UNIVERSITÀ DI PISA
SCUOLA DI MEDICINA
Dipartimento di Patologia Chirurgica, Medica, Molecolare e dell’Area
Critica
SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN ANATOMIA
PATOLOGICA
Direttore: Prof.ssa Gabriella Fontanini
Tesi di Specializzazione
“NEOPLASIE PARATIROIDEE
CONFRONTO ISTOLOGICO E MOLECOLARE TRA ADENOMI, ADENOMI ATIPICI E CARCINOMI
”
RELATORE
CHIAR.MO PROF.
Fulvio Basolo
CANDIDATO
DOTT.
Andrea Marrazzini
ANNO ACCADEMICO 2016/2017
Al dottor Torregrossa, al dottor Condello ed alla dottoressa Denaro per il loro fondamentale aiuto.
Indice
Indice ... 3
1. Le paratiroidi ... 5
1.1. Sviluppo delle paratiroidi ... 7
1.2. Anomalie di sviluppo ... 10
1.3. Anatomia delle ghiandole paratiroidee normali ... 11
2. Neoplasie delle paratiroidi ... 14
2.1. Adenoma paratiroideo ... 14
2.1.1. Adenoma a Cellule Principali ... 17
2.1.2. Adenoma a Cellule Ossifile (oncocitico) ... 18
2.1.3. Lipoadenoma (amartoma) ... 19
2.1.4. Adenoma a Cellule Chiare ... 20
2.2. Carcinoma paratiroideo ... 21
2.3. Adenoma Atipico ... 24
2.4. Tumori secondari, mesenchimali ed altri ... 26
2.4.1. Tumori secondari ... 26
2.4.2. Tumori mesenchimali ed altri tumori ... 26
2.5. Immunoistochimica ... 27
2.6. Oncogeni ... 29
2.7. Opzioni terapeutiche del carcinoma paratiroideo ... 32
3. Scopo dello studio ... 33
4. Materiali e metodi ... 34
4.1. Materiali ... 34
4.2. Metodi ... 35
4.2.1. Studio delle caratteristiche morfologiche ... 35
4.2.2. Analisi molecolare ... 36
4.2.3. Analisi statistica ... 39
5. Risultati ... 40
5.1. Caratteristiche generali clinico-patologiche ... 40
5.2. Valutazione dei parametri morfologici ... 43
5.2.2. Valutazione del pattern di crescita ... 45
5.2.3. Valutazione dell’invasione capsulare ... 47
5.2.4. Valutazione dell’invasione vascolare ... 48
5.2.5. Valutazione dell’aspetto cistico e della presenza di emosiderina ... 49
5.2.6. Valutazione dell’indice proliferativo Ki67 ... 50
5.2.7. Valutazione delle mitosi ... 51
5.2.8. Valutazione della necrosi ... 52
5.3. Valutazione analisi di espressione genica ... 53
6. Discussione ... 62
7. Conclusioni e prospettive future ... 69
1. Le paratiroidi
La scoperta delle ghiandole paratiroidee è stata effettuata nel 1877 da Ivar Sandström, uno studente di medicina svedese che svolgeva la funzione di assistente al dipartimento di Anatomia dell’Università di Uppsala, e poi pubblicata nel 1880. In realtà già nel 1850 il professore inglese di anatomia comparata Sir Richard Owen aveva descritto la presenza di corpi ghiandolari adesi alla tiroide effettuando la dissezione di un rinoceronte indiano allo zoo di Londra e pubblicato un articolo nel 1862, e già Virchow diciassette anni prima di Sandström aveva notato delle strutture nella regione tiroidea. (Rosai J. et al. afip, tumors of the thyroid and parathyroid glands, 2014,
Johansson, 2015)
La funzione fisiologica di queste ghiandole iniziò ad essere chiarita già nel 1891, quando Eugéne Gley, professore di fisiologia a Parigi, notò che rimuovendo la tiroide di un cane, questi sviluppava tetania ed infine arrivava alla morte solamente se venivano rimosse anche le paratiroidi. Nel 1896 gli italiani Giorgio Vassala e Francesco Generali osservarono che si poteva sviluppare tetania rimuovendo solamente le paratiroidi ed ipotizzarono una forma di intossicazione da qualche composto che le paratiroidi aiutavano ad eliminare. Solamente nel 1924, grazie al lavoro di William MacCollum, un patologo del Johns Hopkins Hospital, si capì che la tetania era dovuta ad un deficit di calcio. Nello stesso periodo il fisiologo norvegese Harald Salvesen provò che la tetania ipocalcemica poteva essere trattata con una iniezione di estratto crudo di paratiroide, e nel 1925 il professore canadese James Collip isolò l’ormone paratiroideo.
Nel 1891 il patologo tedesco Friedrich von Rechlinghausen descrisse quella che chiamò “osteite fibrosa cistica” ed il collegamento tra paratiroide e malattia ossea fu evidenziato nel 1904 da Max Askanazy di Tubinga, che riportò il caso di un paziente con alterazioni ossee e tumore paratiroideo. Fu Friedrich Schlagenhaufer nel 1915 che osservò che spesso solamente una ghiandola risultava aumentata di volume, e quindi ipotizzò che fosse l’alterazione della ghiandola a portare alla malattia ossea.
La prima paratiroidectomia fu eseguita a Vienna da Felix Mandl nel 1925. Un paziente di Mandl, Albert Jahne, di 38 anni, soffriva di gravi problemi ossei. Si era fratturato il femore ed i livelli sierici di calcio risultavano estremamente elevati. Inizialmente Mandl ipotizzò una deficienza paratiroidea, per cui trattò il paziente con
estratto di paratiroide, ma fu subito evidente che i sintomi peggioravano. Per cui il passo successivo fu di eseguire una esplorazione chirurgica del collo, in anestesia locale, in cui venne evidenziata e rimossa una neoplasia paratiroidea di 21 mm, mentre le altre tre ghiandole risultarono normali. Il risultato di questa operazione fu un importante miglioramento della patologia del paziente. (Johansson, 2015)
1.1. Sviluppo delle paratiroidi
Le ghiandole paratiroidee originano dalla III e IV tasca branchiale endoblastica. L’apparato branchiale è formato dagli archi e dalle tasche branchiali. Gli archi branchiali sono strutture mesodermiche, esternamente rivestite da ectoderma ed internamente da endoderma, separate da solchi, invaginazioni della superficie esterna (tasche branchiali ectoblastiche) ed interna (tasche branchiali endoblastiche). L’embrione umano possiede quattro paia di archi branchiali, quattro paia di tasche branchiali ectoblastiche e cinque paia di endoblastiche.
La terza tasca abbozzerà dorsalmente la paratiroide inferiore e ventralmente il timo. La porzione dorsale della quarta tasca darà invece origine alla paratiroide superiore, mentre la porzione ventrale darà origine al corpo ultimo branchiale. Per questo la paratiroide inferiore (chiamata P3 per la sua origine) migrerà in direzione caudale e mediana con il timo mentre la paratiroide superiore (chiamata P4) migrerà insieme alla tiroide. Si avrà perciò un “incrocio embriologico” tra le due ghiandole, e questo spiega perché si possa avere un rapporto più o meno stretto tra le due in base al tragitto di P3.
Studi recenti vorrebbero far rientrare le paratiroidi nel sistema APUD, poiché indagini di biologia molecolare (NSE, Cromogranina A, dopadecarbossilasi) suggerirebbero un’origine (quantomeno una parte preponderante del parenchima paratiroideo) dall’ectoderma della cresta neurale. Ciò renderebbe più chiaro il collegamento tra patologia paratiroidea e le sindromi multiendocrine MEN I e II. (Bagatella, Gaio, Caroggio 2007; Scotti 2005)
Scharpf, 2016
1.2. Anomalie di sviluppo
Le anomalie di sviluppo delle ghiandole paratiroidee comprendono l’agenesia/ipoplasia (es. S. di DiGeorge), ectopia (congenita ed acquisita) e variazioni nel numero delle paratiroidi.
La sindrome di DiGeorge è una rara patologia dovuta a microdelezione del cromosoma 22q11 che determina agenesia od ipoplasia delle paratiroidi e del timo. (Rugarli 2015)
Le ectopie paratiroidee congenite riguardano per lo più la paratiroide inferiore, e queste possono essere timiche, pretracheali, pretiroidee, intratiroidee, sotto-angolomandibolari (per mancata migrazione) e mediastiniche. Le ectopie delle paratiroidi superiori possono essere retroarteriose e sottoarteriose (sotto l’arteria tiroidea inferiore), sotto esofagee ed intertracheoesofagee, laterofaringee o retro faringee, intercricotiroidee ed intratiroidee. (Scotti 2005)
L’ectopia acquisita è invece più frequente a livello delle paratiroidi superiori, ed è dovuta all’aumento delle dimensioni della ghiandola in caso di patologia.
