Emanuela Grisanti
Relatori
Prof. Gino Tripodi Dott. Roberto Bandettini
In view of the seriousness of the sepsis in these “frail” patients and of the need for the clinician to intervene in a short time in order to prevent irreversible complications, the application of the MALDI technique to the diagnostic activity would allow a quick identification of the etiological agent with the possibility to administer a targeted therapy.
In this regard the goal of the present work is to optimize a custom-made method for the bacterial identification, starting from a positive blood-culture sample, in a shorter time with respect to the traditional methods.
152 blood culture samples were analysed coming from both male and female paediatric patients hospitalized at Istituto Giannina Gaslini in Genoa. Both the routine method and the new rapid method were applied to the samples, moreover 80 of these samples were further analysed with the thick drop method, already describe in literature.
The new rapid method allowed a drastic reduction in the identification time, preserving at the same time an elevated specificity level, at the expenses of a small reduction in the percentage of valid responses given by the instrument, in any case
reduction in the mortality, including, and especially, in paediatric settings.
te (maggiori per esempio nei bambini nati pretermine) o a condizioni cliniche particolari.
Considerata la gravità dei quadri settici in tali pazienti “fragili” e l’esigenza del clinico di intervenire in tempi ristretti per evitare complicanze irreversibili, l’appli-cazione della tecnica MALDI in campo diagnostico permetterebbe l’identifil’appli-cazione in breve tempo dell’agente eziologico con la possibilità di instaurare una terapia mirata.
A tale proposito lo scopo di questo lavoro è stato quello di ottimizzare una metodica custom-made per l’identificazione batterica, partendo da un flacone di emocoltura positivo, in tempi brevi rispetto alle metodiche colturali tradizionali.
Sono stati analizzati 152 campioni di emocoltura di pazienti di sesso maschile e femminile in età pediatrica ricoverati presso l’Istituto Giannina Gaslini di Genova. Ai campioni è stato applicato, oltre al metodo di routine, anche il nuovo metodo rapido e, per 80 di essi, si è proceduto all’ulteriore confronto con il metodo della goccia spessa, già descritto in letteratura.
L’applicazione del metodo rapido ha permesso di ottenere una notevole riduzione
dimostrandosi pertanto superiore.
In conclusione, lo sviluppo di questo metodo può essere di grande beneficio per l’attività identificativa di laboratorio clinico, in quando, permettendo una riduzione dei tempi, potrebbe portare ad un miglioramento della tempestività delle terapie e, pertanto, ad una diminuzione della mortalità anche, e soprattutto, in ambito pediatrico.
2 scopo della tesi 12
3 materiali e metodi 13
3.1 Campioni utilizzati . . . 13
3.2 Preparazione dei vetrini . . . 14
3.3 Metodo routinario . . . 15
3.4 Metodo rapido . . . 15
3.5 Metodo della goccia spessa . . . 16
3.6 Ceppi noti e ceppo di Candida albicans . . . 17
3.7 Tecnica MALDI-TOF MS . . . 17
3.8 Analisi statistica . . . 18
4 risultati 20 4.1 Metodo rapido . . . 21
4.1.1 Risultati generali . . . 21
4.2 Metodo rapido e metodo della goccia spessa . . . 23
4.2.1 Valori negativi e tempo di identificazione . . . 23
4.3 Scrematura dei dati . . . 24
4.4 Risultati con il metodo della goccia spessa . . . 26
4.4.1 Confronto diretto tra i due metodi . . . 30
4.5 Ceppi noti e ceppo di Candida albicans . . . 30
ringraziamenti
Figura 4.4 Matrice di confusione per il metodo della goccia spessa. . .
E L E N C O D E L L E T A B E L L E
Tabella 4.1 Tabella riassuntiva delle identificazioni. . . 20
Tabella 4.2 Valori di accuratezza del metodo rapido e del metodo della goccia spessa. . . 23
Tabella 4.3 Valori di accuratezza e di percentuale di risposta dei metodi dopo la scrematura. . . 26
Tabella 4.4 Valori delle statistiche per specie batteriche. . . 28
Tabella A.1 Tabella di confusione per il metodo rapido. . . 35
Tabella A.2 Tabella di confusione per il metodo con scrematura. . . 36
Tabella A.3 Tabella di confusione per il metodo della goccia spessa. . . . 37
batteri da una sorgente d’infezione, che può essere rappresentata da persone, animali o ambienti in cui si trova il microrganismo [1–7].
La presenza di batteri nel sangue, detta batteriemia, può avvenire anche in assenza di sintomatologia. Essa può essere dovuta a infezioni, interventi chirurgici, cateteri o altri elementi estranei inseriti in vene o arterie [8–10].
Le batteriemie possono essere divise in transitorie, intermittenti e continue. Le batteriemie transitorie si risolvono in poco tempo (minuti od ore) in maniera spontanea e derivano in genere da manipolazioni di tessuti infetti o manovre strumentali. Le intermittenti sono associate ad infezioni suppurative in spazi non drenati con spesso alla base un’ostruzione intermittente. Le continue in genere si hanno in presenza di un’infezione intravascolare.
