INTRODUZIONE
c-Met è un recettore tirosin chinasico unico strutturalmente distinto dalla famiglia delle altre RTK. È il recettore di superficie per il fattore di crescita degli epatociti (HGF) e, di norma, è espresso dalle cellule epiteliali di molti organi (fegato, pancreas, prostata, rene, muscoli e midollo osseo) sia durante l’embriogenesi che in età adulta(1-3). Il recettore c-Met, come il suo ligando HGF, è formato da una catena α, interamente extracellulare, unita a una subunità β transmembrana mediante un legame disolfuro. Il legame del ligando HGF attivo al dominio extracellulare del c-Met causa la polimerizzazione e la fosforilazione del recettore sui residui di tirosina nel dominio intracellulare di c-Met(4,5).
ASSE HGF/SF-c-Met E IL LORO RUOLO BIOLOGICO
Il ruolo di HGF e di c-Met nell’iniziazione, nella promozione e nella proliferazione delle cellule tumorali è stato affrontato in studi preclinici e sono disponibili vari modelli per valutare l’effetto della modulazione di questa via di trasmissione(6). Visti i recenti successi ottenuti con un numero crescente di inibitori della chinasi per il trattamento del cancro(7,9), c-Met è diventato il bersaglio chinasico prioritario. Gli studiosi hanno prodotto una grande quantità di dati biologici strutturali, test biochimici e funzionali e modelli in vivo per valutare le conseguenze dell’inibizione della cascata del segnale innescato da c-Met. I risultati clinici hanno suggerito che, avere come target l’asse HGF-c-Met, è una via terapeutica praticabile per il trattamento di vari tipi di cancro. Quasi una dozzina di piccole molecole inibitrici sono state utilizzate in studi clinici sull’uomo(6). La via di trasduzione del segnale di c-Met e le sue funzioni
(HGF), inizialmente identificato come un oncogene(14), e il fattore di dispersione (scatter factor SF), sono molecole identiche composte da una catena α di 60 kDa e una catena β di 30 kDa isolate in base alla loro rispettiva funzione. HGF è stato indentificato in base alla sua capacità di stimolare la proliferazione degli epatociti nelle colture primarie, mentre SF è stato identificato come un fattore che stimola la motilità di una linea di fibroblasti embrionali in un mezzo condizionato. HGF e SF, mediante clonazione e analisi dei nucleotidi, sono risultati essere identici (da qui in poi sarà menzionato solo come HGF). Cellule mesenchimali, per esempio, cellule della muscolatura liscia e fibroblasti, sono tra le maggiori fonti di HGF, ed anche alcuni tipi di cellule epiteliali esprimono e secernono HGF
(15-17). In aggiunta alla proteina HGF matura, è stata verificata la presenza di altre tre
varianti naturali: un’isoforma priva di cinque aminoacidi e le isoforme NK1 e NK2. Entrambe le isoforme NK1 e NK2 sono state generate mediante splicing alternativo di mRNA, e si legano al recettore per HGF come agonisti parziali(18). Le risposte biologiche di HGF sono mediate attraverso il recettore tirosin chinasico c-Met, un eterodimero di 90 kDa composto da una subunità α di 50 kDa extracellulare legata da un ponte disolfuro ad una subunità catalitica transmembrana β di 145 kDa. L’attivazione di c-Met si ha dopo autofosforilazione di Y1234 e Y1235 situate nel loop di attivazione (A-loop). c-Met fa parte di una famiglia strutturalmente e funzionalmente correlata che include Ron e Sea(11,13,14,19). Il recettore tirosin chinasico Ron è un membro della famiglia dei recettori tirosin chinasici che include il protooncogene Met. L’interazione di Ron con il suo ligando, conosciuto come proteina simile al fattore di crescita degli epatociti (Hepatocyte growth factor-like protein, HGFL) o proteina stimolante i macrofagi (MSP), induce risposte cellulari ,compresa la crescita invasiva, la proliferazione, la diffusione cellulare e la morfogenesi della ramificazione. Basandosi sulla omologia e le somiglianze funzionali fra Met e Ron, è stato ipotizzato che Ron fosse importante nella formazione dei tumori e delle metastasi(20).
Il recettore c-Met è principalmente espresso nelle cellule epiteliali, ma è espresso anche nei melanociti, nelle cellule ematopoietiche, cellule neuronali, cellule della microglia e cellule endoteliali. In base al modello (pattern) di espressione di HGF e c-Met, il segnale dato dal legame HGF-c-Met è risultato essere un mediatore paracrino importante delle interazioni delle cellule epiteliali-mesenchimali coinvolte nella regolazione di molte attività cellulari, inclusa la motilità cellulare, la mitogenesi, la morfogenesi e l’angiogenesi. L’importanza di queste funzioni è stata evidenziata nei topi in cui c-Met e HGF sono stati inattivati. Mentre i topi eterozigoti sopravvivono, la privazione di HGF o c-Met in omozigoti risulta letale per l’embrione a causa dei deficit nello sviluppo del fegato, della placenta e nella migrazione dei mioblasti(13,21,22).
ASSE HGF-c-Met NELLO SVILUPPO DEL CANCRO
Il recettore c-Met è stato identificato inizialmente come un oncogene (TPR-Met) in una linea cellulare di osteosarcoma trattato con un cancerogeno chimico. La proteina TRP-Met è capace di trasformare e conferire capacità invasive e metastatiche a cellule non tumorali(17). Il potenziale oncogeno è dovuto alla dimerizzazione spontanea e conseguente attivazione costitutiva di TPR-Met. Espressioni aberranti di HGF e c-Met sono associate allo sviluppo e alla prognosi infausta di un vasto numero di tumori solidi, incluso il tumore del seno, della prostata, della tiroide, del colon retto, del pancreas del rene, delle ovaie e dell’utero, il glioma maligno, il melanoma ulveale, l’osteosarcoma e il sarcoma dei tessuti molli(16). Tumori gastrici con un’amplificazione del gene wt-c-Met sono maggiormente suscettibili all’inibizione c-Met, rendendo così c-Met un bersaglio interessante(23). Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato che un’aumentata e sregolata attivazione di c-Met porta ad una vasta gamma di
risposte biologiche associate al fenotipo maligno. Queste risposte includono un’aumentata motilità/capacità invasiva, aumentata cancerogenesi, una maggiore angiogenesi, protezione delle cellule tumorali dall’apoptosi indotta da agenti che danneggiano il DNA come adriamicina, raggi UV, radiazioni ionizzanti e un tasso maggiore di errori nella riparazione del DNA(11,17,24). In base a questi dati, è probabile che HGF aumenti la mutagenesi in seguito al danneggiamento del DNA, permettendo alle cellule tumorali con il DNA danneggiato di sopravvivere, determinando così la resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia(24,25). L’amplificazione di MET gioca un ruolo critico nella mediazione della resistenza del tumore polmonare non a piccole cellule al Tarceva® e Iressa® e la resistenza del cancro del seno HER2 positivo al trastuzumab (Herceptin®)(17,26-29).
HER2/neu (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) è un recettore che legandosi specificatamente al fattore di crescita umano dell’epidermide (Epidermal Growth Factor), determina la crescita tumorale. Il trastuzumab (anticorpo monoclonale umanizzato anti HER2/neu) impedisce il legame fra il recettore e il fattore di crescita bloccando il recettore, che, in molti casi di tumore mammario, risulta sovraespresso. L’inibizione di c-Met nelle cellule resistenti a Tarceva® e Iressa®, usando shRNA (breve RNA a forcina) o piccole molecole da sole o in combinazione con un inibitore di EGFR, vince la resistenza mediata da Met agli inibitori di EGFR(28,30-32).
Iressa® (gefitinib)
trastuzumab (Herceptin®)
Tutti questi studi definiscono l’utilità terapeutica degli inibitori di c-Met nelle sottopopolazioni in grado di riprodurre il cancro. A causa dell’attività pleiotropica, cancerogena dell’asse HGF-c-Met, inibendo questa via, si può affermare di avere potenti effetti antitumorali in molte forme neoplastiche
molti approcci per inibire l’asse HGF-c-Met. Forme solubili e forme dominanti negative del recettore c-Met; piccoli peptidi antagonisti; antagonisti e/o agonisti recettoriali (ad esempio il Fab, fragment antigen-binding, umano monomerico per c-Met o HGF, come OA5D5, Genentech; AMG102, Amgen; SCH9OO105/AV-299, Schering-Plough/AVEO Pharmaceuticals); ansamicine antibiotiche (17-AAG); anti-HGF; anti c-Met U1/ribozomi, hanno dimostrato tutti effetti antitumorali in vari tipi di cancro(33,39).