Presenza di paratiroidi sovrannumerarie sono relativamente frequenti, mentre l’assenza di una ghiandola è più rara, probabilmente dovuta a mancata differenziazione od all’atrofia di una ghiandola nelle prime fasi di sviluppo. (Moore et al. 2017; Bagatella, Gaio, Caroggio 2007; Scotti 2005)
1.3. Anatomia delle ghiandole paratiroidee normali
Le ghiandole paratiroidee sono quattro piccole formazioni ovalari lisce, traslucide e capsulate con un piccolo lobulo adiposo presente sul lato opposto all’ilo. Misurano da 5x3x1 mm a 8,3x4,4x1,8 mm, con un peso variabile tra 35 e 40 mg. In realtà la loro forma, avendo una consistenza relativamente molle, varia in base alla compressione delle strutture circostanti.
P4 ha la sua sede tipica nei pressi dell’articolazione cricotiroidea, infatti nel 77% dei casi si localizza in un area di 2 cm di diametro, 1 cm superiormente all’incrocio tra il nervo laringeo inferiore e l’arteria laringea inferiore, posteriormente al nervo.
P3 tipicamente si reperta nel 60% dei casi a livello del polo tiroideo inferiore, inferiormente, lateralmente o posteriormente a quest’ultimo, a non più di 1 cm dall’apice del lobo. Si localizza generalmente più medialmente di P4, e sempre al davanti del nervo laringeo inferiore. (Bagatella, Gaio, Caroggio 2007)
Con l’età è stato osservato un aumento dell’accumulo di tessuto adiposo all’interno della ghiandola ed una diminuzione dei vasi linfatici e delle cellule principali attive. (Staffieri 2007)
L’apporto vascolare deriva da rami dell’arteria tiroidea superiore (P4) ed inferiore (P3) (Rosai J. et al. afip 2014) e le ghiandole sono composte da una ricca rete capillare.
Si repertano tre tipi cellulari differenti: le cellule principali, le più rappresentate e secernenti l’ormone paratiroideo (PTH), piuttosto piccole (5-10 μm), con nucleo centrale e citoplasma eosinofilo-amfofilo, a volte chiaro o di aspetto vacuolato; le cellule ossifile (oncocitiche), poco più grandi (12-20 μm), con nucleo più grande di quello delle cellule principali, nucleoli prominenti e citoplasma acidofilo, con granuli citoplasmatici marcatamente eosinofili, e le cellule di transizione, di struttura intermedia. Si ritiene che siano tutte fasi diverse di un solo tipo cellulare, di cui la cellula principale sarebbe la forma funzionante matura. (Staffieri 2007; Rosai J. et al. afip 2014)
È possibile differenziare le cellule principali in base al loro livello di attività: le cellule principali scure, le forme attive secernenti paratormone (PTH), leggermente basofile con larghi complessi del Golgi con numerose vescicole e granuli di secrezione, le cellule principali chiare, inattive e poco colorabili e le cellule principali esaurite, che
differiscono dalle cellule principali chiare per la presenza di quadri degenerativi e scarsa presenza di granuli di glicogeno. (Staffieri 2007)
Le cellule principali in ghiandole con bassi livelli di tessuto adiposo stromale sono organizzate in aree solide, mentre con l’aumentare della quota adiposa tendono a formare cordoni cellulari ramificati ed anastomizzati tra loro. Possono inoltre formare strutture ghiandolari od acinari ed occasionalmente follicoli contenenti materiale eosinofilo simil-colloidale PAS positivo.
Le cellule ossifile sono ricche in enzimi ossidativi e contengono numerosi mitocondri. Queste cellule appaiono a partire dalla pubertà e tendono ad aumentare di numero con l’età, formando caratteristicamente cluster cellulari ed in qualche caso grossi noduli oncocitici, difficilmente distinguibili da adenomi.
Non si dovrebbero mai osservare figure mitotiche in ghiandole normali dell’adulto. (Rosai J. et. al. afip 2014)
Immunoistochimicamente, le cellule principali ed oncocitiche sono CK8, CK18, CK19 positive, mentre le cellule stromali e l’endotelio vascolare esprimono Vimentina. Le cellule principali esprimono anche Cromogranina A e sono positive per RetinoBlastoma (RB). Il paratormone (PTH) è espresso nella maggior parte della cellule parenchimali, anche se maggiormente nelle cellule pricipali. La Parafibromina, il prodotto del gene CDC73/HRPT2, è normalmente espressa a livello nucleare nelle cellule principali. PGP9.5 (protein gene product) e Galectina3 sono normalmente non espressi nella paratiroidi normali, mentre la Glicogeno Sintasi 3β ed il prodotto del gene APC (adenomatous polyposis coli) sono presenti. L’immunoreattività per PAX8 è presente in circa un terzo delle paratiroidi normali. L’immunreattività per CD4 è presente nelle cellule principali ma non nelle cellule ossifile. Ciclina D1 è espressa in meno del 10% delle paratiroidi normali. L’attività proliferativa MIB1 risulta nel range dello 0,3%. (Rosai J. et al. afip 2014)
Il calcio ionizzato è il principale regolatore della sintesi del Paratormone (PTH), in quanto una diminuzione del calcio ionizzato comporta una aumentata secrezione di PTH. Una aumentata sintesi di PTH comporta l’attivazione dei recettori ossei, con conseguente riassorbimento del calcio ed il suo rilascio in circolo. Nel rene ciò comporta un riassorbimento del calcio ed aumentata sintesi di 1,25-diidrossi-vitamina D la quale, a livello intestinale comporta un aumentato assorbimento del calcio, ed a livello osseo un aumentato riassorbimento osseo del calcio. (Rosai J. et al. afip 2014; Lloyd RV et al. WHO classification of tumours of endocrine organs, 2017)
Origine embriologica delle paratiroidi (Hillary, Balasubramanian, 2017)
Le ghiandole paratiroidee in relazione all’arteria tiroidea inferiore,
2. Neoplasie delle paratiroidi
I tumori delle paratiroidi possono essere classificati come primitivi (adenomi e carcinoma) e secondari, mesenchimali ed altri. (Lloyd RV et al. 2017)
2.1. Adenoma paratiroideo
Un adenoma paratiroideo di circa 2 cm
L’adenoma paratiroideo è una neoplasia paratiroidea benigna composta da cellule principali, oncociti, cellule di transizione od una combinazione di questi tipi cellulari.
Oggi l’iperparatiroidismo primario rappresenta la problematica endocrinologica più comunemente diagnosticata, in particolare nelle donne in postmenopausa. Circa il 90% degli individui con ipercalcemia hanno un iperparatiroidismo primario, e l’85% di questi presenta un adenoma in una singola ghiandola.
Il picco di incidenza si ha intorno ai 50-60 anni con un rapporto femmine-maschi che varia tra 1:1 sotto i 40 anni ad un 5:1 nei soggetti sopra i 75 anni.
L’eziologia non è chiara, con una minima parte associata alle sindromi MEN1 e MEN2A od ai cosiddetti CDC73 related disorders (sindrome Iperparatiroidismo associato a tumore della mandibola (HPT-JT), Iperparatiroidismo familiare isolato (FIHP) ed il carcinoma apparentemente sporadico con CDC73 mutato). Anche l’irradiazione con radiazioni ionizzanti di testa e collo, particolarmente nell’età infantile, è associata con questa patologia.
Anche la terapia a lungo termine con litio sembra aumenti la probabilità di sviluppare un adenoma paratiroideo e l’iperplasia delle cellule principali.
L’adenoma paratiroideo può originarsi in tutte e quattro le ghiandole paratiroidee, con una predilezione per le superiori, come pure in altre zone del collo (lo spazio retro-esofageo, il mediastino, il timo, la tiroide). Può anche originare da tessuto paratiroideo ectopico o soprannumerario a livello pericardico, dei nervi vago ed ipoglosso, della guaina carotidea o nei tessuti molli adiacenti all’angolo mandibolare. Fino ad un 15% dei pazienti presentano un doppio adenoma, con una predilezione per entrambe le paratiroidi superiori (così detta malattia della quarta tasca).
Clinicamente, mentre prima dell’introduzione di screening di routine basati sul calcio sierico i pazienti si presentavano con i sintomi classici dell’iperparatiroidismo primario (danni ossei, come la malattia ossea di Recklinghausen, o osteite fibrosa cistica, e danno renale), oggi il paziente si presenta senza sintomi e si identifica per livelli anomali di calcio sierico. Spesso i pazienti si presentano con debolezza, fatica, ansia e gradi variabili di disturbi cognitivi. Un 4%-15% dei pazienti con iperparatiroidismo primario sviluppa nefrolitiasi, ed il rischio di frattura è aumentato. Classicamente si ritrovano valori elevati di PTH con elevato calcio sierico, ma si possono anche trovare pazienti normocalcemici con iperparatiroidismo primario.