1.0.2 Sepsi
La sepsi è un’infezione sistemica, caratterizzata dalla presenza di batteri in distretti corporei in genere sterili [11,12]. Si tratta di una patologia invasiva che provoca
una risposta infiammatoria generalizzata [13]. Ogni anno milioni di persone in
tutto il mondo ne sono colpiti e ne muoiono più di uno su quattro [14]. Quindi
risulta molto importante agire il prima possibile con adeguate terapie [15–18]. Le
di una condizione molto delicata con una prognosi che varia dal 30% al 100% di mortalità [31]. Essa presenta quattro fasi cliniche: fase iniziale di shock, fase
di rianimazione attiva, fase di ipermetabolismo (7-10 giorni) e quarta fase con insufficienza epatica e renale.
La sepsi può essere associata alla sindrome da risposta infiammatoria sistemica (SIRS) [32], come mostrato in Fig. 1.1, correlata alla presenza di: febbre alta o
temperatura corporea minore di 36◦C, frequenza cardiaca superiore a 90 battiti al minuto, aumento o riduzione della frequenza respiratoria, leucopenia o leucocitosi [33].
Tra i microrganismi gram positivi più frequentemente isolati in corso di sepsi vi sono: S. pyogenes, S. agalactiae, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae e Clostridium spp.; tra i gram negativi: E. coli, Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Neisseria meningitidis e Bacterioides fragilis.
1.0.3 Aspetti relativi all’età pediatrica
I progressi nel controllo delle malattie infettive negli ultimi decenni, in particolare nella prevenzione e nell’adozione di nuove misure terapeutiche, ha avuto un significativo impatto su una condizione clinica relativamente comune di sepsi in
Figura 1.1:Schema della relazione tra sepsi, sindrome da risposta infiammatoria sistemica (SIRS) e infezione. ©utente: Gambo7 / Wikimedia Commons / CC-BY-SA-3.0.
pediatria [34]. Tuttavia, le sepsi in età pediatrica costituiscono una delle condizioni
più gravi, che possono portare anche a morte del paziente [34–42]. Infatti, il tasso
di mortalità tra i bambini più colpiti da forme gravi della malattia può raggiungere valori superiori al 50%. Anche nei paesi sviluppati, i tassi di mortalità non sono trascurabili (10-20%) e la sepsi rimane una delle cause principali di morte dei bambini [34].
Le criticità sono correlate all’età dei pazienti (maggiori per esempio nei bambini nati pretermine) o a condizioni cliniche particolari.
È stata inoltre osservata una maggiore incidenza di sepsi nel primo di anno di vita rispetto alle altre fasce di età [43].
I principali patogeni che possono causare sepsi in età pediatrica sono: Sta-phylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Salmonella spp. e Neisseria meningitidis.
della coltura.
Un set completo di emocolture comprende due flaconi selettivi, uno per aerobi e uno per anaerobi (distinzione facilitata dal colore dei tappi dei flaconi) [14,44].
I flaconi vengono incubati in appositi strumenti che li monitorano e ne rilevano la positività o negatività. Questi strumenti automatizzati rilevano la crescita microbica mediante l’analisi del rilascio di CO2 utilizzando sensori fluorescenti o sensori colorimetrici oppure, alternativamente, misurando le variazioni di pressione dovute al consumo e alla produzione di gas [45].
1.1.2 Colorazione di Gram
I batteri in base alla colorazione di Gram possono essere classificati in Gram negativi (Gram -) e Gram positivi (Gram +). Il nome “Gram” deriva dal suo inventore, il batteriologo Hans Christian Gram. La colorazione di Gram, sviluppata nel 1884, consiste in diversi passaggi, il primo è dato dall’esposizione al cristal-violetto che permette la colorazione in blu delle componenti acide della parete batterica, seguito dal Lugol che ha la funzione di mordenzante e da una fase di decolorazione mediante l’uso di etanolo.
Gram Negativo
Gram Positivo
Membrana plasmatica Spazio periplasmico Peptodoglicano Membrana plasmatica Membrana esterna (lipopolisaccaride e proteina) Spazio periplasmico PeptidoglicanoFigura 1.2:Schema delle pareti cellulari dei batteri Gram positivi (in alto) e dei Batteri Gram negativi (in basso). Modificata a partire da un’immagine di ©utente: Graevemoore / Wikimedia Commons / CC-BY-SA-3.0.
Figura 1.3:Esempio di colorazione di Gram per batteri Gram + (Bacillus cereus). ©Y. Tambe / CC-BY-SA-3.0.
di quella dei Gram positivi che non viene decolorata e rimane quindi legata al cristal-violetto. Ciò è conseguenza dalla diversa struttura della parete esterna: nei Gram + essa è caratterizzata da un doppio strato lipidico e dalla presenza di lipopolisaccaridi, mentre nei Gram - essa è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano, come rappresentato in Fig.1.2.