Mentre alcuni approcci terapeutici non sono ancora stati valutati clinicamente, altri, come ad esempio anticorpi anti c-Met o HGF [OA5D5 (Ph1); AMG102 (Ph 2); SCH900105 (Ph 1) e 17-AAG (Ph 3)], sono ancora sotto sviluppo clinico(35,36). Negli ultimi sei anni, sono state identificate diverse molecole inibitrici che legano il dominio chinasico di c-Met e queste sono ancora in fase di sperimentazione clinica o in sviluppo pre-clinico (Tabella 1).
Tabella 1. Profilo degli inibitori di c-Met in fase di sviluppo clinico o pre-clinico.Abbreviazioni. SND: struttura non divulgata.; Mit: fattore di trascrizione associato alla microftalmia; PDAC: adenocarcinoma pancreatico duttale; NSCLC: carcinoma del polmone non a piccole cellule; HCC: carcinoma epatocellulare; MTC: carcinoma midollare della tiroide; GBM: glioblastoma; RCC: carcinoma a cellule renali (adenocarcinoma renale); HNSCC: carcinoma a cellule squamose di testa e collo.
Questa recensione si concentra sulle piccole molecole inibitrici durante la fine della fase pre-clinica o durante lo sviluppo clinico.
Il fatto che segnali HGF-c-Met abberranti siano stati identificati in numerose forme tumorali, enfatizza il fatto che c-Met sia un bersaglio terapeutico affascinante. Attualmente sono stati convalidati, in sperimentazioni precliniche e cliniche, più di dieci peptidomimetici o piccole molecole inibitrici di c-Met che hanno mostrato benefici terapeutici promettenti.
Sono state adottate strategie differenti per inibire la via di trasmissione di c-Met, bloccando l’interazione di c-Met con HGF per mezzo di antagonisti biologici o neutralizzando anticorpi oppure bloccando il segnale c-Met dipendente interferendo con i trasduttori di segnale associati a c-Met o con i componenti di segnalazione a valle, ed, inoltre, bloccando l’attività catalitica di c-Met con piccole molecole inibitrici che competono per il legame dell’adenosina 5’-trifosfato (ATP) nel sito attivo della chinasi(40-49).
Come detto sopra, il recettore tirosin chinasico (RTK) è la chiave regolatrice di molti processi cellulari critici, come la crescita cellulare, la differenziazione, la neovascolarizzazione (angiogenesi) e la riparazione tissutale. In aggiunta all’importanza nelle funzioni fisiologiche, espressioni aberranti di alcuni RTK, sono implicate nello sviluppo e nella crescita di molti tipi di cancro. Questi RTK sono diventati promettenti bersagli di farmaci per la terapia del cancro(50).
RTK c-Met è il recettore di superfice per il fattore di crescita degli epatociti (HGF), conosciuto anche come scatter factor (fattore di dispersione)(51,52). HGF è una glicoproteina multidominio di 90 kD altamente connessa con i membri della famiglia delle plasminogeno serina proteasi. Esso è secreto da cellule mesenchimali come un peptide inattivo a catena singola e viene poi spaccato, da un numero di proteasi, nella forma attiva, come eterodimero α/β extracellulare(53). La catena α, nella porzione NH2 terminale, contiene il dominio ad alta affinità
per il legame con il recettore c-Met, ma la catena β è necessaria per interagire con il recettore c-Met e determinarne l’attivazione(54). Il recettore c-Met così come il suo ligando, è un eterodimero, tenuto unito da ponti disolfuro, costituito da catene α e β extracellulari (Figura 1).
Figura 1. Le principali vie di segnale attivate attraverso c-Met, interazioni tra c-Met e altri recettori di membrana, e strategie di inibizione delle vie di segnale attivate da c-Met.
La catena α eterodimerizza con la porzione ammino-terminale della catena β formando il maggior sito di legame per il ligando nel dominio extracellulare. Il dominio transmembrana e la regione juxtamembrana contenente il dominio di legame c-Cbl per la downmodulation del recettore, sono adiacenti al dominio
chinasico e alla coda carbossi-terminale necessari per il segnale a valle(55). Il legame con HGF induce l’omodimerizzazione del recettore c-Met e la fosforilazione di due residui di tirosina (Y1234 e Y1235) all’interno del sito catalitico, regolando l’attività chinasica. La coda carbossi-terminale include le tirosine Y1349 e Y1356, le quali, una volta fosforilate, servono come sito di aggancio per le proteine adattatrici intracellulari, portando a un segnale di downstream(50). Il recettore c-Met è espresso dalle cellule epiteliali di molti organi come il fegato, il pancreas, la prostata, i reni, i muscoli ed il midollo osseo sia durante l’embriogenesi che in età adulta.
L’attivazione di c-Met mediata da HGF, in un complesso studio genetico, è stata denominata “crescita invasiva”, e consiste in una serie di processi fisiologici che includono la proliferazione, l’invasione e l’angiogenesi che si verificano in condizioni fisiologiche normali durante lo sviluppo dell’embrione e, nel periodo post-natale, per riparare lesioni cardiache ed epatiche e, patologicamente, durante l’oncogenesi. È stato dimostrato che l’ipossia attivi la trascrizione di c-Met e amplifichi il segnale di HGF sia in vivo sia in vitro(50). La segnalazione attraverso c-Met promuove la proliferazione e la sopravvivenza attraverso una varietà di effettori downstream. I segnali per la mitosi e la crescita avvengono mediante la via di segnalazione RAS-MAPK e giocano un ruolo essenziale nella morfogenesi e nella transizione da epiteliale a mesenchimale che risulta dalla perdita dell’adesione intracellulare via caderine, chinasi di adesione focale e integrine, con un cambiamento nella forma delle cellule(56).
L’attivazione dell’asse HGF-c-Met impedisce l’apoptosi attraverso l’attivazione del fosfatidilinositolo-3-kinasi (PI3) e, successivamente, attraverso l’attivazione di Akt57-59. L’interazione tra la via di segnale delle chinasi PI3Akt e la via di segnale di RAS-MAPK sembra essere implicata nella promozione della sopravvivenza(60). L’interazione tra c-Met e il recettore per il fattore di crescita dell’epidermide (EGFR) è implicata in diversi sistemi biologici (Figura 1) (61);
c-Met è inoltre conosciuto per la sua interazione con molte proteine di membrana sulla superficie delle cellule, incluso il recettore laminina α6β4 per le integrine, il recettore della famiglia delle plexine B per la semaforina, e la variante v6 del recettore ialuronico CD462. L’interazione tra c-Met e i partner di membrana, contribuisce a modulare l’attivazione di c-Met consentendo l’integrazione dei segnali presenti nell’ambiente extracellulare.
Nelle cellule tumorali, l’attivazione di c-Met promuove l’innesco di una serie di diversi segnali a cascata causando la crescita cellulare, la proliferazione, l’invasione e la resistenza all’apoptosi(50).
Dati derivanti da modelli cellulari e tumori animali, hanno suggerito che i meccanismi biologici base della cancerogenità di c-Met possono essere divisi tipicamente in tre differenti strade:
• attivazione del circuito autocrino HGF/c-Met; • sovraespressione di HGF o c-Met;
• mutazione della sequenza codificante del recettore c-Met in presenza di chinasi attivanti(63).
La sovraespressione di HGF e c-Met è indicativa nell’aumento di aggressività tumorale e segnale di prognosi infausta in pazienti portatori di cancro. La segnalazione HGF/c-Met induce l’angiogenesi tumorale:
• inducendo la proliferazione e la migrazione nelle cellule endoteliali; • inducendo l’espressione del fattore di crescita dell’endotelio vascolare
(VEGF), sistema chiave angiogenetico,
• attraverso la drastica downregolation della trombospondina 1 (TSP-1) che regola negativamente l’angiogenesi.
L’espressione di HGF e c-Met è stata osservata in alcune biopsie di tumori solidi e, la segnalazione c-Met, è stata documentata in una vasta gamma di tumori maligni umani inclusi i tumori della vescica, del seno, della cervice, del colon retto, dello stomaco, della testa e del collo, del fegato, del polmone, delle ovaie, del pancreas, della prostata, dei reni e della tiroide, così come è stata documentata anche in vari sarcomi, tumori del sistema ematopoietico e melanomi. In particolare, una mutazione a livello del dominio chinasico di c-Met, è stata identificata in pazienti con una forma ereditaria di cancro papillare renale, coinvolgendo direttamente c-Met nella cancerogenesi umana. L’amplificazione di c-Met è implicata nello sviluppo della resistenza acquisita ai chemioterapici Tarceva® e Iressa® nei pazienti con tumore al polmone a non piccole cellule (NSCLC)(64).
STUDI RECENTI
Sono stati fatti molti progressi nell’ambito della via di segnale HGF/c-Met che hanno ulteriormente chiarito il ruolo di c-Met nella funzione delle cellule normali e nell’oncogenesi.
• Il silenziamento del proto oncogene Met endogeno ha comportato la mancanza di crescita tumorale, la regressione delle metastasi stabili e la diminuzione nella formazione di nuove metastasi, indicando così l’importanza dell’espressione persistente di Met nelle fasi iniziali della progressione del cancro(65).