Macroscopicamente l’adenoma paratiroideo può avere dimensioni da inferiori al centimetro fino ad oltre i 10 cm, mentre il termine microadenoma si riferisce ad adenomi di dimensioni inferiori a 0,6 cm e peso inferiore ai 100 mg. Sono generalmente ovoidali con capsula sottile, mentre alcuni sono bilobulati o multilobulati. Al taglio gli adenomi sono soffici e di colore rosa-bruno. Può essere presente una rima di tessuto ghiandolare normale alla periferia della neoplasia, riconoscibile per il colore giallastro o bruno chiaro. Possono essere inoltre presenti foci di trasformazione cistica, a contenuto giallo paglierino o bruno, particolarmente nelle neoplasie di grandi dimensioni, che possono essere accompagnati da foci di fibrosi o calcificazione. Le pareti dell’adenoma
cistico possono essere marcatamente ispessite, con aderenze ai tessuti molli adiacenti od alla tiroide. Possono inoltre aversi infarti spontanei nell’adenoma paratiroideo, e sembra sussista una correlazione tra le dimensioni della neoplasia, la sintomatologia ed i livelli sierici di calcio e PTH.
Microscopicamente la maggior parte degli adenomi paratiroidei sono neoplasie capsulate formate da cellule principali nei vari stadi del ciclo secretorio, mentre i microadenomi sono normalmente non capsulati e può essere difficile distinguerli da ghiandole con iperplasia focale (nodulare). Le cellule che lo compongono hanno una struttura a palizzata intorno ai vasi sanguigni.
Le cellule principali neoplastiche sono in genere tonde o poliedriche e generalmente più grandi rispetto a quelle che si ritrovano nella rima di tessuto paratiroideo normale adiacente.
Occasionalmente si possono osservare cellule di forma fusata. Il citoplasma è debolmente eosinofilo, ma può anche apparire chiaro, ed in qualche caso può apparire un alone perinucleare ben evidente. I nuclei sono in genere rotondeggianti e centrali con cromatina densa simil-linfocitica e nucleoli non appariscenti. Possono essere presenti cellule multinucleate, così come cellule con nuclei ipercromatici larghi fino a 50 μm (così detta “atipia endocrina”). Fino all’80% degli adenomi mostrano un certo grado di attività mitotica, tipicamente < 1 mitosi per 10 HPF, e ciò mostra che la sola attività mitotica è un segno non affidabile di malignità in queste neoplasie. Anche la produzione di follicoli non è rara, ed anzi alcuni adenomi hanno una architettura prevalentemente follicolare. Solo raramente si può avere un’architettura papillare. La capsula è usualmente sottile, ma a volte può essere ispessita, con alcune cellule intrappolate nel suo contesto.
A differenza degli adenomi, l’iperplasia a cellule principali è un processo multi ghiandolare, ma si può comunque avere un’iperplasia asimmetrica (pseudo-adenomatosa), con variazioni marcate nella dimensione ghiandolare, ed in questo caso può essere difficile da differenziare da un adenoma singolo o multiplo.
Le ghiandole normali in pazienti con adenoma sono indistinguibili da quelle dei pazienti normocalcemici usando i classici criteri istopatologici, ma comunque le cellule delle ghiandole non adenomatose contengono prominenti goccioline di lipidi neutri che sono indipendenti dal contenuto adiposo stromale. Nelle cellule adenomatose i lipidi sono assenti o finemente dispersi nel citoplasma. Nelle cellule delle ghiandole non
adenomatose inoltre la secrezione è sotto il livello normale, come pure è diminuito l’indice proliferativo.
La citologia paratiroidea non è un’analisi di routine, in quanto sussiste il rischio di disseminazione di cellule neoplastiche ma, in casi limitati, spesso accidentali, si possono avere analisi citologiche paratiroidee. Citologicamente l’agoaspirato di un adenoma paratiroideo è variabilmente cellulato e spesso contiene cellule epiteliali dissociate, oltre aggregati di piccole cellule con nuclei ipercromatici rotondeggianti od ovalari. Il citoplasma è pallido, amfofilo ed occasionalmente vacuolato. (Lloyd RV et al. 2017)
2.1.1. Adenoma a Cellule Principali
2.1.2. Adenoma a Cellule Ossifile (oncocitico)
Variante relativamente non comune, 3%-6% di tutti gli adenomi paratiroidei. Tendono ad essere più grandi degli adenomi a cellule principali. Al taglio la neoplasia risulta soffice e di colore bruno-rossastro. Le cellule tumorali possono essere organizzate in strati, nidi, acini o trabecole. Sono composti esclusivamente o predominantemente (>75%) da cellule con abbondante citoplasma eosinofilo granulare e da nuclei tondi o ovoidali con cromatina grossolana e nucleoli distinti.
Occasionalmente i nuclei possono essere ingranditi, di forma irregolare ed ipercromatici. Si pensava che queste neoplasie fossero non funzionanti od ipofunzionanti, mentre studi recenti suggeriscono che al contrario i livelli sierici di calcio e PTH sono maggiori rispetto agli adenomi a cellule principali. (Lloyd RV et al. 2017)
2.1.3. Lipoadenoma (amartoma)
Il lipoadenoma paratiroideo (amartoma) è una neoplasia benigna rara caratterizzata da proliferazione di elementi stromali e parenchimali. Occasionalmente è stato associato a iperparatiroidismo. Alcuni lipoadenomi possono raggiungere dimensioni ragguardevoli, con pesi superiori ai 400 g, e possono ritrovarsi in ghiandole in posizione normale od in siti ectopici. Sono stati anche documentati doppi lipoadenomi. Macroscopicamente la neoplasia è capsulata e giallastra, composta da tessuto adiposo maturo con aspetti mixoidi, fibrosi e flogosi cronica. Il parenchima include cellule principali ed un numero variabile di oncociti arrangiati in un pattern sottilmente ramificato a cordoni. Possono anche presentarsi foci di trasformazione lipoadenomatosa in ghiandole con un adenoma a cellule principali tipico. (Lloyd RV et al. 2017)
2.1.4. Adenoma a Cellule Chiare
L’adenoma a cellule chiare è eccezionalmente raro. La neoplasia al taglio si presenta di colorito giallo-brunastro e si compone di cellule con citoplasma chiaro contenente multipli piccoli vacuoli. I nuclei sono piccoli ed ipercromatici, e sono localizzati centralmente o verso la periferia. Sono stati anche segnalati casi di adenomi a cellule chiare presenti in due ghiandole. (Lloyd RV et al. 2017)
2.2. Carcinoma paratiroideo
I carcinomi paratiroidei sono neoplasie maligne che originano dalle cellule del parenchima paratiroideo.
Sono neoplasie molto rare, con incidenza inferiore allo 0,005% negli Stati Uniti ed in Europa, e rappresentano meno dell’1% di tutti i casi di iperparatiroidismo primario. Studi italiani e giapponesi hanno invece dimostrato un’incidenza del 5%-6% di tutti i casi di iperparatiroidismo primario. È stato comunque osservato un aumento dell’incidenza di questa patologia negli ultimi anni.
L’età media è circa 56 anni, con un rapporto maschi:femmine di 1:1.
Una chiara eziologia su base genetica esiste nella sindrome dell’Iperparatiroidismo associato a tumore della mandibola (HPT-JT) e nell’Iperparatiroidismo familiare isolato (FIHP), mentre solo in rari casi è stato osservato in MEN1 e 2.
Non sussiste una chiara correlazione tra carcinoma paratiroideo e radiazioni ionizzanti, mentre sono stati riportati rari casi di carcinoma paratiroideo associati ad una iperplasia prolungata delle cellule principali in pazienti con insufficienza renale cronica e malattia celiaca.
Clinicamente il paziente presenta un’ipersecrezione di paratormone, con livelli sierici di calcio spesso superiori a 14 mg/dL. Spesso i pazienti presentano nefrolitiasi e problemi renali e/o problemi ossei, con osteite fibrosa cistica, riassorbimento osseo sub-periostale, osteoporosi diffusa e fratture.
Altri sintomi sono dovuti all’ipercalcemia come debolezza, perdita di peso, nausea, poliuria e polidipsia. Raramente un carcinoma paratiroideo può essere non funzionante, mimando quindi un carcinoma tiroideo.
Una massa cervicale palpabile si reperta in un 30%-75% dei pazienti (mentre ciò è raro negli adenomi).
Una paralisi del nervo ricorrente può far pensare maggiormente ad un carcinoma paratiroideo.
Macroscopicamente si possono osservare differenti presentazioni. Sono normalmente neoplasie capsulate del peso compreso tra 1,5 g e oltre 50 g, spesso appaiono come masse scarsamente circoscritte che possono essere marcatamente adese alle strutture adiacenti. Al taglio si presentano normalmente compatte e di colore rosa-bruno, di
aspetto lobulare per la presenza di spesse bande di tessuto fibroso. A volte possono comunque essere indistinguibili da un adenoma paratiroideo.
