La curcuma, proprietà e benefici: la ricerca continua

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UNIVERSITÀ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN FARMACIA

TESI DI LAUREA

LA CURCUMA, PROPRIETÀ E

BENEFICI: LA RICERCA CONTINUA

ANNO 2017

RELATORI:

Prof.ssa

SABRINA TALIANI

Dott.ssa

SILVIA SALERNO

CANDIDATA:

SHARON STEPHANY SEGHIERI

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2

INDICE

INTRODUZIONE: LE SPEZIE ED IL LORO UTILIZZO IN MEDICINA 5

CAPITOLO 1: LA CURCUMA ……… 19

1.1 INTRODUZIONE ………..……… 19

1.2 IL FASCINO DELLA “SPEZIA D’ORO” ………..…… 25

1.3 LA CURCUMINA È UN COMPOSTO PAINS, IMPS E UN MEDIOCRE LEAD ………….…...………... 29

1.3.1 LA CURCUMINA È UN COMPOSTO PAINS …...………. 29

1.3.2 LA CURCUMINA È UN COMPOSTO IMP ……... 30

1.3.3 LA CURCUMINA NON È UN BUON COMPOSTO LEAD ……...…. 33

1.4 INSTABILITÀ CHIMICA ……….…….. 34

1.5 PROPRIETÀ CHIMICO-FISICHE ………….………….……. 41

1.6 ADMET (ASSORBIMENTO, DISTRIBUZIONE, METABOLISMO, ESCREZIONE E TOSSICOLOGIA) ….... 44

1.6.1 ASSORBIMENTO ………...………….. 44

1.6.2 DISTRIBUZIONE ………...…... 45

1.6.3 METABOLISMO …………...……… 46

1.6.4 ESCREZIONE ………...…… 47

(3)

3

CAPITOLO 2: ATTIVITÀ DELLA CURCUMINA ……… 50

2.1 ANALISI CRITICA DI ALCUNE ATTIVITÀ DELLA CURCUMINA (REALI E VIRTUALI) …...……….. 50

2.2 STUDI SULL’ ATTIVITÀ ……… 51

2.2.1 P300 ……….……….………...……… 51

2.2.2 HDAC8 ……... 53

2.2.3 GSK-3β ………..………. 54

2.2.4 FORMAZIONE DI FIBRILLE AMILOIDI E TAU ………..…….. 55

2.2.5 CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) ………… 56

2.2.6 CB1 ……...…………..………. 57

2.2.7 PANORAMICA DELLE PUBBLICAZIONI ……….. 58

2.3 VALUTAZIONE CRITICA DEGLI STUDI CLINICI …... 59

2.3.1 DERMATITI DA RADIAZIONI …..………..…...………. 62

2.3.2 CANCRO AL COLON …..……..……….………...………. 63

2.3.3 MORBO DI ALZHEIMER …..…….………..………. 64

2.3.4 CANCRO AL PANCREAS …..………..………...………. 67

CAPITOLO 3: COMPLESSI DELLA CURCUMINA ………..………. 69

3.1 COMPLESSI (ARENE)RU(II) DELLA CURCUMINA E DIABETE MELLITO DI TIPO II ……….. 69

3.1.1 INIBIZIONE DI COMPLESSI CURCUMINA-RU(II) SU DPP-IV ISOLATA DI RENE BOVINO ...……… 70

3.1.2 QUENCHING DI FLUORESCENZA DEI COMPLESSI CURCUMINA-RU(II) SULL’ENZIMA DPP-IV ... 73

3.1.3 CURCUMINA E INIBITORI DELL’ENZIMA DPP-IV ..……….………. 77

3.2 COMPLESSI CURCUMINA-OSSOVANADIO(IV) E ATTIVITÀ ANTITUMORALE ………...……….. 78

3.2.1 TERAPIA FOTODINAMICA E COMPLESSI CON METALLI DI TRANSIZIONE ………...….…………...……… 78

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4

3.2.2 LEGAME AL DNA …... 82

3.2.3 ATTIVITÀ DI FOTO-SCISSIONE DEL DNA …...…………..…………. 85

3.2.4 FOTOTOSSICITÀ IN LUCE VISIBILE …...…………..………..………. 88

3.2.5 ASSORBIMENTO CELLULARE …………..………..…………. 91

3.2.6 AGENTI CITOTOSSICI A BASE DI CURCUMINA ……….…..………. 93

CONCLUSIONI: IL FUTURO DELLA RICERCA SULLA CURCUMA .. 94

(5)

5

INTRODUZIONE

L

E

S

PEZIE ED IL LORO

U

TILIZZO IN

M

EDICINA

Con il termine di “spezie” si indicano genericamente sostanze aromatiche di origine vegetale, in genere di provenienza esotica, che vengono impiegate per aromatizzare ed insaporire cibi e bevande. Più recentemente, hanno trovato largo impiego anche in preparati medicinali e in prodotti cosmetici.

Le spezie si distinguono dalle erbe aromatiche in quanto, mentre le prime vengono impiegate in forma essiccata, quest’ultime sono costituite da parti verdi o foglie fresche.

Negli ultimi anni, molte sono le ricerche in campo scientifico che mirano a valutare l’efficacia terapeutica e preventiva di alcune spezie nei confronti di molte patologie. Due spezie particolarmente sperimentate sono curcuma e peperoncino.

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6 LISTA DELLE SPEZIE

 Aneto  Anice  Annatto  Ajowan  Cannella  Cardamomo  Cartamo  Chiodi di garofano  Coriandolo  Cubebe  Cumino  Curcuma  Dragoncello  Fieno grego  Ginepro  Issopo  Levistico  Liquirizia  Macis  Menta  Mirto  Nigella  Noce moscata  Papavero  Paprica  Pepe  Peperoncino  Rafano  Radhuni  Santoreggia  Senape  Sesamo  Sommacco  Tamarindo  Vaniglia  Zafferano  Zenzero

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7

Z

ENZERO

Lo zenzero (Figura 1) è il rizoma di Zingiber Officinalis Ros (Famiglia Zingiberaceae), noto, in base all’origine geografica, come zenzero africano, zenzero di Cochin o zenzero giamaicano. La pianta, importata dalla Cina, viene coltivata in molti Paesi tropicali.

Figura 1

Zingiber officinalis; tavola botanica.

I principali componenti chimici sono contenuti nell’oleoresina, responsabile del sapore pungente della droga; essa contiene gingeroli (33%), shogaoli (prodotti di deidratazione dei gingeroli) e lo zingerone (prodotto di degradazione dei gingeroli). Altri componenti dello zenzero sono: carboidrati (di cui l’amido è il componente prevalente, circa il 50%), lipidi (6-8%) ed un olio essenziale (1-3%), costituito

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8

prevalentemente da sesquiterpeni, quali il β-bisabolene e il zingiberene, nonché molti monoterpeni tra cui geraniolo, nerale, fellandrene e nerolo.1

La Farmacopea Europea IV riporta che la droga (Zingiberis rhizoma), intera o tagliata, deve contenere non meno di 15 ml/kg di olio essenziale, calcolato sulla droga anidra. L'olio di zenzero è noto per le sue proprietà antidolorifiche, stimolanti, carminative, digestive, calmanti e si dimostra particolarmente utile in caso di diarrea, aria e gas intestinali, mal di testa, circolazione periferica rallentata, nausea e ansia.2

Studi sperimentali hanno evidenziato un’azione antiemetica dello zenzero, anche se non è stato chiarito il suo meccanismo d’azione.

La letteratura riporta che estratti etanolici o acetonici di Z. officinalis inibiscono la dismobilità gastrica ed il vomito indotti dal cisplatino, un agente antitumorale.

I principi attivi ritenuti responsabili dell’attività biologica sono i gingeroli (in particolare, il 6-gingerolo) e probabilmente gli shogaoli, in quanto questi composti sono in grado di inibire il vomito indotto dal solfato di rame, un agente irritante, nella rana.