• c-Met ha dimostrato di essere un sensore in condizioni micro-ambientali avverse (come l’ipossia) di guidare l’invasione cellulare e le metastasi
attraverso l’attivazione trascrizionale di un set di geni che controllano la coagulazione del sangue(66).
• Il recettore c-Met e il recettore per VEGF (VEGFR) sono stati trovati come cooperanti nella promozione della sopravvivenza tumorale. Inoltre c-Met ha un ruolo addizionale nell’angiogenesi tumorale come fattore angiogenico indipendente o come fattore che può interagire con la proliferazione angiogenica e con il segnale di sopravvivenza attraverso VEGF e altre proteine angiogeniche. L’ipossia aumenta il fattore inducibile di ipossia (HIF)-1α, che, successivamente, aumenta l’espressione di HGF nel tumore e nelle cellule interstiziali normali circostanti, con un aumento dell’espressione di Met nelle cellule endoteliali e nel tumore. Il segnale HGF/c-Met aumenta i livelli di VEGF nel tumore e di VEGFR2 sulle cellule endoteliali(67). L’aumento del segnale HGF/c-Met diminuisce la trombospondina 1 (TPS-1), il maggior inibitore endogeno dell’angiogenesi. L’aumento del segnale HGF/c-Met coopera con il segnale VEGF per aumentare i livelli di espressione del gene regolatore di VEGF, oltre a cooperare per esprimere nuove trascrizioni nelle cellule endoteliali(68). Il segnale combinato tra VEGF e HGF/c-Met, ha avuto grandi effetti nella prevenzione dell’apoptosi delle cellule endoteliali, sull’aumento della tubulogenesi vascolare in vitro, sulla formazione di capilllari in vivo e sull’aumento della densità dei microvasi all’interno del tumore. Così, avere come target l’inibizione di HGF/c-Met, è sia un mezzo per una maggiore inibizione dell’angiogenesi mediata dall’asse VEGF/VEGFR al momento iniziale della terapia, sia una risposta alla prevista ipossia all’interno dei tumori indotta dalla terapia anti-angiogenica.
• c-Met e c-Src sembrano essere coinvolti come mediatori cooperanti nella fosforilazione della tirosina di EGFR e nella crescita cellulare in presenza
di inibitori di EGFR(69). Così l’inibizione di c-Met, da sola o in combinazione con un inibitore di EGFR, può conferire benefici clinici nell’ambito della resistenza agli inibitori di EGFR.
• La combinazione di un inibitore di c-Met con un inibitore di EGFR come Tarceva® (1), inibisce più efficacemente la crescita del tumore NSCLC xenotrapiantato in topi, rispetto ad entrambi gli inibitori presi da soli, indicando che mirando simultaneamente a c-Met e a EGFR, si può avere un importante impatto sul tumore NSCLC nel quale è stata osservata la contemporanea attivazione di queste vie recettoriali(70).
• Diagnostica preclinica e clinica di c-Met: il grande numero di pazienti che potrebbero beneficiare della terapia che mira a c-Met, solleva la questione di come c-Met possa essere meglio identificato nel tessuto. Alcuni anticorpi hanno mostrato di funzionare bene nell’individuazione di c-Met in tessuti fissati su formalina e incorporati in paraffina (FFPE)(71). Tuttavia, recentemente, è stato descritto un anticorpo monoclonale, MET4, diretto contro il dominio extracellulare di MET umano. MET4 ha dimostrato con accuratezza e riproducibilità di rilevare c-Met nei tessuti FFPE, e il reagente MET4 ha manifestato elevata sensibilità con un basso back-ground(72).
PROGRESSI CLINICI TRASLAZIONALI
Il recettore c-Met, una volta attivato, innesca varie vie che conducono alla cancerogenesi. Quindi, è stato ipotizzato che, utilizzando molti agenti biologici che hanno come target il recettore c-Met si possa inibire la progressione del
cancro a livello molecolare. Sono state studiate parecchie strategie differenti per arrivare a questo risultato, incluso lo sviluppo di:
• competitori di MET/HGF;
• anticorpi monoclonali diretti contro c-Met e HGF;
• piccole molecole inibitrici della tirosin-chinasi dirette contro c-Met. Oltre all’uso d’inibitori selettivi, sono in fase di studio strategie per inibire gli effettori coinvolti nella via di segnalazione di c-Met. Ciò è rilevante in particolare per il ruolo dell’inibizione di HGF/c-Met nell’angiogenesi attraverso l’inibizione di VEGF. L’inibizione di bersagli multipli è stata raggiunta attraverso due strade. Agenti altamente selettivi possono essere combinati per ottenere un ampio spettro di inibizione e per massimizzare i benefici mentre si riducono gli effetti tossici con la massima precisione possibile. Un altro approccio è quello di utilizzare un agente singolo che ha come target più membri specifici della via di segnalazione di c-Met o altre vie di segnale coinvolte con il crosstalk di c-Met, quindi inibendo il crosstalk come un meccanismo di resistenza. L’uso di un agente ad ampio spettro, può ridurre le possibilità di interazione tra farmaci, ma può influire su altre chinasi date le relazioni strutturali all’interno della famiglia delle chinasi. Diversi inibitori selettivi e a largo spettro di c-Met e HGF sono entrati nei trial clinici (Tabella 2).
Tabella 2. Inibitori di HGF/c-Met in fase di sviluppo clinico
Compound Name Type Company Target(s) Phase of Development AMG102 (76) Antibody Amgen human HGF Phase I/II MetMAb (23, 54,
77)
Monovalent antibody
Genentech human c-Met Phase I ARQ197
(23,59,60)
Selective kinase inhibitor, non-ATP competitive
ArQule c-Met Phase I/II JNJ-38877605 (61) Selective kinase inhibitor, ATP competitive Johnson and Johnson c-Met Phase I PF-04217903 (62) Selective kinase inhibitor, ATP competitive
pfizer c-Met Phase I
SGX523 (63) Selective kinase inhibitor, ATP competitive SGX pharmaceuticals c-Met Discontinued PF-02341066 (23, 66) Multikinase inhibitor, ATP competitive
Pfizer c-Met, ALK Phase I/II XL184 (71,72) Broad spectrum
kinase inhibitor, ATP competitive
Exelis c-Met, VEGRF1-3, Ret, Kit, Fit-VEGRF1-3,
Tie-2 Phase I/II/III XL880 (67,69,78,79) Broad spectrum kinase inhibitor, ATP competitive
Exelis c-Met, Ron, VEGFR1-3, PDGFR, Kit, Fit-3, Tie-2 Phase I/II MP470 (23,73) Broad spectrum kinase inhibitor, ATP competitive
SuperGen c-Met, Ret, Rad51, mutant forms of Kit, PDGFR, Fit-3 Phase I MGCD265 (74) Broad spectrum kinase inhibitor, ATP competitive
Methylgene c-Met, VEGFR1-3, Tie-2, Ron, Kit,
Fit-3 Phase I MK-246 (75) Broad spectrum kinase inhibitor Merck c-Met, KDR, FGFR1-3, and Fit 1,3,4 Phase I/II
COMPETITORI MET/HGF
Il legame tra il ligando HGF e il recettore c-Met può essere inibito in subregioni di HGF o di c-Met che possono agire da decoy o da antagonisti. Questi decoy e antagonisti stechiometricamente competono con il ligando o con il recettore senza portare all’attivazione di c-Met, prevenendo così l’innesco della via di segnalazione e le conseguenze biologiche. Parecchie varianti di HGF e di c-Met, sono state validate sperimentalmente come antagonisti, sia in vivo sia in vitro: questi agiscono impedendo il legame del ligando o prevenendo la dimerizzazione di c-Met(62). In aggiunta, sono stati sviluppati analoghi molecolari di HGF, che hanno mostrato di competere con HGF nel legame con c-Met. Studi preclinici con NK4, una variante composta esclusivamente dalla regione N-terminale e da quattro domini kringle di HGF, ha dimostrato di avere attività inibitoria su c-Met sia in vivo sia in vitro(54). È stata sviluppata una molecola decoy di c-Met solubile, ricombinante e enzimaticamente inattiva, che corrisponde all’intero dominio intracellulare di c-Met e che ha dimostrato di interagire sia con HGF che con la lunghezza intera di c-Met per impedire il legame del ligando e prevenire la dimerizzazione del recettore(73). Sperimentazioni precliniche hanno mostrato che entrambe le esche c-Met e NK4 entrano in sinergia con la radioterapia per indurre la regressione tumorale(73).