Microscopicamente, per poter diagnosticare un carcinoma paratiroideo, deve obbligatoriamente esserci evidenza di crescita invasiva verso le strutture circostanti, quali la tiroide ed i tessuti molli, invasione vascolare capsulare e/od extracapsulare, invasione perineurale o presenza documentata di metastasi.
Per definire l’invasione vascolare, il tumore deve essere presente, quantomeno parzialmente aderente ed associato a fibrina, all’interno dei vasi capsulari o nei tessuti molli adiacenti. La presenza di invasione vascolare intratumorale non è un criterio di malignità.
La cellularità è variabile, e spesso è sepimentato da spesse bande fibrose che si dipartono dalla capsula. Le bande fibrose si ritrovano in oltre il 90% dei carcinomi, ma la loro presenza non è specifica per malignità. Occasionalmente si può osservare la presenza di follicoli, mentre raramente può avere pattern di crescita carcinosarcomatoide.
La maggior parte dei carcinomi paratiroidei sono formati da cellule principali di media grandezza, con nuclei tondeggianti od ovoidali e cromatina addensata, con caratteristiche citologiche non distinguibili dall’adenoma. Una quantità variabile di oncociti, cellule di transizione, cellule chiare e cellule fusate possono essere presenti.
Il monomorfismo cellulare è una caratteristica comune, ma molti carcinomi paratiroidei esibiscono un certo grado di pleomorfismo, con nuclei di medie dimensioni e piccoli nucleoli, mentre alcune neoplasie possono mostrare un marcato pleomorfismo, con cromatina grossolanamente ammassata e macronucleoli.
Occasionalmente un carcinoma paratiroideo può essere formato solo da cellule ossifile (oncocitiche), con criteri diagnostici identici al carcinoma a cellule principali.
La presenza di mitosi si riscontra in oltre l’80% dei carcinomi, come pure in molti adenomi, mentre le mitosi atipiche fanno propendere per una diagnosi di malignità.
Possono essere presenti foci di necrosi coagulativa nei carcinomi paratiroidei, per cui è stato suggerito che la presenza di macronucleoli, più di 5 mitosi per 50 HPF e la presenza di necrosi sia un indice di una crescita aggressiva della neoplasia.
Nella diagnosi differenziale del carcinoma paratiroideo deve essere presa in considerazione la paratiromatosi, cioè l’impianto di tessuto paratiroideo iperplastico od adenomatoso durante un intervento chirurgico per iperparatiroidismo o residui embriologici.
La maggior parte dei carcinomi paratiroidei tende a recidivare localmente, a livello dei tessuti contigui del collo, con accompagnamento di ipercalcemia e complicanze metaboliche importanti. I siti di coinvolgimento loco-regionale sono la tiroide omolaterale, i muscoli sottoioidei, il nervo laringeo ricorrente omolaterale, esofago e trachea. La diffusione metastatica si realizza più tardivamente nel corso della malattia con diffusione ai linfonodi cervicali, al polmone, fegato ed altri organi.
La sopravvivenza media a 5 ed a 10 anni si assesta sul 78%-85% e 49%-70% rispettivamente. Naturalmente risultano fattori prognostici negativi l’età avanzata, la dimensione della neoplasia ed il sesso maschile. (Lloyd RV et al. 2017)
Infiltrazione capsulare e dei tessuti adiacenti, 10x
2.3. Adenoma Atipico
Sono un gruppo di neoplasie paratiroidee che mostrano alcune caratteristiche del carcinoma paratiroideo ma in cui manca inequivocabilmente la crescita invasiva. Sono da considerarsi neoplasie ad incerto potenziale di malignità.
Macro e microscopicamente si possono avere bande fibrose (associate o meno a deposizione di emosiderina), aderenza a strutture contigue (ma non invasione), specialmente se la neoplasia è di grandi dimensioni e cistica, presenza di nidi di cellule neoplastiche intrappolate nello spessore della capsula, pattern di crescita solido, trabecolare o raramente follicolare, atipia nucleare, nucleoli prominenti ed attività mitotica. Questi pazienti presentano normalmente livelli di calcio sierico intermedi rispetto ai pazienti con carcinoma ed adenoma paratiroideo.
Comunque nessuno di questi parametri solo o combinato è diagnostico per malignità. La maggior parte dei pazienti ha decorso clinico benigno, ma è comunque richiesto uno stretto follow-up. (Lloyd RV et al. 2017)
2.4 Tumori secondari, mesenchimali ed altri
2.4.1 Tumori secondari
Sono tumori che coinvolgono le ghiandole paratiroidee normali, iperplastiche o adenomi paratiroidei, come risultato di estensione diretta da strutture contigue o diffusione linfo-vascolare da un sito primario a distanza.
Le neoplasie che maggiormente vanno ad interessare secondariamente le paratiroidi sono le neoplasie laringee, esofagee, tiroidee, dei tessuti molli adiacenti, oppure metastasi linfovascolari da una neoplasia a distanza. I siti primari maggiormente coinvolti sono le mammelle, il sistema emolinfatico, la cute (melanoma), polmoni e reni. Circa il 4% delle tiroidectomie eseguite per neoplasia rivelano l’invasione diretta delle paratiroidi. A livello autoptico, fino al 12% delle paratiroidi risultano sede di depositi metastatici in casi di pazienti con neoplasie disseminate di vario tipo.
Clinicamente la maggior parte dei pazienti sono asintomatici ma, a volte, è possibile evidenziare una massa cervicale oppure si possono presentare con raucedine, disfagia e dolore cervicale. Solo in casi rarissimi si può avere ipoparatiroidismo per sostituzione ghiandolare. (Lloyd RV et al. 2017)
2.4.2 Tumori mesenchimali ed altri
Neoplasie mesenchimali e stromali paratiroidee sono estremamente rare. Sono riportati tre casi di emangioma in ghiandole iperplastiche od adenomatose ed un solo caso in una ghiandola normale, suggerendo la possibilità di una proliferazione vascolare esuberante associata a tumore più che una vera neoplasia vascolare.
Anche il paraganglioma può originarsi raramente a livello paratiroideo. (Lloyd RV et al. 2017)
2.5. Immunoistochimica
Immunofenotipicamente gli adenomi paratiroidei sono positivi per PTH, il fattore di trascrizione GCM2 (gene regolatore dello sviluppo paratiroideo), GATA3, Sinaptofisina e Cromogranina. CDC73 (parafibromina) è usualmente positiva, tranne negli adenomi associati a HPT-JT. Sono inoltre positivi per RB, APC e la combinazione di CDKN1B (p27), BCL2 e MDM2. Sono in genere negativi per Galectina3 e PGP9.5.
I carcinomi paratiroidei sono usualmente positivi per il PTH, anche se possono esprimerlo meno degli adenomi, come sono positivi per GCM2 e per GATA3, per le citocheratine (CAM5.2), Sinaptofisina e Cromogranina.
Contrariamente all’adenoma oncocitico, positivo per CK14, il carcinoma oncocitico non esprime questo marker. La colorazione per RB è spesso negativa nel carcinoma paratiroideo. Molti carcinomi, con l’eccezione di quelli che si sviluppano in alcuni pazienti con insufficienza renale cronica, sono negativi per la parafibromina, o CDC73. Purtroppo si sono viste numerose variazioni tra laboratori nella riproducibilità della colorazione per la parafibromina.
Nei carcinomi si ha una minor espressione della p27 rispetto agli adenomi.
Ulteriori markers sono stati riportati in letteratura, risultando positivi la Galectina3 ed il PGP9.5, mentre sono risultati non espressi, o solo debolmente, APC, CDKN1B e BCL2. Comunque per il momento il numero di casi è troppo basso perché possano essere validati. (Lloyd RV et al. 2017)
Studi sull’immunoreattività per CDC73 hanno mostrato l’utilità nel predire la ripresa di un adenoma atipico. Infatti nessuna ripresa è stata documentata in casi CDC73 positivi, mentre invece è stata documentata in un 10% dei casi CDC73 negativi. Nei carcinomi invece la ripresa della patologia è stata documentata nel 36% dei CDC73 positivi e nel 38% dei CDC73 negativi. Studi molecolari hanno mostrato che la perdita allelica di RB, p53, CDC73 e CDKN1A (p21) sono più frequenti nei carcinomi, ma si possono anche trovare negli adenomi atipici. La perdita di NME1 (anche chiamata NM23), la proteina von Hippel-Lindau, e di APC è stata trovata solo nei carcinomi. (Lloyd RV et al. 2017)
L’indice di proliferazione Ki67 è usualmente più elevato nei carcinomi (6%-8%) che non negli adenomi (4%), ma non può essere di grande aiuto nei casi equivoci a causa della sovrapposizione dei valori in adenomi e carcinomi.
