiste nell’individuare opportune trasformazioni lineari 𝑌! delle variabili osservate facilmente interpretabili e capaci di evidenziare e
sintetizzare l’informazione insita nella matrice iniziale 𝑋.
I dati di partenza vengono organizzati in una matrice, indicata con 𝑋:
𝑋 = 𝑋! 𝑋! ⋮ 𝑋! = 𝑋!! 𝑋!" ⋯ 𝑋!! 𝑋!" 𝑋!! ⋯ 𝑋!! ⋮ ⋮ ⋱ ⋮ 𝑋!! 𝑋!! ⋯ 𝑋!! dove:
- le colonne rappresentano le 𝑝 osservazioni effettuate;
- le righe sono le 𝑝 variabili considerate per il fenomeno in analisi.
La matrice dei dati d’origine può essere rappresentata sinteticamente con un vettore casuale multivariato 𝑋 = (𝑋!, 𝑋!, … , 𝑋!, … , 𝑋!)!.
Si vuole ora ottenere una matrice di nuovi dati 𝑌, composta da p variabili incorrelate tra loro, che risultano essere combinazione lineare delle prime:
𝑌 = 𝐿𝑋
in forma estesa: 𝑌 = 𝑌! 𝑌! ⋮ 𝑌! = 𝑌!! 𝑌!" ⋯ 𝑌!! 𝑌!" 𝑌!! ⋯ 𝑌!! ⋮ ⋮ ⋱ ⋮ 𝑌!! 𝑌!! ⋯ 𝑌!! = 𝑙!! 𝑙!" ⋯ 𝑙!! 𝑙!" 𝑙!! ⋯ 𝑙!! ⋮ ⋮ ⋱ ⋮ 𝑙!! 𝑙!! ⋯ 𝑙!! 𝑋!! 𝑋!" ⋯ 𝑋!! 𝑋!" 𝑋!! ⋯ 𝑋!! ⋮ ⋮ ⋱ ⋮ 𝑋!! 𝑋!! ⋯ 𝑋!!
Una generica componente di 𝑌, ad esempio la prima, si esprimerà come:
𝑌 = 𝑌
!!, 𝑌
!", … , 𝑌
!!=
𝑙
!!𝑋
!!,
𝑙
!!𝑋
!!, … ,
! !!! ! !!!𝑙
!!𝑋
!" ! !!!= 𝑙
!!𝑋
In sintesi, si ha che l’i-esima componente di 𝑌 è data da:
𝑌
!= 𝑙
!!𝑋
a cui corrisponde una varianza pari a:𝑉𝑎𝑟(𝑌
!) = 𝑙
!!∑ 𝑙
!e una covarianza di:
𝐶𝑜𝑣(𝑌
!, 𝑌
!) = 𝑙
!!∑𝑙
!𝐿 è la matrice caratteristica della trasformazione lineare, mentre le 𝑌! sono dette
componenti principali.
Il vettore multivariato 𝑌 = (𝑌! 𝑌!… 𝑌!)! è tale che il primo elemento 𝑌
! comprenda la
maggiore variabilità possibile (e quindi maggiori informazioni) delle variabili originarie, e che 𝑌! rappresenti la maggiore variabilità delle variabili ma meno della prima, e così fino a 𝑌! che tiene conto della più piccola frazione dell’originaria varianza. Perciò le componenti principali sono quelle combinazioni lineari delle variabili aleatorie 𝑋! a norma unitaria che ne rendono massima la varianza e che sono incorrelate.
3.2 Procedura formale di estrazione delle componenti principali
Data la matrice di covarianza Σ, dovendo perseguire il vincolo:
𝑉𝑎𝑟(𝑌
!) = 𝑙
!!∑𝑙
!= max 𝑐𝑜𝑛 𝑙
!!𝑙
!= 1
si definisce come funzione obiettivo da massimizzare la funzione di Langrange:
𝑃 = 𝑙
!!∑𝑙
!
− 𝜆(𝑙
!!𝑙
!− 1)
con 𝜆 moltiplicatore di Lagrange.Trattandosi di un problema di massimo vincolato, la soluzione si trova uguagliando a zero la derivata, rispetto al vettore 𝑙!, della funzione Lagrangiana:
𝜕𝑃
𝜕𝑙
!= 2∑𝑙
!− 2𝜆𝑙
!= 2 ∑ − 𝜆𝐼 𝑙
!= 0
dove I è la matrice identità.
Dal teorema di Rouchè-Capelli, l’equazione precedente individua un sistema lineare omogeneo che ammette soluzioni se e solo se la matrice (Σ−λI) è singolare, ovvero:
𝑑𝑒𝑡 ∑ − 𝜆𝐼 = 0
(1)
Le soluzioni della (1) sono gli autovalori della matrice Σ, per cui la risoluzione comporta la ricerca del rango della matrice (Σ − λI ).
Poiché Σ ha dimensione (𝑝×𝑝) , si avranno al massimo p soluzioni. Ordinando le soluzioni λi in senso decrescente, si ha:
