IN DICE
RIASSU N TO ...2
IN TRO DU ZIO N E...5
SCO PO DELLO STU DIO ...10
PAZIEN TI...11
ESAM I DI LABO RATO RIO ...22
ESAM I IN V IV O ...22
M ATERIALI E M ETO DI...23
RISU LTATI...28
DISCU SSIO N E...36
CO N CLU SIO N I...45
RIASSU N TO
L’ipotiroid ism o sub clinico è una cond izione in cui si riscontra un inna lza m e nto d e i live lli sierici d i TSH associato a livelli d i FT4 e FT3 ne lla norm a .
La c a usa più freque nte d i ipotiroid ism o sub clinico ne lle a ree a sufficiente
a pporto iod ico è la Tiroid ite Cronica Autoim m une,ne lla qua le
l’ipotiroid ism o può evolvere nel tem po in ipotiroid ism o franco.
La form a Autoim m une d i ipotiroid ism o sub clinico d e ve com unque e ssere d istinta d a lla più rara cond izione clinica cong enita chiam a ta
Resistenza tiroid e a a l TSH,caratterizza ta d a una rid otta o a ssente
sensibilità d ella tiroid e a lla m olecola d e l TSH b iolog icam ente a ttiva . La Resistenza a l TSH può essere pa rziale o com pleta: ne l prim o caso a vrem o un fenotipo caratterizza to d a un m od esto a um e nto d e l TSH sierico con frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid ei ne lla norm a ; ne l second o caso il va lore d e l TSH sierico sarà francam e nte e le va to e le frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid e i saranno b a sse. Q uind i potrem o a vere d a un la to un
qua d ro d i ipe rtireotropine m ia isola ta, d a ll’altro un qua d ro d i
ipotiroid ism o seve ro.
L’ipertireotropine m ia isola ta è una form a d i ipotiroid ism o sub clinico
che viene riscontrata in sog g e tti con tiroid e in sed e ,d i d im e nsioni
norm a li,con caratteristiche ecog rafiche ne lla norm a ,in a ssenza d i seg ni
clinici e b ioum orali d i autoim m unità tiroid e a . Il lieve a um ento d i TSH non d eve e ssere correla to a d a ltre cond izioni qua li l’uso d i fa rm aci
interfe renti con la funzione tiroid e a ,com e a d esem pio l’am iod a rone o il litio.
Le m utazioni ina ttiva nti de l g ene d el recettore d el TSH (TSHr) sono tra i possib ili m eccanism i pa tog e ne tici responsab ili d ella resistenza tiroid e a a l TSH.
In questo la voro,a b b iam o seleziona to 57 sog g etti con ipertireotropine m ia
isola ta,d e i qua li 17/57 a ve va no un qua d ro clinico d i ipe rtireotropine m ia
isola ta a c a rattere fa m iliare (Fa m iglia A,B,C,D,E,F,G), m e ntre tutti gli
a ltri pa zienti (40/57) veniva no d e finiti sporad ici,ovvero,nessun a ltro
m e m b ro d e lla fa m iglia presentava il fenotipo d escritto.
Tutti i sog g etti ave va no frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid ei ne lla norm a , va lori d i TSH d a lieve m e nte a m od e ratam e nte e le va ti. N on erano
presenti anticorpi anti-tireog lob ulina , a tireope rossid a si e a
nti-recettore d el TSH. E’ stato inoltre eseg uito un d osa g g io d i alcuni d e g li ind ici perife rici d i ipotiroid ism o che sono risultati nella norm a in tutti i pa zienti. L’ecog rafia tiroid e a m ostrava una tiroid e d i norm a li d im e nsioni
pe r sesso e d età,con a spe tto norm oecog eno e senza nod uli. Tutti i
sog g e tti erano clinicam ente e utiroid e i.
In tutti i 57 sog g e tti è stata e seg uita l’ana lisi g enetica d e l g e ne d e l TSHr che ha rivela to in tre m e m b ri d e lla fa m iglia A una m utazione ina ttiva nte d e l TSHr già d e scritta in letteratura (P162A): la proposita è risultata
om ozig ote pe r la m utazione, la m a d re e il figlio sono risultati eterozig oti .
In un m e m b ro d ella fa m iglia con ipe rtireotropine m ia isola ta la m utazione non è stata id e ntificata. La stessa m utazione ina ttiva nte è stata riscontrata
a nche nella fa m iglia G: il proposito è risultato om ozig ote pe r la
m utazione,il pa d re è risultato e terozig ote.
N e lla fa m iglia B è stata id e ntificata una m utazione ina ttiva nte d e l g ene d e l TSHr m a i d e scritta in letteratura (L253P) e d a noi stud iata a nche d a l punto d i vista funziona le.
N e lla fa m iglia E è stata e vid enziata la presenza d i una nuova inserzione (Q 8fsX62) che provoca la form a zione d i una proteina troncata: il proposito e i suoi fa m iliari sono risultati eterozig oti pe r tale a nom a lia. N e lla fa m iglia F è stata id e ntificata una m utazione ina ttiva nte d el g e ne
d e l TSHr,che rigua rd a il resid uo Asp in posizione 410,che è sostituito d a
un Asn (D410N ): la proposita è risultata om ozig ote pe r questa m utazione, la sorella eterozig ote pe r la stessa a nom a lia.
N e lle fa m iglie C e D e ne i 40 sog g etti con ipe rtireotropine m ia isola ta sporad ica non è stata id entificata a lcuna m utazione d e l g e ne d e l TSHr.
IN TRO DU ZIO N E
L’ipotiroid ism o è una sind rom e clinica d ovuta a d un’ insufficiente
a zione d e g li orm oni tiroid e i a live llo tissutale causata,ne lla m a g g ior
pa rte d e i casi,d a un d e ficit d i prod uzione orm ona le d a pa rte d ella
tiroid e .
In b a se a i live lli orm ona li si d isting uono d iversi qua d ri clinici che va nno
d a ll’ ipotiroid ism o franco ,caratterizza to d a e le va ti livelli sierici d i TSH e
a ssociato a orm oni tiroid e i ba ssi,a ll’ ipotiroid ism o lieve o sub clinico
caratterizza to d a un a um ento d e i livelli sierici d i TSH associati a norm a li live lli sierici d i frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid e i (1).
La form a più frequente d i ipotiroid ism o,per qua nto rigua rd a i sog g etti
a d ulti che vivono in a ree a d a d e g ua to a pporto iod ico,è la Tiroid ite
Cronica Autoim m une (2). Essa è caratterizza ta d a un d ife tto d ella funzione tiroid ea che si ve rifica a c a usa d i un processo infiam m a torio d i tipo a utoim m une che colpisce la g hiand ola . I suoi caratteri d istintivi sono costituiti d a lla presenza ne l siero d i anticorpi d iretti contro a ntige ni
tiroid e i com e g li anticorpi anti-tireog lob ulina ,a nti-tireope rossid a si,a
nti-recettore d el TSH. Inoltre a ll’ ecog rafia si d isting ue pe r la presenza d i un a spe tto d iffusam e nte ipoecog eno.
L’ ipotiroid ism o d ovuto a lla Tiroid ite Cronica Autoim m une d e ve essere
d istinto d a lla Resistenza a l TSH,una cond izione clinica cong enita
recentem e nte d e scritta in cui si riscontra una va riab ile sensibilità d ella sintesi orm ona le d e lla g hiand ola tiroid e a a ll’azione d e lla m olecola d i TSH b iolog icam e nte attiva (3).
Ta le cond izione è caratterizza ta,d a l punto d i vista b iochim ico,d a e le va ti live lli sierici d i TSH e orm oni tiroid ei norm a li-ba ssi in presenza d i una
g hiand ola tiroid e a in sed e,d i norm a li d im ensioni o lieve m ente
ipopla sica.
Di recente è stato d im ostrato che questa a nom a lia può d ipe nd ere d a a lterazioni d el recettore d el TSH (5-11) e in b a se a ll’entità d i questa a lterazione possia m o a ve re d ue d ive rsi qua d ri fe notipici: una form a d i
resistenza a l TSH com pleta con ipotiroid ism o seve ro,una form a pa rziale
con la sola presenza d i eleva ti live lli sierici d i TSH d e finibile com e “ ipertireotropine m ia isola ta “.
L’ ipe rtireotropine m ia isola ta è quind i una form a d i ipotiroid ism o
sub clinico o lieve che viene riscontrata in sog g e tti con tiroid e in sed e ,d i
d im e nsioni norm a li,con norm a li caratteristiche ecog rafiche ,in a ssenza
d i seg ni clinici e b ioum orali d i autoim m unità tiroid e a . Il lieve a um e nto d i TSH non d e ve e ssere com unque correla to a d a ltre cond izioni qua li
l’uso d i fa rm aci interferenti con la funzione tiroid e a ,com e a d ese m pio
l’am iod a rone o il litio.