ANTICORPI MONOCLONALI DIRETTI CONTRO HGF E c-Met L’uso di anticorpi specifici per HGF o c-Met impedisce il legame ligando/recettore, portando all’arresto della crescita e alla regressione del tumore, inibendo la proliferazione e promuovendo l’apoptosi. Una combinazione di tre anticorpi monoclonali (A-mix), ha mostrato un’elevata attività neutralizzante verso HGF in vivo e in vitro e un’inibizione significativa della crescita del
glioma xenotrapiantato che esprime il sistema funzionante in modo autocrino HGF/c-Met. La strategia di usare anticorpi monoclonali permette, grazie alla specificità esclusiva contro HGF/c-Met, di avere un tempo di emivita relativamente lungo, paragonato alle piccole molecole inibitrici delle chinasi e di suscitare una risposta immunitaria contro le cellule tumorali. Sfortunatamente l’uso di anticorpi ha elevati costi di produzione e può non essere ottimale nella penetrazione del tumore rispetto alle altre strategie.
AMG102 (Amgen, Inc.) è un anticorpo monoclonale IgG2, di derivazione interamente umana che lega e neutralizza HGF, quindi ne impedisce il legame con c-Met e la sua successiva attivazione(74a,b). AMG102 in modelli paracrini preclinici di HGF, ha mostrato una potente inibizione della crescita dei tumori Met dipendenti(74c). Nei trial di Fase 1, AMG102 è stato completato con un profilo di sicurezza abbastanza accettabile. Risultati recenti, ottenuti dai trial di Fase 2 su AMG102, in pazienti con glioblastoma multiforme, hanno mostrato una risposta parziale, una risposta minore e due casi di malattia stabile nei primi 20 pazienti trattati(74d). Eventi avversi di grado terzo e quarto sono stati osservati in cinque pazienti: edema periferico (n = 2), ipopotassemia (n = 3) e profonde trombosi venose (n = 1). AMG102 ha dimostrato di promuovere gli effetti di vari agenti chemioterapici standard, come la temozolomide e il docetaxel in vitro e negli xenotrapianti, se combinati(75). Uno studio di Fase 1 su AMG102, somministrato in combinazione a due agenti antiangiogenici, bevacizumab e motesanib, ha mostrato una riduzione nella somma del diametro del tumore e una migliore risposta nella stabilizzazione della malattia in 8 pazienti su 10 valutati, senza una tossicità dose-limitante (DLT)(76).
temozolomide
docetaxel
5D5 one-armed, è un anticorpo umanizzato, monovalente, antagonista di c-Met derivante dall’anticorpo agonista monoclonale 5D5(77). MetMab lega c-Met con alta affinità e rimane sulla superficie della cellula con c-Met, prevenendo il legame con HGF, la successiva fosforilazione di c-Met, l’attività di trasmissione del segnale e la risposta cellulare. Recenti studi preclinici hanno mostrato che MetMab è un potente inibitore di c-Met ed è una promessa come anticorpo terapeutico nel cancro umano specialmente in combinazione con inibitori di EGRF e/o VEGF(70-78). Nei modelli preclinici dipendenti e ligando-indipendenti, una combinazione di 3 agenti, MetMAb con un inibitore EGRF e VEGF, ha effetti antitumorali più marcati rispetto a un qualsiasi agente da solo(78c). In particolare il trattamento locale di MetMAb sui glioblastomi contenenti una mutazione dell’attivazione di c-Met, ha portato vicino ad una completa inibizione della crescita del glioblastoma intracerebrale nei topi(78b). Sono iniziati gli studi clinici di Fase 1 di MetMAb e i risultati, da un trial iniziale di Fase 1, hanno indicato che MetMAb è sicura e ben tollerata come singolo agente alla dose di 30 mg/kg(79).
INIBITORI DELLA TIROSIN-CHINASI A PICCOLE MOLECOLE
Il ruolo conosciuto degli effettori intracellulari nelle trasformazioni cellulari, ha portato alla sperimentazione di terapie che limitano la loro interazione nella speranza di interrompere la cancerogenesi c-Met dipendente. Inibitori a piccole molecole di c-Met, hanno come bersaglio l’attività catalitica del recettore, mentre, una varietà di altri inibitori, hanno come bersaglio gli effettori a valle nella via di segnale di c-Met. Poiché l’interazione tra c-Met ed altri recettori di membrana può portare all’attivazione del recettore senza che ci sia il legame con il ligando, la strategia di colpire c-Met attraverso i suoi effettori, può portare a
risultati migliori(79). Queste strategie saranno probabilmente tumore-dipendente, basate sulla presenza di mutazioni di c-Met contro la sovraespressione del recettore.
ARQ197 (ArQule) è un agente non ATP-competitivo altamente selettivo per il recettore c-Met. Quando ARQ197 è stato valutato biochimicamente in un gruppo di 230 chinasi, solo c-Met è stato inibito in modo apprezzabile(58). In esperimenti preclinici, ARQ197 ha inibito potentemente la fosforilazione di c-Met costitutiva e indotta da HGF, in molte linee cellulari di tumori umani e ha ridotto la fosforilazione di molti effettori downstream di c-Met, inclusi AKT, MAPK e STAT-3. Uno studio di Fase 1 su ARQ-197, basato sulla somministrazione di una dose graduale in pazienti metastatici in cui le terapie standard hanno fallito, ha mostrato che ARQ197 è tollerato meglio e non è stata osservata nessuna DLT (dose limiting toxicity)(80). Di 33 pazienti valutati, 2 hanno dato una risposta parziale e 19 sono rimasti stabili. Un altro trial di Fase 1 ha esaminato il profilo farmacodinamico di ARQ197 in pazienti con tumori solidi avanzati e su cui si può fare una biopsia, riportando 1 DLT (fatica di grado 3) in 14 pazienti trattati(80). È stata osservata l’inibizione della fosforilazione di c-Met. Sono
ancora in corso studi di Fase 1 e Fase 2 di ARQ197, da solo o in combinazione.
ARQ197
Recentemente sono entrati in valutazione clinica iniziale, altri tre inibitori selettivi di c-Met. JNJ-38877605 (Johnson and Johnson) è una piccola molecola ATP-competitiva, inibitrice dell’attività catalitica di c-Met. JNJ-38877605 si è
mostrata circa 600 volte più selettivo nei confronti di c-Met rispetto a un gruppo di circa 250 diverse tirosin-chinasi e serina-treonina-chinasi, ed è stato visto che inibisce potentemente, in vitro, la fosforilazione di c-Met, stimolata da HGF e costitutiva.
JNJ-38877605
PF-04217903 (Pfizer) è una piccola molecola ATP-competitiva inibitrice di c-Met e assumibile oralmente, che ha dimostrato di avere una selettività per c-c-Met 1000 volte maggiore rispetto ad uno screening di più di 150 protein chinasi. La valutazione clinica di JNJ-38877605 e di PF-04217903 è appena iniziata e nessun dato è ancora disponibile.
SGX523 (SGX Pharmaceuticals) è un altro inibitore c-Met ATP-competitivo e altamente selettivo. SGX523 ha mostrato una selettività per c-Met 1000 volte maggiore rispetto a tutte le altre chinasi in uno screening di un gruppo di 213 protein-chinasi, e ha mostrato una potente attività antitumorale se somministrato oralmente in modelli umani xenotrapiantati, senza evidente tossicità(81). Tuttavia una tossicità inaspettata è stata osservata all’inizio degli studi di Fase 1, inclusa la compromissione della funzionalità renale evidenziata dall’aumento di creatina nel siero. Le analisi su pazienti campione di questi studi clinici, hanno rivelato un profilo metabolico marcatamente diverso da quello osservato negli esperimenti preclinici. Data la tossicità osservata, sono stati interrotti ulteriori sviluppi clinici di SGX523.
SGX523
PF-02341066 (Pfizer) è un inibitore tirosin-chinasico multitarget che ha attività sia contro c-Met sia contro la chinasi del linfoma anaplastico (ALK)(81). PF-02341066 inibisce potentemente:
• la fosforilazione di c-Met;
• la proliferazione, la migrazione e l’invasione c-Met-dipendente delle cellule tumorali umane in vitro;
• inibisce la sopravvivenza e l’invasione stimolata da HGF delle cellule endoteliali;
• inibisce la tubologenesi stimolata dal siero in vitro suggerendo che questo agente abbia proprietà antiangiogeniche.
PF-02341066
PF-2341066, nei saggi cellulari, inibisce in maniera più potente una gamma di varianti mutanti di c-Met rispetto al recettore c-Met non mutato e ciò ha suggerito che le varianti mutanti di c-Met, possono essere colpite meglio attraverso diversi inibitori di c-Met(82b). I trial di Fase 1 sono ancora in corso. GSK 1363089/XL880 (Exelixis) è un inibitore di c-Met con un IC50 di 0.4 nM. L’affinità di legame è alta sia per c-Met sia per VEGFR2 e causa un cambiamento conformazionale nella chinasi per rimuovere XL880 in profondità all’interno della tasca di legame per l’ATP. Il tempo sul bersaglio e maggiore di 24 ore per entrambi i recettori(83a). Negli esperimenti preclinici, XL880 ha causato necrosi centrali ed emorragie periferiche nei tumori producendo una riduzione delle dimensioni tumorali in vivo. XL880 ha una buona biodisponibilità orale ed è substrato per il CYP450 ma non lo inibisce né lo
somministrazione di XL880, uno ha analizzato un trattamento di 5 giorni sì e 9 giorni no (studio 1) e l’altro analizza una somministrazione giornaliera fissa (studio 2). La DLT è stata dipendente dallo schema di somministrazione (solo lo studio 1). È stato osservato un aumento reversibile delle transaminasi epatiche e delle lipasi pancreatiche(83a,83c). L’ipertensione è stata vista in più del 27% dei pazienti ma è stata di grado 3 solo nel 5% ed è trattabile con farmaci. Di 41 pazienti riportati nello studio 1, 4 hanno confermato una risposta parziale (più del 30% ha avuto una riduzione del tumore secondo i criteri RECIST), 4 hanno dato una risposta minore (risposta RECIST >20% e <30%), e 7 pazienti sono rimasti stabili.
La risposta più lunga è oltre i 54 mesi. Così lo spettro di selettività per XL880 differisce da quello degli agenti ad ampio spettro che mirano all’angiogenesi, come sorafenib e sunitinib , perché agisce all’interno di una sola area terapeutica, un punto alla volta (con benefici clinici significativi in determinati tipi di tumore). Differisce inoltre dagli inibitori dell’angiogenesi vandetanib e XL647, che agiscono su due diverse vie che possono o no sovrapporsi nelle cellule tumorali. XL880 agisce su due diverse vie che cooperano per la proliferazione e per la sopravvivenza, su diversi punti allo stesso tempo, portando ad una soluzione terapeutica per la risposta del tumore all’aggressività iniziale dell’angiogenesi tumorale. I trial di Fase 2 sono stati iniziati in molti tipi di tumori incluso il tumore renale papillare, il tumore gastrico e il tumore di testa e collo.
GSK 1363089/XL880
Sorafenib
vandetanib
XL647
XL184 (Exelixis) è una nuova piccola molecola anticancro somministrabile oralmente che, nei modelli preclinici, ha mostrato di essere potente nell’inibizione sia di MET sia di VEGFR2. XL184 ha inoltre esibito potere inibitorio su altri RTK, che sono implicate in vari tipi di cancro, come Ret, Kit,
Flt-3 e Tie-2. In studi preclinici efficaci XL184 ha inibito la crescita tumorale e ha indotto la riduzione di tumori di grandi dimensioni in una vasta gamma di modelli tumorali xenotrapiantati, incluso il tumore al seno, il tumore al polmone e il glioma. XL184 è inoltre in grado di sensibilizzare di nuovo cellule resistenti agli inibitori di EGFR come gefitinib e erlotinib; la combinazione di XL184 con con gli inibitori di EGRF ha portato ad un’importante attività sinergica paragonata agli altri farmaci somministrati da soli nei modelli cellulari e xenotrapiantati preclinici. Le prime esperienze precliniche hanno dato segnali incoraggianti dell’attività antitumorale a dosi non associate a tossicità(84). In particolare, i risultati su 17 pazienti con cancro midollare alla tiroide, trattati con XL184, hanno indicato un tasso di risposta maggiore del 50% e un controllo della malattia del 100%. Dei pazientii con MTC, nove sono stati trattati preventivamente con inibitori delle tirosin-chinasi.
XL184
MP470 (SuperGen) è una nuova piccola molecola somministrabile oralmente con attività inibitoria verso c-Met e contro altre diverse proteine tirosin-chinasiche, incluse le forme mutanti di c-Kit, di PDGRFα e di Flt-3(85). In aggiunta, MP470 sensibilizza le cellule cancerose agli agenti a base di platino che danneggiano il DNA e alla terapia radiante, presumibilmente attraverso la soppressione di Rad51, un componente chiave del meccanismo di riparazione cellulare che
indicato che MP470 è ben tollerata e che l’espressione di Rad51 è modulata in maniera dose-dipendente, supportando la teoria secondo la quale, in combinazione con agenti che danneggiano il DNA, MP470 è capace di sopprimere il meccanismo di riparazione di Rad51(85). Ulteriori studi clinici, inclusi studi in combinazione con i chemioterapici standard, sono ancora in corso. Sono iniziate recentemente le valutazioni cliniche di altri inibitori di c-Met ad ampio spettro.
MP470
MGCD265 (Methylgene) inibisce potentemente l’attività enzimatica in vitro di c-Met, Ron, VEGFRs, e Tie-2 ed è stato segnalato per fermare gli endpoints cellulari HGF-dipendenti, come la diffusione cellulare e la guarigione delle ferite e come la risposta VEGF-dipendente: angiogenesi in vitro e permeabilità vascolare in vivo(86).
MK-2461 (Merck) è un potente inibitore c-Met, KDR, FGFR1/2/3 e Flt 1/3/4 che è attivo in modo particolare nei modelli preclinici con l’amplificazione del gene Met, in cui c-Met è fosforilato constitutivamente. MK-2461 è ben tollerato nelle prime valutazioni di Fase1(87).
MK-2461
Anche se molto in ritardo rispetto alle altre strategie, lo sviluppo di piccole molecole inibitrici di c-Met chinasi, ha fatto progressi significativi con l’ausilio di molti composti recentemente introdotti negli studi clinici(42,43,46,88-90). Questi includono la [3-[[(R)-1-(2,6-dicloro-3-fluorofenil)etil]ossi]-5-[1-(piperidin-4-il)carbonil]-1H-pirazol-4-il]piridin-2-il]ammina(88) PF-2341066, la (3Z)-N-(3-
clorofenil)-3-((3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pirrol-2-il)metilene)-N-metil-2-ossi-2,3-diidro-1H-indolo-5-solfonammide(89) ,Su11274, e un’aciltiourea analoga(90), insieme a molti altri composti sviluppati recentemente, a struttura pirrolotriazinica, pirrolopiridinica, piridopirimidinica, tienopiridinica/pirimidinica e triazolopiridazinica(40-49).
SU1 1274
SU1 1274 aciltiourea
Attraverso uno screening ad alto rendimento (HTS), Porter et al.(91) hanno recentemente riportato due promettenti inibitori di c-Met contenenti rispettivamente un nucleo chinossalinico (1a) e chinolinico (1b) variamente sostituiti. Tuttavia solo il primo nucleo è stato ampiamente studiato (chinossalina
1a) e ha condotto a diverse strutture con una potenza inibitoria di c-Met
nell’ordine del nanomolare. Sebbene Porter e colleghi abbiano tentato di preparare anche chinoline 3,5 disostituite e 3,5,7 trisostituite (1b), solo un composto (4a) si è mostrato degno di nota. Come mostrato nello Schema 1, la maggior difficoltà nel preparare composti come (4a) usando la procedura di Porter(91), consiste nella bassa efficienza nell’introdurre il sostituente in 3 nel nucleo chinolinico, mediante la reazione di coupling C-N di Buchwald-Hartwig tra il bromuro (7) e la corrispondente piperazina sostituita ( meno del 10% di resa)(91). È stato supposto che la bassa resa nella reazione di coupling C-N
derivasse dalla bassa reattività del sistema chinolinico e dalle proprietà steriche ed elettron-donatrici del sostituente in C5 nel precursore (7). Durante il programma di ricerca di farmaci derivati da prodotti naturali,26,27 è stato visto di recente che la difficoltà nel preparare il composto (4a) può essere superata introducendo il sostituente amminico in C3 prima di inserire il sostituente in 5 sul nucleo chinolinico. Grazie a questa strategia sono state preparate con buone rese una serie di chinoline 3,5 sostituite e 3,5,7 sostituite, facilitando la scoperta di una gamma di potenti inibitori di c-Met(1).
(1a) X=N chinossalina (1b) X=CH chinolina
SINTESI DEI DERIVATI CHINOLINICI
La sintesi inizia dalla 3-bromo-5-nitrochinolina (5)(91) come intermedio chiave
(schema 1). Si segue per prima la procedura di Porter(91) per preparare la 3-(4-metilpiperazin-1-il)_5-(3-nitrobenzilossi)chinolina (4a). La riduzione della chinolina (5) con Fe/AcOH, seguita da diazotizzazione e idrolisi acida (reazione di Sandmeyer(92)) porta alla formazione di 3-bromo-5-idrossichinolina (6)) con una resa complessiva del 30%. L’alchilazione della chinolina (6) con 3-nitrobenzilbromuro porta alla formazione dell’etere (7)(91) con una resa dell’85%.
La successiva reazione di coupling C-N di Buchwald-Hartwig(93) (Pd2 (dba)3,
BINAP, NaOtBu) tra il bruomuro di (7) e la N-metilpiperazina è molto lenta e conduce al prodotto (4a) con basse rese (5-10%) anche dopo due giorni di reflusso. Non si hanno miglioramenti significativi neppure aumentando la
quantità di catalizzatore o passando ad un altro sistema catalitico (Pd(PPh4)4/BINAP, Pd(PPh3)4/(o-tolil)3P, Pd2(dba)3/dppf)(93) o usando altre basi
(Cs2CO3, K3PO4, KOtBu). Mentre si ha accumulo di prodotto de-bromurato.