È stata studiata in diverse ricerche l’immunoreattività per l’antigene associato al ciclo cellulare Ki67 con l’anticorpo monoclonale MIB1: in un caso è stato osservato che la percentuale di positività è maggiore nei carcinomi paratiroidei rispetto agli adenomi (7,1±1,0% contro 2,4±0,2%, p < 0,001) e nessun paziente con adenoma, iperplasia o paratiroide normale superava mai il 5,3%. (Lloyd 1995)
In un altro studio è stato osservato che su otto casi di carcinoma paratiroideo, solamente in un caso la percentuale di Ki67 era inferiore al 5% (4,8%). (Ozolins 2016)
Purtroppo questo indice non è sempre di aiuto per distinguere un carcinoma da un adenoma atipico (Karaarslan 2015), ed in un’altra ricerca, ad esempio, è stata osservata una media di percentuale del Ki67 del 2,7% nei casi di carcinoma, del 2% nei casi di adenoma atipico e dello 0,9% nei casi di adenoma. (Ryhänen 2017)
2.6 Oncogeni
Geneticamente mutazioni ricorrenti di una varietà di oncogeni e geni oncosoppressori giocano un ruolo patogenetico nello sviluppo degli adenomi paratiroidei. CCND1/Ciclina D1 (prima chiamato PRAD1, parathyroid adenoma1) è stato identificato come oncogene attivato nel riarrangiamento del DNA clonale negli adenomi paratiroidei, e risulta iperespresso fin nel 40% dei casi. L’iperespressione della Ciclina D1, un regolatore centrale del ciclo cellulare, causa neoplasia paratiroidea ed iperparatiroidismo biochimico, incluso un setpoint PTH-calcio alterato, in topi transgenici.
Il gene oncosoppressore MEN1, la cui mutazione germinale causa MEN1 (multiple endocrine neoplasia), sviluppa una inattivazione biallelica somatica, per mutazione e/o delezione, nel 12%-35% degli adenomi sporadici. Mutazioni germinali e somatiche in alcuni geni della famiglia CDKN sono stati identificati negli adenomi paratiroidei sporadici. Mutazioni somatiche ricorrenti in ZFX e EZH2 sono state trovate in 1%-5% degli adenomi sporadici, risultando oncogeni paratiroidei diretti. Mutazioni somatiche di CDC73 (chiamato anche HRPT2) si hanno quasi esclusivamente in adenomi di pazienti con HPT-JT o predisposizioni associate, più che in veri casi sporadici.
Nella diagnosi differenziale genetica degli adenomi paratiroidei sono inclusi disordini associati a CDC73 come l’iperparatiroidismo familiare isolato ed il carcinoma apparentemente sporadico con mutazione germinale di CDC73, MEN1 e MEN2A.
MEN1 è una sindrome neoplastica autosomica dominante che si riscontra in 1-2 casi su 100.000 è caratterizzata dalla triade di tumori pituitari, iperplasia paratiroidea e neoplasia pancreatica. La manifestazione principale di MEN1 è l’iperplasia multighiandolare delle cellule principali paratiroidee, mentre l’adenoma paratiroideo è meno comune. Il 90% dei pazienti con MEN1 si presenta con ipercalcemia prima dei 25 anni. La mutazione determinante la perdita di funzione del gene oncosoppressore MEN1 (11q13) codificante per la menina, è stata riscontrata nell’80%-90% dei casi familiari e nel 65% dei casi non familiari. Delezioni esoniche o dell’intero gene sono state riscontrate nel 1%-4%.
Rare mutazioni germinali di CDKN1B (p27) ed altri geni CDKN possono essere associati con sindrome MEN1-simile.
MEN2 è una sindrome neoplastica autosomica dominante che si riscontra in 1 caso su 300.000 e si divide in tre sottotipi in base alla combinazione delle caratteristiche cliniche. MEN2A è la più comune ed è caratterizzata da carcinoma midollare della tiroide, feocromocitoma ed iperparatiroidismo. Il gene di suscettibilità per MEN2A è il gene RET, e ciò ha portato a comprendere che esistono patterns variabili di penetranza correlati al genotipo, e che la soglia maggiore è a livello delle paratiroidi, mentre la soglia più bassa si ritrova a livello delle cellule C.
L’incidenza di iperparatiroidismo, che si riscontra nel 15%-30% dei pazienti, è genotipo-dipendente ed è associata con mutazione del codone C634R. Le lesioni proliferative paratiroidee sono quasi sempre caratterizzate da iperplasia multighiandolare delle cellule principali di tipo nodulare o diffuso, ma occasionalmente sono riportati anche adenomi.
Geneticamente nel carcinoma sporadico paratiroideo si osserva frequentemente una mutazione somatica con inattivazione del gene soppressore CDC73, gene che produce una proteina che controlla l’espressione genica ed inibisce la proliferazione cellulare. Poiché le mutazioni capaci di inattivare CDC73 possono non essere individuate se localizzate esternamente alla porzione codificante, è possibile che l’incidenza riportata di inattivazione di CDC73 come conduttore di malattia (>75%) sia sottostimata.
Mutazioni germinali di CDC73 sono presenti in una minoranza di casi che si presentano come carcinoma paratiroideo sporadico, e ciò ha fatto pensare che alcuni di questi pazienti possono comunque avere HPT-JT od una variante fenotipica. Per questo si è estesa l’analisi del DNA nei familiari di questi pazienti.
Sicuramente possono esserci altri geni coinvolti nell’evoluzione del carcinoma paratiroideo. Ad esempio CCND1/Ciclina D1, un oncogene dell’adenoma paratiroideo, è iperespresso in molte neoplasia paratiroidee. Anche la perdita del cromosoma 13q è stata osservata nei carcinomi paratiroidei, ed un gene oncosoppressore presente su questo cromosoma nelle vicinanze del gene RB1 potrebbe svolgere un suo ruolo in qualche caso.
Nelle MEN1, il carcinoma paratiroideo è stato documentato solo in casi rarissimi. Altri oncogeni candidati nell’avere un ruolo, inferiore rispetto a CDC73, nello sviluppo del carcinoma paratiroideo sono PRUNE2, PIK3CA, KMT2D (prima chiamato MLL2), MTOR, ADCK1 ed alcune chinasi collegate alla migrazione cellulare ed invasione.
Nei casi di carcinoma paratiroideo, geneticamente la diagnosi differenziale include l’HPT-JT, il FIHP ed il carcinoma paratiroideo apparentemente sporadico con mutazioni germinali di CDC73.
L’HPT-JT è una patologia autosomica dominante caratterizzata da adenoma o carcinoma paratiroideo, fibroma ossificante della mandibola e della mascella, cisti renali, adenomi e carcinomi renali. Tipicamente i pazienti con questa condizione si presentano con un adenoma o carcinoma paratiroideo, solo raramente presentano una doppia neoplasia. La diagnosi si basa su riscontro biochimico di iperparatiroidismo primario, l’identificazione del fibroma ossificante della mascella e/o della mandibola, la storia familiare e la variante eterozigote germinale patogenica di CDC73. A livello istologico sussiste un’alta incidenza di trasformazione cistica delle lesioni paratiroidee in questa condizione.
L’HPT-JT (con una percentuale superiore al 50%-80% di casi con CDC73 mutato), il carcinoma paratiroideo (con 20% di casi di carcinoma apparentemente sporadico con CDC73 mutato) ed il FIHP associato con mutazione germinale di CDC73 sono anche chiamati CDC73 related disorders.
Ad oggi è riconosciuto che CDC73 lega la DNA polimerasi II come parte del complesso regolatorio trascrizionale PAF1 e media la metilazione di H3K9, che silenzia l’espressione della Ciclina D1.
Ciclina D1/CCND1 (o PRAD1, parathyroid adenoma1) è un oncogene localizzato sul cromosoma 11q13 e la proteina da lui prodotta è regolatrice del ciclo cellulare. Un riarrangiamento del gene con la regione regolatrice del gene PTH è riportato in un 5% degli adenomi paratiroidei e l’oncoproteina Ciclina D1 è iperespressa in 18%-40% degli adenomi ed in un elevata percentuale dei carcinomi.
Anche il gene RB (retinoblastoma), presente sul cromosoma 13, sembra essere coinvolto nello sviluppo del carcinoma paratiroideo, anche se la delezione della porzione 13q è molto ampia e non è sicuro sia coinvolto unicamente il gene RB (ad esempio sul cromosoma 13q12-14 è presente anche il gene BRCA2, hereditary breast cancer susceptibility gene). (Ricardo V. Lloyd et al. 2017; Shane E., 2001)
2.7 Opzioni terapeutiche per il carcinoma paratiroideo
Nel trattamento del carcinoma paratiroideo l’approccio principale rimane sempre quello chirurgico, con la resezione della paratiroide e delle strutture adiacenti, come il lobo tiroideo ipsilaterale, il tessuto muscolare adiacente, il nervo laringeo ricorrente (se coinvolto) e, nei tumori più invasivi, trachea, esofago, vasi sanguigni od ossa. Purtroppo, essendo l’esame estemporaneo spesso non diagnostico, il chirurgo, nei casi sospetti, deve effettuare una rimozione en bloc, poiché è importante che la capsula della neoplasia sia integra. È invece al momento controversa la dissezione linfonodale, in quanto è più comune una infiltrazione locale che una metastasi linfonodale, in particolare nelle neoplasie di dimensioni inferiori ai 3 cm.