La procedura si conclude con l’aggiunta della safranina che colora di rosso le componenti acide libere dei Gram negativi. Ogni passaggio è intervallato dall’e-liminazione dell’eccesso di colorante e dal risciacquo con acqua. Il vetrino viene infine lasciato ad asciugare e successivamente osservato al microscopio ottico ad alto ingrandimento.
I batteri Gram + assumono un colore blu o viola (come mostrato in Fig. 1.3),
mentre i batteri Gram - assumono un colore rosa (come mostrato in Fig. 1.4).
Alcuni tipi particolari di batteri non presentano una colorazione ben definita (rosa o blu/viola) e vengono definiti come Gram-variabili.
Figura 1.4:Esempio di colorazione di Gram per batteri Gram - (Escherichia coli). ©Y. Tambe / CC-BY-SA-3.0.
1.1.3 Semina su piastra e terreni di coltura
Le emocolture segnalate come positive devono essere seminate su terreni selettivi e non, per isolare i microrganismi responsabili del quadro clinico.
Il tipo di semina più utilizzato per l’isolamento di colonie batteriche è la semina per isolamento, detta anche semina per striscio. Lo striscio sul terreno di coltura viene effettuato mediante un’ansa sterile e, in genere, con il metodo a quadranti (mostrato in Fig. 1.5). Per il metodo a quadranti si effettuano dei movimenti a
zig-zag dapprima su un quadrante della piastra, poi su un altro (ruotando la piastra di 90◦) e via via in questa maniera fino ad occupare tutta la piastra.
La semina può essere effettuata in terreni di coltura di diverso tipo, costituiti da specifici componenti in modo da poter favorire la crescita di un ceppo ed eventualmente inibire la crescita di altri. I componenti generalmente presenti nei terreni di coltura sono: l’acqua, i carboidrati (glucosio, lattosio o mannite), gli idrolisati, le proteine (come caseina o emoglobina), i peptoni (composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi delle proteine), i sali inorganici, le sostanze di arricchimento,
Figura 1.5:Esempio di terreno di coltura con microrganismi seminati con il metodo a quadranti.
le sostanze selettive e i solidificanti. In base al tipo di microrganismo che deve essere isolato si utilizzano terreni che possiedono i nutrienti specifici di cui questo necessita.
I terreni di coltura possono essere classificati in base allo stato fisico (solidi e liquidi), in base alla composizione chimica (minimi e complessi oppure sintetici o definiti e semisintetici) e in base alla funzione (di arricchimento, selettivi e differenziali).
Alcuni tra i terreni solidi di coltura maggiormente usati sono:
• l’agar sangue, terreno complesso di arricchimento, contenente sangue di montone;
• l’agar cioccolato, terreno complesso di arricchimento, contenente sangue di cavallo;
• il MacConkey, terreno sintetico selettivo per i batteri gram negativi, in quanto viene inibita la crescita dei batteri gram positivi, e differenziale, in quanto il lattosio e il rosso neutro permettono la distinzione tra batteri fermentanti e non fermentanti;
1.1.4 Spettrometria di massa
La spettrometria di massa è una tecnica analitica, estremamente sensibile, che consente l’identificazione e l’analisi quantitativa di una molecola a partire dal suo rapporto massa/carica (m/z).
La misurazione della massa di una molecola non può essere eseguita direttamen-te, perciò è necessario ionizzare la molecola per poi effettuare la misurazione del rapporto m/z dello ione ottenuto. Al fine di misurare tale rapporto, la spettrometria di massa genera degli ioni a partire dal campione e li separa tramite dei campi magnetici.
Il processo di ionizzazione è effettuato tramite l’indirizzamento di un fascio di elettroni ad energia nota sulla superficie del campione. Le molecole ionizzate sono instabili e, in base alla loro struttura chimica, si dividono in ioni più leggeri. In funzione del rapporto m/z degli ioni si genera uno spettro caratteristico per ogni composto, detto spettro di massa.
La spettrometria di massa prevede l’uso di quantità di campione, in miscele complesse, estremamente piccole e in bassissime concentrazioni.
e deve inoltre avere un’alta capacità di assorbimento ottico nella regione UV. In genere per ionizzare il campione viene utilizzato un fascio laser ultravioletto e la matrice ha la capacità di assorbire questa luce e di trasformarla in energia termica. Una parte della matrice si riscalda velocemente e viene vaporizzata con il campione. La matrice quindi protegge dagli effetti del raggio laser l’analita ionizzato e vaporizzato. Si ottengono così degli ioni, di solito a singola carica. Questo processo è esplicitato in Fig.1.6.
La spettrometria di massa a tempo di volo o MALDI-TOF MS (TOF-MS, Time of Flight Mass Spectrometry) è un tipo di spettrometria di massa correlato con la misura del tempo di volo. Mediante un campo elettrico di intensità nota, gli ioni in analisi accelerano all’interno di un tubo di deriva ad una velocità che è inversamente proporzionale alla loro massa: il rivelatore viene raggiunto più velocemente quindi dagli ioni più leggeri e più lentamente da quelli più pesanti. Pertanto, essendo nota la distanza che gli ioni devono percorrere per raggiungere il rivelatore, il loro rapporto m/z può essere calcolato misurando il tempo che essi impiegano per raggiungerlo.
La tecnica MALDI-TOF MS permette, a partire da cellule intatte o da estratti cellulari, un’accurata identificazione dei microrganismi [50], sia gram positivi che
Figura 1.6:Rappresentazione schematica del processo di desorbimento/ionizzazione nella tecnica MALDI. Modificata a partire da un’immagine di ©K. Murray / CC-BY-SA-3.0.
per gli studi epidemiologici [51]. Questa tecnica presenta diversi vantaggi ed alcune
limitazioni. I vantaggi sono la sensibilità della metodica, la rapidità [52,53] ed i
bassi costi [54,55]. Le limitazioni riguardano l’identificazione di nuovi isolati, in
A tale proposito lo scopo di questo lavoro è stato quello di ottimizzare una metodica custom-made per l’identificazione batterica utilizzando la tecnica MALDI, partendo direttamente da un flacone di emocoltura positivo.
responsabili di sepsi è stato effettuato su campioni di pazienti in età pediatrica. Si tratta di pazienti, sia di sesso maschile che femminile, ricoverati presso l’Istituto Giannina Gaslini di Genova.
Sono stati analizzati 152 campioni di emocoltura sia con un metodo rapido che con quello utilizzato nella routine di laboratorio. I campioni utilizzati sono rappresentativi della pratica quotidiana di laboratorio, in quanto l’unica selezione effettuata è consistita nell’eliminare i campioni risultati come “flora mista” tra-mite osservazione al vetrino (Gram) o tratra-mite metodo routinario, in quanto noti per fornire risultati non attendibili all’analisi al MALDI-TOF MS, ed i campioni per i quali l’identificazione tramite metodo routinario è risultata non possibile o particolarmente problematica.
Il confronto tra metodi è stato effettuato anche per dei ceppi noti di Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e per un ceppo di Candida albicans, nonché per un campione risultato positivo per miceti lievitiformi all’osservazione microscopica del vetrino.
È stato, inoltre, analizzato il “tempo di positivizzazione” dei campioni di emocol-tura, ovvero il tempo in cui è stata rilevata la positività di questi dallo strumento
lievitiformi.
Si procede in questo modo: una goccia di sangue prelevata con una siringa dal flacone dell’emocoltura viene posta in modo omogeneo su un vetrino. Effettuata la fissazione, si procede con la colorazione di Gram, introdotta nella sezione1.1.2. I
passaggi di questa colorazione sono i seguenti:
• ricoprire il preparato con il colorante cristal-violetto e lasciare agire per un minuto;
• sciacquare con acqua;
• ricoprire il vetrino con il Lugol e lasciare agire per un minuto;
• sciacquare con acqua;
• decolorare il vetrino con etanolo (tenere il decolorante sul vetrino per pochi secondi);
• sciacquare con acqua;
• ricoprire il vetrino con la safranina e lasciare agire per un minuto;
Il metodo utilizzato in routine prevede, dopo la preparazione del vetrino e la sua osservazione, la semina del campione a quadranti su terreni solidi (agar sangue, agar cioccolato, Mc Conkey, agar sale-mannitolo e Chromagar Candida). Le piastre vengono incubate in termostato a 37◦C per 24-48 ore in presenza di anidride carbonica, nel caso delle piastre di agar sangue e agar cioccolato, e ad aria, nel caso di piastre Mc Conkey, agar sale-mannitolo e Chromagar Candida.
Il giorno successivo (ovvero dopo circa 24 ore), se le piastre presentano crescita microbica, si procede con la tecnica MALDI-TOF MS per l’identificazione del germe e, successivamente, con l’eventuale allestimento dell’antibiogramma per testare la sensibilità o resistenza a determinati antibiotici.
3.4
metodo rapido
Per lo studio del metodo rapido sono state valutate due procedure definite come “metodo rapido” e “metodo della goccia spessa”.
Il metodo rapido permette l’identificazione di eventuali batteri causa di sepsi in un tempo estremamente veloce: solo circa 2 ore (invece di 24), oltre che con l’uso di materiali a bassissimo costo, facilmente reperibili in laboratorio.
La procedura del metodo in questione è la seguente:
come si presenta il precipitato;
• dopo l’alternarsi dei lavaggi e delle centrifugazioni, eliminare il sovranatante e procedere con la metodica MALDI-TOF MS con il precipitato.
Per i batteri Gram negativi occorrono un numero di lavaggi e centrifugazioni minore rispetto ai Gram positivi (talvolta anche uno).
Nel caso dei miceti lievitiformi è stata utilizzata la stessa procedura con delle piccole variazioni: l’uso di falcon da 15 ml invece di provette da 5 ml, la velocità della centrifuga 4000 g invece di 3500 g e riduzione del numero di lavaggi con fisiologica a 3-4 in totale invece di 4-5.
3.5
metodo della goccia spessa
Per il metodo della goccia spessa, utilizzato in 80 campioni, viene inoculata una piastra di agar sangue con una goccia prelevata dal flacone positivo. Tale goccia viene diffusa su un’area circolare di terreno con diametro non superiore a 2 cm.