Come prima menzionato, la bassa efficienza della reazione di copulazione è dovuta, probabilmente, all’effetto sterico ed elettron donatore del sostituente in 5 sulla chinolina (7). A questo riguardo si è deciso di condurre la reazione di copulazione C-N prima di eseguire la reazione di Sandmeyer. Fortunatamente la reazione tra 5-nitro-3-bromochinolina (5) e la piperazina N-sostituita, sotto sistema catalitico (dba)3/BINAP/Cs2CO3, procede senza intoppi e porta alla
formazione dei prodotti (8a) e (8b) con una resa rispettiva del 70% e 72%. La riduzione di (9a) e (9b) con Fe/NH4Cl porta alla formazione di amminochinoline
con rendimenti moderati. Dopo aver introdotto il sostituente desiderato in 3 con successo, si sono attivate prontamente le reazioni di diazotizzazione ed idrolisi acida secondo la procedura di Porter, così è stata convertita l’amminochinolina
(9a) nell’idrossiamminochinolina (10) con una resa superiore al 30%.
L’alchilazione di (10) con 3-nitrobenzil bromuro fornisce il composto desiderato
(4a) con una resa del 73%. Quindi, saltando alcuni passaggi nella reazione, il
prodotto (4a) di Porter è stato preparato in quattro passaggi a partire dalla 3-bromo-5-nitrochinolina (5). Seguendo questo processo migliorato, l’alchilazione di (10) con altro bromuro offre chinoline 3,5 sostituite (4b,c) con una resa dell’88% (Schema 1). La condensazione(95) di 5-idrossichinolina (10) con l’acido 1-(4-fluorofenil)-2-ossi-1,2-dididropiridina-3-carbossilico o l’acido 3-nitrobenzoico, fornisce i rispettivi esteri (4d) e (4e) con una resa dell’83%. L’esterificazione(96) della 5-idrossichinolina con 3-nitrobenzene-1-solfonil cloruro conduce alla chinolina 3,5 sostituita (4f) con una resa dell’81%.
L’amminazione riduttiva(97) delle 5-amminochinoline (9a) e (9b) con 3-nitrobenzaldeide porta alla formazione delle corrispondenti 3,5-diamminochinoline (11a) e (11b) con una resa rispettiva del 67% e del 59%
(Schema 2). Trattando le 5-amminochinoline (9a) e (9b) con un isocianato o un
isotiocianato appropriato(98) si ottengono i composti (12a-g) con una resa da moderata a buona (52-85%). La diazzotazione(99) della 5-amminochinolina (9a) seguita dal trattamento con KI porta alla formazione di ioduro con una resa del 70%. La copulazione di Suzuki(100) del composto (13) con un appropriato acido aril boronico porta alla formazione di 5-aril-3-amminochinoline (14a-f) con una resa del 81-87%.
Da quando Porter ha segnalato che l’introduzione del sostituente CF3 sull’analogo di chinossalina (1a), conduce ad un aumento di potenza enzimatica su c-Met, è stato ipotizzato un trasferimento di CF3 sulla struttura chinolinica. Pertanto sono state preparate una serie di chinoline 3,5,7 sostituite che portano CF3 come sostituente sul C7. Come descritto nello Schema 3, seguendo la
procedura descritta da Belcher(101) nel 1954, è stata sintetizzata la 5-nitro-7-(trifluorometil)chinolina (17), trattando la 3-nitro-5-(trifluorometil)anilina (15) rintracciabile in commercio, con glicerolo, acido solforico e il pentossido d’arsenico con una bassa resa (15%), e parallelamente è stato isolato il regioisomero (18) come prodotto marginale (5%). La bassa resa in questa reazione di ciclizzazione è attribuibile principalmente alle dure condizioni di reazione e alla difficoltà nel separare i prodotti dall’enorme complesso gommoso. Gli sforzi per sostituire il pentossido d’arsenico che è tossico, con altri ossidanti che di solito si utilizzano nella sintesi di Skraup(102a,b) (come il sodio 3-nitrobenzene solfato o vitriolo verde) non hanno avuto successo. Al contrario, il prodotto di doppia ciclizzazione 5-(trifluorometil)-1,7- fenantrolina (16)(103) è stato isolato come il composto principale.
Allo stesso modo, trattando la chinolina (17) con NBS in AcOH si ottiene il bromuro (19) con una resa del 90% (Schema 3). La copulazione C-N della chinolina (19) con un’appropriata piperazina sostituita in 4, porta alla formazione delle 5-nitro-7-trifluorometilchinoline (20a-d) con una resa del 75-80%.
Trattando i composti (20a-c) con Fe/NH4Cl e facendo un’amminazione riduttiva con un’appropriata arilaldeide e NaBH4, si ottengono le corrispondenti chinoline
3,5,7 sostituite (21a-j) con una resa complessiva del 55-73%. La copulazione del bromuro (19) con la piperidina e la morfolina, conduce ai prodotti (20e) e (20f) con una resa rispettiva del 75% e 85%. Questi ultimi sono stati poi sottoposti ad una riduzione mediata dal Fe, seguita da una amminazione riduttiva, per arrivare alle chinoline (21k) e (21l) con una resa del 68% (Schema 4). In aggiunta, trattando la 5-amminochinolina (20a) con Fe/NH4Cl e successivamente condensando con 3-nitrobenzensolfonilcloruro si ottiene un ammide solfonica
(22) con una resa del 85% (Schema 4). Allo stesso modo, la riduzione della
amminochinolina (20a) seguita dalla reazione di Sandmeyer, conduce alla 5-idrossichinolina (23) con una resa superiore al 30%. Dall’alchilazione del composto (23) con il 3-nitrobenzil buomuro, si ottiene con una resa del 90% l’etere (24).
Sono stati inoltre sintetizzati composti con sostituenti diversi sulla posizione N 4 del nucleo piperazinico (Schema 5). Deproteggendo il composto (20d) e trattando con un appropriato cloruro o bromuro, sono state ottenute le chinoline (26a-d) con una resa del 89-94%. Riducendo il gruppo nitro e facendo un’amminazione riduttiva, sono state ottenute chinoline 3,5,7 sostituite (27a-d) con una resa complessiva del 50-53%. L’acido (27e) è stato ottenuto mediante idrolisi dell’estere (27c) con LiOH.
Nel frattempo, il regioisomero (18), che si è formato nella ciclizzazione dell’anilina (15), è stato anche convertito nella corrispondente chinolina trisostituita (Schema 6). Trattando quindi il composto (18) con NBS è stato ottenuto il bromuro (28) con una resa del 90%. La copulazione C-N del bromuro
(28) con i sostituenti N-Me o N-Et sulla piperazina, è risultata scorrevole e ha
portato alla formazione di chinoline 3,5,7 sostituite (29a,b) con una resa rispettiva del 78% e dell’82%. La riduzione di (29a,b) con il Fe/NH4Cl seguita
da amminazione riduttiva ha portato ad ottenere i composti finali (31a,b) con rese moderate.
Schema 2 sintesi dei composti 11a,b 12a-g, 14a-f
Schema 4 sintesi dei composti 22 e 24a
Schema 5 sintesi dei composti 27a-d
CONCLUSIONI.
Negli ultimi anni, l’introduzione di agenti strutturalmente mirati nel cancro, ha dato risultati impressionanti. L’inibizione di RTK iniziatori (ad esempio Brc-abl nella leucemia mieloide) o promotori (ad esempio EGFRmut nel NSCLC; c-Kit nel tumore dello stroma gastrointestinale) della sopravvivenza tumorale, attraverso piccole molecole mirate come agenti singoli, ha mostrato diversi benefici clinici in pazienti affetti da cancro in differenti circostanze. Anticorpi monoclonali altamente selettivi, hanno mostrato di essere efficaci in un gran numero di tumori umani se combinati con altri agenti, in particolare, con chemioterapici citotossici. L’inibizione di molti fattori e delle vie di segnalazione coinvolte nell’angiogenesi, ottenuta grazie agli inibitori tirosin-chinasici, (VEGFR2, PDGFR) ha portato a benefici clinici nel cancro delle cellule renali. L’asse HGF/c-Met sembra essere un bersaglio interessante per lo sviluppo di farmaci antitumorali. Sebbene HGF/c-Met rappresenti la mutazione guida nel cancro papillare renale ereditario, è presente anche in alcuni glioblastomi, tumori gastrici, tumori epatocellulari e tumori dei tessuti molli, una sovraespressione di HGF e c-Met in una percentuale molto alta di pazienti con tumori solidi, è associata a prognosi infausta e si possono avere dei benefici dalle terapie che mirano a Met. Le conseguenze biologiche conosciute dell’attivazione di c-Met sono: invasione, morfogenesi cellulare, motilità, metastasi, immortalizzazione e angiogenesi che rappresentano le proprietà maggiormente indesiderate associate al cancro. Inoltre, il segnale c-Met promuove l’angiognesi tumorale mediata dall’asse VEGF. La risposta all’ipossia che aumenta il rilascio di HGF e il segnale di c-Met, promuove la metastatizzazione nei tumori non trattati e può essere importante nella resistenza agli agenti antitumorali che hanno come bersaglio VEGF. L’associazione di inibitori di EGRF e di Met in combinazione può portare ad un sinergismo di azione simultanea su c-Met e VEGF, se
realizzata in maniera bilanciata sia con una combinazione di più agenti sia con un solo agente con effetto duale, si possono avere benefici maggiori rispetto all’inibizione di un singolo bersaglio alla volta.