La radioterapia sembra diminuire le recidive locali ed aumentare la disease-free survival, ma ancora gli studi non sono conclusivi. La chemioterapia non sembra avere un ruolo nella sopravvivenza di questi pazienti.
Per il momento il trattamento più importante risulta il controllo dell’ipercalcemia. (McClenaghan 2015, Long, Sippel 2018)
3. Scopo dello studio
Il nostro scopo in questo studio è stato quello di osservare le differenze istologiche e molecolari tra adenomi, adenomi atipici e carcinomi paratiroidei non metastatici.
Nonostante siano ben noti gli aspetti morfologici che permettono la diagnosi differenziale tra le diverse entità, nella pratica istologica quotidiana la loro valutazione può risultare assai difficile. Spesso, infatti, sia le caratteristiche citologiche che architetturali possono essere sfumate e chiaramente apprezzabili solo con un’attenta ed ampia osservazione microscopica, andando a cercare gli elementi sospetti per malignità, cioè la necrosi, i macronucleoli ed il numero di figure mitotiche, e le caratteristiche specifiche del carcinoma paratiroideo, cioè la presenza di invasione vascolare, l’invasione capsulare con estensione ai tessuti adiacenti e la presenza di metastasi.
In base a queste considerazioni, abbiamo valutato e confrontato il profilo di espressione di 770 geni (nCounter PanCancer Progression Panel) tra adenomi, adenomi atipici e carcinomi paratiroidei non metastatici al fine di individuare un pannello di espressione genica che possa essere di aiuto nella diagnosi differenziale tra le classi istologiche analizzate.
4. Materiali e metodi
4.1. Materiali
È stata oggetto del nostro studio la caratterizzazione morfologica di 37 adenomi atipici e di 10 carcinomi paratiroidei non metastatici, nonché la caratterizzazione molecolare di 8 adenomi, 11 adenomi atipici e di 17 carcinomi paratiroidei non metastatici.
Le diagnosi istologiche degli adenomi e degli adenomi atipici sono state formulate presso l’U.O. Anatomia Patologica III e l’U.O. Anatomia Patologica Sperimentale dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana. Le diagnosi di carcinoma paratiroideo sono state effettuate a Pisa ed in altri due centri esterni.
Per tutti i pazienti erano noti quasi sempre i dati istopatologici, ma per i pazienti esterni non erano sempre noti i dati istopatologici e clinico-patologici circa il sesso e l’età.
4.2. Metodi
4.2.1. Studio delle caratteristiche morfologiche
Abbiamo condotto il nostro studio osservando i preparati istologici di 37 adenomi atipici, di cui 11 sono stati utilizzati per l’analisi molecolare e confrontati con 8 adenomi e 17 carcinomi paratiroidei non metastatici, valutando le dimensioni, l’attività mitotica, la presenza di bande fibrose, l’indice di proliferazione Ki67, il pattern crescita, la presenza di invasione capsulare e la sospetta invasione vascolare, la presenza di necrosi, la presenza di aspetti cistici e di depositi di emosiderina. Dove possibile, abbiamo osservato i preparati istologici di 10 carcinomi non metastatici provenienti da Pisa, valutando le dimensioni, l’attività mitotica, la presenza di bande fibrose, l’indice di proliferazione Ki67, il pattern crescita, la presenza di invasione capsulare ed extracapsulare e di invasione vascolare e la presenza di necrosi.
4.2.2. Analisi molecolare
L’analisi molecolare è stata condotta su 11 adenomi atipici, 8 adenomi e 17 carcinomi paratiroidei non metastatici. Sui vetrini colorati con ematossilina ed eosina, su cui è stata condotta l’analisi morfologica, è stata accuratamente delimitata l’area tumorale in modo da poter procedere all’arricchimento tissutale sui preparati destinati all’analisi molecolare.
Purificazione RNA
Per ciascun campione 4 sezioni non colorate dello spessore di 5 µm sono state utilizzate per la micro-dissezione manuale. Le sezioni non colorate sono state desparaffinate con xilolo e reidratate in soluzioni con concentrazioni decrescenti di etanolo. L’RNA è stato estratto utilizzando il kit RNeasy FFPE Kit (Qiagen Inc, Hilden, Germany) seguendo le istruzioni del manuale fornito dalla ditta. L’RNA è stato eluito in 20 µL di RNase-free water e quantificato con uno spettrofotometro (Dropsense Xpose, Trinean, Gentbrugge, Belgium). Per l’analisi di espressione genica abbiamo utilizzato come materiale di partenza 150 ng di RNA.
NanoString Technology e nCounter PanCancer Progression
Panel
Nanostring technology è una metodica ultra-sensibile, specifica e riporducibile, in grado di determinare l’espressione simultanea di un ampio pannello di geni senza fasi di retrotrascrizione ed amplificazione.
Tale metodica utilizza barcode molecolari costituiti da una coppia di sonde: Capture Probe e Reporter Probe.
La Capture probe è costituita da circa 50 nucleotidi complementari ad uno specifico RNA target ed all’estremità 3’ reca una molecola di biotina, fondamentale per le fasi di immobilizzazione e allineamento del complesso RNA target-sonde su un supporto solido (nCounter cartridge).
La Report Probe si appaia alla molecola di RNA target in maniera contigua rispetto alla Capture Probe, e si estende per ulteriori 50 nucleotidi circa, recando all’estremità 5’
sei fluorofori di quattro diversi colori, la cui combinazione è fondamentale per l’identificazione di uno specifico RNA target.
Il protocollo prevede le seguenti fasi:
1) Fase di ibridazione tra RNA target e sonde molecolari: Capture e Reporter probes (Fig.1)
2) Fase di purificazione dei complessi RNA target-sonde (Fig.2)
3) Fase di immobilizzazione e allineamento del complesso RNA target-sonde su un supporto solido (nCounter Cartridge) (Fig.3-4)
4) Analisi digitale mediante l’nCounter Digital Analyzer (Fig.5).
Il pannello di espressione genica utilizzato in questo studio è l’nCounter PanCancer Progression Panel, disegnato e sintetizzato da Nanostring Technology (NanoString, Seattle, WA, USA). Questo pannello prevede l’analisi di espressione di 770 geni coinvolti nei processi di angiogenesi (ANG), di rimodellamento della matrice extracellulare (ECM), di transizione epiteliale-mesenchimale (ETM) e nel processo di metastasi. Più nel dettaglio, il pannello è costituito da 277 geni coinvolti nel processo dell’angiogenesi, 254 geni coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare, 269 geni coinvolti nella transizione epiteliale-mesenchimale e 173 geni coinvolti nel processo di metastasi.
(Kaufmann S., L. Dennis, A. Mashadi-Hossein, P. Danaher, C. Bailey, J. Beechem. Multiplex Cancer Progression Analysis, Using the nCounter PanCancer, Foglio illustrativo Prosigna® Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay (Saggio prognostico della firma genica del cancro al seno Prosigna®); Progressione Panel, nCounter XT Assay, User Manual)
4.2.3. Analisi statistica
Il Mann-Whitney U test, seguito dalla correzione di Benjamini-Hochberg, è stato il test utilizzato per individuare i geni differenzialmente espressi tra Adenomi Atipici e Adenomi paratiroidei e tra Adenomi Atipici e Carcinomi paratiroidei non metastatici. Un cutoff di 0,05 è stato fissato per il False Discovery Rate (FDR). L’analisi di clusterizzazione è stata effettuata con NanoString nSolver version 4.0 software sui dati normalizzati usando la correlazione di Pearson (r). L’analisi statistica è stata effettuata usando R software package, version 3.4.0.
5. Risultati
5.1. Caratteristiche generali clinico-patologiche
La nostra casistica si compone di 37 casi di adenoma atipico. Dei 37 casi, 24 (65%) sono di sesso femminile e 13 (35%) di sesso maschile. L’età media dei pazienti è 55 anni, con un range compreso tra 18 e 81 anni e con mediana 55 anni. La dimensione media delle ghiandole (valutabile in 34 pazienti, in quanto sono presenti pazienti operati al di fuori dell’Azienda Pisana) è di 2,83 cm, con un range compreso tra 1 e 7 cm e con mediana 2,25 cm.
Nel gruppo degli adenomi atipici (n° 11) utilizzati per l’analisi molecolare 7 (64%) sono di sesso femminile e 4 (36%) di sesso maschile, l’età media di 51,7 anni, con range compreso tra 29 e 81 anni e con mediana 50 anni, dimensione media delle ghiandole di 3 cm, con un range compreso tra 1,1 e 7 cm e con mediana 2,6 cm.