Studi volti alla comprensione del meccanismo d’azione, hanno evidenziato un’azione procinetica gastrica, effetto possibilmente legato ad un’azione antagonista sul recettore serotoninergico 5- di alcuni componenti dello zenzero.3

I recettori 5- gastrici sono importanti per la genesi del vomito. Evidenze sperimentali lasciano supporre che alcuni componenti dello zenzero blocchino questo recettore, con conseguente riduzione del segnale emetico che arriva a livello centrale, attraverso le afferenze vagali, ed aumento della motilità gastrica: il blocco di questi

1_{F. Capasso, G. Grandolini, A. A. Rizzo; FITOTERAPIA, Impiego razionale delle droghe vegetali; Milano, 2006;}

pag.723 e seguenti.

2_Ibidem

3_{F. C. Czygan, D. Frohne, K. Hiller, Chr. Höltzel, A. Nagell, P. Pachaly, H. J. Pfänder, M. Wichtl, G. Willuhn,}

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9

recettori determina, infatti, un aumento nella liberazione di acetilcolina, un neurotrasmettitore che favorisce la motilità gastrointestinale.

La Commissione E tedesca raccomanda l’uso dello zenzero in casi di inappetenza, per il trattamento della dispepsia e per la cinetosi.4

L’efficacia dello zenzero nel trattamento della nausea dipende dalla condizione che determina questo disturbo. Lo zenzero è, infatti, in grado di contrastare la nausea e il vomito indotti in gravidanza, ma non nel post-operatorio e da cinetosi.

È sconsigliato l’uso in gravidanza per una possibile azione mutagenica di alcuni gingeroli e shogaoli. È consigliato l’utilizzo sotto controllo medico in pazienti con calcoli alla colicisti, in quanto lo zenzero possiede proprietà colagoghe.

Non sono stati segnalati casi clinici d’interazioni farmacologiche; tuttavia, lo zenzero possiede un effetto antitrombotico e spesso si sconsiglia l’utilizzo di questa droga a pazienti in terapia con anticoagulanti.

La Commissione E raccomanda una dose giornaliera di 2-4 g di droga.

P

EPERONCINO

Il peperoncino rosso è il frutto essiccato di Capsicum frutescens L. (Famiglia Solanaceae), pianta erbacea annuale, originaria delle zone tropicali d’America e attualmente coltivata in Paesi tropicali, subtropicali e temperati (Figura 2).

Il peperoncino rosso è noto contenere fino all’1.5% di capsaicina e composti correlati, noti nell’insieme come capsaicinoidi, che sono situati nella parete dei frutti. Contiene, inoltre, un olio volatile, vitamine A e C e caroteni.5

pag.723 e seguenti.

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Specie che non contengono capsaicina, ma con un alto contenuto di vitamina C, sono usate come ortaggi e indicate come peperoni dolci.

La FU XI riporta come droga i frutti maturi di C. frutescens sensu latiore, intero o polverizzato. Deve contenere non meno dello 0.4% di capsaicinoidi, calcolati come capsaicina.6

Diverse sono le attività riportate per il peperoncino, tra cui un’azione vasodilatatrice e stimolante del circolo sanguigno, proprietà anti-infiammatorie, antidolorifiche e antiossidanti.

Figura 2

Capsicum frutescens L.; tavola botanica.

La capsaicina agisce su recettori localizzati sulle fibre sensoriali gastriche, noti come recettori dei vanilloidi o per la capsaicina. L’effetto della capsaicina su questi recettori è di tipo bifasico: inizialmente attiva questi recettori, causando un rilascio di

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neuropeptidi, tra cui la sostanza P; successivamente, però l’attivazione prolungata causa una ridotta sensibilità delle fibre sensoriali, le quali diventano insensibili agli stimoli nocicettivi (desensibilizzazione), con conseguente riduzione della percezione del dolore.

Il dolore epigastrico in pazienti con dispepsia funzionale riflette, in parte, un’alterazione delle informazioni nocicettive che dallo stomaco giungono al cervello. I recettori dei vanilloidi, presenti su neuroni afferenti, hanno un ruolo importante nella percezione del dolore e possono essere attivati da stimoli nocivi, quali calore e pH. In pazienti con dispepsia funzionale questi recettori risultano essere ipersensibili. Ecco che la desensibilizzazione indotta dalla capsaicina determina un effetto analgesico.

Alcuni studi sperimentali, inoltre, riportano che la capsaicina sia in grado di ridurre le ulcere gastriche indotte nel ratto da etanolo, farmaci (tra cui l’aspirina) e shock emorragico.

L’assunzione di elevate dosi di peperoncino può influenzare la peristalsi intestinale, causando diarrea e coliche. Inoltre, il peperoncino può causare problemi respiratori in persone allergiche, che diminuiscono dopo alcuni giorni di trattamento.

Non sono riportate interazioni farmacologiche in seguito all’assunzione della droga vegetale.

La dose clinica efficace è pari a 2.5 g di polvere al giorno, somministrata in capsule di gelatina, da assumere prima dei pasti (0.5 g di polvere per capsula).7

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12

C

ANNELLA

La cannella o cinnamomo (Cinnamomum verum) è un albero sempreverde, alto 10-15 m, della Famiglia della Lauraceae (Figura 3).

Originaria dello Sri Lanka, viene coltivata in India, Indonesia e Sud America. La droga è costituita dalla corteccia essiccata di fusto, rami e polloni.

La droga contiene olio essenziale (0.5-2.5%), costituito prevalentemente da aldeide cinnamica (65-75%), eugenolo (5%) e altri fenilpropani (tra cui aldeidi o-metossicinnamica, alcol cinnamico e il suo acetato), nonché piccole quantità di mono- e sesquiterpeni.

L’olio essenziale di cannella contiene un alto quantitativo di eugenolo (80-96%), aldeide cinnamica, furfurolo, fellandrene, pinene, cimolo e linalolo.8

Grazie alla presenza di queste sostanze, l’olio essenziale svolge un’azione stimolante su mente e corpo e lenisce disturbi dell’apparato motorio, come artriti e reumatismi.

Figura 3

Cinnamomum verum; tavola botanica.

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In combinazione con altre droghe, viene utilizzata come stomachico e carminativo contro la sensazione di pienezza, la flatulenza, lievi spasmi gastrointestinali nonché per stimolare l’appetito.

Nella medicina popolare, l’olio essenziale viene utilizzato in gocce per il trattamento della dismenorrea e come emostatico (“gocce di cannella”).

A dosi terapeutiche non presenta effetti collaterali.

A dosi elevate, a causa della stimolazione del centro vaso-motore, può indurre tachicardia, aumento della peristalsi intestinale, della respirazione e della sudorazione. Questo stato di eccitazione è poi seguito da una fase di sedazione del sistema nervoso centrale con sonnolenza e depressione.9

C

HIODI DI

G

AROFANO

Syzygium aromaticum (Figura 4) è un albero sempreverde alto circa 10-15 m, della

Famiglia delle Myrtaceae, che cresce spontaneamente in Indonesia, nelle Antille e in Madagascar.

I boccioli fiorali vengono raccolti ed essiccati e costituiscono la spezia chiamata chiodi

di garofano.

La droga contiene flavonoidi, tannini, triterpeni e composti volatili tra cui l’eugenolo, componente base dell’olio essenziale e responsabile del potere analgesico di questa spezia.

I chiodi di garofano contengono, quindi, una serie di oli volatili (circa il 25%), in particolare eugenolo, componente base dell’olio essenziale, metile salicilato, flavonoidi e tannini.

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14

Fin dall’antichità i chiodi di garofano venivano utilizzati proprio per le loro proprietà analgesiche, trovando impiego nella cura del mal di denti e nel trattamento di infiammazioni cutanee.

Numerosi testi di medicina cinese riportano l’utilizzo dei chiodi di garofano per il trattamento di dolori articolari, intossicazioni, mal di pancia, capogiri e mal di denti.

Figura 4

Syzygium aromaticum; tavola botanica.

L’infuso di chiodi di garofano viene oggi utilizzato per attenuare la nausea, l’indigestione ed i disturbi intestinali, mentre l’olio essenziale, oltre ad essere un valido antisettico contro virus e micosi, svolge un’efficace azione anestetica.10

I chiodi di garofano trovano, quindi, impiego come antinfiammatori, grazie ai flavonoidi in essi contenuti: l’aromaterapia utilizza i chiodi di garofano per alleviare condizioni come artriti, reumatismi, raffreddori, bronchiti e sinusiti.