BIBLIOGRAFIA
1. Yuanxiang Wang, Jing Ai, Ying Wang, Yi Chen, Lu Wang, Gang Liu, Meiyu Geng, and Ao Zhang, J. Med. Chem. 2011, 54, 2127–2142.
2. Trusolino, L.; Comoglio, P. M. Scatter-factor and semaphoring receptor: cell signaling for invasive growth. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 289–300. 3. Birchmeier, C.; Birchmeier, W.; Gherardi, E.; Vande Woude, G. F. Met,
metastasis, motility and more. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4, 915– 925.
4. Lokker, N. A.; Mark, M. R.; Luis, E.; Bennett, G. L.; Robbins, K. A.; Baker, J. B.; Godowski, P. J. Structure_function analysis of hepatocyte growth factor: identification of variants that lack mitogenic activity yet retain high affinity receptor binding. EMBO J. 1992, 11, 2503–2510.
5. Okigaki, M.; Komada, M.; Uehara, Y.; Miyazawa, K.; Kitamura, N. Functional characterization of human hepatocyte growth factor mutants obtained by deletion of structural domains. Biochemistry 1992, 31, 9555– 9561.
6. Ted L. Underiner, Torsten Herbertz and Sheila J. Miknyoczki Discovery of Small Molecule c-Met Inhibitors: Evolution and Profiles of Clinical Candidates. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2010, 10, 7-27. 7. Jänne, P. A.; Gray, N.; Settleman, J. Factors underlying sensitivity of
cancers to small-molecule kinase inhibitors. Nat. Rev. Drug Discov., 2009,
8 (9), 709-723.
8. Ma, W. W.; Adjei, A. A. Novel agents on the horizon for cancer therapy.
9. Zhang, J.; Yang, P. L.; Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat. Rev. Cancer, 2009, 9(1), 28-39.
10. Christensen, J. G.; Burrows, J.; Salgia, R. c-Met as a target for human cancer and characterization of inhibitors for therapeutic intervention.
Cancer Lett., 2005, 225(1), 1-26.
11. Comoglio, P. M.; Trusolino, L. Invasive growth: from development to metastasis. J. Clin. Invest., 2002, 109(7), 857-862.
12. Mazzone, M.; Comoglio, P. M. The Met pathway: master switch and drug target in cancer progression. FASEB J., 2006, 20, 1611- 1621.
13. Sattler, M.; Salgia, R. c-Met as a therapeutic target. Update Cancer Ther.,
2009, 3, 109-118.
14. Park, M., Dean, M., Cooper, C. S., Schmidt, M., O’Brien, S. J., Blair, D. G., and Vande Woude, G. F. Mechanism of Met oncogene activation, Cell,
1986, 45, 895-904.
15. Abounader, R.; Laterra, J. Scatter factor/hepatocyte growth factor in brain tumor growth and angiogenesis. Neuro-Oncology, 2005, 7(4), 436-451. 16. Jaing, W. G.; Martin, T. A.; Parr, C.; Davies, G.; Matsumoto, K.;
Nakamura, T. Hepatocyte growth factor, its receptor and their potential value in cancer therapies. Crit. Rev. Oncol./Hematol., 2005, 53, 35-69. 17. Sattler, M.; Salgia, R. c-Met and hepatocyte growth factor: potential as
novel targets in cancer therapy. Curr. Oncol. Rep., 2007, 9(2), 102-108. 18. Maulik, G.; Shrikhande, A.; Kijima, T.; Ma, P. C.; Morrison, P.T.; Salgia,
R. Role of the hepatocyte growth factor receptor, c-Met, in oncogenesis and potential for therapeutic inhibition. Cytokine Growth Factor Rev., 2002,
19. Cristiani, C.; Rusconi, L.; Perego, R.; Schiering, N.; Kalisz, H.M.; Knapp, S.; Isacchi, A. Regulation of the wild-type and Y1235D mutant Met kinase activation. Biochemistry, 2005, 44(43), 14110-14119.
20. Peace BE, Hughes MJ, Degen SJ, Waltz SE. Point mutations and overexpression of Ron induce transformation, tumor formation, and metastasis. Oncogene, 2001, Sep 27; 20(43):6142-51.
21. Bardelli, A.; Longati, P.; Williams, T.; Benvenuti, S.; Comoglio, P.M. A peptide representing the carboxyl-terminal tail of the Met receptor inhibits kinase activity and invasive growth. J. Biol. Chem., 1999, 274(41), 29274-29281.
22. Schmidt, L.; Junker, K.; Nakaigawa, N.; Kinjerski, T.; Weirich, G.; Miller, M.; Lubensky, I.; Neumann, H.; Brauch, H.; Decker, J.; Vocke, C.; Brown, J.A.; Jenkins, R.; Richard, S.; Bererheim, J.; Gerrard, B.; Dean, M.; Linehan, W.M.; Zbar, B. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene, 1999, 18(14), 2343-2350.
23. Smolen, G. A.; Sordella, R.; Muir, B.; Mohapatra, G.; Barmettler, A.; Archibald, H.; Kim, W. J.; Okimoto, R. A.; Bell, D. W.; Sgori, D. C.; Christensen, J. G.; Settleman, J.; Haber, D. A. Amplification of MET may identify a subset of cancers with extreme sensitivity to the selective tyrosine kinase inhibitor PHA-665752. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(7), 2316-2321.
24. Fan, S.; Ma, Y. X.; Gao, M.; Yuan, R. Q.; Meng, Q.; Goldberg, I. D.; Rosen, E. M. The mulitsubstrate adapter Gab1 regulated hepatocyte growth factor (scatter factor)-c-Met signaling for cell survival and DNA repair.
25. Hiscox, S.; Jordan, N. J.; Harper, M.; McClelland, R.; Smith, C.; Nicholoson, R. I. Chronic exposure to fulvestrant promotes overexpression of the c-Met receptor in breast carcinoma cells: implications for tumour-stroma interactions. Endoc.-Relat. Cancer, 2004, 13(4), 1085-1099.
26. Engleman, J. A.; Zejnullahu, K.; Mitsudomi, T.; Song, Y.; Hyland, C.; Park, J. O.; Lindeman, N.; Gale, C.-M.; Zhao, X.; Christensen, J. G.; Kosaka, T.; Holmes, A. J.; Rogers, A. M.; Cappuzzo, F.; Mok, T.; Lee, C.; Johnson, B. E.; Cantley, L. C.; Jänne, P. A. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science, 2007,
316(5827), 1039-1043.
27. Shattuck, D. L.; Miller, J. K.; Carraway K. L., III; Sweeney, C. Met receptor contributes to tratuzumab resistance of her2-overexpressin breast cancer cells. Cancer Res., 2008, 68(5), 1471-1477.
28. Agarwal, S.; Zerillo, C.; Kolmakova, J.; Christensen, J. G.; Harris, L.N; Rimm, D. L.; DiGiovanna, M. P.; Stern, D. F. Association of constitutively activated hepatocyte growth factor receptor (Met) with resistance to a dual EGFR/Her2 inhibitor in non-small-cell lung cancer cells. Br. J. Cancer,
2009, 100(6), 941-949.
29. Kubo, T; Yamamoto, H. Y.; Lockwood, W. W.; Valencia, I.; Soh, J.; Peyton, M.; Jida, M.; Otani, H.; Fujii, T.; Ouchida, M.; Takigawa, N.; Kiura, K.; Shimizu, K.; Date, H.; Minna, J.D.; Varella- Garcia, M.; Lam, W.L.; Gazdar, A.F.; Toyooka, S. MET gene amplification or EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR kinase inhibitors. Int. J. Cancer, 2009, 124(8), 1778-1784.
30. Bachleitner-Hoffman, T.; Sun, M. Y.; Chen, C.-T.; Tang, L.; Song, L.; Zeng, Z.; Shah, M.; Christensen, J. G.; Rosen, N.; Solit, D. B.; Weiser, M
inhibition in MET oncogene-addicted gastric cancer cells. Mol. Cancer
Ther., 2008, 7(11), 3499-3508.