Le piastre, a questo punto, sono state messe a incubare (37 ◦C, anidride carbonica) ed osservate dopo 3 ore. Per le piastre che presentavano crescita batterica si è
3.6
ceppi noti e ceppo di candida albicans
I ceppi batterici noti (ATCC) sono stati scongelati e seminati, con il metodo a quadranti, su terreno agar sangue e messi ad incubare in termostato a 37◦C. Il ceppo di Candida albicans è stato invece seminato su terreno Chromagar Candida e messo ad incubare in termostato alla stessa temperatura. Dopo aver aspettato la crescita per 24 ore si è proceduto a preparare per ogni campione una sospensione avente torbidità pari a 0, 5 McFarland e, partendo da essa, per i ceppi noti tre diluizioni successive (1:10, 1:100, 1:1000) per un totale di 1 ml ciascuna. Queste sospensioni microbiche sono state poi inserite, mediante siringa, nei flaconi per emocoltura e quest’ultimi inseriti nello strumento “BactAlert”, che rileva la loro positivizzazione. A seguito della positivizzazione, si è proceduto con il metodo della goccia spessa e con il metodo rapido.
3.7
tecnica maldi-tof ms
La tecnica MALDI-TOF MS prevede l’uso di una piastrina costituita da tre settori, ciascuno contenente sedici pozzetti per i campioni ed un pozzetto al centro per il ceppo di Escherichia coli di riferimento (ATCC 8739). Dapprima viene letto con lo specifico lettore il codice della piastrina utilizzata e poi vengono inseriti di volta in volta i codici dei campioni presenti nei pozzetti nelle varie posizioni della
valore di probabilità.
3.8
analisi statistica
L’analisi statistica è stata eseguita mediante l’uso del software R [56].
Il risultato della misura effettuata dallo strumento MALDI-TOF MS è stato consi-derato come negativo (campione sterile) nel caso in cui nessuna delle identificazioni putative fosse associata ad un valore di probabilità maggiore del 50%. Come spiega-to in dettaglio nella sezione4.3, al fine di migliorare l’accuratezza delle risposte, in
un secondo momento sono state considerate come risposte negative le risposte null prodotte dallo strumento in un tempo maggiore di 50 ore. Nel caso del metodo della goccia spessa, sono state considerate come risposte non valide anche i casi nei quali non è stata osservata crescita batterica. Infine, in tutti i casi, sono state prese come identificazioni di riferimento (contro le quali sono confrontati i valori predetti) quelle ottenute tramite il metodo routinario.
Il tempo necessario MALDI per generare l’identificazione è stato analizzato tramite regressione lineare multipla, usando come regressori: l’identificazione ottenuta con il metodo routinario, la correttezza dell’identificazione ottenuta con
1:1000) sono state ottenute 15 identificazioni con il metodo rapido e 16 con il metodo della goccia spessa (11 dopo 3 ore e 5 dopo 5 ore).
Per il ceppo di Candida albicans è stata ottenuta 1 identificazione con il metodo rapido e nessuna identificazione con il metodo della goccia spessa.
Inoltre è stata effettuata l’identificazione di un campione proveniente da una emocoltura positiva per miceti lievitiformi (Candida parapsilosis). Il metodo rapido si è mostrato in grado di fornire la corretta identificazione del microrganismo, al contrario del metodo della goccia spessa che invece non ha fornito una risposta
Tot. ID Gram - Gram +
3 h 5 h 3 h 5 h
Metodo rapido 152 116 53 - - 63 -
-Met. goccia spessa 80 39 30 27 3 9 2 7
Tabella 4.1:Tabella riassuntiva delle identificazioni ottenuta tramite il metodo rapido ed il metodo della goccia spessa. Nelle colonne sono riportati: il numero dei campioni totali esaminati, il numero di identificazioni e la loro suddivisione tra Gram + e Gram -. Per il metodo della goccia spessa il numero delle identificazioni è stato suddiviso ulteriormente tra quelle ottenute dopo 3 ore e quelle ottenute dopo 5 ore.
4.1.1 Risultati generali
Per ogni campione positivo si è proceduto ad applicare il metodo di isolamento e di identificazione dei microrganismi, come descritto in sezione3.3e,
contempora-neamente, è stato utilizzato il metodo rapido (descritto in sezione3.4), in modo da
poter confrontare tra loro i risultati ottenuti.
Il confronto è stato effettuato tramite la costruzione di una matrice di confusione, mostrata come Tab.A.1in appendiceA. Queste matrici si costruiscono collocando nelle colonne i valori ottenuti dal metodo rapido (“valori predetti”) e, nelle righe, i valori ottenuti con il metodo routinario (“valori di riferimento”). I numeri presenti nelle varie celle rappresentano la frequenza con la quale il valore di riferimento corrisponde al corrispondente valore predetto.
La matrice di confusione può essere mostrata in modo grafico mappando i diversi valori delle celle, dopo averli normalizzati per colonna, su di una scala di grigi, come è mostrato in Fig.4.1. In una condizione di corrispondenza perfetta
(accuratezza 100%), si avrebbero tutti i quadrati della matrice di colore nero, tranne i quadrati lungo la diagonale principale, che sarebbero di colore bianco. Osservando la Figura in questione si può osservare la presenza di quadrati di colore chiaro disposti fuori dalla diagonale, lungo una linea orizzontale corrispondente al valore predetto “null” (come definito in sezione3.8). Tale situazione è indice della presenza
di falsi negativi.
0 1 E.cloacaeE.coli E.faecalis E.faeciumK.oxytoca K.pneumoniaeM.luteus P.aeruginosa P.fluorescensS.aureus S.capitis S.epidermidis S.haemolyticusS.hominis S.maltophiliaS.mitis/oralis S.pneumoniaeS.warneri B.caccae B.capacia C.indologenesG.sanguinis P.mirabilis E .c lo ac ae E .c ol i E .fa ec al is E .fa ec iu m K .o xy to ca K .p ne um on ia e M .lu te us P .a er ug in os a P .fl uo re sc en s S .a ur eu s S .c ap iti s S .e pi de rm id is S .h ae m ol yt ic us S .h om in is S .m al to ph ili a S .m iti s/ or al is S .p ne um on ia e S .w ar ne ri P re de tti Null Negativo
Figura 4.1:Matrice di confusione per il metodo rapido. I valori delle celle sono normalizzati per colonna e rappresentati sulla scala di grigi.
riportato (insieme al suo intervallo di confidenza) in Tab. 4.2 . Si è osservato in
particolare che, come già anticipato, ben il 68, 9% di tutti gli errori forniti dal metodo fosse rappresentato da falsi negativi.
4.2
metodo rapido e metodo della goccia spessa
Sono stati confrontati 80 campioni in cui è stato applicato sia il metodo rapido che il metodo della goccia spessa ed è stata osservata l’accuratezza dei due metodi. Dal confronto si è osservata un’accuratezza di circa il 73% con il primo metodo e un’accuratezza di circa il 45% con il secondo (come mostrato nella Tab.4.2).
4.2.1 Valori negativi e tempo di identificazione
Conseguentemente si è proceduto ad analizzare con maggiore precisione i valori per i quali il MALDI-TOF MS non ha fornito l’identificazione mediante il metodo rapido, definiti come “valori null”, mettendoli in relazione al tempo in cui essi vengono segnalati come positivi dal BactAlert ed il risultato dell’analisi è mostrato in Fig. 4.2. Si è visto, come mostrato nel grafico, che i valori null risultati come
delle identificazioni. Infine, l’analisi evidenzia che i microrganismi definiti come a lenta crescita, quali M. luteus e S. capitis, sono associati fortemente a lunghi tempi di positivizzazione, ma ciò è indipendente dalla correttezza dell’identificazione ottenuta.
4.3
scrematura dei dati
A seguito delle osservazioni descritte nella sezione 4.2.1 e, come descritto nella
sezione3.8, poichè i “valori null” con un tempo di positivizzazione minore di 50
ore sono risultati “falsi negativi” (circa il 21% dei casi), si è proceduto con una scrematura dei dati, analizzando le effettive identificazioni in modo da valutarne l’accuratezza.
L’accuratezza delle identificazioni è risultata di circa l’88%, come descritto nella Tab.4.3.
Si tenga presente che quei campioni per cui non si è ottenuta una identificazio-ne tramite il metodo rapido sono stati comunque identificati usando il metodo routinario.
0 50 10 0 15 0 Corretto Te m po ( h) Falso Vero
Figura 4.2:Grafico del tempo di positivizzazione dei valori null, divisi per la correttezza dell’identificazione. Si noti come i valori falsi-negativi corrispondano ad un range di tempo inferiore a 50 ore e come i valori veri-negativi siano invece spesso correlati ad un tempo di identificazione di gran lunga superiore.
in appendiceAe, graficamente, in Fig. .3. Come si può vedere, in questo caso i quadrati chiari della matrice sono disposti quasi unicamente lungo la diagonale maggiore, ad indicazione della correttezza dei risultati ottenuti.
Per i risultati ottenuti con questo metodo, si è proceduto anche ad analizzare con maggiore dettaglio le identificazioni ottenute con le specie batteriche che presentano prevalenza (percentuale di presenza nei campioni osservati) maggiore del 10%, in quanto esse corrispondono alle specie batteriche più rappresentative (rappresentando esse cumulativamente quasi il 70% dei campioni). I risultati sono riportati in Tab. 4.4: come si può vedere, per le specie batteriche con maggiore
prevalenza, si riscontrano ottimi valori di sensitività, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo ed accuratezza bilanciata.
4.4
risultati con il metodo della goccia spessa
Si è proceduto infine a testare un sotto-insieme di campioni con un metodo diffe-rente, denominato: “metodo della goccia spessa”, per confrontarlo sia con il metodo di routine che con il metodo rapido. Il metodo è descritto nella sezione3.5e la
0 1 E.cloacaeE.coli E.faecalis E.faeciumK.oxytoca K.pneumoniaeM.luteus Negativo P.aeruginosa P.fluorescensS.aureus S.capitis S.epidermidis S.haemolyticusS.hominis S.maltophiliaS.mitis/oralis S.pneumoniaeS.warneri B.caccae B.capacia C.indologenesG.sanguinis P.mirabilis S.hyointestinalisS.porcinus S.vitulinus E.cloacae E.coli E.f aecalis E.f aecium K.o xytoca K.pneumoniae M.luteus Negativ o P.fluorescens S.aureus S.capitis S.epider midis S.haemolyticus S.hominis S.maltophilia S.pneumoniae S.w ar ner i Riferimento Pre detti
Figura 4.3:Matrice di confusione per il metodo rapido con scrematura, descritto nella sezione4.3. L’immagine è stata costruita come in Fig.4.1. Si noti come i quadrati chiari (corrispondendi alle celle con alti valori di corrispondenza) siano disposti quasi unicamente lungo la diagonale maggiore.
presentano prevalenza maggiore del 10%.
riportata come Tab.A.3in appendiceAe graficamente come Fig.4.4.
In questo caso, sono stati analizzati con lo strumento MALDI-TOF MS solo i campioni nei quali è stata osservata una crescita batterica. L’accuratezza e la percentuale di risposte ottenibili con questo metodo sono riportate in Tab. 4.3.
Come si può vedere, la percentuale di risposte non valide concordanti con il metodo di riferimento è risultata essere molto maggiore rispetto a quella che si ha con il metodo rapido dopo la scrematura dei dati (51% rispetto al 21%). Di contro l’accuratezza non è risultata essere significativamente diversa da quella del metodo rapido, come si può notare dal fatto che il suo intervallo di confidenza (79%, 98%) includa completamente quello riportato per l’altro metodo (81%, 93%).
Infine, abbiamo provveduto a studiare il tempo di crescita batterica sufficiente per poter allestire il preparato da analizzare con il MALDI. Il 74, 4% dei campioni analizzati presenta un tempo inferiore a 3 ore (intervallo di confidenza al 95%: 57, 9%, 87, 0%), mentre i restanti presentano tempi compresi tra le 3 e le 5 ore.
0 1 E.coli E.faecalis K.pneumoniae S.aureus S.epidermidis S.hominis S.maltophilia C.youngae K.oxytoca P.mirabilis E.coli E.f aecalis K.pneumoniae S.aureus S.epider midis S.hominis S.maltophilia Riferimento Pre detti
Figura 4.4:Matrice di confusione per il metodo della goccia spessa. L’immagine è stata costruita come in Fig.4.1.
nei valori di accuratezza tra i due metodi risulti non significativa (p-value=0.35, test χ2).
È interessante notare che in quasi tutti i casi (10/11 – 91, 0%) nei quali il metodo rapido non sia riuscito a fornire una riposta valida, neanche il metodo della goccia spessa è riuscito a fornirla. Al contrario, nel 75, 6% dei casi nei quali il metodo della goccia spessa non è riuscito a fornire una risposta valida, il metodo rapido è riuscito a fornirla ed il 77, 4% di risposte fornite in questo caso risulta corretto.
4.5
ceppi noti e ceppo di candida albicans
Si è, inoltre, effettuato un confronto delle due metodiche sperimentali utilizzando ceppi di riferimento ATCC (come indicato nella sezione3.6) rispetto ai dati ottenuti
con il metodo di routine. Per i ceppi noti il risultato ottenuto con il metodo rapido ha mostrato una totale corrispondenza tra i valori predetti e quelli di riferimento, con l’unica eccezione del ceppo di E. faecalis con la diluizione 1:100. Anche i valori ottenuti con il metodo della goccia spessa sono risultati congruenti (dopo 3 ore per le diluizioni del ceppo di E. coli e per lo 0, 5 McF e le diluizioni del ceppo di S. aureus e E. faecalis o dopo 5 ore per lo 0, 5 McF del ceppo di E. coli e per lo 0, 5 McF
di accuratezza dei risultati che di facilità di applicazione in laboratorio clinico della metodica. Tale diminuzione dei tempi è avvenuta a scapito di una piccola riduzione nella percentuale delle risposte valide fornite dallo strumento. Questa riduzione non presenta un forte impatto sulle procedure di identificazione, in quanto le risposte non valide sono chiaramente identificate come tali e vengono integrate dai risultati ottenuti tramite il metodo routinario, che viene effettuato in contemporanea con il metodo rapido.
Infine, dal confronto (effettuato su 80 campioni) di questo metodo con il me-todo della goccia spessa descritto in letteratura si è osservato come il meto-do rapimeto-do, a fronte di un livello di accuratezza simile, presenti una percentua-le significativamente più alta di identificazioni valide, dimostrandosi pertanto superiore.
In conclusione, lo sviluppo di questo metodo può essere di grande beneficio per l’attività identificativa di laboratorio clinico, in quando, permettendo una riduzione dei tempi, potrebbe portare ad un miglioramento della tempestività delle terapie e, pertanto, ad una diminuzione della frequenza dei decessi anche, e soprattutto, in
Lo studio in oggetto apre interessanti possibilità di ulteriori sviluppi.
Nonostante il valore di accuratezza del metodo sviluppato sia già elevato, sareb-be auspicabile riuscire ad aumentarlo ulteriormente, fino a renderlo uguale alle metodiche gold-standard.
In aggiunta a ciò, le osservazioni preliminari effettuate sui miceti lievitiformi dimostrano la possibilità di estendere questo metodo anche per la loro identificazio-ne. A questo proposito sono però necessari ulteriori futuri studi atti ad aumentare la numerosità delle osservazioni.
Infine, sarebbe interessante valutare la possibilità di allestire gli antibiogrammi immediatamente dopo l’identificazione tramite metodo rapido, in modo da ve-locizzare anche i tempi necessari alla valutazione di sensibilità e resistenza agli antibiotici in modo da aumentare la rapidità di risposta tramite terapie mirate.
questo.
t a b e l l e 35 Null 0 2 2 0 0 1 0 5 2 0 3 2 15 0 1 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 P.aeruginosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P.fluorescens 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.aureus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.capitis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.epidermidis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.haemolyticus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.hominis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.maltophilia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.mitis/oralis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.pneumoniae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.warneri 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 B.caccae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B.capacia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C.indologenes 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G.sanguinis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P.mirabilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.hyointestinalis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.porcinus 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.vitulinus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
t a b e l l e 36 S.epidermidis S.haemolyticus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.hominis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.maltophilia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.mitis/oralis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.pneumoniae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.warneri 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 B.caccae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 B.capacia 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C.indologenes 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 G.sanguinis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P.mirabilis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.hyointestinalis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.porcinus 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.vitulinus 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabella A.2:Tabella di confusione per il metodo rapido riportante i risultati ottenuti dopo aver effettuato la scrematura dei dati descritta in sezione4.3.
Riferimento
Predizione E.coli E.faecalis K.pneumoniae S.aur
eus
S.epider
midis
S.hominis S.maltophilia C.y
oungae K.oxytoca P.mirabilis E.coli 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 E.faecalis 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 K.pneumoniae 0 0 14 0 0 0 0 0 0 0 S.aureus 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 S.epidermidis 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S.hominis 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 S.maltophilia 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 C.youngae 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 K.oxytoca 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 P.mirabilis 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
metodo routinario (Rifer), la correttezza dell’identificazione ottenuta con il metodo veloce (Corret) e la loro interazione
Call :
lm( formula = Tempo ~ Corret * Rifer , data = dati_MALDI ) Residuals :
Min 1Q Median 3Q Max -24.850 -2.756 -0.064 1.573 33.956
Coefficients : (12 not defined because of singularities )
Estimate Std . Error t value Pr (>|t|) ( Intercept ) 10.3712 11.4846 0.903 0.369 CorretTRUE 1.7487 8.3563 0.209 0.835 RiferE . coli -0.6125 8.1209 -0.075 0.940 RiferE . faecalis -1.3350 9.6490 -0.138 0.890 RiferE . faecium 7.8588 13.9272 0.564 0.574 RiferK . oxytoca -6.2712 13.9272 -0.450 0.653 RiferK . pneumoniae -2.1760 8.0730 -0.270 0.788 RiferM . luteus 46.6000 11.1417 4.182 6.28e -05 *** RiferNegativo -6.5512 13.9272 -0.470 0.639 RiferP . fluorescens 7.6100 11.1417 0.683 0.496 RiferS . aureus 1.3388 12.7645 0.105 0.917 RiferS . capitis 44.6300 9.6490 4.625 1.14e -05 *** RiferS . epidermidis 10.3763 11.8176 0.878 0.382 RiferS . haemolyticus 6.9600 8.6304 0.806 0.422 RiferS . hominis 6.9088 8.3563 0.827 0.410 RiferS . maltophilia 9.6133 8.5096 1.130 0.261 RiferS . pneumoniae -2.2500 11.1417 -0.202 0.840 RiferS . warneri 7.4100 11.1417 0.665 0.508 CorretTRUE : RiferE . coli NA NA NA NA CorretTRUE : RiferE . faecalis NA NA NA NA CorretTRUE : RiferE . faecium NA NA NA NA CorretTRUE : RiferK . oxytoca 8.0713 13.9272 0.580 0.564 CorretTRUE : RiferK . pneumoniae NA NA NA NA CorretTRUE : RiferM . luteus NA NA NA NA CorretTRUE : RiferNegativo 162.4313 12.1414 13.378 < 2e -16 *** CorretTRUE : RiferP . fluorescens NA NA NA NA
Multiple R- squared : 0.9407 , Adjusted R- squared : 0.928 F- statistic : 74.05 on 21 and 98 DF , p- value : < 2.2e -16
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lavoro.
Ringrazio la mia famiglia per avermi supportato in questa esperienza.
Ringrazio, infine, Giuseppe per essermi stato particolarmente vicino in questo periodo.