10_{www.inerboristeria.com}

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15

Grazie alle proprietà analgesiche, legate esclusivamente alla presenza di olio di eugenolo, vengono impiegati come rimedi naturali per il trattamento del mal di denti e per la cura e l’igiene della cavità orale (applicazione diretta sul sito dolorante o tramite gargarismi).

Sono ottimi antimicrobici (gli antichi egizi li utilizzavano per imbalsamare cadaveri ed evitare la formazione di funghi e batteri) e vengono utilizzati, sottoforma di infusi, per il trattamento di micosi cutanee, spesso in associazione a coriandolo e timo.

A livello dell’apparato digestivo, migliorano il transito intestinale con conseguente riduzione dell’accumulo di tossine.

Inoltre, possiedono proprietà antiossidanti; per questo motivo sono impiegati per contrastare l’invecchiamento cutaneo ed evitare la formazione di radicali liberi.

Infine, la tintura di chiodi di garofano, alla quale si possono aggiungere zenzero e cannella, viene impiegata per combattere l’inappetenza.

C

URCUMA

Curcuma longa (Figura 5) è una pianta erbacea, perenne, rizomatosa, della famiglia

delle Zingiberaceae. La pianta, alta fino a 1 metro, è originaria dell’Asia e largamente impiegata come spezia nella cucina indiana, medio-orientale e thailandese.

I principali costituenti della droga sono i curcuminoidi (3-5%), ovvero miscele di derivati del dicinnamoilmetano, quali la curcumina (diferuloilmetano), la demetossicurcumina (p-cumaroilferuloilmetano) e la bisdemetossicurcumina (di-p-cumaroilmetano).

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La frazione volatile (3-5%) contiene principalmente composti terpenici caratteristici, come zingiberene, curcumolo e α- e β-turmerone.11

Il curcuminoide bisdemetossicurcumina è caratteristico della curcuma.

Figura 5

Curcuma longa; tavola botanica.

L’ingrediente attivo della droga, il rizoma, è la curcumina che ha un sapore terroso, amaro, piccante ed estremamente volatile, mentre il colore si conserva nel tempo. La polvere di curcuma è uno degli ingredienti del curry, a cui dà il colore giallo intenso caratteristico. Inoltre, la curcuma è un colorante alimentare: tra gli additivi alimentari codificati dall’Unione Europea, la curcumina occupa il primo posto, E100. La Curcuma è parte integrante della medicina e fitoterapia di molti paesi del Sud-Est asiatico; viene comunemente utilizzata per trattare disturbi biliari, ittero, anoressia, tosse, ulcere diabetiche, disturbi epatici, reumatismi, infiammazione, sinusite, disturbi

11_{A. Lugli, M. Pescari, F. Monti, C. Ghelardini, N. Galeotti; MONOGRAFIE ESCOP, Le Basi Scientifiche dei}

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mestruali, ematuria, ed emorragia. La curcuma è anche usata come antisettico, analgesico, antinfiammatorio, antimalarico e repellente per insetti.

Nel XX secolo, alcune ricerche hanno identificato nella curcumina il fattore responsabile della maggior parte delle attività biologiche della curcuma.

Studi in vitro e su animali hanno suggerito un potenziale ruolo terapeutico e preventivo della curcumina per le sue attività antinfiammatorie, antibatteriche, metaboliche, neurologiche.

Le principali proprietà della curcuma ipotizzate includono:

 Proprietà antinfiammatorie;

 Azione depurativa;

 Azione coleretica (incrementa la produzione della bile e favorisce il passaggio

verso il duodeno);

 Azione antiossidante;

 Azione antitumorale (uso della curcumina nella prevenzione di tumori quali cancro di colon, bocca, polmoni, fegato, pelle, reni, mammelle e leucemia);  Azione cicatrizzante;

 Stabilizzatore glicemico (uso in caso di diabete);

 Proprietà digestive (favorisce il funzionamento dell’attività gastrica);

 Azione neuroprotettiva (ostacola l’avanzamento delle patologie

neurodegenerative);

 Azione immunostimolante (impiego della curcumina nel morbo di Crohn e in

malattie autoimmuni);

 Proprietà seboregolatorie e lenitive (utilizzo nel trattamento di affezioni dermatologiche, dall’acne, alla psoriasi alle micosi);

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 Protettore cardiovascolare (favorisce la fluidificazione del sangue, migliora la circolazione, aiuta a regolare il colesterolo);

 Proprietà carminative e antispastiche (uso in caso di meteorismo e per regolarizzare le funzioni intestinali).

Nonostante le molte proprietà ipotizzate, sulla base delle Monografie ESCOP, la curcuma risulta indicata solo per il trattamento di disturbi digestivi lievi e disfunzioni biliari minori.

Non sono noti particolari effetti indesiderati, nemmeno associati a sovradosaggio.12

12_{A. Lugli, M. Pescari, F. Monti, C. Ghelardini, N. Galeotti; MONOGRAFIE ESCOP, Le Basi Scientifiche dei}

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19

CAPITOLO 1

L

A

C

URCUMA

1.1 I

NTRODUZIONE

I prodotti naturali forniscono le basi di molti farmaci ampiamente utilizzati.

Di recente, questa caratteristica è stata ampiamente riconosciuta dal momento che chi ha scoperto l’artemisinina ha condiviso il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 2015 con altri ricercatori che hanno riconosciuto le proprietà antielmintiche dei prodotti naturali della famiglia della avermectina.

L’artemisinina, un prodotto naturale riconosciuto dalla medicina tradizionale cinese (MTC), l’Artemisia Annua, si è rivelata efficace nella terapia della malaria da Plasmodium Falciparum.

Alcuni ricercatori hanno visto questo premio come una convalida dell’utilità generale della medicina tradizionale cinese.13

In netta contrapposizione a questa sostenuta rivendicazione del ruolo di alcuni farmaci tradizionali ed etnici nella pratica medica, vi sono pubblicazioni recenti che classificano la curcumina, un costituente della curcuma, e parte della miscela di

13_{Yuan, D.; Yang, X.; Guo, J. C. A great honor and a huge challenge for China: You-you tu getting the nobel}

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composti denominati curcuminoidi, sia come composti PAINS (pan-assay interference compounds) 14_{che come composti IMPS (invalid metabolic panaceas)}15_.

Inoltre, molti ricercatori hanno descritto il potenziale “lato oscuro della curcumina” 16_: gli inconvenienti della curcumina includono le sue scarse proprietà farmacocinetiche/farmacodinamiche (PK/PD), la scarsa efficacia in diversi modelli di malattia, e gli effetti tossici in certe condizioni di analisi.

Queste pubblicazioni cautelative sono state “spazzate via” da numerosi articoli, review, brevetti e siti web che sollecitano l’uso della curcumina (e la sua prima fonte commerciale, la curcuma) come agente antitumorale 17_{, agente terapeutico per} l’Alzheimer 18_{, nel trattamento dei postumi della sbornia}19_{, nella disfunzione erettile} 20_{, nella calvizie}21_{, nell’irsutismo}22_{, nella fertilità}23_{, e come estratto contraccettivo}24_, che nel complesso costituiscono le proprietà necessarie per una panacea.

A tutt’oggi vengono ancora regolarmente pubblicati manoscritti scientifici basati esclusivamente sul presupposto fondamentale dell’attività e dell’utilità terapeutica della curcumina.

14_{Baell, J.; Walters, M. A. Chemistry: Chemical con artists foil drug discovery. Nature (London, U. K.) 2014, 513,}

481−483.

15_{Bisson, J.; McAlpine, J. B.; Friesen, J. B.; Chen, S.-N.; Graham, J.; Pauli, G. F. Can invalid bioactives}

undermine natural product-based drug discovery? J. Med. Chem. 2016, 59, 1671−1690.

16_{Burgos-Moron, E.; Calderon-Montano, J. M.; Salvador, J.; Robles, A.; Lopez-Lazaro, M. The dark side of}

curcumin. Int. J. Cancer 2010, 126, 1771− 1775.

17_{Neckers, L.; Trepel, J.; Lee, S.; Chung, E.-J.; Lee, M.-J.; Jung, Y.- J.; Marcu, M. G. Curcumin is an inhibitor of}

p300 histone acetyltransferase. Med. Chem. (Sharjah, United Arab Emirates) 2006, 2, 169− 174.

18_{Rainey-Smith, S. R.; Brown, B. M.; Sohrabi, H. R.; Shah, T.; Goozee, K. G.; Gupta, V. B.; Martins, R. N.}

Curcumin and cognition: A randomised, placebo-controlled, double-blind study of community-dwelling older adults. Br. J. Nutr. 2016, 115, 2106− 2113.

19_{Kwon, H. N. Functional noodles for relieving hangover and its manufacturing method. KR1314917B1, 2013.} 20_{Wang, A.; An, X.; Zhou, Y. Application of curcumin to medicinal preparations for treating erectile dysfunction.}

CN101822656A, 2010.

21_{Isaacs, E.; Cobbledick, T. Complete supplement formulae for maintenance of hair growth and condition.}

GB2484812A, 2012.

22_{Ahluwalia, G. S.; Shander, D.; Styczynski, P. Inhibition of hair growth with protein kinase C inhibitors.}

WO9609806A2, 1996.

23_{Jana, S.; Paul, S.; Swarnakar, S. Curcumin as anti-endometriotic agent: Implication of MMP-3 and intrinsic}

apoptotic pathway. Biochem. Pharmacol. (Amsterdam, Neth.) 2012, 83, 797− 804.

24_{Naz, R. K.; Lough, M. L. Curcumin as a potential non-steroidal contraceptive with spermicidal and microbicidal}

(21)

21

Nel 2015, questi dati hanno giustificato la compilazione di un Database di Risorse della Curcumina (CRDB: Curcumin Resource Database) che mira a sostenere lo sviluppo preclinico dei curcuminoidi, pubblicando così 1000 composti analoghi ed i loro presunti bersagli molecolari 25_.

Il servizio di informazioni del CRDB, con oltre 900 pubblicazioni e 500 brevetti, dimostra sia l’interesse scientifico per i curcuminoidi, che la grande quantità di informazioni che sono in attesa di un’interpretazione chimico-farmaceutica razionale. L’obiettivo di questa tesi è descrivere gli effetti della curcumina (Figura 6) e dei relativi curcuminoidi, estratti dalla curcuma.

È stato dimostrato che l’artemisinina (Figura 7) funzioni come un proiettile, efficace a lungo raggio, che agisce sui parassiti eme-dipendenti e li distrugge con una elevata reattività non selettiva 26_.

La struttura dell’artemisinina, contenente un perossido, suggerisce la possibile instabilità in ambiente biologico.

25_{Kumar, A.; Chetia, H.; Sharma, S.; Kabiraj, D.; Talukdar, N. C.; Bora, U. Curcumin resource database.}

Database 2015, 2015, bav070.

26_{Wang, J.; Zhang, C.-J.; Chia, W. N.; Loh, C. C. Y.; Li, Z.; Lee, Y. M.; He, Y.; Yuan, L.-X.; Lim, T. K.; Liu,}

M.; Liew, C. X.; Lee, Y. Q.; Zhang, J.; Lu, N.; Lim, C. T.; Hua, Z.-C.; Liu, B.; Shen, H.-M.; Tan, K. S. W.; Lin, Q. Haem-activated promiscuous targeting of artemisinin in Plasmodium falciparum. Nat. Commun. 2015, 6, 10111.

Figura 6.

Struttura della curcumina.

Figura 7.

(22)

22

Tuttavia, la sua stabilità in vivo ( = 2.5 h; = 30%) 27 prova che sia sufficientemente

stabile, dal punto di vista farmacocinetico, per poter essere un farmaco efficace.

La curcumina ha mostrato risultati promettenti nei saggi preliminari (in vitro), anche se questi dati possono essere stati falsati da problemi legati al set-up del saggio utilizzato, determinando dei falsi positivi.

La struttura della curcumina suggerisce che potrebbe essere instabile in un ambiente biologico; e, infatti, lo è: la sua stabilità sia in vitro che in vivo è ben lontana ( < 5min; < 1%) 28_{da quella dei farmaci in commercio.}

Secondo quanto risulta dalla letteratura, la curcumina non si è mai mostrata definitivamente efficace in nessun studio clinico randomizzato, per nessuna indicazione 29_.

La curcumina è meglio classificata, pertanto, come un proiettile che soffia continuamente sul cuscinetto d’avvio, senza mai raggiungere l’atmosfera o il suo bersaglio.

Questi risultati hanno conferito alla curcumina l’etichetta di farmacodinamicamente efficace (agisce su molti bersagli), ma ancora farmacocineticamente debole (non raggiunge i suoi target) 30_.

Questi fallimenti non hanno comunque scoraggiato i ricercatori interessati al suo sviluppo. Di conseguenza, sono state spese importanti risorse nella ricerca che coinvolge la curcumina, come potenziale agente terapeutico.

27_{Medhi, B.; Patyar, S.; Rao, R. S.; Byrav, D. S. P.; Prakash, A. Pharmacokinetic and toxicological profile of}

artemisinin compounds: An update. Pharmacology 2009, 84, 323− 332.

28_{Wang, Y.-J.; Pan, M.-H.; Cheng, A.-L.; Lin, L.-I.; Ho, Y.-S.; Hsieh, C.-Y.; Lin, J.-K. Stability of curcumin in}

buffer solutions and characterization of its degradation products. J. Pharm. Biomed. Anal. 1997, 15, 1867− 1876.

29_{Chow, S.-C.; Chiu, S.-T. A note on design and analysis of clinical trials. Drug Des.: Open Access 2013, 2, 102.} 30_{Heger, M.; van Golen, R. F.; Broekgaarden, M.; Michel, M. C. The molecular basis for the pharmacokinetics}

and pharmacodynamics of curcumin and its metabolites in relation to cancers. Pharmacol. Rev. 2014, 66, 222− 307.

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23

Dal 1995 a oggi, secondo il Database del NIH RePORTER 31_{, sono stati assegnati} fondi per un valore di oltre 150 milioni di dollari per progetti che sono collegati, direttamente o indirettamente, alla ricerca biomedica sulla curcumina. Questo fornisce una stima approssimativa dell’ordine di grandezza delle risorse (non scientificamente significativa) che sono state usate, direttamente o indirettamente, per esperimenti con la curcumina ed i suoi analoghi.

Tuttavia, questo continuo interesse ha portato ad una maggiore produzione di pubblicazioni scientifiche che riguardano gli studi biologici sulla curcumina rispetto a quelli pubblicati sull’artemisinina (Figura 8).

Figura 8.

Confronto della frequenza di pubblicazione di studi biologici di curcumina e artemisinina. I numeri di manoscritti all'anno sono stati recuperati da SciFinder ricercando le sostanze curcumina (CAS no. 458-37-7) o artemisinina (CAS no. 63968-64-9) e quindi filtrando con "studio biologico" e "tipo di documento "= giornale. (Accesso ai dati il 3 maggio 2016)

31_{National Institutes of Health. NIH RePORTER. Research portfolio online reporting tools. Reports, data, and}

(24)

24

Questo suggerisce che, mentre la ricerca sull’artemisinina è maturata, la ricerca sulla curcumina potrebbe essere entrata nella fase “buia” dei prodotti naturali (NP), in cui lo sforzo supera di gran lunga l’utilità, cosa comune per i composti IMPS.

Inoltre, molti prodotti naturali che sono stati sviluppati come farmaci, sono stati scoperti in test fenotipici e hanno mostrato attività rilevante a livello terapeutico. Questo ha consentito il rapido sviluppo del prodotto naturale capostipite o dell’analogo, relativamente semplice, per ottenere l’effetto terapeutico desiderato. Questa è stata la storia dell’artemisinina; ma un’attenta analisi della letteratura conduce a una conclusione molto diversa che interessa la curcumina.

In questa tesi, speriamo di poter rispondere ad alcune domande sulla curcumina: PAINS, IMPS o promessa? Oro massiccio o solo pirite? Valido composto lead per lo sviluppo terapeutico o ancora una sfida difficile per NP e chimici farmaceutici?

Ci sono molte questioni importanti, e non possono essere tutte affrontate in questa tesi, in quanto sono presenti più di 15000 manoscritti pubblicati, relativi alle interazioni biologiche della curcumina, e ogni settimana vengono pubblicati più di 50 manoscritti.

In primo luogo, si presenteranno le prove che la curcumina non è un efficace composto lead, come dimostrato mediante una valutazione critica delle sue caratteristiche PAINS e IMPS.

In secondo luogo, si valuteranno in modo critico le sue proprietà fisico-chimiche e farmacocinetiche/farmacodinamiche, responsabili del comportamento in vitro e in

vivo, correlando queste proprietà all’attività della curcumina nei confronti di molti

bersagli biologici.

In terzo luogo, sarà offerta una visione critica su una selezione di studi clinici riguardanti curcumina/curcuminoidi, per contestualizzare la sua utilità terapeutica.

(25)

25

Infine, si cercherà di individuare nuovi aspetti che potrebbero guidare la ricerca futura su quest’importante medicina tradizionale.

1.2 I

L

F

ASCINO DELLA “

S

PEZIA D’

O

RO”

La curcuma, il rizoma polverizzato della Curcuma Longa, è ampiamente utilizzata come spezia nel curry e nelle mostarde; è spesso responsabile del loro colore distintivo, e contribuisce molto al loro sapore, a causa della presenza delle oleoresine e degli olii essenziali che contiene.

La curcuma è un membro della famiglia dello zenzero (Zingiberaceae) e viene ampiamente prescritta in varie patologie nella medicina tradizionale sia cinese che indiana. Per esempio, preparati di curcuma vengono applicati su ferite fresche e contusioni e come anti-prurito nelle punture di insetto. La pasta di curcuma viene usata per facilitare la formazione di croste nella varicella e nel vaiolo. È usata in caso di disturbi urologici, disturbi epato-biliari e come antielmintico. Nella letteratura della medicina tradizionale indiana, la curcuma è stata anche descritta come rimedio per il cancro.

I principali fitocostituenti della curcuma sono diarileptanoidi, che si trovano in una miscela nota come curcuminoidi che, in genere, costituiscono l’1-6% del peso secco della curcuma.

La maggior parte degli estratti grezzi preparati dalla curcuma, e anche molti materiali raffinati della “curcumina”, contengono tre principali composti (Figura 9): la curcumina [1 (1E,6E)-1,7-bis(4-idrossi-3-metossifenil)-1,6-eptadiene-3,5-dione, in genere 60-70% dell’estratto grezzo], la demetossicurcumina (3, 20-27%), e la

(26)

26

bisdemetossicurcumina (4, 10-15%), insieme a numerosi e meno abbondanti metaboliti secondari 32_.

Figura 9.

Principali fitocostituenti degli estratti di Curcuma longa. I composti 1, 3 e 4, spesso raggruppati come "curcuminoidi", costituiscono, generalmente, circa l'1-6% della curcuma in peso. Di un estratto di curcuminoide, 1 rappresenta circa il 60-70%, mentre 3 (20- 27%) e 4 (10-15%) sono componenti minori.

Sebbene la natura a multicomponenti della “curcumina” sia ben documentata, l’assegnazione univoca di specifiche strutture in una particolare preparazione non è sempre chiara.

Qui, il termine “curcumina” sarà usato in modo intercambiabile con “curcuminoidi” se non c’è una descrizione più esplicita (es. di una singola struttura chimica).

Sulla base dei dati riportati in letteratura, molti studi in vitro usano la curcumina sintetica pura, mentre la maggior parte degli studi in vivo e delle sperimentazioni cliniche utilizzano una miscela di curcuminoidi.

32_{Priyadarsini, K. I. The chemistry of curcumin: From extraction to therapeutic agent. Molecules 2014, 19,}

(27)

27

La natura dinamica della curcumina 1 solubilizzata rende difficile considerarla come un singolo componente sia in vitro che in vivo.

Tuttavia, a prescindere dal materiale di partenza impiegato nella maggior parte degli studi clinici, la struttura della curcumina 1 è in genere citata, forse di default, come costituente attivo per ottenere l’effetto terapeutico, ed è il composto impiegato come “lead” in chimica farmaceutica.

In questa tesi non saranno affrontati i potenziali effetti terapeutici dei più complessi estratti della curcuma o delle preparazioni, ma sarà descritta l’utilità della struttura chimica del maggior costituente di questi estratti: la curcumina.

Dal punto di vista della scoperta di farmaci, la curcumina 1 sembra avere molte qualità interessanti.

Ci sono molte pubblicazioni che riportano una vasta gamma di attività biologiche del composto che è “ritenuto generalmente sicuro” (GRAS) dalla FDA come additivo alimentare, in quantità fino a 20 mg per dose 33_{, una designazione che potrebbe,} concettualmente, aiutare a bypassare alcuni requisiti normativi per la sua approvazione come farmaco.

Questa designazione, insieme al lungo utilizzo storico e culturale della curcuma come medicamento, hanno contribuito alla sua popolarità come integratore dietetico, commercializzato per molti disturbi comuni.

Negli Stati Uniti, nel 2014, sono riportate vendite di integratori a base di curcumina per oltre 20 milioni di dollari, anche se è difficile stimare un numero preciso 34_.

Insieme a questo boom nelle applicazioni nutraceutiche della curcumina, la normativa DSHEA (Dietary Supplement Health and Education Act), che istituisce gli aspetti

33_{Food and Drug Administration Office of Food Additive Safety. Agency Response Letter GRAS Notice No. Grn}

000460. U.S. Food and Drug Administration, 2013.

34_{Majeed, S. The state of the curcumin market. Natural Products Insider ; Informa Exhibitions , 20 1 5 ;}

(28)

28

legali degli integratori dietetici negli Stati Uniti (1994) e dei test in vitro, ha probabilmente contribuito, in modo significativo, ad una forte ripresa, alla fine degli anni novanta, della pubblicazione di manoscritti sull’uso della curcumina in studi biologici (Figura 8).

Da quel momento, è stata riconosciuta alla curcumina l’attività per le seguenti indicazioni: antiinfiammatorio, anti-HIV, antibatterico, antifungino, nematocida, antiparassitario, antimutageno, antidiabetico, antifibrinogeno, radioprotettivo, nella guarigione di ferite, ipolipemizzante, antispasmodico, antiossidante 35_, immunomodulatore, antitumorale 36_{, neuroprotettivo nel morbo di Alzheimer.}

Questi effetti hanno fatto si che la curcumina sia stata proposta come punto di partenza per lo sviluppo di futuri trattamenti innovativi per patologie complesse che richiedono terapie potenti ma non selettive.

In questo entusiasmo non critico per la potenziale utilità della curcumina, il suo “lato oscuro” è spesso trascurato.

È importante, quindi, che gli articoli che riguardano l’attività biologica (sperimentalmente testata o predetta in modo computazionale) della curcumina o dei suoi analoghi, trattino anche altre caratteristiche di questo composto naturale: la sua instabilità chimica, le scarse proprietà ADME, i potenziali effetti tossicologici, e la sua mancanza di successo, a oggi, in clinica.

35_{Panahi, Y.; Hosseini, M. S.; Khalili, N.; Naimi, E.; Majeed, M.; Sahebkar, A. Antioxidant and}

anti-inflammatory effects of curcuminoid-piperine combination in subjects with metabolic syndrome: A randomized controlled trial and an updated meta-analysis. Clin. Nutr. 2015, 34, 1101− 1108.

36_{Yue, G. G.; Chan, B. C.; Hon, P. M.; Lee, M. Y.; Fung, K. P.; Leung, P. C.; Lau, C. B. Evaluation of in vitro}

anti-proliferative and immunomodulatory activities of compounds isolated from Curcuma longa. Food Chem. Toxicol. 2010, 48, 2011− 2020.

(29)

29

1.3 L

A

C

URCUMINA È UN

C

OMPOSTO

P

AINS,

I

MPS E UN

M

EDIOCRE

L

EAD

1.3.1 L

A

C

URCUMINA È UN

C

OMPOSTO

P

AINS

PAINS (pain-assay interference compounds) è un acronimo utilizzato per indicare composti che hanno mostrato attività in molteplici tipologie di saggi, mediante interferenza con la lettura del saggio piuttosto che attraverso specifiche interazioni composto/target. Molte classi di composti sono state codificate e identificate come PAINS o potenziali PAINS.

La curcumina mostra tutti i comportamenti tipici dei PAINS: legame covalente a proteine 37_{, chelazione metallica, reattività redox} 38_{, aggregazione, rottura di} membrana, interferenza di fluorescenza 39_{e decomposizione strutturale}40_.

Questo suggerisce che qualsiasi pubblicazione relativa alla sua attività in vari saggi deve essere presa nella giusta considerazione. Questo è un aspetto importante da considerare per valutare in maniera adeguata i dati già pubblicati sull’attività biologica della curcumina.

Le più recenti linee guida richiedono quattro nuove caratteristiche per stabilire la riproducibilità: premessa, progettazione, variabili e validazione.

Di conseguenza, qualsiasi proposta basata sull’apparente attività biologica della curcumina dovrebbe garantire che la “premessa scientifica che costituisce la base della ricerca proposta” sia fondata (ovvero, l’attività biologica non è semplicemente il

37_{Fang, J.; Lu, J.; Holmgren, A. Thioredoxin reductase is irreversibly modified by curcumin: A novel molecular}

mechanism for its anticancer activity. J. Biol. Chem. 2005, 280, 25284− 25290.

38_{Schneider, C.; Gordon, O. N.; Edwards, R. L.; Luis, P. B. Degradation of curcumin: From mechanism to}

biological implications. J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 7606− 7614.

39_{Priyadarsini, K. I. Photophysics, photochemistry and photobiology of curcumin: Studies from organic solutions,}

bio-mimetics and living cells. J. Photochem. Photobiol., C 2009, 10, 81− 95.

40_{Esatbeyoglu, T.; Ulbrich, K.; Rehberg, C.; Rohn, S.; Rimbach, G. Thermal stability, antioxidant, and}

(30)

30

risultato di interferenze nel test) e che le “risorse chimiche” siano “validate”; cioè, siano impiegati metodi analitici e target per fornire prove convincenti che la curcumina sia effettivamente responsabile dell’attività.

1.3.2 L

A

C

URCUMINA È UN

C

OMPOSTO

I

MP

Da un punto di vista generale, i composti IMPS sono panacee metabolicamente non valide, che si trovano proprio nel centro del buco nero dei prodotti naturali, che tendono ad esaurire le risorse della ricerca.

Come elementi singoli, gli IMPS sono panacee metabolicamente improbabili che risultano scarsi come composti lead. Le proprietà bioattive segnalate dei composti IMPS sono ulteriormente complicate da diversi fattori, che possono aggiungersi alle caratteristiche IMPS ma che spesso sono separate da loro.

Dopo la valutazione dei profili di bioattività della curcumina riportati in letteratura si sono sollevate due importanti osservazioni: (1) l’elevato tasso al quale questo composto, o una sua miscela, risulta bioattivo e soprattutto (2) il tasso relativamente alto di attività positive osservate in proporzione al numero totale di bioattivi distinti segnalati: appena più di 300 come stimato dal database NAPRALERT 41_.

NAPRALERT (www.napralert.org) è un database che riguarda la chimica, l’attività

biologica e l’uso folcloristico di prodotti naturali con sede, dal 1975, presso l’University of Illinois di Chicago, all’Università di Farmacia con il Programma di Ricerca Collaborativa in Scienze Farmaceutiche. Fondato dal defunto Professore Norman R. Farnsworth, NAPRALERT, da allora, ha compilato più di 190.000 riferimenti bibliografici che riportano oltre 200.000 composti chimici ottenuti da più di

41_{Bisson, J.; McAlpine, J. B.; Friesen, J. B.; Chen, S.-N.; Graham, J.; Pauli, G. F. Can invalid bioactives}

(31)

31

60.000 specie di organismi. Di conseguenza, NAPRALERT copre centinaia di migliaia di report di test sull’attività biologica (inclusi risultati clinici, in vitro e in vivo) sia di estratti di prodotti naturali (400.000+) che di composti chimici isolati (300.000+).

Ulteriori considerazioni IMPS includono le caratteristiche PAINS della curcumina, principalmente l’aggregazione chimica, la presenza di un accettore reattivo di Michael nella struttura e la fluorescenza.

Quest’ultima caratteristica è particolarmente importante in quanto le principali categorie di attività riportate in NAPRALERT emergono da saggi cellulari, che tipicamente implicano la fluorescenza ed il quenching per il rilevamento del punto finale.

Un’analisi più dettagliata della distribuzione delle attività positive riportate in NAPRALERT mostra che 28 attività farmacologiche distinte, equivalenti a meno del 10% di tutte quelle ottenute, rappresentano circa il 50% del totale delle attività riportate per la curcumina.

Al contrario, nel caso di prodotti naturali lead di successo, come artemisinina, ivermectin e paclitaxel, questo tasso è solo compreso tra 1% e 2%.

Questo caratteristico “ampio spettro d’attività biologica” associa strettamente la curcumina alla top 100 dei composti con l’attività più promiscua.

Di questi top 100, ginsenosidi Rb-1 e Rg-1, genisteina, quercetina, apigenina, acido nordiidroguaiaretico, resveratrolo, canferolo e fisetina sono gli unici composti con un numero maggiore di attività distinte riportate rispetto alla curcumina. Anche se ciò significa che questi nove composti presentano una vasta gamma di risultati positivi nei test biologici, non significa automaticamente che, anche in pratica, i loro effetti farmacologici siano così ampi.

(32)

32

È ugualmente significativo che, come la curcumina, nessuno di questi nove composti, o qualsiasi dei loro derivati, abbia raggiunto, a oggi, la maturità come farmaco lead. Una delle spiegazioni più plausibili per quanto riguarda la polifarmacologia osservata della curcumina, oltre al suo apparente carattere PAINS/IMPS, il profilo promiscuo dei test biologici, e l’instabilità chimica, è lo stato di purezza variabile e la mancanza di caratterizzazione dei materiali della “curcumina”.

Questa miscela sconosciuta rappresenta ciò che è definito come complessità residua statica (CR statica o RC static; vedi anche http://go.uic.edu/residualcomplexity) 42_{: il}

materiale bioattivo ipotizzato ed eventuali impurità sono presenti e costanti durante tutto il test biologico.

L’elevata variabilità delle preparazioni di curcumina e delle fonti rende la CR statica un fattore importante di variabilità e può condurre a risultati imprevedibili o potenzialmente non riproducibili.

Al contrario, la complessità residua dinamica (CR dinamica) 43_{è correlata ad} instabilità metabolica, una proprietà caratteristica della curcumina.

L’intervallo di tempo tipico per gli esperimenti biologici, riportati in NAPRALERT, è dovuto alla significativa degradazione della curcumina. I prodotti di degradazione avranno probabilmente differenti attività biologiche in vitro e/o in vivo rispetto al composto originale. Inoltre, i metaboliti biogenici sono spesso diversi dai prodotti di degradazione presenti nei tamponi o nelle condizioni di conservazione dei laboratori, ed i prolungati tempi di incubazione di molti saggi cellulari rendono difficile sapere quali prodotti di degradazione siano presenti e a quali concentrazioni. Ad esempio, un

42_{Pauli, G. F.; Chen, S. N.; Friesen, J. B.; McAlpine, J. B.; Jaki, B. U. Analysis and purification of bioactive}

natural products: The AnaPurNa study. J. Nat. Prod. 2012, 75, 1243− 1255.

43_{Simmler, C.; Hajirahimkhan, A.; Lankin, D. C.; Bolton, J. L.; Jones, T.; Soejarto, D. D.; Chen, S. N.; Pauli, G.}

F. Dynamic residual complexity of the isoliquiritigenin-liquiritigenin interconversion during bioassay. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 2146− 2157.

(33)

33

prodotto di degradazione della curcumina recentemente identificato è uno spiro-epossido, che è altamente sensibile agli acidi e reagisce rapidamente con i tioli 44_. Questo evidenzia indirettamente l’importanza della CR dinamica, ipotizzando che la polifarmacologia della curcumina può in parte, o anche in gran parte, essere dovuta alla presenza dei suoi prodotti di degradazione.

Le problematiche della CR sia statica che dinamica, così come la reattività incerta, rendono lo studio della curcumina una vera sfida sia per biologi che per chimici. Prima di effettuare gli esperimenti biologici devono esser stabilite procedure di caratterizzazione chimica al fine di controllare il materiale iniziale e i componenti rimasti al termine dell’esperimento (permettendo così di valutare la degradazione del materiale in esame).

Dal punto di vista dei farmacologi o dei biologi, il controllo sull’aggregazione chimica, la specificità del target, le condizioni fotochimiche (assorbanza, fluorescenza, quenching) è di primaria importanza per ottenere letture interpretabili e risultati biologici significativi.

1.3.3 L

A

C

URCUMINA NON È UN BUON

C

OMPOSTO

L

EAD

La curcumina è completamente inadatta come composto lead se consideriamo le sue proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche.

Anche se vi sono eccezioni e alcune discrepanze su ciò che determini un “buon” composto lead, un prototipo di composto lead per lo sviluppo terapeutico presenta, generalmente, potenza al di sotto del micromolare verso il target desiderato, selettività e meccanismo d’azione adeguati, buona biodisponibilità, stabilità chimica, qualità

44_{Gordon, O. N.; Luis, P. B.; Sintim, H. O.; Schneider, C. Unraveling curcumin degradation: Autoxidation}

proceeds through spiroepoxide and vinylether intermediates en route to the main bicyclopentadione. J. Biol. Chem. 2015, 290, 4817− 4828.

(34)

34

ADMET (assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicologia) che possono essere ottimizzate in un numero ragionevole di cicli sintetici 45_.

La curcumina non ha alcuna di queste caratteristiche. Inoltre, i tentativi di migliorare le sue qualità ADMET (in genere le proprietà di un composto più difficili da ottimizzare) e di incrementare la sua specificità mediante ottimizzazione chimica e varie formulazioni non hanno finora avuto successo.

L’ottimizzazione di farmacocinetica e farmacodinamica della curcumina potrebbe non essere possibile viste le molteplici caratteristiche strutturali presumibilmente responsabili della sua “auspicabile” attività.

Per esempio, una proprietà spesso utilizzata per l’ottimizzazione è l’indiscriminata attività verso i tioli (in particolare con le proteine), anche se questa, probabilmente, è la principale spiegazione della sua polifarmacologia.

Sicuramente, la reattività covalente può essere utile per lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, questa modalità d’azione o è volutamente inserita nella progettazione del farmaco o si stabilisce nell’ottimizzazione della potenza e delle proprietà ADMET. Per esempio, i gruppi reattivi α,β-insaturi sono spesso introdotti volutamente in composti stabili, che vengono così ottimizzati incrementando le loro potenza e selettività. L’ottimizzazione intesa a migliorare la scarsa farmacocinetica della curcumina molto probabilmente indebolirà la veloce farmacodinamica.

1.4 I

NSTABILITÀ

C

HIMICA

La struttura della curcumina ha una funzione β-dichetonica, che subisce rapidamente tautomerizzazione cheto-enolica (Figura 10).

45_{Workman, P.; Collins, I. Probing the probes: Fitness factors for small molecule tools. Chem. Biol. (Oxford, U.}

(35)

35

Figura 10.

Tautomerizzazione del composto 1. Studi di NMR dimostrano che il composto 1 non è presente in soluzione come dichetone (1a), ma solo come miscela delle strutture enoliche (1b) ugualmente presenti (a causa di simmetria).

Gli spettri NMR, registrati utilizzando vari solventi a pH 3-9, hanno confermato che l’unica forma della molecola presente in soluzione è il tautomero enolico (1b), piuttosto che il dichetone (1a) 46_{. Questa preferenza per il tautomero enolico porta a} una struttura planare, con legami a idrogeno intramolecolari, sia in soluzione che in forma solida 47_.

Il calcolato della curcumina è stato riportato tra 2.3 e 3.2; la curcumina è praticamente insolubile in acqua a temperatura ambiente e pH neutro 48_{. A pH} alcalino, i fenoli sono trasformati in fenolati, permettendo la solubilizzazione della curcumina in acqua. Sono stati riportati i range dei valori di pKa dei protoni fenolici in funzione del solvente e del metodo di misura 49_{, e sono risultati 8.5-10.4 per il primo e} 9.5-10.7 per il secondo.

46_{Payton, F.; Sandusky, P.; Alworth, W. L. NMR study of the solution structure of curcumin. J. Nat. Prod. 2007,}

70, 143− 146.

47_{Jagannathan, R.; Abraham, P. M.; Poddar, P. Temperature-dependent spectroscopic evidences of curcumin in}

aqueous medium: A mechanistic study of its solubility and stability. J. Phys. Chem. B 2012, 116, 14533− 14540.

48_{Takagi, T.; Ramachandran, C.; Bermejo, M.; Yamashita, S.; Yu, L. X.; Amidon, G. L. A provisional}

biopharmaceutical classification of the top 200 oral drug products in the United States, Great Britain, Spain, and Japan. Mol. Pharmaceutics 2006, 3, 631− 643.

(36)

36

Tuttavia, la curcumina si degrada facilmente, sia a pH neutro che alcalino. La curcumina è strutturalmente più stabile in ambiente acido, ma, con la diminuzione di pH, l’equilibrio si sposta verso la forma neutra della molecola (solubilità scarsa/nulla)50_.

Pertanto, studi in solventi tampone in genere comportano prima la solubilizzazione della curcumina in un solvente organico, polare, protico, come il metanolo, e successivamente la diluizione con acqua.

Il sistema coniugato della curcumina assorbe nel visibile (408-500 nm) 51_{, e questa} proprietà è stata sfruttata per studiare la sua degradazione, in vari tamponi, tramite metodi spettroscopici e HPLC.

A pH neutro (7.5) e a temperatura ambiente in tampone acquoso, la della

curcumina è approssimativamente 20 min 52_{.Quando la temperatura viene aumentata} a 37°C, la riportata a pH 7.2 è minore di 10 min 53_{Quest’osservazione sulla rapida} degradazione, in seguito a riscaldamento, ha portato ad un’indagine più approfondita dei prodotti di degradazione della curcumina.

È noto che la curcumina sia fotoreattiva, in quanto è stata osservata una riduzione del 5% del composto di partenza semplicemente durante la preparazione dei campioni in vetro chiaro rispetto al vetro ambrato 54_.

La curcumina si degrada mediante due vie principali: solvolisi e degradazione ossidativa.

bio-mimetics and living cells. J. Photochem. Photobiol., C 2009, 10, 81− 95.

52_{Griesser, M.; Pistis, V.; Suzuki, T.; Tejera, N.; Pratt, D. A.; Schneider, C. Autoxidative and cyclooxygenase-2}

catalyzed transformation of the dietary chemopreventive agent curcumin. J. Biol. Chem. 2011, 286, 1114− 1124.

(37)

37

La solvolisi (sostituzione nucleofila o eliminazione mediante molecole solventi) della catena di eptadienedione in tampone acquoso alcalino ha come effetto la degradazione del 90% del composto in 30 minuti. I principali prodotti identificati sono vanillina (5), acido ferulico (6), e feruloilmetano (7), riportati in Figura 11A.

Figura 11 A.

Confronto delle strutture chimiche di vanillina (5), acido ferulico (6) e feruloilmetano (7).

Figura 11.

Principali percorsi di degradazione chimica del composto 1. (A) La solvolisi a pH alcalino della soluzione acquosa tampone rapidamente porta ad una molteplicità di sottoprodotti di frammentazione. (B) L'autossidazione in mezzo tampone crea un biciclopentadione (8), che è il principale prodotto di degradazione in condizioni acquose. (C) La fotodegradazione di 1 può verificarsi quando è in forma cristallina e viene disciolta in solvente organico. (D) Quando viene disciolta in taluni solventi organici (come isopropanolo), la fotodegradazione può includere la reazione con il solvente come substrato.

(38)

38

Mentre l’abbondanza relativa di questi prodotti di degradazione differisce in base al diverso pH d’incubazione e alla temperatura, questi sono stati osservati anche con curcumina sotto incubazione in terreno di cultura cellulare (RPMI 1640, Roswell Park Memorial Institute medium) e sangue umano 55_.