31. Tang, Z.; Du, R.; Jiang, S.; Wu., C; Barkauskas, D. S.; Richey, J.; Molter, J.; Lam, M.; Flask, C.; Gerson, S.; Dowlati, A.; Liu, L.; Lee, Z.; Halmos, B.; Wang, Y.; Kern, J. A.; Ma, P. C. Dual Met-EGFR combinatorial inhibition against T790M-EGFR-mediated erlotinib-resistant lung cancer.
Br. J. Cancer, 2008, 99(6), 911-922.
32. Bean, J.; Brennan, C.; Shih, J. Y.; Riely, G.; Viale, A.; Wang, L.; Chitale, D.; Motoi, N.; Szoke, J.; Broderick, S.; Balak, M.; Chang, W. C.; Yu, C. J.; Gazdar, A.; Pass, H.; Rusch, V.; Gerald, W.; Huang, S. F.; Yang, P. C.; Miller, V.; Ladanyi, M.; Yang, C. H.; Pao, W. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2007, 104(52), 20932-20937.
33. Burgess, T.; Coxon, A.; Meyer, S.; Sun, J.; Rex, K.; Tsuruda, T.; Chen, Q.; Ho, S. Y.; Li, L.; Kaufman, S.; McDorman, K.; Cattley, R. C.; Sun, J.; Elliott, G.; Zhang, K.; Feng, X.; Jia, X. C.; Green, L.; Radinsky, R.; Kendall, K. Fully human monoclonal antibodies to hepatocyte growth factor with therapeutic potential against hepatocyte growth factor/c-Met dependent human tumors. Cancer Res., 2006, 66(3), 1721-1729.
34. Jin, H,; Yang, R.; Zheng, Z.; Romero, M.; Ross, J.; Bou-Resaln, H.; Carano, R. A. D.; Kasman, I.; Mai, E.; Young, J.; Zha, J.; Zhang, Z.; Ross, S.; Schwall, R.; Colbern, G.; Merchant, M. Met-Mab, the one-armed 5D5 anti-c-Met antibody, inhibits orthotopic pancreatic tumor growth and improves survival. Cancer Res., 2008, 68(11), 4360-4368.
35. Kakkar, T.; Ma, M.; Zhuang, Y.; Patton, A.; Hu, Z.; Mounho, B. Pharmacokinetics and safety of a fully human hepatocyte growth factor
antibody, AMG 102, in cynomologus monkeys. Pharm. Res., 2007, 24(10), 1910-1918.
36. Ramanathan, R. K.; Egorin, M. J.; Eiseman, J. L.; Ramalingam, S.; Friedland, D.; Agarwala, S. S.; Ivy, S. P.; Potter, D. M.; Chatta, G.; Zuhowski, E. G.; Stoller, R. G.; Naret, C.; Guo, J.; Belani, C. P. Phase I and pharmacodynamic study of 17-(allylamino)-17- demethoxygeldanamycin in adult patients with refractory advanced cancers. Clin. Cancer Res., 2007,
13(6), 1769-1782.
37. Tam, E. M.; Runyon, S. T.; Santell, L.; Quan, C.; Yao, X.; Kirchofer, D.; Skelton, N. J.; Lazarus RA Noncompetitive inhibition of hepatocyte growth factor dependent Met signaling by a phage derived peptide. J. Mol. Biol.,
2009, 385(1), 79-90.
38. Wang S; Pashtan I; Tsutsumi S; Xu W; Neckers L Cancer cells harboring MET gene amplification activate alternative signalling pathways to escape MET inhibition but remain sensitive to Hsp90 inhbitors. Cell Cycle, 2009, 8 (13), 2050-2056.
39. Abounader, R.; Raganathan, S.; Lal, B.; Fielding, K.; Book, A.; Dietz, H.; Burger, P.; Laterra, J. Reversion of human glioblastoma malignancy by U1 small nuclear RNA/ribozyme targeting of scatter factor/hepatocyte growth factor and c-Met expression. J. Natl. Cancer Inst., 1999, 91(18), 1548-1556.
40. Cui, J. Inhibitors targeting hepatocyte growth factor receptor and vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases. Expert Opin. Ther. Pat.
41. Cui, J. J. Inhibitors targeting hepatocyte growth factor receptor and their potential therapeutic applications. Expert Opin. Ther. Pat. 2007, 17, 1035– 1045.
42. Abidoye, O.; Murukurthy, N.; Salgia, R. Review of clinic trials: agents targeting c-Met. Rev. Recent Clin. Trials. 2007, 2, 143–147.
43. Comoglio, P. M.; Giordano, S.; Trusolino, L. Drug development of MET inhibitors: targeting oncogene addiction and expedience. Nat. Rev. Drug
Discovery 2008, 7, 504–516.
44. Liu, X.; Yao, W.; Newton, R. C.; Scherle, P. A. Targeting the c-Met signaling pathway for cancer therapy. Expert Opin. Invest. Drugs 2008, 17, 997–1011.
45. Dussault, I.; Bellon, S. F. From concept to reality: the long road to c-Met and RON receptor tyrosine kinase inhibitors for the treatment of cancer.
Anti-Cancer Agents Med. Chem. 2009, 9, 221–229.
46. Eder, J. P.; Vande Woude, G. F.; Boerner, S. A.; LoRusso, P. M. Novel therapeutic inhibitors of the c-Met signaling pathway in cancer. Clin.
Cancer Res. 2009, 15, 2207–2214.
47. Giubellino, A.; Linehan, W. M.; Bottaro, D. P. Targeting the Met signaling pathway in renal cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 2009, 9, 785–793. 48. Underiner, T. L.; Herbertz, T.; Miknyoczki, S. J. Discovery of small
molecule c-Met inhibitors: evolution and profiles of clinical candidates.
Anti-Cancer Agents Med. Chem. 2010, 10, 7–27.
49. Porter, J. Small molecular c-Met kinase inhibitors: a review of recent patent.
50. Eder, J. P.; Vande Woude, G. F.; Boerner, S. A.; LoRusso, P. M. Novel therapeutic inhibitors of the c-Met signaling pathway in cancer. Clin.
Cancer Res. 2009, 15, 2207–2214.
51. Cooper CS, ParkM, Blair DG, et al.Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature
1984;311:29-33.
52. Bottaro DP, Rubin JS, Faletto DL, et al. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science
1991;251:802-4.
53. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, VandeWoude GF. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol 2003;4:915-25.
54. Matsumoto K, Nakamura T. NK4 (HGF-antagonist/angiogenesis inhibitor) in cancer biology and therapeutics. Cancer Sci 2003;94:321-7.
55. Peschard P, Ishiyama N, LinT, Lipkowitz S, ParkM. A conserved DpYR motif in the juxtamembrane domain of the Met receptor family forms an atypical c-Cbl/Cbl-b tyrosine kinase binding domain binding site required for suppression of oncogenic activation. J. Biol. Chem 2004; 279:29565-71. 56. Boccaccio C, Comoglio PM. Invasive growth: a MET-driven genetic
programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer 2006;6:637- 45. 57. Fan S, MaYX,Wang JA, et al. The cytokine hepatocyte growth
factor/scatter factor inhibits apoptosis and enhances DNA repair by a common mechanism involving signaling through phosphatidyl inositol 3¶ kinase. Oncogene 2000;19:2212-23.
58. Derksen PW, de Gorter DJ,Meijer HP, et al.The hepatocyte growth factor/Met pathway controls proliferation and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia 2003; 17: 764-74.
59. Xiao GH, JeffersM, Bellacosa A,MitsuuchiY,Vande Woude GF,TestaJR. Anti-apoptotic signaling by hepatocyte growth factor/Met via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase pathways. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:247-52.
60. a) Zeng Q, Chen S,You Z, et al. Hepatocyte growth factor inhibits anoikis in head and neck squamous cell carcinoma cells by activation of ERK and Akt signalling independent of NFn B. J Biol Chem 2002;277: 25203-8. b) Tulasne D, Foveau B. The shadow of death on the MET tyrosine kinase receptor. Cell Death Differ 2008; 15:42-34.
61. Guo A,Villen J, Kornhauser J, et al. Signaling networks assembled by oncogenic EGFR and c-Met. Proc Natl Acad Sci USA 2008;105:692-7. 62. Comoglio PM, Giordano S,Trusolino L. Drug development of MET
inhibitors: targeting oncogene addiction and expedience. Nat Rev Drug
Discov 2008; 7:504-16.
63. a) Benvenuti S, Comoglio PM.TheMETreceptor tyrosine kinase in invasion and metastasis. J Cell Physiol 2007;213:316-25. b) Gentile A,Trusolino L, Comoglio PM. The Met tyrosine kinase receptor in development and cancer. Cancer Metastasis Rev 2008; 27:85-94. c) Schmidt L, Duh FM, Chen F, et al. Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nat
Genet 1997; 16:68 -73.
64. a) Bean J, Brennan C, Shih JY, et al.METamplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired
