Riassunto
Candida parapsilosis è un lievito patogeno opportunista considerato ad oggi la seconda causa più comune di candidemia dopo Candida albicans. Poco è noto riguardo ai meccanismi di virulenza utilizzati da C. parapsilosis durante l’instaurarsi del processo infettivo, tuttavia, la capacità di aderire alle superfici dell’ospite è ritenuta un evento chiave nelle prime fasi dell’infezione. In C. albicans un ruolo cruciale nell’adesione a superfici biotiche è svolto da una classe di glicoproteine di superficie, chiamate proteine Als (Agglutinin-Like Sequence proteins), codificate da una famiglia multi-genica composta da 8 membri (ALS1-8). La recente pubblicazione dell’intera sequenza del genoma di C. parapsilosis e le prime analisi di omologia hanno evidenziato la presenza di 5 possibili omologhi dei geni ALS (CpALS1-5). Il presente lavoro di tesi si è inserito all’interno di un progetto più ampio volto alla comprensione del contributo di ciascuno dei geni ALS nell’adesione di C. parapsilosis a superfici biotiche e abiotiche, mediante l’allestimento di ceppi mutanti privi dei geni CpALS1-5. In particolare, il gene CPAG_05056 (successivamente indicato come CpALS3), il cui omologo in C. albicans svolge un ruolo di primaria importanza nella virulenza di questo lievito, è stato scelto come primo target per la delezione mediante ricombinazione omologa. Durante la prima parte dell’internato di tesi è stata condotta una caratterizzazione fenotipica del ceppo di riferimento di C. parapsilosis ATCC 22019 (wild type, WT), e di mutanti privi di una (CpALS3H) o di entrambe le copie (CpALS3KO) del gene CpALS3 ottenuti mediante la strategia di delezione basata sull’ utilizzo della cassetta SAT1-flipper. L’analisi della capacità replicativa della collezione di mutanti in terreno YPD e in terreno contenente agenti perturbanti la parete, ha indicato che la delezione di CpALS3 non compromette la vitalità dei ceppi in studio, almeno per quanto concerne le condizioni di crescita utilizzate. Sia il ceppo wild type che i ceppi mutanti, se sottoposti a crescita in condizioni inducenti, sono risultati in grado di produrre pseudoife, a dimostrazione che la delezione di CpALS3 non altera la capacità di C. parapsilosis di andare incontro a morfogenesi. Successivamente, mediante l’allestimento di un saggio di adesione in vitro a cellule buccali umane (HBEC), sono state saggiate le capacità adesive della collezione di mutanti a seguito di co-incubazione per 45 minuti a 37°C di una sospensione cellulare contenente HBEC e lieviti (rapporto 1:1000). Dai dati ottenuti è stato possibile osservare una drastica diminuzione nelle capacità adesive del ceppo mutante privo di entrambe le copie del gene CpALS3. Allo scopo di confermare il contributo di tale gene nell’adesione di C. parapsilosis, nel corso di questo lavoro di tesi è stato creato un ceppo complementato, tramite la re- introduzione di una copia wild type del gene CpALS3 nel background del mutante nullo CpALS3KOb. I risultati ottenuti hanno confermato il ripristino della funzione di adesione alle cellule HBEC da parte del ceppo complementato. La citotossicità del pannello di ceppi in studio è stata, inoltre, valutata mediante quantificazione del rilascio di lattato
deidrogenasi (LDH) da parte della linea tumorale epiteliale umana A549. Il saggio non ha permesso di evidenziare alcun rilascio di LDH da parte dei ceppi mutanti e/o WT, mentre un danno quantificabile (44%) era indotto dal ceppo di C. albicans SC5314, utilizzato come controllo positivo. Infine, una prima analisi del potenziale patogenico è stata valutata nel lepidottero Galleria mellonella. La percentuale di sopravvivenza delle larve infettate con il ceppo mutante non differiva significativamente rispetto al ceppo WT o ricostituito, in accordo con il fatto che CpALS3 possa svolgere un ruolo primario nelle fasi di colonizzazione, ma non sia direttamente coinvolto nel danno tissutale.