Recenti analisi spettroscopiche hanno rivelato che la solvolisi è solo una via minore, e che il prodotto di degradazione chimica prevalente è un biciclopentadione (8), che è prodotto mediante autossidazione (Figura 11B) 56_.

Figura 11B.

Struttura chimica del biciclopentadione.

La spontanea incorporazione di O₂, indotta da radicali liberi, porta ad ossigenazione e doppia ciclizzazione della catena di eptadienedione che collega i due anelli di metossifenolo 57_.

Un ulteriore studio sulla cinetica della decomposizione del composto radioattivo ha anche identificato diversi prodotti di degradazione che probabilmente si formano nella via di sintesi del biciclopentadione 58_{. Questa reazione di ossidazione avviene senza}

56_{Griesser, M.; Pistis, V.; Suzuki, T.; Tejera, N.; Pratt, D. A.; Schneider, C. Autoxidative and cyclooxygenase-2}

catalyzed transformation of the dietary chemopreventive agent curcumin. J. Biol. Chem. 2011, 286, 1114− 1124.

57_{Gordon, O. N.; Schneider, C. Vanillin and ferulic acid: Not the major degradation products of curcumin. Trends}

Mol. Med. 2012, 18, 361− 363 (author reply, pp 363− 364).

58_{Schneider, C.; Gordon, O. N.; Edwards, R. L.; Luis, P. B. Degradation of curcumin: From mechanism to}

(39)

39

iniziazione fotochimica e può, in parte, spiegare le proprietà antiossidanti riportate per la curcumina.

Queste vie di degradazione suggeriscono che, quando si interpretano i risultati dei test biologici che coinvolgono la curcumina, dovrebbe essere considerata la CR dinamica. Mentre la degradazione ossidativa non richiede iniziazione fotochimica, la degradazione fotochimica della curcumina si verifica sia in forma cristallina che in quella solubilizzata.

La curcumina cristallina è degradata mediante esposizione alla luce solare per dare principalmente vanillina (5), acido ferulico (6), aldeide ferulica (9), e acido vanillico (10), le cui strutture sono riportate in Figura 11C 59_.

Figura 11C.

Strutture chimiche di vanillina (5), acido ferulico (6), aldeide ferulica (9), e acido vanillico (10).

Lo stesso tipo di degradazione è stato osservato per la curcumina in solventi organici quando è esposta alla luce. Si formano anche molti prodotti solvente-dipendenti. In metanolo, isopropanolo, e cloroformio, si forma un prodotto di ciclizzazione interna.

59_{Khurana, A.; Ho, C. T. High-performance liquid-chromatographic analysis of curcuminoids and their}

(40)

40

L’isopropanolo può anche comportarsi come un substrato reattivo, portando alla formazione di un derivato guaiacolico (11), riportato in Figura 11D 60_.

Figura 11D.

Struttura chimica del derivato guaiacolico (11).

Il meccanismo di degradazione fotochimica è causato per lo più da reazioni di tipo I e tipo II con ossigeno molecolare.

La stabilità chimica della curcumina può essere migliorata mediante incapsulamento con lipidi o nanoparticelle.

Altri tentativi di miglioramento della stabilità hanno coinvolto manipolazioni sintetiche per rimuovere o proteggere i siti d’ossidazione (idrossili fenolici ed enolici) e derivatizzazione del β-dichetone per ridurre l’attività dell’accettore enolato di Michael.

Sebbene gli analoghi della curcumina possono rappresentare una via più percorribile per lo sviluppo di molecole stabili in vitro o in vivo, in ogni caso dovranno esser valutati come strutture chimiche completamente nuove.

La rapida degradazione della curcumina richiede molta attenzione per lo studio in

vitro o in vivo. La stabilità della curcumina nelle condizioni dei saggi deve esser sempre

dimostrata.

60_{Tønnesen, H. H.; Karlsen, J.; van Henegouwen, G. B. Studies on curcumin and curcuminoids. VIII.}

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Inoltre, molti studi hanno utilizzato metodi computazionali per prevedere l’attività della curcumina o per spiegare l’attività biologica osservata sperimentalmente. Poiché la curcumina non è probabilmente presente in situ, o perlomeno la sua attività biologica è confusa dalla presenza di molteplici prodotti di degradazione reattivi e/o bioattivi, questi modelli sono poco rilevanti. Anche quando gli studi computazionali hanno considerato le caratteristiche di legame dei prodotti di degradazione, non sono stati considerati altri probabili meccanismi d’interferenza 61_.

Un requisito primario per la maggior parte dei prodotti farmaceutici è la stabilità in condizioni fisiologiche (tipo le condizioni in vivo) e la stabilità in condizioni di stoccaggio o nelle formulazioni.

La curcumina non ha alcuna di queste caratteristiche e mostra una prominente instabilità chimica.

1.5 P

ROPRIETÀ

C

HIMICO-

F

ISICHE

L’instabilità chimica della curcumina è probabilmente la principale responsabile dell’interpretazione sbagliata dei risultati relativi all’attività biologica, in vitro e in vivo, e della difficoltà di effettuare previsioni computazionali sul binding e sull’attività biologica. Similmente ai farmaci noti, la curcumina mostra anche proprietà fisico-chimiche non ottimali.

Oltre ad essere instabile, forma aggregati chimici (colloidi) nelle condizioni usuali dei saggi biochimici 62_{. Alcuni studi} 63 _{hanno descritto una concentrazione critica}

61_{Ciccone, L.; Tepshi, L.; Nencetti, S.; Stura, E. A. Transthyretin complexes with curcumin and bromo-estradiol:}

Evaluation of solubilizing multicomponent mixtures. New Biotechnol. 2015, 32, 54− 64.

62_{Duan, D.; Doak, A. K.; Nedyalkova, L.; Shoichet, B. K. Colloidal aggregation and the in vitro activity of}

traditional Chinese medicines. ACS Chem. Biol. 2015, 10, 978− 988.

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d’aggregazione tra 10 e 20 µM per la curcumina. Questo è importante perché tali concentrazioni corrispondono a quelle normalmente utilizzate nei saggi di sperimentazione.

L’inibizione enzimatica da parte di aggregati colloidali è stechiometrica, il che significa che a una certa concentrazione di composto, la reale concentrazione dell’enzima è molto più bassa. Una volta che un colloide chimico è saturato con la proteina (sia che si tratti di un enzima o di una proteina carrier), qualsiasi enzima non legato è libero di reagire nel saggio 64_.

Di conseguenza, l’apparente selettività in vitro può essere influenzata dalle concentrazioni relative delle proteine (per esempio, tutte le proteine presenti: enzimi,

carrier e proteine substrato) e non sempre riflette la selettività della tradizionale

interazione composto-ligando.

Questi fenomeni meritano particolare considerazione durante la progettazione di esperimenti che includono saggi senza detergenti. Nel caso in cui l’attività osservata non sia dovuta a interferenze nel saggio, l’instabilità della curcumina mette in dubbio l’identità del composto realmente “attivo”.

È importante considerare la localizzazione cellulare della proteina target, in quanto la curcumina ha mostrato la capacità di alterare le membrane cellulari. L’alterazione della membrana può essere interpretata come un legame specifico con le proteine associate alla membrana 65_{. Questo potrebbe avere significative ripercussioni per molte} attività riportate, comprese quelle per canali ionici, proteine di trasporto, e fattori di crescita.

64_{Coan, K. E. D.; Maltby, D. A.; Burlingame, A. L.; Shoichet, B. K. Promiscuous aggregate-based inhibitors}

promote enzyme unfolding. J. Med. Chem. 2009, 52, 2067− 2075.

65_{Ingolfsson, H. I.; Thakur, P.; Herold, K. F.; Hobart, E. A.; Ramsey, N. B.; Periole, X.; de Jong, D. H.; Zwama,}

M.; Yilmaz, D.; Hall, K.; Maretzky, T.; Hemmings, H. C., Jr.; Blobel, C.; Marrink, S. J.; Kocer, A.; Sack, J. T.; Andersen, O. S. Phytochemicals perturb membranes and promiscuously alter protein function. ACS Chem. Biol. 2014, 9, 1788− 1798.