Il TSH è un orm one ipofisario. H a un ruolo fond a m e ntale
ne ll’accrescim ento ,nella d iffe renziazione e ne l funziona m e nto d e lle
cellule follicola ri d ella tiroid e. Il TSH esplica la sua funzione le g a nd osi in m od o a ltam e nte specifico a l recettore espresso sulla superficie cellula re d e i tireociti.
Il recettore d e l TSH (TSHr) ha una struttura sim ile a que lla d i m olti altri recettori appa rtenenti alla fa m iglia d e i recettori orm ona li g licoproteici. E’ form a to d a una sing ola catena polipeptidica che attrave rsa sette volte la
m e m b rana ,d a un g rosso d om inio e xtracellula re N -term ina le e d a un d om inio intracellula re carbossiterm ina le . La form a m a tura d e l TSHr è e spressa sulla supe rficie cellula re d ivisa in d ue sub unità.
L’azione d e l TSH sul tireocita a vviene principa lm ente a ttrave rso
l’attiva zione,m e d iata d a l recettore,d i Gsalfa e a l conseg ue nte a um e nto
d i AM Pciclico (AM Pc). Inoltre,a ll’aum e ntare d e lle concentrazioni
sieriche d i TSH,viene a ttiva ta a nche la proteina Gq con conseg ue nte
prod uzione d i inositolo trifosfa to (IP3) e d iacilg licerolo(DAG) m e d iato d a lla cascata d e lla fosfolipa si C.
L’attiva zione d e ll’ AM Pc è responsab ile d e l m a ntenim ento d e l d iffe renzia m e nto d e lle cellule tiroid ee,d e lla crescita e d ella prod uzione d e g li orm oni tiroid e i,reg ola nd o così anche la funzione d e lla g hiand ola . L’attiva zione d e lla fosfolipa si C è responsab ile d e l processo d i iod ina zione e secrezione d e g li orm oni tiroid e i (Fig.1-2).
Fig. 2 Attivazione d ella cascata d e g li inositoli fosfati
Il g ene d e l TSHr è localizza to sul b raccio lung o d e l crom osom a 14
(14q31) e si estend e pe r più d i 60Kb . E’ costituito d a 10 esoni (30-31). I prim i 9 e soni cod ificano pe r il d om inio extracellula re (398 a m inoacid i) contenente sequenze ricche d i le ucina e responsab ili d ell’interazione con
il TSH,m entre l’esone 10 (346 am inoacid i) cod ifica pe r i sette d om ini
Fig.3 : struttura d el recettore d el TSH
La reg ione prom oter d el g ene d el TSHr contiene siti di le g a m e sia pe r le proteine im plicate nella via d i reg ola zione d ell’ a d e nosina m onofosfa to
ciclico (AM Pc) sia pe r i fa ttori d i trascrizione tiroid e a (TTF1,PAX8 e
TTF2)(30). NH2
COOH intracellulare
SCO PO DELLO STU DIO
Q uesto la voro è stato cond otto con lo scopo d i stud iare d a un punto d i vista g e netico il g e ne d e l recettore d e l TSH in pa zienti affe tti d a
ipertireotropine m ia isola ta,id e ntificata in un g ruppo d i 57 sog g e tti
g iunti alla nostra osserva zione per l’occasiona le rilievo d i un a um e nto
d e l va lore d e l TSH,in presenza d i frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid ei
ne lla norm a .
Di questi sog g etti 17 a ppa rtene va no a 7 fa m iglie ne lle qua li l’ipe rtireotropine m ia isola ta e ra trasm essa in m od o a utosom ico
d om ina nte. Gli altri 40 sog g etti erano sporad ici,ossia,solo il proposito
e ra a ffe tto d a tale anom a lia.
PAZIEN TI
Il nostro g ruppo d i stud io com prend eva 57 sog g e tti: 38 d onne d i età m e d ia d i 37,5 a a ± 24 a a ; 11 uom ini d i età m e d ia d i 35,8 a a ± 8,4 a a ; 8 b a m b ini d i età m e d ia d i 10,7 a a ± 2,3 a a .
In 17/57 casi,d ive rsi m e m b ri d ella stessa fa m iglia e rano a ffetti d a
ipertireotropine m ia isola ta (Fa m iglia A,B,C ,D,E ,F e G). Veniva no
pe rciò d e finiti com e form e fa m iliari.
Tutti gli altri (40/57) veniva no d e finiti sporad ici,ovve ro,nessun a ltro
m e m b ro d e lla fa m iglia presentava il fenotipo d escritto.
In tutti i sog g e tti ,fa m iliari e sporad ici ,i va lori d e lle frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i erano ne l rang e d e lla norm a .
Il va lore d e l TSH in 5/57 era com preso tra 10 e 20 µU/L,in 52/57 va riava
d a 4 a 10 µU/L (Fig. 4). In tutti i sog g etti gli anticorpi anti-tireog lob ulina , a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH m isurati nel siero e rano ne g a tivi.
L’ecog rafia tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a li
d im e nsioni per sesso e d età,con a spe tto norm oecog e no.
N onostante l’assenza d i seg ni clinici ricond ucibili ad un qua d ro d i
pseud oipopa ratiroid ism o,in tutti i sog g e tti ve niva e seg uito un d osa g g io
d e l pa ratorm one che risultava nella norm a .
Inoltre,ve niva eseg uito il d osa g g io d i alcuni d e g li ind ici pe rife rici d i
ipotiroid ism o,qua li colesterolo totale ,colesterolo-HDL,triglicerid i,
SGO T,SGPT,g a m m aGT,LDH,CPK,risultato ne lla norm a in tutti i
40/57 sog g e tti ve niva no sottoposti al test d i stim olo con TRH ( e .v.). Il picco d e l TSH risultava proporziona le a l va lore b a sale d e l TSH ed e ra seg uito d a un a d e g ua to increm e nto d e lle frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i. Q uesto risultato sug g e riva che la m olecola d i TSH era b iolog icam e nte attiva .
.Fig.4. Concentrazioni sieriche di FT4, TSH, colesterolo, trigliceridi, enzimi epatici (alanina aminotransferasi and aspartato aminotransferasi),
_-glutammiltranspeptidasi(GGT), fosfatasi alcalina nel proposito della famiglia A, il figlio della proposita della famiglia A, il proposito della famiglia B Soggetti FT4 (9–22 pmol/litro) TSH (0.4–3.4 mU/litro) Colesterolo (<200 mg/dl) Trigliceridi (<160 mg/dl) GOT (5–45 U/litro) GPT (5–45 U/litro) GGT (5-39 U/litro) Fosfatasi Alcalina (90–260 U/litro) Famiglia A(a) Famiglia A(b) Famiglia B 10.7 11.7 12.7 13.4 5.2 8.6 200 210 163 60 87 179 20 16 15 15 18 11 12 10 8 120 100 90
GOT, Transaminasi glutammico ossalacetica; GPT, transaminasi glutammico piruvica.
In tutti i sog g etti ve niva eseg uito un prelievo d i sang ue pe rife rico per l’ana lisi g e ne tica d e l g ene d el recettore d e l TSH.
In 5/8 b a m b ini ve niva iniziata la terapia con L-Tiroxina a d osi sostitutive,
con norm a lizza zione d el va lore d e l TSH. N ei 3 b a m b ini non trattati,il
m onitorag g io sem estrale d ella funzione tiroid e a m ostrava che il va lore d e l TSH e d elle frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i rim a neva no costanti. N e i sog g etti ad ulti la terapia sostitutiva con L-Tiroxina veniva instaurata in 14/49. Dopo l’inizio d e lla terapia con L-Tiroxina si ottene va la norm a lizza zione d e l va lore d e l TSH.
N e i restanti sog g etti ad ulti non veniva instaurata terapia sostitutiva con L-Tiroxina e i va lori d i TSH e d elle frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid e i ve niva no controlla ti pe riod icam e nte.
FAM IGLIA A(Fig.5a)
La proposita d ella fa m iglia A è una d onna d i 47 a nni che era g iunta pe r la prim a volta a lla nostra osserva zione pe r “senso d i costrizione a l collo”. La pa ziente e ra na ta d a g e nitori consang uine i: il pa d re e ra d eced uto pe r
m a rasm a senile; la m a d re e ra una d onna d i 85 a nni,a ppa rentem ente non
a ffe tta d a tireopa tia.