Dei carcinomi non metastatici, solo per i 10 casi provenienti dall’Azienda Pisana, 7 (70%) sono di sesso maschile e 3 di sesso femminile (30%), con età media di 52,6 anni, con range compreso tra 34 e 69 anni e mediana 54,5 anni. La dimensione media delle ghiandole (ove è stato possibile recuperarla, cioè in 8 casi) è di 2,83 cm, con range compreso tra 1,8 e 4 cm e con mediana 2,6 cm.
Gli 8 casi di adenoma paratiroideo sono composti da 7 (87,5%) di sesso femminile e 1 (12,5%) di sesso maschile con età media di 49,6 anni, con range compreso tra 27 e 74 anni e mediana 47,5 anni. La dimensione media delle ghiandole è di 1,58 cm, con range compreso tra 1 e 2,5 cm e con mediana 1,5 cm.
Tabella 1 Caratteristiche morfologiche e clinico-patologiche adenomi
Sesso Età Dimensione cm
f 38 1,5 f 27 1,5 f 40 2,5 f 68 2 f 53 1,5 m 74 1,7 f 55 1 f 42 1
Tabella 2 Caratteristiche morfologiche e clinico-patologiche adenomi atipici. In rosso i casi utilizzati per l'analisi molecolare (1 presenza, 0 assenza).
ET À SE SS O IS TO LO G ICO (c m) A TT IV IT A ' M IT O TI CA P A TT ER N D I CR ES CI TA K 67 B A N D E F IB R O SE CR ES CI TA T R A B ECOL A R E IN V A SIO N E CA P SU LA R E SO SP ET TA IN V A SIO N E V A SCOL A R E N ECR O SI EM O SID ER IN A A SP ET TO CI ST ICO 56 f 3, 4x 2, 2x 2 c m 0 so lid o e fo lli co la re 5% 1 0 0 0 0 1 1 39 f 3 c m 0 fo lli co la re 2% 1 0 1 0 0 1 1 31 m 2, 3x 2x 1 c m 1/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 2% 0 1 1 0 0 0 0 29 m 2, 6x 2x 1, 3 c m 4/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 2% 0 1 1 0 0 1 0 66 f 1, 5x 1, 2x 0, 5 c m 0 so lid o e tr ab e co la re 3% 1 1 1 0 0 1 0 68 m 2, 5x 1, 2x 0, 5 c m 0 so lid o e tr ab e co la re 1% 1 1 0 1 0 0 0 50 m 2. 2 c m 0 so lid o e fo lli co la re 1% 1 0 0 0 0 1 0 55 f 1, 8x 1, 5x 0, 7 c m 0 fo lli co la re 1% 1 0 0 0 0 1 1 68 m 3, 5x 3, 4x 2 c m 2/ 10 H P F so lid o 1% 1 0 1 0 0 1 1 49 f 4x 3, 6x 2, 5 c m 1/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 1% 1 1 1 0 0 1 1 71 f 3x 1, 5x 1, 2 c m 1/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 1% 1 1 0 0 0 1 1 61 f 5x 3, 2x 2, 2 c m 0 fo lli co la re 1% 1 0 1 0 0 1 1 47 f 2x 1, 5x 1 c m 1/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 4% 1 1 1 0 0 1 1 73 f 2x 1, 4x 1 c m 0 so lid o e tr ab e co la re 4% 1 1 1 0 0 1 0 40 f 2, 8x 2x 1, 3 c m 0 tr ab e co la re s o lid o 1% 1 1 1 0 0 1 0 60 m 1, 7 c m 0 so lid o e fo lli co la re 2% 1 0 1 0 0 1 1 38 f 1, 1x 0, 6x 0, 4 c m 0 so lid o e fo lli co la re 15% 1 0 0 0 0 0 0 64 f 4x 2, 5x 1, 7 c m 1/ 10 H P F so lid o e fo lli co la re 3% 1 0 1 0 0 1 1 81 m 4, 5x 3, 5x 2, 5 c m 0 so lid o e fo lli co la re 4% 1 0 0 0 0 1 1 58 f 2x 1, 5x 0, 4 c m 2/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 1% 1 1 1 0 0 1 0 53 f 6x 4, 5x 3 c m 0 so lid o 2% 1 0 1 1 0 1 1 78 f 7x 3, 1x 2, 4 c m 0 so lid o e fo lli co la re 5% 1 0 0 0 0 1 1 18 f 0 so lid o 1% 1 0 1 1 0 0 0 48 f 1, 8x 0, 9x 0, 7 c m 1/ 10 H P F so lid o , f o lli co la re e tr ab e co la re 3% 1 1 1 1 0 0 0 59 f 4, 8x 2, 5x 1, 5 c m 0 tr ab e co la re 2% 1 1 1 0 0 0 0 65 f 1, 3x 1x 1 c m 2/ 10 H P F so lid o 5% 1 0 0 0 0 0 0 47 m 0 so lid o e tr ab e co la re 4% 1 1 1 0 0 0 0 70 m 5x 4x 2 cm 1/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 3% 1 1 1 0 0 0 0 70 m 1, 1x 1x 0, 5 c m 0 so lid o 5% 1 0 1 0 0 0 0 49 f 4, 5x 3x 1, 3 c m 1/ 10 H P F tr ab e co la re 1% 1 1 0 0 0 0 0 52 f 2X 1, 3X 0, 6 c m 1/ 10 h p f so lid o e tr ab e co la re 1% 1 1 1 0 0 0 0 48 m 0 so lid o e tr ab e co la re 3% 1 1 0 0 0 0 0 37 f 1x 0, 5x 0, 4 c m 4/ 10 H P F so lid o e tr ab e co la re 5% 1 1 1 0 0 0 0 42 f 1, 2x 0, 8x 0, 5 c m 3/ 10 H P F so lid o 5% 1 0 0 0 0 0 0 70 m 1, 9x 1, 5x 1 c m 0 so lid o 2% 1 0 1 0 0 0 0 63 m 2, 1x 1, 4x 1, 4 c m 0 so lid o e tr ab e co la re 3% 1 1 1 0 0 1 0 55 f 1, 7x 1, 5x 1 c m 1/ 10 H P F so lid o 4% 1 0 1 0 0 1 1
Tabella 3 Caratteristiche morfologiche e clinico-patologiche carcinomi non metastatici (dimensioni in cm, 0 assenza, 1 presenza).
SE SS O ET A' DIM EN SION I AT TIV ITA ' M ITOT ICA PA TT ER N D I CR ES CI TA K6 7 BA N DE FIB ROS E IN VA SION E CA PS UL AR E IN VA SION E V AS COL AR E N ECR OS I IN FIL TR AZ ION E E XT RA m 51 3,8 5% 1 1 1 1 f 58 4 8% 1 1 0 1 m 38 2,3 5% 1 1 1 0 m 63 1% 1 1 1 0 f 69 1,8 4% 0 1 0 1 m 69 2,5 1/ 10 H PF SOL ID O 4% 1 1 1 1 m 38 2,8 1/ 10 H PF SOL ID O-TR AB ECOL AR E 5% 1 1 1 0 0 f 44 3 0/ 10 H PF SOL ID O 10% 1 1 0 1 0 m 62 2,5 0/ 10 HP F SOL ID O-TR AB ECOL AR E 10% 1 1 0 0 1 m 34 0/ 10 H PF SOL ID O-TR AB ECOL AR E 10% 1 0 1 0 0
5.2. Valutazione dei parametri morfologici
In tutti i casi di adenoma atipico considerati sono stati valutati i seguenti parametri morfologici: 1) le dimensioni della ghiandola (già discusse al punto precendente “5.1 Caratteristiche Generali”), 2) la presenza di bande fibrose, 3) il pattern di crescita, 4) la presenza di sospetta invasione capsulare, 5) la sospetta invasione vascolare, 6) la presenza di aspetti cistici, 7) la presenza di depositi di emosiderina, 8) l’indice di proliferazione Ki67, 9) l’attività mitotica, 10) la presenza di necrosi.
Nel caso dei dieci carcinomi non metastatici provenienti da Pisa sono stati valutati: 1) le dimensioni della ghiandola (già discusse al punto precendente “5.1 Caratteristiche Generali”), 2) la presenza di bande fibrose, 3) il pattern di crescita (ove valutabile), 4) la presenza di invasione capsulare ed extracapsulare, 5) la presenza di invasione vascolare, 6) l’indice di proliferazione Ki67, 7) l’attività mitotica, 8) la presenza di necrosi (ove valutabile).
5.2.1. Valutazione della fibrosi
Si intende la presenza di bande di tessuto fibroso denso che si dipartono dalla capsula e sepimentano il parenchima paratiroideo donandogli un aspetto lobulato.
È stata valutata in termini di presenza/assenza. Si è osservata in 35 casi di adenoma atipico su 37 ed in 9 casi su 10 di carcinoma non metastatico.
5.2.2. Valutazione del pattern di crescita
È stato valutato il pattern di crescita degli adenomi atipici, che è risultato solido, trabecolare, follicolare od una combinazione di questi. Nei carcinomi, ove valutabile, il pattern è risultato sempre solido o solido-trabecolare.
Pattern di crescita follicolare, 10x
5.2.3. Valutazione dell’invasione capsulare
È stata riscontrata la presenza di una sospetta invasione capsulare in 21 casi di adenoma atipico su 37 e di infiltrazione capsulare franca in 9 casi su 10 di carcinoma non metastatico, dei quali 5 presentavano anche l’infiltrazione dei tessuti extra-paratiroidei.
Sospetta invasione capsulare, 10x
5.2.4. Valutazione dell’invasione vascolare
Essendo l’invasione vascolare un carattere di chiara malignità della neoplasia, sono stati osservati solo 3 casi di adenoma atipico su 37 in cui non è stato possibile dimostrare una chiara invasione vascolare della neoplasia, pur non essendo però possibile escluderla. Nei casi di carcinoma non metastatico la chiara invasione vascolare è stata osservata in 6 casi su 10.
5.2.5. Valutazione dell’aspetto cistico e della presenza di
emosiderina
La presenza di aspetti cistici e di emosiderina sono molto spesso collegati, infatti negli adenomi atipici sono stati osservati 7 casi con la sola presenza di emosiderina e 14 con aspetti cistici e presenza di emosiderina.
Non è stato possibile valutare questo parametro nei carcinomi non metastatici.
Aspetti cistici, 4x
5.2.6. Valutazione dell’indice proliferativo Ki67
L’indice proliferativo è stato valutato con metodica immunoistochimica che prevede l’utilizzo di un anticorpo monoclonale di coniglio (IgG) diretto verso la porzione C-terminale dell’antigene Ki67. Ki67 è una proteina nucleare espressa dalle cellule proliferanti, essendo presente nelle fasi G1, S, G2 ed M del ciclo cellulare, ed assente nella fase G0 di quiescenza. (Ventana, CONFIRM™ anti-Ki-67, Package insert)
L’indice Ki67 negli adenomi atipici superava il 5% in un solo caso, in 12 casi è risultato uguale all’1%, in 7 casi è risultato uguale al 2%, in 6 casi uguale al 3%, in 5 casi uguale al 4% ed in 6 casi uguale al 5%.
Nei casi di carcinoma non metastatico l’indice Ki67 superava il 5% in quattro casi, in 1 caso è risultato uguale all’1%, in 2 casi uguale al 4% ed in 3 casi uguale al 5%.
La media della percentuale dell’indice di proliferazione Ki67 per gli adenomi atipici è del 3% sia per i 37 casi studiati dal punto di vista morfologico sia per gli 11 casi messi a confronto dal punto di vista molecolare con i carcinomi, mentre per i 10 casi di carcinoma non metastatico la media della percentuale dell’indice di proliferazione Ki67 è del 6%.
5.2.7. Valutazione delle mitosi
L’attività mitotica negli adenomi atipici è risultata pari a 4 mitosi su 10HPF in soli 2 casi, 3 mitosi su 10HPF in un caso, 2 mitosi su 10HPF in 3 casi, 1 mitosi su 10HPF in 10 casi e 0 mitosi su 10HPF nei restanti casi, con media < 1 mitosi su 10HPF. Nei casi di carcinoma non metastatico le mitosi sono risultate 1 su 10HPF in soli due casi, mentre nei restanti casi non sono state osservate mitosi.
5.2.8. Valutazione della necrosi
È stata valutata la presenza o meno di necrosi che, nel caso delle neoplasie paratiroidee, di solito si manifesta con foci circoscritti di necrosi coagulativa. Non è stata osservata necrosi in tutti i casi di adenoma atipico, mentre nei carcinomi (ove valutabile) è stata osservata in un solo caso.
5.3. Valutazione analisi di espressione genica
Confronto del profilo di espressione genica tra Adenomi Atipici e Adenomi paratiroidei
Il profilo di espressione genica degli adenomi atipici è stato confrontato con quello degli adenomi paratiroidei.
L’analisi ci ha permesso di identificare 67 geni differenzialmente espressi (P-values aggiustati < 0,05) tra i due gruppi analizzati. Più nel dettaglio, 31 geni erano up-regolati mentre 36 geni erano down-regolati nel gruppo costituito dagli adenomi atipici rispetto agli adenomi paratiroidei.
I geni differenzialmente espressi, il tipo di regolazione (up- o down-regolazione) e i P-values sono riportati nella tabella 4.
Tabella 4. Geni differenzialmente espressi tra Adenomi Atipici e Adenomi Geni up-regolati ANG EMT ECM META P-values* P-values
aggiustati** MTDH + 0,00006 0.01110 VCAN + + 0,00057 0.01417 THBS1 + + 0,00081 0,01528 ADAM9 + 0,00111 0,01528 SNRPF + 0,00111 0,01528 VAMP8 + 0,00111 0,01528 CXCR2 + 0.00152 0.01710 FN1 + + + + 0.00153 0.01710 SDC4 + + 0.00153 0.01710 SFRP2 + + 0.00153 0.01710 SMAD5 + 0.00153 0.01710 ADD1 + 0.00208 0.01895 DESI1 + 0.00208 0.01895 HIF1A + + + 0.00208 0.01895 RPS27A + 0.00208 0.01895 MGP + 0.00208 0.02205 NFKB1 + 0.00208 0.02205 PTEN + + 0.00208 0.02205 PIK3CA + + 0.00375 0.02620 LDHA + 0.00499 0.03130 COL1A1 + 0.00659 0.03584 COL3A1 + + 0.00659 0.03584 CTNNB1 + + 0.00659 0.03584 CUL1 + 0.00659 0.03584 DAG1 + 0.00659 0.03584 IL6 + + 0.00656 0.03584 COL1A2 + + + 0.00863 0.04285 DENND5A + 0.00863 0.04285 GLYR1 + 0.00863 0.04285 NCL + 0.00863 0.04285 OLFML2B + + 0.00863 0.04285
ANG, angiogenesi; EMT, transizione epiteliale-mesenchimale; ECM, matrice extracellulare; META, metastasi ** P values ottenuti usando la correzione di Benjamini–Hochberg.
aggiustati** BCN2 + 0.00006 0.01110 MTBP + 0.00006 0.01110 PTRF + 0.00006 0.01110 PITX2 + 0.00057 0.01417 SPDEF + 0.00056 0.01417 ECM1 + + 0.00111 0.01528 MEG3 + 0.00111 0.01528 CKMT1A + 0.00153 0.01710 PIK3CD + + 0.00153 0.01710 TNFSF13 + 0.00153 0.01710 EIF4E2 + 0.00208 0.01895 TBXA2R + 0.00208 0.01895 MISP + 0.00208 0.02205 MT3 + 0.00277 0.02205 PKNOX1 + 0.00280 0.02205 SNAI1 + + + 0.00280 0.02205 TNN + 0.00280 0.02205 VIT + 0.00280 0.02205 CFP + 0.00337 0.02620 ITGA8 + 0.00337 0.02620 NAP1L3 + 0.00337 0.02620 SH2B3 + 0.00337 0.02620 VWA2 + 0.00337 0.02620 EGFL7 + + 0.00499 0.03130 EVPL + 0.00499 0.03130 MMP17 + 0.00499 0.03130 EPHB4 + 0.00656 0.03584 ITGA7 + 0.00656 0.03584 NRXN1 + 0.00656 0.03584 TACSTD2 + 0.00656 0.03584 TIMP4 + + 0.00656 0.03584 ACHE + 0.00863 0.04285 ANGPT1 + + 0.00863 0.04285 CHAD + 0.00863 0.04285 CHD4 + 0.00863 0.04285 ZC3H12A + 0.00863 0.04285
Analisi di clusterizzazione: Adenoma Atipici vs Adenomi paratiroidei
I geni differenzialmente espressi tra i due gruppi analizzati sono stati utilizzati per l’analisi di clusterizzazione, effettuata mediante l’nSolver Analysis software ed utilizzando la correlazione di Pearson. Questo ha permesso di valutare e confrontare i profili di espressione genica tra adenomi atipici ed adenomi paratiroidei. Come riportato in figura 6 è possibile identificare due clusters principali:
-cluster A: costituito da 11 adenomi atipici (100%) -cluster B: costituito da 8 adenomi paratiroidei (100%)
Questo dimostra che il profilo di espressione di 67 geni è in grado di distinguere gli adenomi atipici dagli adenomi paratiroidei.
Fig 6 Dendrogramma ottenuto dall’analisi di clusterizzazione di Adenomi Atipici vs Adenomi paratiroidei. Le colonne rappresentano i campioni e le righe i geni. Solo i geni differenzialmente espressi
(P-value aggiustati < 0,05) tra i due gruppi sono stati usati per l’analisi di clusterizzazione. Il rosso ed il verde rappresentano un’alta ed una bassa espressione rispettivamente. ATY: adenoma atipico; ADE: adenoma.