N e l corso d e lla prim a visita l’esam e ob iettivo non m ostrava seg ni clinici d i ipotiroid ism o. Il d osa g g io d e g li orm oni tiroid e i m ostrava frazioni
lib e re nel rang e d e lla norm a ; il va lore d e l TSH era d i 18,9 µU/l. Gli
a nticorpi anti-tireog lob ulina ,a nti-tireoperossid a si e a nti-recettore d e l
TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,
d i norm a le volum e (10 m l),norm oecog e na e senza nod uli d istinti. La
pa ziente ve niva sottoposta a l test d i stim olo con TRH ( e .v.) prolung a to
pe r 4 ore. Il picco d el TSH,rag g iunto a 30 m inuti,risultava proporziona le
a l va lore b a sale (82 µU /l),e d e ra seg uito tra 120 e 180 m inuti da un
a d e g ua to increm e nto d elle frazioni libe re d e g li orm oni tiroid e i,supe riore a l 20% d e l loro va lore b a sale .
Inizialm ente,nel sospe tto d i una prob a b ile resistenza tiroid e a a l TSH,il
figlio d e lla pa ziente,un uom o d i 23 a nni,clinicam ente e utiroid e o,ve niva
sottoposto a lla m e d e sim a va lutazione m orfolog ica e funziona le tiroid e a . Il d osa g g io d e g li orm oni tiroid ei m ostrava frazioni lib ere ne l rang e d ella
norm a ; il va lore d e l TSH era d i 6,3 µU/l. Gli anticorpi anti-tireog lob ulina , a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d el TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (13m l),
norm oecog e na e senza nod uli d istinti. Il pa ziente ve niva sottoposto a l test d i stim olo con TRH ( e.v.) prolung a to per 4 ore. Il picco d el TSH,
rag g iunto a 30 m inuti,risultava proporziona le a l va lore b a sale (34,6
µU/l),e d e ra seg uito tra 120 e 180 m inuti da un a d e g ua to increm ento
d e lle frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid ei,superiore a l 20% d e l loro va lore b a sale .
La sud d etta va lutazione veniva successiva m e nte a lla rga ta a d a ltri m e m b ri d ella fa m iglia. La m a d re d e lla proposita presentava norm a li
va lori d e g li orm oni tiroid ei; il TSH era pa ri a 5,0 µU/l; gli anticorpi
anti-tireog lob ulina ,a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano
ne g a tivi.
U na nipote d e lla prob a nd a a veva norm a li va lori d e g li orm oni tiroid e i; il
TSH era pa ri a 5,0 µU/l; gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,a
nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano ne g a tivi. Il pa d re e la m a d re a ve va no un profilo tiroid eo ne lla norm a .
U n fratello d ella prob a nd a presentava un profilo tiroid eo norm a le . La figlia d i una cug ina d e lla prob a nd a a ve va una tiroid ite cronica
a utoim m une con ipotiroid ism o sub clinico (TSH = 5,0 µU/l).
In nessuno d e i m e m b ri d ella fa m iglia con ipe rtireotropine m ia isola ta ve niva instaurata la terapia con L-tiroxina . O g nuno d i loro ve niva sottoposto a follow-up sem estrale .
A d istanza d i 2 a nni d a lla prim a osserva zione,ne l corso d i un controllo d i
routine,la prob a nd a presentava un qua d ro d i ipotiroid ism o franco: le
frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid e i erano a i lim iti ba ssi d ella norm a ,il
TSH risultava pa ri a 61,0 µU/l. Gli anticorpi atireog lob ulina e a
nti-tireope rossid a si risultava no e leva ti (il titolo era pe r entram b i d i 1:6400 U /m l). L’ecog rafia tiroid e a m ostrava una g hiand ola d i norm a li d im e nsioni con a spe tto ipoecog e no tipico d e lla tiroid ite cronica a utoim m une. Veniva pe rtanto instaurata la terapia con L-Tiroxina a d osi sostitutive con norm a lizza zione d el va lore d e l TSH.
Fig.5
FAM IGLIA B(Fig.5b )
La proposita d ella fa m iglia B è una d onna d i 34 a nni,g iunta a lla nostra osserva zione per l’occasiona le rilievo d i ipe rtireotropine m ia isola ta. L’esam e ob iettivo non m ostrava seg ni clinici d i ipotiroid ism o. Il d osa g g io d e g li orm oni tiroid ei m ostrava frazioni lib e re nel rang e d e lla norm a ; il
va lore d el TSH era d i 8,5 µU/l. Gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,a
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (9 m l), norm oecog e na e senza nod uli d istinti. La pa ziente ve niva sottoposta a l test d i stim olo con TRH ( e.v.) prolung a to per 4 ore. Il picco d el TSH,
rag g iunto a 30 m inuti,risultava proporziona le a l va lore b a sale (42 µU /l),
e d e ra seg uito tra 120 e 180 m inuti da un a d e g ua to increm e nto d elle
frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid ei,supe riore a l 20% d e l loro va lore
b a sale .
La m a d re d e lla proposita,una d onna d i 60 a nni,clinicam e nte eutiroid e a ,
a veva frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i nel rang e d e lla norm a ; il va lore
d e l TSH era d i 6,0 µU/l. Gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,a
nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (7 m l),
norm oecog e na e senza nod uli d istinti.
Il pa d re e il fratello d e lla proposita presentava no un profilo tiroid eo norm a le .
Fig.5b
FAMIGLIA C
La proposita d ella fa m iglia C è una d onna d i 34 a nni,g iunta a lla nostra osserva zione per l’occasiona le rilievo d i ipe rtireotropine m ia isola ta. Il d osa g g io d e g li orm oni tiroid ei m ostrava frazioni lib e re ne l rang e d e lla
norm a ; il va lore d e l TSH era d i 8,2 µU /l. Gli a nticorpi anti-tireog lob ulina ,
a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d el TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (11 m l),
norm oecog e na e senza nod uli d istinti.
La m a d re d e lla proposita,una d onna d i 63 a nni,clinicam e nte eutiroid e a ,
a veva frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i nel rang e d e lla norm a ; il va lore
d e l TSH era d i 6,8 µU/l. Gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,a
nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (7 m l),
norm oecog e na e senza nod uli d istinti.
FAM IGLIA D
La proposita d e lla fa m iglia D è una d onna d i 23 a nni,g iunta a lla nostra osserva zione per l’occasiona le rilievo d i ipe rtireotropine m ia isola ta. Il d osa g g io d e g li orm oni tiroid ei m ostrava frazioni lib e re ne l rang e d e lla
norm a ; il va lore d e l TSH era d i 4,5 µU/l. Gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,
a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d el TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (11 m l),
norm oecog e na e senza nod uli d istinti. La pa ziente ve niva sottoposta a l test d i stim olo con TRH ( e.v.) prolung a to per 4 ore. Il picco d el TSH,
µU/l),e d e ra seg uito tra 120 e 180 m inuti da un a d e g ua to increm ento d e lle frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid ei,superiore a l 20% d e l loro va lore b a sale.
La m a d re d e lla proposita,una d onna d i 55 a nni,clinicam e nte eutiroid e a ,
a veva frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i nel rang e d e lla norm a ; il va lore
d e l TSH era d i 6,0 µU/l. Gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,a
nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia
tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e (7 m l),
norm oecog e na e senza nod uli d istinti.
FAMIGLIA E (Fig. 5c)
Il proposito d e lla fa m iglia E è un b a m b ino d i 13 a nni ,na to a term ine d a g e nitori non consang uinei. Alla na scita non presentava a lcun seg no o sintom o d i ipotiroid ism o e lo screening neona tale non m ostrava a lterazione d e i live lli d i TSH.
Il peso a lla na scita e ra d i 3.4 kg e l’altezza d i 50 cm . Il suo accrescim ento e il suo sviluppo psicofisico erano ne lla norm a .
All’età d i 13 a nni giung e va a lla nostra osserva zione senza una specifica m otiva zione. Veniva sottoposto a g li esa m i sierolog ici d a i qua li risultava
un qua d ro d i ipe rtireotropine m ia isola ta con TSH 6.6 m U /l (0.3-3.6) ,FT4
7.5 pm ol/l (7-16),FT3 3.4 pm ol/l (2.5-5-5), in a ssenza d i seg ni o sintom i d i
ipotiroid ism o.
L’ecog rafia tiroid e a m ostrava una g hiand ola in sed e,d i norm a le volum e
(7 m l),norm oecog ena e senza nod uli d istinti.
Veniva iniziata terapia con L-Tiroxina (50µg /d ie) che veniva e seg uita pe r un a nno. Sotto terapia con L-Tiroxina il TSH era 2.5 m U /l. Q ua nd o è torna to ne l nostro Dipa rtim e nto pe r eseg uire d ei controlli la terapia e ra
stata interrotta. Dopo tre m esi il TSH era 4.0 m U /l,FT-4 8.4 pm ol/l,FT3
4.8 pm ol/l.
IL suo pe so era d i 60 Kg e l’altezza 162cm (90°percentile ).
Dopo stim ola zione con TRH l’inna lza m e nto d ei livelli d i TSH risultava no e sag e rati rispetto a i suoi livelli ba sali e la prod uzione d i FT-3 era rid otta. La funzione d e lle pa ratiroid i era norm a le .
N on c’era storia d i fa m iliarità pe r ipotiroid ism o ne l pa d re e ne lla m a d re d e l proposito; il pa d re a veva norm a li live lli sierici d e lle frazioni lib e re d e g li orm oni tiroid e i (FT-4 10.1 pm ol/l;FT-3 4.8 pm ol/l). I livelli ba sali d i TSH erano 3.6 m U /l e non erano stati trova ti a nticorpi a nti-tiroid e ne l siero. La m a d re d el proposito a veva risultati d e lla funzione tiroid e a ne lla norm a .
L’unica sorella d el proposito a ve va nove a nni ed era clinicam e nte e utiroid e a .
Ave va frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid e i nella norm a (FT4 9pm
ol/l(7-16); FT3 4.3 pm ol/l(2.5-5.5)),m a i live lli d i TSH erano lieve m e nte sopra
d e i livelli norm a li (TSH 6.6m U /l). Gli anticorpi anti-tireog lob ulina ,a
nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano ne g a tivi. N on presentava seg ni o sintom i d i ipotiroid ism o. La sua a ltezza e ra d i 129 cm (50°pe rcentile ) e il suo pe so era d i 34.4 Kg .
Fig. 5c
FAM IGLIA F
La proposita è una d onna d i 31 a nni giunta a lla nostra a ttenzione per ipertireotropine m ia. I live lli d e lle frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid ei e rano nella norm a e il TSH b a sale le g g e rm ente sopra i lim iti supe riori
norm a li [TSH 8,7 m U /l (0.3-3.6); FT4 12 pm ol/l ( 7-16)]. Gli anticorpi
anti-tireog lob ulina ,a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d e l TSH erano
ne g a tivi. L’ecog rafia m ostrava una g hiand ola tiroid e a d i norm a li
d im e nsioni e norm oecog e na . Era stata trattata con LT4 per 10 a nni,d opo i
qua li era g iunta nel nostro Dipa rtim e nto. Dopo la sospe nsione d e lla
terapia pe r circa tre m esi,i livelli sierici d e g li orm oni tiroid e i risultava no i
seg ue nti: FT4 8.3 pm ol/l,FT3 4.2 pm ol/l e TSH 10.1 m U /l. Dopo test d i
stim olo con TRH la risposta d el TSH era stata e sag e rata rispe tto a i live lli b a sali d i TSH e la prod uzione d i FT3 e ra rid otta. La sua a ltezza e ra d i 162 cm e il peso e ra d i 59 kg .
La sorella d ella proposita a ve va ipertireotropine m ia isola ta (TSH 9.3 m U /l; FT4 8.8 pm ol/l; FT3 4.8 pm ol/l ). I g e nitori d e lla proposita e rano d eced uti e non erano d isponibili inform a zioni a rigua rd o.
FAM IGLIA G
Il proposito è un uom o d i 38 a nni giunto a lla nostra a ttenzione pe r ipertireotropine m ia.
I live lli d elle frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid ei erano norm a li,m e ntre il
va lore d el TSH era lieve m e nte a um e ntato: TSH 8.6 m U /l; FT4 8.8 pm ol/l(7-16); FT3 4.8 pm ol/l (2.5-5.5). Gli anticorpi anti-tireog lob ulina , a nti-tireope rossid a si e a nti-recettore d el TSH erano ne g a tivi. L’ecog rafia m ostrava una g hiand ola tiroid e a d i norm a li d im e nsioni e norm oecog e na . Dopo test d i stim olo con TRH la risposta d e l TSH era e sag e rata rispe tto a i live lli ba sali d i TSH e la prod uzione d i FT3 risultava rid otta. La sua a ltezza e ra d i 173 cm e il suo peso d i 78 kg .
Il pa d re a veva ipertireotropine m ia isola ta con livelli sierici d i TSH d i 7.8 m U /l e norm a li live lli d i FT4 e FT3. I d ue figli d el proposito a veva no test d e lla funzione tiroid e a ne lla norm a .
ESAM I DI LABO RATO RIO
Test d i la b ora torio d i funzione tiroid ea
I va lori d e lle frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid ei sono stati dosati tram ite
m e tod o RIA (FT4 RIA e FT3 RIA,Liso-pha se,La b oratori Bouty,M ilano,
Italia). Il TSH è stato d osato con m e tod o sensibile (sensitive -TSH ICM A,
Im m ulite 2000,Diag nostic Prod ucts Corp. Los Ang eles,CA). Il va lore d e l
TSH è stato m isurato a nche d opo d iluizioni prog ressive d el siero. Gli a nticorpi anti-tireog lob ulina e a nti-tireoperossid a si sono stati dosati tram ite d osa g g io im m unofluorim e trico (AIA-PACK Tg Ab /TPO Ab ,
Tosoh Corp,Tokyo Japa n). Gli anticorpi anti-recettore d e l TSH sono stati
d osati utilizza nd o un d osa g g io rad iorecettoriale com m e rciale (TRAk
hum a n,B.R.A.H.M .S. ,Berlino,Ge rm a nia).
ESAM I IN V IV O
Test d i stim olo con TRH
Il Te st d i stim olo con TRH è stato eseg uito utilizza nd o 100µg d i TRH
U CB. I sog g e tti sono stati sottoposti a prelievo b a sale pe r FT4,FT3 e TSH;
d opo l’iniezione end ove na d i 100µg d i TRH,il va lore d el TSH e d elle
frazioni lib ere d e g li orm oni tiroid e i è stato testato a 20’, 30’,
60’,120’,150’,180’ e 210 m inuti utilizza nd o il m etod o d i d osag g io g ià
Ecogra fia tiroid ea
L’esam e e c og rafico è stato eseg uito in tutti i 57 sog g etti,utilizza nd o un
a ppa recchio ecog rafico (Technos Esaote Biom e d ical) colle g a to a d un
trasd uttore line a re (7,5 M H z). I sog g e tti sono stati esa m ina ti in posizione
supina e con il collo ipe resteso. Il volum e tiroid eo è stato calcola to in b a se a lla form ula d e ll’ellissoid e d i rotazione: la rghezza (m m ) x lung hezza
(m m ) x profond ità (m m ) x 0,52 pe r og ni lob o = volum e (m l).
M ATERIALI E M ETO DI
Determ ina zione d ella sequenza d el gene d el recettore d el TSH
Il DN A g nom ico è stato estratto d a i linfociti pe rife rici utilizza nd o proced ure stand a rd (9). Pe r potere a m plificare l’intero esone 10 che cod ifica pe r la porzione carbossiterm ina le (che com prend e i sette seg m e nti transm e m b rana e le a nse intra e d extracellula ri) tram ite
Re a zione Polim erasica a Ca tena (PCR),questa porzione d el g ene d e l
TSHr è stata scom posta in d ue fram m enti(18). Gli altri esoni,d a ll’ 1 a l 9,
sono stati am plificati utilizza nd o prim e rs intronici. I prod otti d i PCR
sono stati purificati (Concert rapid PCR Purification System ,Life
Technolog ies,Inc., Grand Isla nd ,N Y). Il seque nzia m e nto d iretto è stato
e seg uito utilizza nd o Am pliTa q DN A polim e rasi,tram ite ABI Prism Big
d ye 310. I prod otti d i seque nza sono stati ana lizza ti con un sequenziatore
(m od e llo 310 A,PE Applied Biosystem ). Per conferm a re la presenza d elle
m utazioni d e l g e ne d e l TSHr,i seg m enti genici contene nti le m utazioni
sono stati sub clona ti in un ve trino d i espressione e la seque nza g e nica è stata ripetuta.
Costruzione ed espressione d el gene m uta to
Il g e ne d el TSHr m utato (L252P) è stato inserito ne l pla sm id e pSVL
tram ite m utag e ne si (Invitrog e n Life Technolog ies Ca rlsb a d ,CA).
L’accuratezza d el costrutto ricom b ina nte è stata ve rificata tram ite seque nzia m e nto d iretto.
Pe r l’espressione transitoria d el recettore selva g g io (wtTSHr) e d e l
recettore m utato,le cellule CO S-7 (cellule e m b riona li d i rene d i scim m ia)
sono state sem ina te a lla concentrazione d i 150.000 cellule pe r piastra d a 3 cm d i d iam e tro e fa tte crescere nel loro m e zzo d i coltura DM EM
a d d iziona to con siero b ovino fe tale a l 10% ,penicillina 100IU /m l,
streptom icina 100U I/m l,fung inzone 2,5 µg r/m l e sod io piruva to 1 m M .
Dopo 24 ore d i incub a zione a 37 °C in presenza d i CO2 a l 5% ,og ni piastra
è stata trasfettata con 250ng r d i DN A pla sm id ico utilizza nd o la tecnica d e l DEAE-Dexstrano e sottoposta a shock pe r 2 m inuti con DM SO a l 10% . Dopo 48 ore d a lla trasfe zione le cellule sono state utilizza te pe r m isurare la prod uzione d i AM Pc,per stud i d i leg a m e e d i ana lisi citofluorim e trica (FACS).
Tutti gli espe rim e nti sono stati eseg uiti in triplicato e i risultati sono e spressi com e la m e d ia ± d eviazione stand a rd d i un esperim e nto usato com e rife rim e nto.
Ana lisi citofluorim etrica (FACS)
Pe r la citofluorim etria,le cellule CO S-7,48 ore d opo la trasfezione sono
state rim osse d a lla piastra con EDTA 5m M e EGTA 5m M in N a Cl/Pi e
trasferite in tub i tipo fa lcon (2025,Fa lcon La b we re,Cocke ysville,M D,
U SA). In seg uito le cellule sono state la va te con N a Cl/Pi contene nte lo
0,1% d i BSA e centrifug a te 500 x g a 4°C pe r 3 m inuti e sottoposte a
protocollo d i pe rm e a b ilizza zione e non perm e a b ilizza zione. Le cellule non pe rm e a b ilizza te sono state incub a te a tem pe rature a m b iente pe r 30 m inuti con 200µl d i anticorpo m onoclona le d iretto contro il recettore d el TSH (BA8 d ona to d a lla d r.ssa Sa b ine Costag liola ) d iluito in N a Cl/Pi
contenente 0,1% d i BSA. Le cellule sottoposte a l trattam e nto d i
pe rm e a b ilizza zione sono state fissate con pa raform a ld e id e a l 2% in
N a Cl/Pi e in seg uito trattate per 30 m inuti con N a Cl/Pi contene nte lo 0,1%
d i BSA e 0,2% d i saponina (Sig m a Che m ical Co., St Louis,M O ,U SA);
ne lle successive fa si l’anticorpo è stato trattato con saponina con 0,2% . In
seg uito le cellule la va te con N a Cl/Pi e 0,1% d i BSA e incub a te a 4°C per 30 m inuti al b uio con un a nticorpo second a rio coniug a to con la fluoresceina
(g oa t antim ouse IGg ) (Becton Dickison a nd Co., Sa n Josè,CA,U SA)
d iluito 1:20 in N a Cl/Pi più BSA 0,1% contene nte 10 µg r/m l d i iod uro d i
propizio (PI) (Sig m a ). Lo iod uro d i propizio (PI) è stato usato pe r e vid e nziare ed esclud e re d a ll’ana lisi le cellule d a nne g g iate.
L’ana lisi citofluorim etrica è stata ottenuta utilizza nd o lo strum e nto FacSort (N e c ton Dickinson a nd Co) e quipa g g iato con un la ser ad a rgon pe r un’eccitazione d i 488 nm pe r riconoscere a nticorpi m onoclona li coniug a ti con fluoresceina 5-isotiociana to e con PI. La fluorescenza
e m essa d a lla fluoresceina e d a l PI d i og ni sing ola cellula sono state sepa rate e m isurate utilizza nd o l’ottico stand a rd d e l FacSort. E’ stato utilizza to il softwa re CELLQ U EST pe r acquisire e a na lizza re i d a ti. Sono state ana lizza te a lm e no 10.000 cellule.
Stud i d i lega m e
Lo stud io d i leg a m e 125I-bTSH al suo recettore è stato eseg uito sia pe r
d e term ina re il num e ro d i recettori espressi sulla supe rficie cellula re (Bm a x) sia per d e term ina re la costante d i affinità d el le g a m e (Kd ).
Le cellule CO S-7,48 h d opo la trasfe zione,sono state la va te con la
soluzione d i Hank’s in cui il cloruro d i sod io e ra stato sostituito con 280m M d i sucrosio pe r il m a ntenim ento d e ll’osm ola rità e contenente
0,2% d i alb um ina b ovina (BSA). In seg uito le cellule sono state incub a te
pe r 4 h a tem peratura a m b iente ne lla stessa soluzione tam pone
contenente il 2,5% d i la tte in polve re a b a sso contenuto d i grassi,80.000
cpm per piastra d i 125I-bTSH (BRAH M S,Be rlino,Germ a nia) a d ive rse
concentrazioni d i bTSH fred d o. Alla fine d e ll’incub a zione le cellule sono state la va te pe r 2 volte con lo stesso tam pone fred d o e solub ilizza te con N a O H 1M e la rad ioa ttività è stata contata con un contatore ?. L’ag g iunta d e l la tte a l tam pone è stata utile pe r rid urre il le g a m e a specifico d el TSH
m a rcato a lle cellule d i controllo,che non esprim ono il recettore,e d a lla
pla stica d elle piastre.
In queste cond izioni spe rim e ntali,il le g a m e non specifico d el rad ioa ttivo
(d e finito com e la rad ioa ttività le g a ta a lla pla stica d e lle piastre in presenza d i 100 m U /m l d i bTSH fred d o) a lle piastre contenenti le cellule d i
controllo trasfettate solo con pSVL,e ra pa rag ona b ile. Poiché non esiste
un criterio d i stand a rd izza zione d e lla b ioa ttività d e l b TSH, tutte le
concentrazioni d el TSH o d e l TSHr sono state e spresse in m U /m l, a ssum end o un rapporto stechiom e trico d i 1:1 pe r il le g a m e d el TSH al suo recettore.
Determ ina zione d ell’AM Pc
Pe r il d osa g g io d e ll’AM Pc extracellula re le cellule CO S-7,utilizza te pe r lo
stud io funziona le d e lla m utazione L252P,e le cellule JP09,utilizza te per il
sa g g io d e lla b ioa ttività d e lla m olecola d e l TSH,sono state la va te con un tam pone ipotonico Kreb s/Ring er Hepes b uffr (KRH) e pre-incub a te nello stesso tam pone pe r 30’ a 37°C; le cellule sono state successiva m e nte
incub a te pe r 1 h 37°C in presenza d i isob utilm e tilxa ntina (IBM X) 0,5 m M
(inibitore d e lla fosfod iesterasi) e d in a ssenza (b a sale ) o in presenza d i
TSH b ovino (b TSH) (Sig m a Che m ical Co),o d i TSH um a no ricom b ina nte
utilizza to com e stand a rd d i rife rim ento (Ge nzym e ) e TSH um a no purificato com e d escritto in preced enza . L’AM Pc extracellula re è stato
m isurato ne l soprana tante con un m e tod o RIA,utilizza nd o un a nticorpo
policlona le a nti-AM Pc com m e rciale e i risultati sono stati espressi in pm ol/pozze tto.
RISU LTATI
L’ana lisi g ene tica d e l g ene d e l recettore d e l TSH eseg uita ne i 40 pa zienti sporad ici affe tti d a ipertireotropine m ia isola ta non ha e vid e nziato la presenza d i alcuna a nom a lia.
L’ana lisi g ene tica,e seg uita ne i 17 sog g etti con ipertireotropine m ia isola ta
a c a rattere fa m iliare,ha e vid e nziato la presenza d i m utazioni ina ttiva nti
d e l TSHr in 12/17 sog g etti. Le m utazioni sono state id e ntificate nelle
fa m iglie A,B,E,F e G. N ella fa m iglia C e D non è stata id e ntificata
a lcuna m utazione d el TSHr.
Il sequenziam e nto d iretto d i tutti gli esoni d e l g ene d e l TSHr ha in m olti pa zienti evid e nziato la presenza d i qua ttro va rianti polim orfiche.
In 5/57 è stata id entificata una va riante a lle lica a carico d e ll’esone 1 (Pro 52Thr in cond izioni d i eterozig osi).
In 26/57 è stato id e ntificato un polim orfism o nell’esone 7 a carico d el
nucleotide 561 (AAC/AAT): in 24/26 il polim orfism o e ra om ozig ote,in
2/26 era e terozig ote. Q uesta sostituzione non m od ificava l’am inoacid o in posizione 187.
26/49 sog g e tti erano om ozig oti per un polim orfism o ne ll’esone 9 a c a rico d e l nucle otid e 855 (GCC/GCT). Q uesta sostituzione non m od ificava l’am inoacid o in posizione 285.
FAM IGLIA A
Il sequenziam e nto d iretto d e l g ene d e l recettore d e l TSH ha e vid e nziato la presenza d i una m utazione g ià d escritta in le tteratura (5) che consiste ne lla transversione d i una Citosina con una Gua nina a c a rico d e l nucleotide 484 (CCT/GCT) con conseg ue nte sostituzione d i una prolina con una a la nina in posizione 162 (P162A)(Fig.6). Q uesto resid uo è localizza to sulla porzione extracellula re d e l recettore.
L’ana lisi g e ne tica d e lla proposita ha m ostrato una m utazione ina ttiva nte d e l g e ne d e l TSHr in om ozig osi; ne l figlio e nella m a d re d e lla prob a nd a la m e d e sim a m utazione e ra in eterozig osi. N e ll’altro m e m b ro d e lla fa m iglia con ipe rtireotropine m ia isola ta la m utazione è a ssente.
Fig. 6
FAM IGLIA B
Il seque nzia m e nto d iretto d el g ene d e l recettore d e l TSH ha evid enziato la presenza d i una m utazione non a ncora d escritta in le tteratura che consiste ne lla sostituzione d i una le ucina con una prolina in posizione 252 (L252P)(Fig.7). La le ucina in posizione 252 è un resid uo a ltam e nte conserva to tra i recettori glicoproteici.
L’ana lisi ge ne tica d e lla proposita e d e lla figlia ha m ostrato una m utazione ina ttiva nte d e l g ene d e l TSHr in e terozig osi.
Fig. 7
Caratteristiche funzionali d ella m utazione L252P d el TSHr
Le caratteristiche funziona li d e l recettore m utato L252P sono state stud iate tram ite espressione transitoria in cellule CO S-7. Com e controllo, sono state utilizza te cellule trasfe ttate con il recettore selva g g io (wtTSHr) e cellule trasfettate con il vettore pSVL.
Ana lisi citofluorim etrica (FACS): l’ana lisi citofluorim etrica,e seg uita
utilizza nd o un a nticorpo m onoclona le (BA8) d iretto contro il TSHr,ha
e vid e nziato un b a sso live llo d ’espressione d el recettore m utato L252P sulla supe rficie cellula re. Dopo pe rm e a b ilizza zione d elle cellule con
saponina ,il recettore m utato è stato localizza to a ll’interno d ella
cellula (Fig. 8) sug g e rend o che la proteina è presente a ll’interno d e lla cellula .
Fig. 8
Stud i d i lega m e 125I-b TSH Pe r m isurare il num e ro totale d i recettori
e spressi sulla superficie d e lle cellule transfe ttate con il recettore m utato L252P (Bm a x) e la costante d i d issociazione (Kd ) sono stati eseg uiti stud i d i le g a m e 125I-bTSH.
Il recettore m utato ha una b a ssa c a pacità d i leg a m e (0,05 ± 0,001 m U /m l) rispetto a quella d e l recettore selva g g io (0,21 ± 0,04 m U /m l),confe rm a nd o così il suo b a sso live llo d ’espressione sulla supe rficie cellula re. La costante d i d issociazione (Kd ) d el recettore m utato è sig nificativa m e nte m inore d i quella d el recettore selva g g io (rispe ttiva m e nte 0,46 ± 0,2 vs 0,9 ± 0,20 m U /m l) (Fig.9).
Fig. 9
Ca sca ta d ell’AMPc: Per la d e term ina zione d e ll’AM Pc b a sale,le cellule CO S-7 sono state trasfettate utilizza nd o 250ng per piastra d i DN A d el recettore wt e d e l recettore m utato L252P. Le cellule trasfettate con il
recettore wt m ostrano un a um e nto d e ll’AM Pc b a sale ,in a ssenza d i
a g onista,d i 5 volte rispe tto a lle cellule trasfe ttate con il solo pSVL
(rispettiva m e nte 205 ± 13 pm ol/piastra; 30 ± 8 pm ol/piastra). Q ue sto risultato d im ostra che il wtTSHr ha un’attività costitutiva per l’AM Pc. Le cellule trasfe ttate con il recettore m utato L252P m ostrano livelli più
b a ssi d i AM Pc b a sale rispe tto a l recettore selva g g io d e l TSH,m a più a lti
rispetto a quella d elle cellule trasfe ttate con il solo ve ttore pSVL (54 ± 13 pm ol/piastra).
La risposta b iolog ica al b TSH nelle cellule trasfe ttate con il recettore selva g g io d e l TSH e con il recettore m utato L252P è stata va lutata in term ini d i accum ulo d i AM Pc. Q ua nd o testate con concentrazioni
m ostrano un increm ento d e lla prod uzione d i AM Pc,rag g iung e nd o il 50%
d e lla d ose efficace alla concentrazione d i 0,27 ± 0,02 m U /m l (EC50) e d un
pla tea u a lla concentrazione d i bTSH d i 10 m U /m l (Fig.10). Le cellule trasfettate con il recettore m utato L252P m ostrano una scarsa risposta in term ini d i prod uzione d i AM Pc d opo stim olo con b TSH (Fig.10).
Fig. 10
FAM IGLIA E
Il seque nzia m e nto d iretto d el g e ne d e l recettore d e l TSH ha e vid enziato la presenza d i una nuova inserzione .
Si tratta d i una d uplicazione d i 4b p in posizione 41 (41TGCAins) che d e term ina la crea zione d i uno stop prem a turo a livello d e l cod one 62 Q 8fsX62 che provoca la form a zione d i una proteina troncata.
Il proposito e ra eterozig ote pe r tale inserzione . Il pa d re d el proposito e la sorella erano e terozig oti pe r la stessa a nom a lia. La m a d re invece m ostrava solo il recettore d e l TSH d i tipo selva g g io(wrTSH)(Fig.11).
Fig.11
FAM IGLIA F
Il seque nzia m e nto d iretto d e l g e ne pe r il recettore d el TSH rive la la
presenza d i una sola a nom a lia,una m utazione ina ttiva nte GAC/AAC che
rigua rd a il resid uo Asp in posizione 410,che è sostituito d a un Asn
La proposita e ra om ozig ote pe r questa m utazione. La sorella e terozig ote pe r la stessa a nom a lia.
FAM IGLIA G
Il seque nzia m e nto d iretto d el g e ne pe r il recettore d el TSH rive la la presenza d i una m utazione ina ttiva nte d i tipo CCT/GCT che rigua rd a il resid uo d i prolina in posizione 162 che è rim piazza to d a una a la nina . Era inoltre presente un polim orfism o d i CCC/ACC che colpiva la prolina in posizione 52 (P52T). Sia il proposito che il pa d re e rano eterozig ote pe r la m utazione. I 2 figli d el proposito presentava no solo sequenze d el recettore d e l TSH tipo selva g g io (wrTSH).
DISCU SSIO N E
L’ipotiroid ism o sub clinico è una cond izione in cui si riscontra un inna lza m e nto d e i live lli sierici d i TSH associato a livelli d i FT4 e FT3 ne lla norm a (1).
La Tiroid ite Cronica Autoim m une è la più freque nte causa d i ipotiroid ism o sub clinico nei sog g e tti ad ulti che a b itano in a ree a d a d e g ua to a pporto iod ico e g li ele m enti d iag nostici che caratterizza no que sta pa tolog ia sono la presenza d i anticorpi rivolti verso a ntige ni
tiroid e i com e g li anticorpi anti-tireog lob ulina ,a tireope rossid a si e a
nti-rece ttore d e l TSH. All’ ecog rafia si evid e nzia,inoltre,la presenza d i un
a spe tto d iffusam e nte ipoecog e no,tipico d e lle form e a d e ziolog ia
a utoim m une (2).
Tuttavia sono state d escritte a nche d e lle rare form e d i Tiroid ite Cronica Autoim m une d e finite “Siero-ne g a tive ” pe r l’assenza d i seg ni d i
a utoim m unità um orale (2),che sono sospe ttate sulla b a se d el riscontro d i
un a spetto ipoecog e no a ll’ecog rafia e che possono e ssere d iag nosticate,
e ventua lm e nte,a nche a ttraverso esam e c itolog ico d e ll’ag oa spirato d e lla
g hiand ola tiroid e a , d a l qua le risulti la presenza d i infiltrato
infiam m a torio(20-21).
La form a Autoim m une d i ipotiroid ism o sub clinico va com unque d iffe renziata d a lla rara cond izione clinica cong enita chiam a ta Resistenza tiroid e a a l TSH (3).
La Resistenza tiroid e a a l TSH è una sind rom e in cui la tiroid e m ostra una rid otta sensibilità a ll’azione d el TSH b iolog icam e nte a ttivo che può essere d i grad o va riab ile e può e ssere d e finita com e “ipertireotropine m ia isola ta”.
Q uesta cond izione può essere d ovuta a d a nom a lie nel recettore d el
TSH(5-11),a d un d ifetto a live llo d ella proteina Gs-alfa (com e ne llo
pseud oipopa ratiroid ism o d i tipo 1)(22),o a d e ve ntua li anom a lie a live llo
d e l fa ttore d i trascrizione PAX-8. Q ue sta cond izione,com e a b b iam o
potuto riscontrare a nche nei nostri stud i clinici,può conseg uire a d una
m od a lità d i trasm issione ered itaria d i tipo a utosom ico d om ina nte.
Lo scopo d el nostro la voro è stato que llo d i stud iare la preva lenza d i m utazioni ina ttiva nti d el g e ne d e l recettore d e l TSH in una popola zione
d i 57 sog g e tti con ipe rtireotropine m ia isola ta,d i cui 17 fa m iliari e 40
sporad ici.
Tutti i 57 sog g e tti,38 d onne,11 uom ini e 8 b a m b ini,sono stati sottoposti
a l sequenziam e nto d iretto d e ll’intero g ene d e l recettore d e l TSH.
L’ana lisi ge ne tica ha id e ntificato qua ttro m utazioni ina ttiva nti del recettore d el TSH in 12/17 d e i sog g etti affe tti d a ipe rtireotropine m ia isola ta a carattere fa m iliare.
N e lla fa m iglia A e G è stata id e ntificata la m utazione ina ttiva nte P162A (Fig. 6).
Le caratteristiche funziona li d e lla m utazione P162A sono state d escritte in preced enza d a d e Roux(6). Da g li stud i funziona li em erge che il recettore
in vitro in cellule eucariote,pa ri ad 1/10 d i que lla d e l recettore selva g g io.
Inoltre,g li stud i d i le g a m e e vid e nziano che il recettore m utato ha una
rid otta e spressione sulla superficie cellula re.
La m utazione P162A è stata d escritta a nche d a a ltri autori (4-10) e a d
e sem pio nel la voro d i Re fe toff (5),d ue m e m b ri d e lla stessa fa m iglia
presentava no la m e d e sim a m utazione in e terozig osi. La m a d re a ve va un
ipotiroid ism o seve ro (TSH = 99 µU/m l),m e ntre nel figlio il va lore d e l
TSH era sug g estivo d i un ipotiroid ism o lieve (14 µU/m l). Q uind i la stessa m utazione era responsab ile d i un fenotipo d i d ive rsa g ravità.
N e i nostri pa zienti portatori d e lla m utazione i va lori d i TSH erano
rispettiva m e nte 18,9 µU/m l ne lla proposita e 6.3 µU/m l ne l figlio.
E’ quind i ve rosim ile che l’espressione d e l fe notipo,in que sti ed a ltri
sog g e tti,possa e ssere m od ula ta d a a ltri fa ttori,com e a d esem pio la
funzione d i altre proteine im plicate nella trasd uzione d el seg na le,o
l’interferenza d i fa ttori am b ientali,qua li l’apporto iod ico.
U n a spetto peculiare d e lla proposita d e lla fa m iglia A è che ne l corso d i
uno d ei controlli annua li,d opo circa 2 a nni d a lla prim a osserva zione e in
a ssenza d i terapia con L-Tiroxina ,la pa ziente ha presentato un qua d ro d i
franco ipotiroid ism o (TSH = 60 µU/m l) in concom itanza con la com pa rsa d i anticorpi anti-tireog lob ulina e a nti-tireope rossid a si positivi ad a lto
titolo. Inoltre,l’ecog rafia tiroid e a m ostrava una g hiand ola d i norm a li
d im e nsioni,m a con un a spetto ecog rafico ipoecog eno,tipico d ella
tiroid ite a utoim m une,chiaram e nte d ive rso rispetto a que llo d ella prim a
La pa ziente inoltre rife riva la com pa rsa d i astenia,d ifficoltà ne lla concentrazione e stipsi. All’esam e ob iettivo la cute a ppa riva secca. La
pa ziente è stata pe rtanto trattata con L-Tiroxina a d osi sostitutive,con
norm a lizza zione d e l va lore d e l TSH.
N oi riteniam o che l’associazione tra m utazioni o polim orfism i d e l recettore d e l TSH e lo sviluppo d i tiroid ite a utoim m une sia un evento d e l tutto occasiona le; tuttavia in pa ssato è stato proposto che un recettore m od ificato potreb b e essere im plicato ne ll’inizio d el processo
a utoim m une tiroid e o,m a in rea ltà que sto fe nom eno non è m a i stato
d im ostrato (9). Infa tti,a lcune va rianti alle liche d e l recettore d e l TSH sono
state d escritte,a d e sem pio,in pa zienti affe tti d a M orbo d i Ba sed ow, a ltra m a la ttia a c a rattere a utoim m une . Tuttavia la preva lenza d i que ste va rianti alle liche non è d iffe rente d a que lla riscontrata nella popola zione norm a le d i controllo non a ffe tta d a pa tolog ia a utoim m une (17).
N e lla fa m iglia B a b b iam o id entificato una m utazione ina ttiva nte d e l g e ne d e l recettore d e l TSH m a i d e scritta in letteratura.
La nuova m utazione d a noi id e ntificata,la L252P,è stata stud iata a nche
d a l punto d i vista funziona le.
In pa rticola re la FACS a na lisi ha e vid e nzia to,d opo espressione in cellule
e ucariote,un b a sso livello d ’espressione d e l recettore m utato L252P sulla
supe rficie cellula re. Dopo perm e a b ilizza zione d elle cellule con saponina , il recettore m utato è stato localizza to a ll’interno d e lla cellula . Gli stud i d i
le g a m e con 125-I ha nno confe rm a to che il recettore m utato ha un b a sso
Pe r tali m otivi le cellule trasfe ttate con il recettore m utato L252P m ostrano una scarsa risposta in term ini d i prod uzione d i AM Pc d opo stim olo con concentrazioni crescenti di bTSH (Fig.10).
Il com portam e nto funziona le d i questa m utazione in vitro non d ifferisce d a que llo g ià d escritto in letteratura pe r altre m utazioni ina ttiva nti del g e ne d e l TSHr ed è responsab ile d el fenotipo osserva to.
In pa rticola re qua nd o la m utazione ina ttiva nte è presente in eterozig osi
sem plice,il fenotipo che ne d e riva è que llo d i una resistenza pa rziale a l
TSH d i tipo d om ina nte; in a ltri term ini,nonostante la coe sistenza d e l
recettore selva g g io d el TSH e d el recettore m utato, tale a nom a lia si
e sprim e in og ni m od o con il qua d ro d e ll’ipe rtireotropine m ia,seppur in
form a lieve o m od erata.
Il m eccanism o m olecola re che può g iustificare que sto com portam e nto d a
pa rte d e lla m utazione, non è a ncora d e l tutto chiaro. L’ipotesi più
accred itata è che il recettore m utato eserciti un e ffe tto “d om ina nte ne g a tivo” sul recettore selva g g io d e l TSH che porta a sua volta a d una rid otta e spressione d e l recettore stesso sulla supe rficie cellula re.
N e lla fa m iglia E è stata trova ta una d uplicazione 4b p in posizione 41 (41TGCAins) che era responsab ile d e llo stop prem a turo ne l cod one 62 Q 8fsX62 (Fig.11). In questo caso l’inserzione d eterm ina va la form a zione d i una proteina troncata con incapacità funziona le .
N e lla fa m iglia F è stata riscontrata una m utazione ina ttiva nte il g ene d e l
recettore d e l TSH g ià d e scritta in le tteratura,D410N (6). Gli stud i
funziona li sulla m utazione D410N m ostrava no che il recettore m utato
d i trasd uzione d el se g na le. Ciò ind ica che,in questo tipo d i m utazione,il d ife tto è pa rziale.
In pa rticola re la m utazione D410N è stata d e scritta in un neona to con ipotiroid ism o cong enito che presentava una g hiand ola tiroid e a in sed e, lieve m e nte ing rand ita. Q uesta m utazione e ra presente in form a e terozig ote.
Le m utazioni id entificate nel nostro g ruppo d i stud io sono tutte fa m iliari, in a ltre pa role presenti in d ue o più m em b ri d i una stessa fa m iglia.
Q uesto concord a con i d a ti riportati in le tteratura,ne i qua li tutte le
m utazioni ina ttiva nti de l g e ne d e l TSHr ad og g i d escritte sono state id e ntificate in m e m b ri d i una stessa fa m iglia(5-11).
In letteratura sono d escritte 16 fa m iglie con Re sistenza tiroid e a a l TSH d ovuta a m utazioni ina ttiva nti d e l g ene d e l TSHr ed in pa rticola re Alb e rti (11) ha recentem e nte d e scritto un’ele va ta preva lenza d i m utazioni ina ttiva nti de l TSHr in 10 b a m b ini affe tti d a ipotiroid ism o cong e nito a ppa rtenenti a 4 fa m iglie. In 4 b a m b ini erano presenti m utazioni ina ttiva nti il recettore d el TSH e in questi casi anche il pa d re o la m a d re a veva no la stessa a nom a lia. In un caso fa m iliare sono state id e ntificate d ue m utazioni in e terozig osi com posta; ne i restanti 9 casi le m utazioni e rano in eterozig osi sem plice.
N e lla nostra casistica d i pa zienti nessun sog g etto,a d eccezione d e l
proposito d e lla fa m iglia E,è stato id entificato a llo screening ne ona tale
pe r l’ipotiroid ism o cong enito,perché na to prim a d e ll’introd uzione d i
que sta ind a g ine che risale a g li anni ’80. Com unque,un a spe tto
pa rte d e i casi d i ipe rtireotropine m ia isola ta può non essere d iag nosticata a llo screening neona tale pe r l’ipotiroid ism o cong enito.
N e i la b oratori d ei centri d i scree ning ,infa tti,i ne ona ti affetti da
ipotiroid ism o cong e nito sono id e ntificati qua nd o a lla na scita il va lore d e l
TSH risulta m a g g iore a 15-20 µU/m l. In que sti pa zienti,a c a usa d e l lieve
d ife tto,il sistem a d i d osag g io d e l TSH sierico può non risultare
sufficientem e nte sensibile.
U n’ altra im portante osserva zione è che ne lle fa m iglie C e D d ue m e m b ri
d i og nuna ,rispe ttiva m e nte m a d re e figlia,presentava no un qua d ro d i
ipertireotropine m ia isola ta,m a l’ana lisi g e ne tica d el TSHr non ha
id e ntificato m utazioni ina ttiva nti del TSHr.
In letteratura sono d escritti altri casi fa m iliari nei qua li d iversi m e m b ri d i
una stessa fa m iglia ha nno una ipertireotropine m ia isola ta,in a ssenza d i
m utazioni ina ttiva nti d el g e ne d e l TSHr o d i alterazioni a carico d ella proteina Gsalfa .
In pa rticola re ne l la voro d i Xie e t al.(26) sono state d escritte tre fa m iglie con ipe rtireotropine m ia isola ta nelle qua li l’ana lisi g enetica d el g ene d el TSHr non ha e vid enziato a lcuna m utazione ina ttiva nte d e l TSHr.
N e l nostro la voro a b b iam o a nche d e scritto 40 casi sporad ici d i ipertireotropine m ia isola ta ne i qua li l’ana lisi g enetica d el g ene d e l TSHr non ha id e ntificato a lcuna m utazione.
L’ ipotesi sul possibile m eccanism o responsab ile d i questi qua d ri d i
ipertireotropine m ia isola ta,sia sporad ica che fa m iliare,non è chiara.
Consid e rand o i preced e nti d a ti presenti in le tteratura e quelli presenti nel
recettore d e l TSH rappresentino,in a ssenza d i autoim m unità,un raro e vento nella pa tog e ne si d e ll’ipotiroid ism o sub clinico in form a sporad ica. E’ pe rciò consiglia b ile che le ind a g ini gene tiche per lo stud io d e l recettore d e l TSH siano lim itate a lle form e d i ipotiroid ism o a carattere fa m iliare. Da l punto d i vista d e lla pratica clinica è necessario tuttavia e sclud e re che l’ipe rtireotropine m ia isola ta sia conseg ue nte a ll’assunzione d i fa rm aci pe rchè a d esem pio a lcuni pa zienti in terapia fa rm acolog ia con litio o a m iod a rone possono a ve re un qua d ro d i ipe rtireotropine m ia isola ta. Tutte le form e d i ipe rtireotropine m ia isola ta d e vono poi essere d istinte d a que lle form e d i ipotiroid ism o lieve d ovute a d un’alterazione d ella b ioa ttività d e lla m olecola d el TSH. Anche in que sti casi il fenotipo sarà
caratterizza to d a un increm ento d e l va lore d e l TSH,la cui entità
d ipend e rà d a l g rad o d i b ioina ttività d e lla m olecola d e l TSH (b ioa ttività rid otta o a ssente)(32-36).
Il test d i stim olo con TRH può e ssere utilizza to com e m etod o d i va lutazione d ella b ioa ttività d e l TSH in vivo.
Altri casi d i ipe rtireotropine m ia isola ta non d ovuti a m utazioni ina ttiva nti de l g e ne d el TSHr possono e ssere in rea ltà form e d i tiroid ite a utoim m une in a ssenza d i seg ni bioum orali ed ecog rafici d i a utoim m unità tiroid e a (2). In questi casi è utile seg uire il pa ziente ne l tem po poiché è prob a b ile che se il m eccanism o è a utoim m une, l’ipotiroid ism o è d e stina to a d e volve re ve rso una form a più g rave ,con la com pa rsa d i anticorpi anti-tireog lob ulina e a nti-tireope rossid a si.
Il pa ziente a ffe tto d a ipotiroid ism o sub clinico è solitam e nte a sintom a tico, m a a ttente ind a g ini ha nno d im ostrato com e queste a lterazioni bioum orali
correlino con lo sviluppo d i com plicanze che ha nno ripercussioni sulla
qua lità d e lla vita,le capacità cog nitive ,i livelli d i lipid i,il ritm o e la
funziona lità card iaca,la m ine ralizza zione d e ll’osso e il processo d i
a terog e nesi(1).In pa rticola re,l’ipotiroid ism o presente in età ne ona tale o
ne ll’ infa nzia,a nche se lieve , può essere causa d i alterazioni
ne uropsicolog iche o a lterazioni d ella crescita som a tica.
Pe r qua nto rigua rd a la sintom a tolog ia d e i pa zienti stud iati in questo la voro non sono state riscontrate anom a lie cliniche im portanti.
Alcuni autori sug g e riscono che pa zienti affe tti da ipotiroid ism o a nche lieve possano sviluppa re a lterazioni m e tab oliche qua li l’ increm ento d e l
colesterolo totale,d el colesterolo-LDL,d e i triglicerid i,d ell’apoproteina
A1 (ApoA1),d ell’Apoproteina B (ApoB),d e lla liporpoteina (a ),
increm e nto d ei livelli sierici d i m iog lob ina ,un eccesso d i prod uzione d i
acid o la ttico d urante l’esercizio fisico(1-2).
In tutti i nostri 57 sog g etti affe tti d a ipe rtireotropine m ia isola ta a b b iam o e seg uito un d osa g g io d i alcuni d e g li ind ici pe riferici d i ipotiroid ism o:
profilo lipid ico com ple to (cole sterolo totale,LDL,HDL,triglicerid i),
fe rritina ,prove d i funzione epa tica (SGO T,SGPT),LDH (Fig. 4). In tutti i
sog g e tti i va lori erano nella norm a ,sug g e rend o che l’ipotiroid ism o a ve va
scarsi effe tti a live llo m etab olico.
U n netto increm e nto d el va lore d e l cole sterolo totale e d ei triglicerid i è
stato osserva to sola m e nte nella proposita d ella fa m iglia A,in
concom itanza d e ll’ insorgenza d i ipotiroid ism o franco d opo lo sviluppo d e lla tiroid ite a utoim m une.
CO N CLU SIO N I
In 12/17 pa zienti affetti d a ipertireotropine m ia isola ta a carattere fa m iliare (Fa m iglia A,B,E,F e G) l’ana lisi g e netica d e l g ene d e l recettore d e l TSH ha id e ntificato la presenza d i qua ttro m utazioni ina ttiva nti del recettore d el TSH: due d i queste g ià d e scritte in le tteratura ( P162A, D410N ) e d ue d escritte per la prim a volta e stud iate a nche d a l punto d i
vista funziona le (Q 8fsX62,L252P).
U n sog g e tto con m utazione ina ttiva nte d el TSHr ha sviluppa to, in
seg uito,una tiroid ite cronica autoim m une con ipotiroid ism o franco.
N e lle fa m iglie C e D e nei rim a ne nti 40/57 sog g e tti con
ipertireotropine m ia sporad ica,l’ana lisi g enetica d e l g e ne d e l TSHr è
risultata ne g a tiva pe r m utazioni ina ttiva nti.
Rim a ne a ncora d a chiarire se i casi d i ipe rtireotropine m ia isola ta nei qua li l’ana lisi ge ne tica ha escluso m utazioni ina ttiva nti de l g ene d el TSHr, rappresentino d e lle form e d i tiroid ite a utoim m une sierone g a tive o se l’ipe rtireotropine m ia isola ta sia l’espressione d i un d ifetto g e ne tico a carico d i altri ge ni. Q ue sto sarà a rgom ento d i stud i futuri.
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