Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed Agro-ambientali
CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN PRODUZIONI
AGROALIMENTARI E GESTIONE DEGLI AGROECOSISTEMI
L’infiorescenza ligulata di Helianthus × multiflorus varietà
“Soleil d’Or” è correlata all’espressione ectopica di un gene
CYCLOIDEA caratterizzato dall’inserzione di un trasposone
Relatori:
Prof. Andrea Cavallini
Prof. Claudio Pugliesi
Correlatore:
Prof. Piero Picciarelli
Candidato:
Alessandro Marino
Anno accademico 2016/2017Indice
Riassunto 5
1. Introduzione 7
1.1 La famiglia delle Asteraceae 7
1.2 I fattori di trascrizione della famiglia TCP 11 1.3 L’elemento trasponibile CACTA responsabile
delle mutazioni Chry2 e turf 15
1.4 L’ibrido interspecifico Helianthus × multiflorus 23
2. Materiali e metodi 28
2.1 Materiale vegetale e condizioni di crescita 28 2.2 Analisi morfologica dell’infiorescenza in
Helianthus × multiflorus 28
2.3 Estrazione del DNA e isolamento di geni CYC da Helianthus decapetalus e
Helianthus × multiflorus 29
2.4 Analisi delle sequenze e analisi filogenetiche 32 2.5 Analisi dell’espressione genica mediante real
time RT-PCR (qPCR) 33
2.6 Analisi statistiche 35
3. Risultati e discussione 37
3.1 Analisi morfologica degli organi fiorali di
3.2 Analisi delle sequenze e analisi filogenetiche dei geni CYC2c di Helianthus decapetalus
e Heliantus × multiflorus 39
3.3 In Helianthus × multiflorus il gene CYC2c è espresso ectopicamente in corolle dei fiori
del disco modificati in fiori “ray-like” 62
4. Conclusioni 64
5. Bibliografia 66
6. Supplementare 78
Riassunto
I geni del clade CYCLOIDEA (CYC)/TEOSINTE BRANCHED1 (TB1) sono fattori di trascrizione (FT) specifici delle piante, appartenenti alla famiglia TCP. L’acronimo TCP deriva dai tre geni della famiglia isolati inizialmente: TB1 in Zea mays, CYC in Antirrhinum majus e PROLIFERATING CELL FACTOR1 e 2 (PCF1 e PCF2) in Oryza sativa. Dal clade CYC/TB1, in seguito ad una serie di eventi di duplicazione e successiva diversificazione di espressione, si sono evoluti i subcladi CYC1, CYC2 e CYC3. I geni CYC1 e CYC3 regolano lo sviluppo delle gemme ascellari (ad esempio TB1), i geni CYC2 controllano l’accrescimento del meristema fiorale e la simmetria bilaterale. Recentemente è stato scoperto che la simmetria dei fiori del raggio e del disco in Helianthus annuus è regolata essenzialmente dall’attività del gene HaCYC2c, uno dei dieci geni CYC/TB1 presenti nel genoma di girasole. Studi su questa specie hanno dimostrato che il gene HaCYC2c è espresso in ovari e petali dei fiori del raggio, ma non in fiori del disco, determinando così lo sviluppo di un’infiorescenza di tipo raggiato caratteristica del genere. Quando il gene HaCYC2c è espresso ectopicamente, i fiori del disco si trasformano da attinomorfi a zigomorfi, e l’infiorescenza assume la forma ligulata, simile ad un crisantemo ornamentale (mutanti dbl e Chry2).
Una specie del genere Helianthus di particolare interesse per lo studio del ruolo dei geni CYC2 nel determinare l’architettura dell’infiorescenza è Helianthus × multiflorus. Lo studio è stato effettuato sulla varietà “Soleil d’Or”, una varietà commerciale con infiorescenza ligulata, che presenta fiori del disco trasformati in fiori con caratteristiche molto simili ai fiori del raggio (“ray-like”). In
tale studio sono stati identificati i geni CYC2 di una accessione diploide (2n = 2x = 34) di Helianthus decapetalus (HdCYC2c) e dell’ibrido interspecifico triploide (2n = 3x = 51) di H. × multiflorus (H×mCYC2cA e H×mCYC2cB). H. × multiflorus si è originato da cellule uovo non ridotte di H. decapetalus fecondate da gameti maschili aploidi di H. annuus. Le analisi delle sequenze dei prodotti amplificati mediante PCR di H. × multiflorus mostrano identità più elevata e minori “gaps” con H. decapetalus che non con H. annuus. L’analisi filogenetica colloca HdCYC2c e H×mCYC2c in un subclade di CYC2 con un livello di identità superiore ad HaCYC2c. L’analisi dei prodotti di PCR ottenuti da DNA genomico supportano l’ipotesi che l’allele del parentale H. annuus possa aver subito delezioni o ampi riarrangiamenti genici. Nella regione 5' del promotore del gene H×mCYC2cB di H. × multiflorus è stata identificata un’inserzione di 865 pb, riconducibile ad un elemento trasponibile (ET) troncato, facente parte della superfamiglia CACTA. Questa inserzione a monte della regione codificante di H×mCYC2cB determina, molto probabilmente, l’espressione ectopica del gene e il mutamento di fiori del disco da attinomorfi a zigomorfi, generando un’infiorescenza ligulata atipica nel genere Helianthus.
1. Introduzione
1.1 La famiglia delle Asteraceae
Le Asteraceae sono una famiglia molto numerosa, costituita all’incirca da 1.600 generi e 25.000 specie, distribuite in tutte le parti del mondo, in areali con aspetti pedoclimatici molto differenti tra loro (Funk et al., 2005; Barker et al., 2008; Tähtiharju et al., 2012; Panero et al., 2014; Bello et al., 2017).
Vi appartengono molte specie spontanee, medicinali e coltivate come orticole, ornamentali o per la produzione di olio. La morfologia degli organi vegetativi è molto varia, rispecchiando anche la diversità di ambienti in cui le specie di questa famiglia si sono adattate. Si tratta di piante in gran parte erbacee (poche le arbustive o le arboree), con foglie in genere semplici, per lo più alterne o in rosetta basale. I fiori, tipicamente riuniti in infiorescenze a capolino, simulano un unico fiore (pseudanzio), accompagnato alla base da un involucro con l’aspetto caliciforme, formato da brattee. I capolini possono essere solitari o riuniti in infiorescenze composte. Nel singolo fiore il calice può essere ridotto, assente o sostituito da un pappo, organo piumoso adatto alla dispersione anemocora dei frutti. La corolla è gamopetala, di due tipi principali: tubulare, attinomorfa o polisimmetrica; o ligulata, zigomorfa o monosimmetrica. I fiori sono in genere ermafroditi, proterandri (le antere maturano prima degli stami), ma anche unisessuali o sterili; nella stessa infiorescenza possono essere presenti tipi fiorali diversi. Gli stami sono cinque ed hanno antere saldate tra loro, antere sinandre, a formare un manicotto entro cui si accresce
lo stilo con all’apice lo stimma ancora chiuso e non recettivo. Questo raccoglie e spinge fuori il polline, e solo al termine si apre al di sopra delle antere esponendo la superficie interna recettiva. L’ovario è infero, bicarpellare sincarpico, uniloculare, contenente un solo ovulo. Il frutto è un achenio, sormontato dal pappo, oppure munito di strutture atte alla dispersione zoocora come denti o uncini, oppure nudo (Abbate et al., 2008).
All’interno della famiglia delle Asteraceae esistono delle sostanziali variazioni nell’architettura dell’infiorescenza. Le tre principali sottofamiglie si distinguono per le loro differenze in: ligulato, formata soltanto da fiori del raggio zigomorfi ed ermafroditi, come nella maggior parte delle Cichorioideae (Fig.1 A); discoide, formata soltanto da fiori del disco attinomorfi ed ermafroditi, come nelle Carduoideae (Fig. 1 B); raggiato, formata sia da fiori del raggio zigomorfi per lo più sterili e fiori del disco attinomorfi ed ermafroditi, come nelle Asteroideae (Fig.1 C) (Gillies et al., 2002; Chapman et al., 2008).
Fig. 1: Tipo di architettura dell’infiorescenza caratteristiche della famiglia delle
Asteraceae. (A) Infiorescenza di tipo discoidale di Silybum marianum (Carduoideae). (B) Infiorescenza di tipo ligulato di Taraxacum officinale (Cichorioideae). (C) Infiorescenza di tipo raggiato di Leucanthemum vulgare (Asteroideae).
Il grande successo evolutivo dello zigomorfismo risiede, molto probabilmente, nella capacità di attrarre e di interagire in modo specifico con gli
insetti impollinatori (Cronk e Möller, 1997; Neal et al., 1998; Sargent, 2004). L'evoluzione di una corolla bilateralmente simmetrica limita la direzione di avvicinamento e il movimento degli impollinatori su e tra i fiori. Limitare gli impollinatori ad avvicinarsi a un fiore da un'unica direzione, facilita il posizionamento specifico del polline sull'impollinatore. Il posizionamento preciso del polline aumenterebbe la probabilità che i grani di polline raggiungano uno stigma compatibile (Nikkeshi et al., 2015). Nelle Asteroideae i fiori monosimmetrici si sono evoluti per rendere più evidente il capolino sotto la selezione mediata dagli impollinatori. Come evidenziato in Helianthus grosseserratus, l’eliminazione dei fiori del raggio comporta una riduzione della frequenza nella visita delle infiorescenze da parte degli impollinatori (Stuessy et al., 1986).
Il girasole (Helianthus annuus) (Fig. 2 e Fig. 7 A) oltre ad essere una delle più importanti piante coltivate per la produzione di olio, è una pianta modello per studiare la regolazione della simmetria dei fiori, poiché fiori zigomorfi e attinomorfi si trovano sulla stessa infiorescenza (Berti et al., 2005; Chapman et al., 2008; Fambrini et al., 2011; 2014a; 2014b; Tähtiharju et al., 2012). La parte più esterna del capolino è circondata da grandi fiori del raggio con corolla zigomorfa: nella regione distale, l’unione di tre petali con accrescimento abassiale (schema 0:3 adassiale:abassiale) determina la caratteristica simmetria bilaterale; nella regione prossimale, tali petali formano un corto tubo (Jeffrey, 1977; Fambrini et al., 2006). Essi svolgono principalmente il compito di attrarre gli insetti impollinatori, ma sono sterili in quanto conservano solo resti filamentosi di stami abortiti, stili e stigmi rudimentali e ovari vuoti. Le spirali interne sono costituite da fiori del disco più piccoli, attinomorfi, con corolla
tubulare a cinque lobi, fertili ed ermafroditi (Knowles, 1978; Preston e Hileman, 2009; Çetinbas e Ünal, 2012).
1.2 I fattori di trascrizione della famiglia TCP
Recentemente è stato scoperto che la simmetria dei fiori del raggio e del disco in girasole è regolata principalmente dall’attività di un gene CYCLOIDEA (CYC), denominato HaCYC2c (Fig. 3) (Chapman et al., 2008; Fambrini et al., 2014b), uno dei dieci geni CYC/TB1 presenti nel genoma del girasole (Chapman et al., 2008).
Questi geni codificano per fattori di trascrizione (FT) specifici delle piante, appartenenti alla famiglia TCP. L’acronimo TCP deriva dai tre geni della famiglia isolati inizialmente: TEOSINTE-BRANCHED1 (TB1) in Zea mays, CYCLOIDEA (CYC) in Antirrhinum majus e PROLIFERATING CELL FACTOR1 e 2 (PCF1 e PCF2) in Oryza sativa (Cubas et al., 1999; Preston e Hileman, 2009; Martìn-Trillo e Cubas, 2010; Fambrini et al., 2011; 2014a; 2014b; Fambrini e Pugliesi, 2017a).
Quando CYC e TB1 vennero descritti per la prima volta, non fu trovata alcuna omologia con proteine di funzione biochimica nota. Successivamente sono state rilevate due proteine aggiuntive con omologia a CYC e TB1 nella regione bHLH (basic Helix-Loop-Helix): PCF1 e PCF2. Queste proteine sono state isolate sulla base della loro capacità di legarsi in maniera specifica agli elementi del promotore del gene del riso (PCNA), una proteina coinvolta nella replicazione del DNA e nel controllo del ciclo cellulare (Zophonias e Hubscher, 1997; Cubas et al., 1999). Le proteine PCF possono legarsi al DNA come omodimeri o eterodimeri; ciò suggerisce che CYC e TB1 possono avere anch’essi la capacità di legare il DNA e interagire con altre proteine attraverso il loro dominio bHLH (Kosugi e Ohashi, 1997; Cubas et al., 1999).
I membri della famiglia TCP sono caratterizzati da un particolare dominio bHLH (TCP) di circa 60 residui amminoacidici. (Cubas et al., 1999; Aggarwal et al., 2010; Uberti Monassero et al., 2013; Fambrini et al., 2011; 2014a; 2014b; Hileman, 2014a; 2014b; Fambrini e Pugliesi, 2017a). I Geni TCP sono coinvolti in un grande numero di processi, tutti fondamentalmente attribuibili alla proliferazione e crescita cellulare, ed agiscono sia come attivatori trascrizionali che come repressori (Martìn-Trillo e Cubas, 2010; Fambrini et al., 2011; 2014a).
I membri di questa famiglia, circa 600-800 milioni di anni fa (Navaud et al., 2007) si sono divisi in due sottofamiglie in base alla loro struttura e al dominio TCP: i TCP di Classe I che contengono PCF1 e PCF2 coinvolti nella divisione delle cellule meristematiche; i TCP di Classe II che oltre al motivo bHLH presentano uno specifico dominio addizionale R di circa 18-20 amminoacidi ricco in Arginina (Cubas et al., 1999; Fambrini et al., 2011; 2014b; Fambrini e Pugliesi, 2017a). Analisi accurate delle sequenze, combinate ad analisi filogenetiche, hanno consentito di suddividere ulteriormente i TCP di Classe II in due cladi: CINCINNATA (CIN) e CYC/TB1. Quest’ultimo si distingue per la presenza tra i domini TCP e R di un altro dominio denominato ECE costituito da Acido Glutammico-Cisteina-Acido Glutammico (Howarth e Donoghue, 2006; Chapman et al., 2008; Fambrini et al., 2011; Fambrini e Pugliesi, 2017a). Dal clade CYC/TB1 in conseguenza di una serie di eventi di duplicazione e successiva diversificazione di espressione si sono evoluti i subcladi CYC1, CYC2 e CYC3 (Preston e Hileman, 2009; Martìn-Trillo e Cubas, 2010; Fambrini et al., 2011; 2014a; 2014b; Fambrini e Pugliesi, 2017a;). I geni CYC1 e CYC3 regolano l’accrescimento delle gemme ascellari (ad esempio TB1)
(Aguilar-Martínez et al., 2007; Finlayson, 2007; Bello et al., 2017), i geni CYC2 controllano l’accrescimento del meristema fiorale e la simmetria bilaterale (Luo et al., 1999; Damerval et al., 2007; Citerne et al., 2013; Fambrini et al., 2014a; 2014b; Bello et al., 2017).
Fig. 3: Rappresentazione schematica del gene HaCYC2c di Helianthus annuus.
In verde e in azzurro sono rappresentati rispettivamente, il dominio TCP e R. Il triangolo verde indica il codone di start (ATG), il triangolo rosso indica il codone di stop (TAG) e il triangolo giallo indica l’introne. La rappresentazione schematica è in scala.
È stato dimostrato che oltre ai geni CYC, la simmetria fiorale può essere controllata anche dall’attività di altri geni; in A. majus (Fig. 4) interazioni più o meno strette tra i geni RADIALIS (RAD) e DICHOTOMA (DICH) insieme a CYCLOIDEA (CYC), regolano lo sviluppo dei fiori nella regione dorsale (regione superiore, adassiale); i geni del clade DIVARICATA (DIV) regolano lo sviluppo della regione ventrale (regione inferiore, abassiale) (Luo et al., 1996; 1999; Corley et al., 2005).
In A. major i geni CYC e DICH determinano un ritardo nella crescita di petali e stami a ridosso della regione dorsale; successivamente l’espressione di CYC nella regione dorsale si accentua, con la promozione dello sviluppo dei petali e la repressione degli stami (Luo et al., 1996). L’espressione di DICH è ristretta nella parte più dorsale dei petali, contribuendo alla loro simmetria interna (Luo et al., 1999). I geni CYC e DICH codificano per FT di tipo TCP; i
al., 2017a). Il gene RAD viene attivato da CYC e DICH nella regione dorsale del fiore, dove svolge una funzione antagonista della proteina DIV (Corley et al., 2005). In definitiva, si può affermare che i geni CYC e DICH determinano lo sviluppo dorsale dei petali e degli stami; inoltre, controllano l’attività dei geni RAD e DIV (Luo et al., 1996; 1999). In questo contesto, i fiori zigomorfi di A. majus sono soggetti ad una doppia interazione tra i FT TCP e MYB (Corley et al., 2005; Fambrini et al., 2017a).
1.3 L’elemento trasponibile CACTA responsabile delle
mutazioni Chry2 e turf
Studi in H. annuus dimostrano che il gene HaCYC2c è espresso in ovari e petali dei fiori del raggio, determinando un’infiorescenza di tipo raggiato caratteristica del genere (Fig. 2 e Fig. 7 A) (Chapman et al., 2008); ma quando il gene HaCYC2c è espresso ectopicamente nei fiori del disco, essi si trasformano da attinomorfi a zigomorfi e l’infiorescenza assumere la forma ligulata, simile al fenotipo di un crisantemo ornamentale (mutante double-flowered; dbl e Chrysanthemoides2; Chry2) (Fig. 5 A) (Chapman et al., 2012; Fambrini et al., 2014a). Quando il gene HaCYC2c viene interrotto da una inserzione, i fiori del raggio che normalmente sono di tipo zigomorfo diventano attinomorfi, generando un mutante con fiori esterni tubulari (mutante tubular ray flower; turf e tubular-rayed; tub) (Fig. 5 B) (Fambrini et al., 2011; 2014b; 2017b; Chapman et al., 2012). Questi dati suggeriscono, che i geni CYC hanno avuto un ruolo chiave nell’evoluzione della complessa struttura dell’infiorescenza del girasole. I risultati ottenuti identificano HaCYC2c come un regolatore chiave dei fiori monosimmetrici del raggio. La perdita di funzione di HaCYC2c, promuove il passaggio dello sviluppo da fiori sterili a fiori ermafroditi, rivelando un nuovo ruolo inaspettato per un gene CYC-like nella repressione degli organi riproduttivi femminili e maschili (Fambrini e Pugliesi, 2017a).
Fig. 5: Mutanti di Helianthus annuus. (A) Mutante Crysanthemoides2 (Chry2)
generato dall’inserzione nella regione prossimale del promotore al 5' del gene HaCYC2c, di un elemento trasponibile (ET) CACTA, denominato Tech1. (B) Mutante tubular ray flower (turf) generato dall’inserzione nella regione codificante di HaCYC2c, all’interno del dominio TCP, di un ET CACTA, denominato Tetu1.
I fenotipi della mutazione si sono generati in seguito all’inserzione, nel locus del dominio TCP del gene HaCYC2c (turf e tub), o sul promotore dello stesso gene (Chry2 e dbl), di elementi trasponibili (ET) non autonomi appartenenti alla superfamiglia CACTA. Quando sono associati a regioni regolatorie dei geni, essi possono influenzare l’espressione genica e come diretta conseguenza, contribuire all’evoluzione dei genomi delle piante (Fedoroff, 2012).
Nonostante le strutture fisiche di base di tutti i genomi nucleari eucariotici siano simili, la dimensione del genoma presenta un alto grado di variabilità: da molto piccolo in alcune specie, come in Arabidopsis thaliana (125 milioni di pb) (Hahn e Wray, 2002), ad estremamente grande e complesso in alcune specie
correlazione tra complessità dell’organismo e dimensioni del genoma non ha un andamento lineare; tale mancanza di una precisa correlazione tra queste due variabili viene definita “paradosso del valore C” (Fedoroff, 2012) e tra i responsabili di questo fenomeno, gli ET mostrano un ruolo rilevante.
Tutti gli organismi contengono ET e in alcune specie, tali elementi costituiscono la maggior parte del DNA genomico (Bennetzen, 2000; Vukic et al., 2009). Questi elementi hanno la capacità di riorganizzare i genomi e alterare la struttura e la regolazione dei singoli geni attraverso una qualsiasi delle attività che promuovono: trasposizione, inserimento, escissione, rottura del cromosoma e ricombinazione ectopica.
Generalmente la mobilizzazione di un ET avviene quando l’organismo è sottoposto a condizioni di “shock genomico”. Queste possono comprendere sia stress biotici ed abiotici (infezioni virali e batteriche, sbalzi termici, salinità eccessiva) che condizioni di poliploidia ed ibridazione interspecifica (Wang et al., 2010).
Considerata la varietà di ambienti e condizioni climatiche a cui le piante sono esposte non c’è da sorprendersi, quindi, di come gli ET svolgano un ruolo di primo piano nella comparsa di mutanti in specie caratterizzate da un genoma ricco di ET (mais, grano, orzo, girasole) (Wicker et al., 2003; 2007; Cavallini et al., 2010; Wang et al., 2010; Staton et al., 2012; Natali et al., 2013; Giordani et al., 2014).
Scoperti per la prima volta nelle piante di mais dalla genetista Barbara McClintock a metà degli anni '40, inizialmente furono considerati come una “stranezza genetica”. Alcuni decenni più tardi, gli ET acquisirono le etichette di "DNA egoista" e di "DNA parassita" a causa della loro autonomia replicativa e
capacità di indurre cambiamenti genomici (Fedoroff, 2012). Sebbene gli ET siano ampiamente distribuiti nei genomi delle piante e svolgano ruoli essenziali nell'evoluzione dei cromosomi, la maggior parte di essi sono dormienti o inattivi. Questo è principalmente dovuto al silenziamento epigenetico, un sistema di regolazione e controllo che mira a limitarne la proliferazione. Modificazioni epigenetiche come la metilazione del DNA, l’attività di small RNA e le modificazioni degli istoni, rappresentano un sofisticato meccanismo utilizzato per prevenire gli effetti deleteri indotti dagli ET (Li et al., 2017).
Gli ET possono essere suddivisi in due gruppi principali: elementi di classe I e di classe II. Gli elementi di classe I (chiamati anche retrotrasposoni) si replicano attraverso un intermedio di mRNA che viene trascritto in senso inverso nel DNA e integrato in un'altra regione del genoma (Gbadegesin e Beeching, 2010). I retrotrasposoni hanno contribuito in larga misura all’aumento abnorme del DNA genomico totale di piante come grano, orzo, mais e girasole. Gli elementi di classe II o trasposoni si muovono attraverso un DNA intermedio, il che significa che essi sono escissi da una regione del genoma e integrati altrove (Gbadegesin e Beeching, 2010).
I trasposoni sono stati divisi in diverse superfamiglie; una di queste, la superfamiglia CACTA, è costituita da trasposoni caratterizzati da “terminal inverted repeats” (TIRs) di circa 10-28 pb fiancheggiati da un motivo conservato 5'-CACTA-3' ritenuto il sito di riconoscimento per l’enzima trasposasi. Nei membri di questa superfamiglia sono presenti anche numerosi “sub terminal repeats” (sub-TRs) di 10-20 pb con orientamento diretto e invertito, che negli elementi CACTA generano la caratteristica “firma del trasposone” e che
insieme ai TIRs mostrano uno specifico profilo di riconoscimento nelle analisi dot-plot (Wicker et al., 2003; Fambrini et al., 2014a).
Generalmente gli elementi CACTA integri codificano per almeno due proteine ottenute da un unico trascritto mediante “splicing” alternativo. Una proteina, denominata TNPD, rappresenta la trasposasi putativa responsabile del processo di escissione e integrazione durante la trasposizione; l’altra chiamata TNPA, è un fattore con funzioni multiple, alcune delle quali riflettono la sua capacità di legare il DNA (Gierl et al., 1989; Trentmann et al., 1993; Fambrini et al., 2014a).
Quando la proteina TNPA è legata ai domini subterminali degli elementi CACTA difettosi, l’avanzamento dell’RNA polimerasi viene interrotta, dando luogo a trascritti prematuri. Entrambe le proteine TNPD e TNPA sono assolutamente necessarie per la trasposizione di elementi CACTA, tuttavia possono essere fornite da regioni differenti da quella di origine (in trans) da elementi (intatti) autonomi attivi per consentire la trasposizione di elementi non autonomi (derivati da delezione), purché interagiscano con sequenze “target” proprie della regione di origine (in cis) (Fedoroff et al., 1995; Fambrini et al., 2014a).
La mutazione Chry2 (Fig. 5 A) è causata dall’inserimento di un CACTA di dimensioni molto ridotte (1.034 pb) denominato Transposable Element of Chrysanthemoides2 (Tech2), 558 pb prima del codone di inizio di HaCYC2c (Fambrini et al., 2014a). Esso è una versione troncata di un ET, probabilmente generato da una escissione imperfetta perché manca una sequenza di codifica ovvia per le proteine TNPD e TNPA. A causa delle sue piccole dimensioni,
l’elemento è stato classificato come “Small Non Autonomous CACTA” (SNAC) (Wicker et al., 2003; Fambrini et al., 2014a).
Il cambiamento della simmetria fiorale visualizzato nel mutante Chry2 è limitato ai soli fiori del disco. Le corolle diventano allungate e assumono le dimensioni e l’aspetto dei fiori del raggio. Tuttavia, lo zigomorfismo è visibilmente marcato in quei fiori inseriti alla periferia dell’infiorescenza Chry2, mentre si osserva una progressiva riduzione in quei fiori del disco posti in posizione più centrale, dove l’unione dei petali forma un organo tubulare che occupa fino all’80% dell’intera lunghezza della corolla. La corolla dei fiori del raggio nell’infiorescenza Chry2 mostra un abassializazione che gradualmente diminuisce con il gradiente centripeto (Fambrini et al., 2003; 2006).
La mutazione Chry2 influisce anche sullo sviluppo degli stami, sulla forma dello stilo e sulla formazione dell’ovulo. I fiori inseriti alla periferia dell’infiorescenza, mostrano caratteristiche che ricordano i fiori sterili del raggio, compresa l’assenza di ovuli, di stili non ramificati e piccole antere. I difetti degli organi riproduttivi maschili e femminili diminuiscono progressivamente con la riduzione dello zigomorfismo della corolla, fino a scomparire in quei fiori che si trovano al centro dell’infiorescenza che mostrano soltanto una ridotta dimensione degli organi maschili (Fambrini et al., 2003; 2006).
L’inserimento dell’ET Tech2 nel promotore del gene HaCYC2c non è sempre sufficiente ad alterare l’espressione genica e generare il fenotipo Chry2. Una estesa analisi genetica ha dimostrato che un singolo gene semidominante controlla il tratto Chry2. Tuttavia, i fenotipi osservati nella progenie F2 e F3 che segregano per questo tratto, suggeriscono che la mutazione Chry2 è controllata da un meccanismo genetico molto più
complesso (Fambrini et al., 2014a). È probabile che lo SNAC in Chry2 regoli l’espressione genica di HaCYC2c attraverso meccanismi epigenetici, come lo stato di metilazione dell’ET (Bucher et al., 2012). Analisi bioinformatiche di Tech2 evidenziano la presenza di isole CpNpG di 659 pb, putativi “target” di metilazione. Stress genomici come l’ibridazione possono indurre cambiamenti dello stato di metilazione, causando differenti livelli di espressione del gene HaCYC2c (Verhoeven et al., 2010).
Su tali basi sono state avanzate due ipotesi alternative: i mutanti Chry2 sarebbero caratterizzati da una ipermetilazione dello SNAC che impedisce il legame di un repressore putativo dell’espressione di HaCYC2c nei fiori del disco; oppure Tech2 potrebbe fornire un sito di legame per un attivatore che consentirebbe l’espressione ectopica di HaCYC2c in piante Chry2 (Fambrini et al., 2014a).
Analisi in silico hanno dimostrato come le due ipotesi possono essere valide: Tech2 presenta siti di legame per il repressore delle gibberelline, esse potrebbero essere uno dei fattori chiave di controllo della forma delle corolle sia dei fiori del raggio che dei fiori del disco (Zhang et al., 2012; Kuang et al., 2013); inoltre, la presenza di una sequenza consenso per un attivatore costitutivo della trascrizione (ASF1MOTIFCAMV) porterebbe all’espressione ectopica del gene HaCYC2c (Després et al., 2003).
Nel mutante turf (Fig. 5 B) l’ET di 5.787 pb, denominato Transposable Element of Turf1 (Tetu1) si è inserito 427 pb dopo il codone di start, nella regione basica del motivo TCP. L’integrazione di Tetu1 determina un cambiamento del “frame” di lettura dell’mRNA per la proteina codificata, con formazione di un codone di stop prematuro (Fambrini et al., 2011).
L’analisi morfologica dei mutanti turf rileva che il cambiamento della simmetria è limitato ai soli fiori del raggio. Il passaggio dalla simmetria bilaterale alla simmetria radiale è accompagnato da una diminuzione delle dimensioni della corolla; i fiori immaturi (pochi giorni prima dell’antesi) mostrano un aspetto attinomorfo quasi tubulare (“tubular-like”), a maturità il tubo della corolla si deforma e si piega in modo abassiale mantenendo comunque una certa simmetria zigomorfa. La maggior parte delle corolle sono costituite da cinque petali; considerando che i fiori del raggio in girasole sono formati da tre petali allungati, ciò suggerisce che la mutazione influenza anche il numero di organi (Fambrini et al., 2006). I mutanti turf differenziano fiori del raggio, in cui i filamenti degli stami, le antere e gli ovuli mostrano molti difetti nello sviluppo.
Analisi morfologiche e genetiche hanno dimostrato che pur con tali difetti, questi organi, sia maschili che femminili, sono del tutto funzionali (Berti et al., 2005; Fambrini et al., 2011; 2014b).
L’escissione di Tetu1 spesso ristabilisce un’infiorescenza “wild-tipe” (WT); anche se sono state osservate piante i cui fiori del raggio mostrano piccole modificazioni morfologiche rispetto ai selvatici: fiori del raggio con caratteristiche intermedie tra i fiori del raggio e quelli del disco, e fiori tipici del mutante turf (Fambrini et al., 2011). È stato dimostrato che la presenza di infiorescenze con diverse sfumature fenotipiche che vanno dal WT al mutante turf era correlata all’escissione perfetta o imperfetta di Tetu1 (Fambrini et al., 2014b).
1.4 L’ibrido interspecifico Helianthus × multiflorus
Una specie del genere Helianthus di particolare interesse per lo studio del ruolo dei geni CYC2 nel determinare l’architettura dell’infiorescenza è Helianthus × multiflorus (Fig. 6 A, B e Fig. 7 C). Venne descritta per la prima volta nel XVI secolo in Europa da Jacob Theodor Tabernaemontanus e soltanto qualche secolo dopo, nel 1753, Linneo lo nominò Helianthus multiflorus. Heiser e Smith nel 1960 stabilirono che la specie è un ibrido interspecifico tra H. annuus (Fig. 2 e Fig. 7 A) e Helianthus decapetalus (Fig. 7 B) e secondo il Codice Internazionale di Nomenclatura Botanica il nome corretto da attribuirgli è “Helianthus × multiflorus”.
È stato ipotizzato che H. × multiflorus si sia originato casualmente, poco dopo l’introduzione dei girasoli in Europa e che tali ibridi si siano formati in modo casuale, poiché entrambi i parentali vennero coltivati a stretto contatto in giardini di case nobiliari dell’epoca. Molto improbabili sono le affermazioni di alcuni autori che individuano nell’America la patria della specie, poiché H. annuus e H. decapetalus crescono e prosperano in aree geografiche distinte e hanno esigenze luminose completamente diverse; inoltre non sono mai state trovate piante di H. × multiflorus in ambienti naturali (Heiser e Smith, 1960).
Fig. 6: Fenotipo di Helianthus × multiflorus varietà “Soleil d’Or”. (A) Pianta in
fase riproduttiva di Helianthus × multiflorus posta in vaso di 30 cm di diametro. (B) Infiorescenza di Helianthus × multiflorus in completa antesi. Il capolino è costituito da fiori zigomorfi. (C) Fiore del raggio; stilo con un solo stigma (st), si evidenziano antere poco sviluppate (a). (D) Fiore del disco trasformato in “ray-like” con simmetria zigomorfa, stilo bifido (st); si evidenziano antere poco sviluppate (a) che non producono polline; (f) filamento. Lunghezza barra: 20 cm in A; 12 mm in B; 5 mm in C e D.
Fig. 7: (A) Infiorescenza di Helianthus annuus. (B) Infiorescenza di Helianthus
decapetalus. (C) Infiorescenza di Helianthus × multiflorus varietà “Soleil d’Or”. H. × multiflorus è risultato essere triploide (2n = 3x = 51) e nella metafase meiotica mostra generalmente 17 bivalenti e 17 univalenti (Heiser e Smith, 1960). La natura triploide spiega la sua sterilità gametica; l’ibrido si propaga vegetativamente, solo attraverso frammenti di rizoma (Frey e Spring, 2015).
Heiser e Smith generarono progenie F1 da incroci artificiali di H. annuus e H. decapetalus con cariotipo tetraploide e ottennero diverse piante fenotipicamente simili a H. × multiflorus. Questa combinazione appariva ragionevole in quanto l’ibrido mostrava un cariotipo triploide, ma gli autori non escludevano che la natura triploide potesse anche derivare dall’incrocio di parentali diploidi quando un gamete conteneva un set cromosomico non ridotto. Le piante prodotte da Heiser e Smith erano molto simili all’ibrido originale di H. × multiflorus ma non identiche; si attribuiva questa variabilità al fatto che H. annuus ha un gran numero di forme genetiche, sia selvatiche che coltivate. Appare alquanto improbabile che in questi incroci sia stato usato lo stesso genotipo del parentale originale (Heiser e Smith, 1960).
Studi più recenti osservano che il profilo della lattone sesquiterpenica (STL) di H. × multiflorus contiene desacetyleupasserrin, il principale composto presente in H. decapetalus diploide, ma non presente in H. decapetalus
tetraploide. Inoltre, il confronto dei profili STL di H. × multiflorus mostrano il 77% di somiglianza con l’ibrido prodotto tra H. annuus e H. decapetalus diploide, mentre si riscontra solo il 35% di somiglianza con l’ibrido prodotto tra H. annuus e H. decapetalus tetraploide (Frey e Spring, 2015).
Questi risultati confermano che H. × multiflorus proviene dall'ibridazione tra H. annuus e la specie diploide di H. decapetalus, con l’intervento di gameti non ridotti di uno dei parentali (Spring e Schilling, 1990). Il confronto delle sequenze del DNA cloroplastico (cpDNA) suggeriscono che H. × multiflorus si sia originato da cellule uovo non ridotte di H. decapetalus fecondate da gameti maschili aploidi di H. annuus (Frey e Spring, 2015).
Esistono diverse varietà di H. × multiflorus, molte di queste si originarono per mutazioni spontanee in giovani germogli, che dopo la separazione dalla pianta madre si dimostrarono stabili e vennero poi propagati e venduti come nuove varietà. Tra le prime varietà di H. × multiflorus ricordiamo Anemoniflorus Flore Pleno (Bouquet d’Or), apparsa per la prima volta nel 1848 in un catalogo vivaistico in Belgio. Secondo gli autori, sembra essere stato il primo “girasole doppio” (Offenthal e Kaiser, 1999). Altre varietà introdotte nei mercati sono state: Capenoch Star, Corona Dorica, Duplex, John Davies, Loddon Gold, Maximus Plenus, Meteor, Soleil d’Or, Triomphe the Gand (Offenthal e Kaiser, 1999).
Molte di queste varietà differiscono principalmente per le dimensioni dei fiori del disco, trasformati in fiori con caratteristiche molto simili ai fiori del raggio (“ray-like”) e dunque zigomorfi. Si potrebbe supporre che tale variabilità nella morfologia dell’infiorescenza possa essere la conseguenza dell’attivazione di ET all’interno del genoma e del loro complesso sistema di regolazione
epigenetico. Non va dimenticato che l’ibridazione interspecifica è uno dei processi che maggiormente sembra influenzare l’attivazione di ET silenti.
Come per i mutanti del girasole Chrysanthemoides2 (Chry2) e Florepleno o double-flowered (dbl) (Fig. 5 A), il fenotipo delle infiorescenze di H. × multiflorus (Fig. 6 B e 7 C) potrebbe essere determinato dall’inserzione di un ET. Pertanto, i primi obiettivi di questo studio sono stati: i) identificare il gene CYC2c in H. decapetalus diploide, uno dei parentali di H. × multiflorus; ii) identificare gli alleli CYC2c dell'ibrido interspecifico H. × multiflorus inclusa la regione del promotore; iii) ed infine, analizzare l’espressione di CYC2c in fiori con diversa simmetria per ampliare le nostre conoscenze sull’effetto degli ET sulla trascrizione genica e la correlazione tra il fenotipo del mutante Chry2 del girasole e il triploide H. × multiflorus.
2. Materiali e metodi
2.1 Materiale vegetale e condizioni di crescita
Il materiale vegetale utilizzato è costituito da piante diploidi (2n = 2x = 34) di H. annuus (linea pura EF2 del Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agroambientali, Università di Pisa, Italia), di H. decapetalus (identificativo PI 468697 dell’USDA, USA) e da piante triploidi (2n = 3x = 51) di H. × multiflorus varietà “Soleil d’Or” (tipologia ad infiorescenza ligulata, provenienti da L’Erbario della Gorra, Casalborgone, Torino, Italia). Esse sono state allevate in vasi da 30 cm di diametro contenente una miscela di torba e sabbia. Lo sviluppo vegetativo è stato favorito mediante allevamento in camera di crescita a 23 ± 1 °C con fotoperiodo di 16 ore di luce (400 µmol di fotoni su m-2·s-1) e 8 ore di buio. L’irraggiamento è stato fornito da lampade a ioduri metallici (Kolorarc Daylight, MBID400/T/H 400 Watts, Betchworth, Inghilterra).
2.2 Analisi morfologica dell’infiorescenza in Helianthus ×
multiflorus
In infiorescenze di H. × multiflorus varietà “Soleil d’Or”, è stata eseguita l’analisi morfologica degli organi fiorali in fiori del raggio del primo cerchio e in “fiori del disco” del secondo cerchio, modificati in fiori monosimmetrici molto simili ai fiori del raggio (“ray-like”). I fiori sono stati prelevati nella fase finale dell’antesi. Le analisi morfologiche sono state eseguite prendendo in considerazione: la
dimensione della corolla, la presenza di antere, la presenza dei filamenti, la presenza dello stilo, la presenza dello stigma e la dimensione dell’ovario. Gli organi sono stati analizzati con micrometro oculare adattato ad un microscopio Wild Makroskop M420 (Wild Heerbrugg, Svizzera) mediante una metodologia precedentemente descritta (Fambrini et al., 2014b).
2.3 Estrazione del DNA e isolamento geni CYC da Helianthus
decapetalus e Helianthus × multiflorus
Il DNA di H. decapetalus e H. × multiflorus è stato estratto da giovani foglie di 2-3 cm di lunghezza utilizzando il protocollo di estrazione e purificazione Nucleon DNA, seguendo le istruzioni del produttore (GE Healthcare, Bio-Sciences). Per isolare l’intero gene CYC2c (introni ed esoni), è stata utilizzata la combinazione di “primer” F73/CYC11 (Tabella 1). Le condizioni di PCR utilizzate sono state: denaturazione iniziale a 94 °C per 4 min; 35 cicli con denaturazione a 94 °C per 30 s, attacco degli oligonucleotidi a 65 °C per 30 s, estensione a 72 °C per 1 min e 50 s; estensione finale a 72 °C per 7 min. Successivamente è stata condotta una elettroforesi in tampone TAE su gel di agarosio all’1,5%. I prodotti di PCR sono stati visualizzati sotto luce UV successivamente ad incorporazione di Gel Red TM Nucleic Acid Stain (Biotium).
In H. × multiflorus sono state eseguite ulteriori prove di PCR per determinare la presenza dell'allele CYC2c derivato dal parentale H. annuus. A tale scopo, sono stati utilizzati le combinazioni di “primer” F73/CYCREV6, RAG6F/CYC11 e F71/73R (Tabella 1) nelle condizioni di PCR descritte in precedenza (Fambrini et al., 2011; 2014a; 2014b).
I prodotti amplificati sono stati purificati utilizzando il protocollo WizardV R SV Gel e PCR Clean-UP System (Promega Italia, Milano, Italia), legati al vettore pGEM-T-easy Vector (Promega) e trasferiti in cellule competenti di Escherichia coli JM109 (Promega). Il DNA plasmidico è stato preparato utilizzando il protocollo WizardV R Plus Minipreps DNA Purification Kit (Promega). Il sequenziamento dei diversi cloni analizzati è stato svolto su entrambi i filamenti.
Tabella 1: Elenco dei “primer” utilizzati per l’amplificazione e l’analisi trascrizionale dei geni CYCLOIDEA (CYC) di Helianthus
annuus (Ha), Helianthus decapetalus (Hd) e Helianthus × multiflorus (H×m).
Uso Primer Sequenza 5'-3'
Amplificazione delle sequenze complete di HdCYC2c e H×mCYC2c
F73 CYC11
forward, 5'-CGTGGTGCAGTTGCATCGCTGT-3' reverse, 5'-CCAATCAACTAGTGCCGAGAAGTGG-3' Amplificazione di frammenti di DNA di
CYC2c F71 73R F73 CYCREV6 RAG6F CYC11 forward, 5'-CCAACTCTCTTAAGCATATCACACAGG-3' reverse, 5'-ACAGCGATGCAACTGCACCACG-3' forward, 5'-CGTGGTGCAGTTGCATCGCTGT-3' reverse, 5'-ACTGGAGGTAGGGTTGATGGTTGTGGAGCA-3' forward, 5'-TGCTCCACAACCATCAACCCTACCTCCAGT-3' reverse, 5'-CCAATCAACTAGTGCCGAGAAGTGG-3'
Valutazione della contaminazione da DNA genomico in campioni di RNA
PSTOP INT1R
forward, 5'-TCTCCCAAATTTCATCCAAAGGTATGCC-3' reverse, 5'-CCGTGTTTTGTATTTGATTAATTAATCTAC-3' Analisi trascrizionale dei geni CYC2c Q4F
Q4R 18F
forward, 5'-AGAGATCGGAGGGTGAGATTG-3' reverse, 5'-TTCTTGGACTTCGTAAAGAGCC-3' forward, 5'-TGACTCAACACGGGGAAAC-3'
2.4 Analisi delle sequenze e analisi filogenetiche
Le sequenze in esame sono state sottoposte ad analisi bioinformatica mediante l’utilizzo del programma BLAST del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) (Altschul et al., 1997). Sono stati utilizzati i database PROSITE e PFAM per l’identificazione dei domini conservati (Bateman et al., 2002; Falquet et al., 2002).
Le sequenze amminoacidiche, dei FT di CYC delle diverse specie, sono state allineate usando il programma ClustalW (Thompson et al., 1994) della Kyoto University Bioinformatic Center (http://www.genome.jp/tools/clustalw/) (Fig. S1). L'analisi filogenetica è stata eseguita utilizzando i programmi del gruppo PHYLIP, PHYLogeny Inference Package, versione 3.64 (Felsenstein, 1989). Le relazioni filogenetiche tra le specie sono state ricavate da una matrice di distanza Dayhoff PAM, (Kosiol e Goldman, 2005) generata dal programma PROTDIST e successivamente sottoposta al programma NEIGHBOR per il “clustering UPGMA”. Infine, gli alberi di consenso sono stati ottenuti con l’ausilio del programma CONSENSE impostando l'opzione “regola di maggioranza” (Margush e McMorris, 1981). Come supporto delle ramificazioni ottenute, è stata eseguita un'analisi “bootstrap” con 100 repliche, con l’ausilio del programma SEQBOOT (Felsenstein, 1985). La sequenza amminoacidica di PCF1 di Oryza sativa (OsPCF1) è stata utilizzata come “outgroup”.
I database degli elementi ripetuti di girasole (SUNREP, Natali et al., 2013) e di Triticeae (TREP, http://wheat.pw.Usda.gov/ITMI/Repeats), sono stati sottoposti a screening dagli algoritmi BLASTN e BLASTX. Un’analisi dettagliata dot-plot è stata condotta mediante il programma DOTTER (Sonnhammer e
Durbin, 1995). I dati delle sequenze di questo elaborato sono stati depositati in GenBank sotto il numero di accesso MG797677 per CYC2c di H. decapetalus (HdCYC2c), MG797678 e MG797679 per i due alleli di CYC2c di H. × multiflorus (rispettivamente, H×mCYC2cA e H×mCYC2cB).
2.5 Analisi dell’espressione genica mediante real time RT-PCR
(qPCR)
Per analizzare i livelli di trascrizione dei geni CYC2c, è stato estratto l’RNA totale da corolle di fiori del raggio (ray flower; RF) e del disco (disk flower; DF) di H. annuus, H. decapetalus e H. × multiflorus. In quest’ultimo i DF, sono sostituiti da fiori con corolla zigomorfa, molto simili ai fiori del raggio (“ray-like”). Per questo motivo i fiori del disco sono stati denominati fiori del raggio interni (RFI), mentre i reali RF sono stati denominati RF esterni (RFE).
L’RNA totale è stato estratto dalle corolle di RF (0,7-1,0 cm di lunghezza senza ovario, HaRF) e DF (0,5-0,7 cm, senza ovario, stilo-stigma e antere, HaDF) di H. annuus; corolle di RF (0,5-0,7 cm di lunghezza senza ovario, HdRF) e corolle di DF (0,4-0,6 cm, senza ovario, stilo-stigma e antere, HdDF) di H. decapetalus; corolle RFE (1,0-1,2 cm di lunghezza senza ovario, H×mRFE) e corolle RFI (0,5-1,0 cm di lunghezza senza ovario, H×mRFI) di H. × multiflorus. L’estrazione è stata condotta con il metodo TriPure Isolation Reagent, seguendo le istruzioni del produttore (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania). Per escludere la contaminazione da DNA è stata eseguita la digestione degli estratti con “DNase I-RNasi free” (Dasit Sciences S.r.l., Cornaredo, Milano, Italia), come precedentemente descritto (Sambrook e
Russell, 2001). L'assenza di contaminazione da DNA genomico nei campioni trattati con DNasi I è stata testata effettuando delle analisi di PCR con i “primer” PSTOP e INT1R, progettati appositamente per l’amplificazione di un frammento di DNA contenente una parziale regione esonica ed intronica del gene CYC2c (Tabella 1). Per determinare l’integrità dell’RNA e che uguali quantità vengano utilizzate per ogni reazione è stata condotta un’analisi spettrofotometrica nella regione UV e successiva analisi di 500 ng di RNA di ogni campione mediante un’elettroforesi su gel denaturante di formaldeide-formammide.
La sintesi di cDNA (retrotrascrizione) è stata eseguita utilizzando 1 μg di RNA totale e il protocollo iScriptTM cDNA synthesis kit (BIO-RAD). Le real time quantitative qRT-PCR sono state eseguite utilizzando il protocollo Real-time Step One (Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific Inc, USA) e “primer” specifici per CYC2c e Ha-18S. La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando 20 ng di cDNA e Power SYBR Green RNA-to-Ct 1 Step Kit, secondo le istruzioni del produttore (Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific Inc. USA, numero di catalogo 4389986). I cicli termici della RT-PCR sono stati impostati con le seguenti condizioni: trascrittasi inversa a 48 °C per 30 min con formazione di cDNA; attivazione della polimerasi: 95 °C per 15 min; 40 cicli di PCR: 95 °C per 15 sec e 59 °C per 30 sec; curva di Melt: 95 °C per 15 sec, 60 °C per 15 sec e 95 °C per 15 sec. La quantificazione relativa dei livelli di mRNA è stata eseguita utilizzando il metodo comparativo 2-∆∆CT (Livak e Schmittgen, 2001). I valori CT di tutti i campioni sono stati normalizzati con i valori CT del gene di riferimento (RNA ribosomiale 18S, Ha-18S, numero di accessione GenBank KF767534.1) in modo da eliminare le variazioni causate dal campionamento. Ha-18S è stato utilizzato come gene di riferimento sulla base
dei dati preliminari che hanno rivelato livelli di espressione coerenti per le corolle dei vari tipi di fiori. In particolare, l'Ha-18S è stato preferito ad altri geni “housekeeping” putativi verificati in precedenza [es., actina (Ha-ACT), fosfoglicerato chinasi 2 (PGK2) e SAND, numeri di accesso GenBank AF282624.1, HM490307 e GE516373, rispettivamente]. Per amplificare il cDNA di Ha-18S sono stati utilizzati i “primer” 18F/18R, mentre i “primer” usati per amplificare il cDNA di CYC2c erano Q4F/Q4R (Tabella 1). È stato inoltre utilizzato come campione di riferimento mRNA di radici di H. annuus (HaR). Per ogni gene, i valori CT normalizzati di HaR sono stati sottratti dai corrispondenti valori CT negli organi analizzati e nello stesso HaR. I valori derivati (DDCT), sono stati inseriti nella formula 2-DDCT secondo Livak e Schmittegen (2001). Le analisi della curva di Melt sono state eseguite dopo la PCR. Un singolo picco è stato osservato in entrambi geni bersaglio (CYC2c) e controllo (Ha-18S), indicando l'amplificazione specifica di un singolo prodotto. I prodotti sono stati sequenziati per un ulteriore controllo.
I dati derivano dalla media di tre repliche biologiche di campioni che sono stati prelevati da piante allevate in momenti diversi, ognuna comprendente tre repliche tecniche. È stato utilizzato il software Real-time Step One v2.3, fornito con lo strumento tramite il quale è stata effettuata la qRT-PCR.
2.6 Analisi statistiche
I valori della tabella 2 (Tabella 2) sono le medie ± di deviazione standard (SD) ottenute da 3-4 esperimenti indipendenti (piante), con 3 repliche di ognuno
(infiorescenze). Per ogni infiorescenza sono stati misurati 20-30 organi fiorali. L’analisi statistica dei dati è stata condotta mediante il “t” di Student.
Per l’analisi dell’espressione (qRT-PCR), i valori mostrati nel grafico rappresentano la media ± di SD ottenuta da tre esperimenti indipendenti (repliche biologiche) con tre differenti repliche tecniche. I dati sono stati elaborati utilizzando il test ANOVA (ANalysis Of VAriance tra i gruppi) disponibile su http://www.physics.csbsju.edu/stats/anova.html, le medie sono state confrontate con il test di Tukey disponibile all'indirizzo http://faculty.vassar.edu/lowry/hsd.html.
3. Risultati e discussione
3.1 Analisi morfologica degli organi fiorali di Heliantus ×
multiflorus
Nelle infiorescenze di H. × multiflorus varietà "Soleil d'Or" è stata eseguita l'analisi morfologica dei fiori del raggio e dei fiori del disco “ray-like”, denominati rispettivamente fiori del raggio esterni (RFE) e fiori del raggio interni (RFI). Sono state rilevate poche differenze significative nella larghezza della corolla e nel numero di antere per fiore (Tabella 2). L’alto rapporto di antere/fiore in fiori del raggio interni (RFI) si può ricondurre all’origine attinomorfa ed ermafrodita di tali fiori (Mizzotti et al., 2015). È stato sorprendente constatare la presenza di antere e stili anche nei fiori del raggio esterni (RFE) (Tabella 2). Tuttavia, i filamenti di tali fiori si presentavano malformati, con antere piccole, prive di granuli pollinici (Fig. 6 C, D); alcuni organi riproduttivi femminili mostravano una morfologia anormale con stili monostigmatici (Fig. 6 C).
Tabella 2: Analisi morfologica degli organi fiorali nell’infiorescenza di Helianthus × multiflorus varietà “Soleil d’Or”.
Carattere Fiori del raggio 1° cerchio Fiori del raggio * del 2 cerchio
Length of the corolla (mm) ** 32,28 ± 3,83 a 33,47 ± 4,49 a
Width of the corolla (mm) 14,61 ± 1,12 a 11,85 ± 0,50 b
No. of petal tips 2,92 ± 0,10 a 2,89 ± 0,13 a
No. of anthers/flower *** 3,78 ± 0,20 a 4,54 ± 0,40 b
Length of the ovary (mm) 5,76 ± 0,07 a 5,68 ± 0,24 a
Width of the ovary (mm) 1,89 ± 0,35 a 1,62 ± 0,59 a
No. of style-stigmas/flower **** 0,11 ± 0,15 a 0,23 ± 0,20 a
* Fiori del disco attinomorfi trasformati in fiori zigomorfici.
** I valori sono medie ± DS di 3-4 esperimenti indipendenti (piante o infiorescenze), con 3 repliche (infiorescenze o fiori). Sono stati misurati 20-30 organi per ogni infiorescenza. I valori seguiti dalla stessa lettera entro una riga non sono significativamente differenti (p = 0,05) in accordo all’analisi statistica “t” di Student.
*** I filamenti erano spesso malformati, le antere piccole senza granuli pollinici. Alcuni stami mostravano parziali trasformazioni omeotiche in strutture petaloidi.
3.2 Analisi delle sequenze e analisi filogenetiche dei geni
CYC2c di Helianthus decapetalus e Heliantus × multiflorus
L’analisi della sequenza del gene HdCYC2c di H. decapetalus ha mostrato una regione codificante (CDS) di 1.146 pb (Fig. 8 A). Il peptide HdCYC2c è costituito da 381 amminoacidi con una massa molecolare calcolata di 43.652 Da e un punto isoelettrico teorico di 7,26 (Fig. 8 B). Nel gene HdCYC2c l’introne (86 pb) è localizzato all’esterno del CDS, 11 pb dopo il codone di stop, all’interno della regione 3'-UTR di HdCYC2c (Fig. 8 A, Fambrini et al., 2011). La posizione dell’introne è stata dedotta mediante il confronto del cDNA di HaCYC2c e della sequenza ottenuta dal DNA genomico. La sequenza amminoacidica di HaCYC2c mostra i domini TCP e R altamente conservati (Fig. 8 B). Non sono stati trovati i residui ECE generalmente presenti nelle proteine del subclade CYC2; il residuo è verosimilmente sostituito dal motivo QCE come riscontrato in HaCYC2c di girasole.
Il gene H×mCYC2cA è stato isolato da H. × multiflorus. L’analisi della sequenza mostrava una regione CDS di 1.152 pb (Fig. 9 A e Fig. 10 A). Il peptide H×mCYC2cA è costituito da 383 amminoacidi con una massa molecolare calcolata di 43.679 Da e un punto isoelettrico teorico di 7,25 (Fig. 9 B). Nel gene H×mCYC2cA, l'introne (86 pb) è localizzato all'esterno del CDS, 11 pb dopo il codone di stop, all'interno della regione 3'-UTR come in HdCYC2c (Fig. 9 A e Fig. 10 A).
Fig. 8: Confronto delle sequenze CYC2c di Helianthus annuus (HaCYC2c) e H.
decapetalus (HdCYC2c) (A) L’allineamento delle sequenze nucleotidiche di HaCYC2c e di HdCYC2c è stato ottenuto con ClustalW2 (MUSCLE 3.8). In verde e magenta sono evidenziati rispettivamente i codoni di inizio e di stop della regione codificante. In giallo sono evidenziati gli introni posizionati nella regione 3'-UTR. Gli asterischi indicano i nucleotidi identici. (B) Allineamento delle sequenze amminoacidiche di HaCYC2c e di HdCYC2c è stato ottenuto con ClustalW Omega. In verde e azzurro sono evidenziati rispettivamente i domini conservati della clade CYC2, TCP e R. Gli asterischi indicano residui amminoacidici identici. (A) HaCYC2c TTTGTAATTTCTAAAATGTTAGCTTTTTTCATCATGTACAGTGTACTTTATAGTATTGAA HdCYC2c TTTGTAATTTCTAAAATGTTAGCTTTTTTCATCATGTACAGTGTACTTTATAGTATTGAA ************************************************************ HaCYC2c TAAACCGAAAGTAAAATATAGCTTGATGACCTTATTTAATACAGCAACGATCTCTCTATT HdCYC2c TAAACCGAAAGTAAAATATAGTTTGATGACCTTATTTAATACTGCAACGATCTCTCTATT ********************* ******************** ***************** HaCYC2c TACTAAAGTTTGGAGTGACCGTGTGGCAAAAACTGAGCTAACGCTTCTGTTAATGGTAAC HdCYC2c TACTAAAGTTTGGAGGGACCGTGTGGCAAAAACTGAGCTAACGCTTCTGTTAATGGTAAC *************** ******************************************** HaCYC2c ATTAATCTTTATAATGAGATACACAATTGACTTAATTGTCCAAAGGTCATAAGTTATGGT HdCYC2c ATTAATC-TTATAATGAGATACACGATAGACTTAATTGTCCAAAGGTCATAAGTTATGGT ******* **************** ** ******************************** HaCYC2c TACTGAAAGTTATATGCATTCCTATTTTTATCCTATATCTAGGTTTTGAATTTTTTTATA HdCYC2c TACTGAAAGTTATATGCATTCCTATTTTTATCCTACATCTAGGTTTTGAATTTTGTTATA *********************************** ****************** ***** HaCYC2c TTAATATAATCATCTAGAAAATTGAAAATAGTACATTTTTAACTCGTTTGTTTTCCTTAG HdCYC2c TTAATATAATCATCTAGAAAATTGAAAATAGTACATTTTTAACTCGTTTGTTTTCCTTAG ************************************************************ HaCYC2c TACTAGCACCCTATACTTTTGTATTGAAGGAGGAGGTATGAGCAGAGTTGTGCCCTAAAA HdCYC2c TACTAGCACCCTATACTTTTGTATTGAAGGAGGATGTATGAGCAGAGTTGTGCCCTAAAA ********************************** ************************* HaCYC2c AGGAAGATTTACAGTGTAAAGCTTAAGAGGGGTGGTGGTCTCTTAAATGCAACTTTACCC HdCYC2c AGGAAGATTTACAGTGTAAAGCTTAAGAGGGGAGGTGGTCTCTTAAATGCAACTTTACCC ******************************** *************************** HaCYC2c TTAGCTTTATTTGGATCAATGAACTTATATCTAAACTTCTTTGTTAACTATTATTGTTAT HdCYC2c TTAGCTTTATTTGGATCAATGAACTTATATCTAAACTTCTTTGTTAACTATTATTGTTAT ************************************************************ HaCYC2c TGTTTCTTTCATTTCCAAATTACAATGTTTTCCTCAAACCCTTTTCCACAGATTCCATCT HdCYC2c TGTTTCTTTCATATCCAAATTACAATGTTTTCCTCAAACCCTTTTCCACAGATTCCATCT ************ *********************************************** HaCYC2c CCCATCCATGTCTCACATCCTTTCAATTCCTTCTTTGACCTTGAAAGAAACGATGTATAT HdCYC2c TCCATCCATGTCTCACATCCTTTCAATTCCTTCTTTGACCTTGAAAAAAACGATGTATAT ********************************************* *************
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Fig. 9: Analisi della sequenza del gene H×mCYC2A di Helianthus × multiflorus.
(A) Sequenza nucleotidica di H×mCYC2A. In verde e magenta sono evidenziati rispettivamente i codoni di inizio e di stop della regione codificante. In giallo è evidenziato l'introne posizionato nella regione 3'-UTR. (B) Sequenza amminoacidica di H×mCYC2A. In verde e in azzurro sono evidenziati rispettivamente i domini conservati della clade CYC2, TCP e R.
(A) TTTGTAATTTCTAAAATGTTAGCTTTTTTCATCATGTACAGTGTACTTTATAGTATTGAATAAACCGAAAGTAAAATA TAGTTTGATGACCTTATTTAATACAGCAACGATCTCTCTATTTACTAAAGTTTGGAGGGACCGTGTGGCAAAAACTGA GCTAACGCTTCTGTTAATGGTATCATTAATCTTATAATGAGATACACAATTGACTTAATTGTCCAAAGGTCATAAGTT ATGGTTACTGAAAGTTATATGCATTCCTATTTTTATCCTATATCTAGGTTTTGAATTTTATTATATTAATATAATCAT CTAGAAAATTGAAAATAGTACATTTTTAACTCGTTTGTTTTCCTTAGTACTAGCACCCTATACTTTTGTATTGAAGGA GGAGGTATGAGCAGAGTTGTGCCCTAAAAAGGAAGATTTACAGTGTAAAGCTTAAGAGGGGAGGTGGTCTCTTAAATG CAACTTTACCCTTAGCTTTATTTGGATCAATGAACTTATATCTAAACTTCTTTGTTAACTATTATTGTTATTGTTTCT TTCATATCCAAATTACAATGTTTTCCTCAAACCCTTTTCCACAGATTCCATCTTCCATCCATGTCTCACATCCTTTCA ATTCTTTCTTTGACCTTGAAAAAAACGATGTATATCTCAACCATCATGAAGACAACAATAACCCTTTTGTCTCCGGTG ATTCTTTTTTTCATTCCTACAGCAATTTTGCTCCACAACCATCAGCCCTACCTCCAGTCACAGACTATATGCCTTCAA ATACACAAGAGTTAGATAGTCAAAACCAGCTGCTTGATCATGAAGGGTCTGGGTTGCAATATTGTGACAATTATAGTG ATCTTTTGGAGTCAGTGGTTTACCCATCTAAGAAAAAAGTGGTGACCTCAAAAAAAGATGGGCATAGTAAAATCCATA CCGCACAAGGCCCGAGAGATCGGAGGGTGAGATTGTCCATTGACATTGCAAGAAAGTTTTTTGTGCTTCAAGATTTGC TAGGTTTTGACAAAGCAAGCAAAACCCTTGATTGGCTCTTTACGAAGTCCAAGAAGGCGATTAAGGAGTTGATTGAAG AAACAAAGCACTCCTCGTCTTCCACTGTTAGTACTAATCAGTGTGAAATGGCTTTCCTAGAGACCATCCAGGGAGGAT CAGGATCAGGATCAGATGAAGATAAAGGGCAAAAAATGTCAGCTCTCAAGTTTCTTGATGGAGAAAAGAAGAAAATGA CACAAAAATGCAAATCTGGATTTCATGCTAGTCTTGCAAGAGGCCAGTCAAGGGCAGAGGCAAGAGCAAGGGCTAGGG AGAGAACAAAACAAAAATTGCGCATCAAGGAGCTAGACAACGACTTGAAGAAGGTTCCTGATGATTACCCTTGTCATG CATTAAGCCCCTCAAACGCAACACTCCAATCAAACTCTTGGGGTCAATTTGAATCACAAAGTGACTATAATGACATCC TTCAAGGATCAATGCTGGAACAAAGATTTTCAGTATCATCTTCAACTTTGTATACTTACAATCACAACTTTGTTGTAT CAGATGAGTGGATCTCCCAAATTTCATCCAAAGGTATGCCTAAATTTAAAGTAATTCATGAGGAGCAGAGTCACCGTG CAATGATATAGATCTACAAGAGGTAGATTAATTAATCAAATACAAAACACGGTCGTTACTGAATATAGTTTTTAAGAT TTCATATGCCGTTGTTTGTTTTGTCAACAGAACTCTGAAAGGAGAGCTGGAGAAAATCTAGTCTTCATCAGCCGGCAA ATAGATCTAGTAA (B) MNLYLNFFVNYYCYCFFHIQITMFSSNPFPQIPSSIHVSHPFNSFFDLEKNDVYLNHHED 60 NNNPFVSGDSFFHSYSNFAPQPSALPPVTDYMPSNTQELDSQNQLLDHEGSGLQYCDNYS 120 DLLESVVYPSKKKVVTSKKDGHSKIHTAQGPRDRRVRLSIDIARKFFVLQDLLGFDKASK 180 TLDWLFTKSKKAIKELIEETKHSSSSTVSTNQCEMAFLETIQGGSGSGSDEDKGQKMSAL 240 KFLDGEKKKMTQKCKSGFHASLARGQSRAEARARARERTKQKLRIKELDNDLKKVPDDYP 300 CHALSPSNATLQSNSWGQFESQSDYNDILQGSMLEQRFSVSSSTLYTYNHNFVVSDEWIS 360 QISSKGMPKFKVIHEEQSHRAMI 383
Fig. 10: Rappresentazione schematica dei due alleli del gene H×mCYC2c in
Helianthus × multiflorus. L’allele H×mCYC2cA (A) differisce da H×mCYC2cB (B) per la mancanza dell’elemento trasponibile (ET) CACTA nella regione in 5' del promotore (56 pb a monte di ATG). L’ET CACTA è lungo 862 pb. I tre nucleotidi (TTA) evidenziati in rosso, rappresentano la duplicazione nel punto di inserzione dell’ET. In verde e in azzurro sono rappresentati rispettivamente, il dominio TCP e R. Il triangolo verde indica il codone di start (ATG), il triangolo rosso indica il codone di stop (TAG) e il triangolo giallo indica l’introne. La rappresentazione schematica è in scala.
Le analisi dell’elettroforesi dei prodotti di PCR suggerivano la presenza di un diverso allele nel genoma di H. × multiflorus, come previsto per la natura poliploide di questa specie. A tale scopo, è stato amplificato e sequenziato un secondo prodotto di PCR (Fig. 11 e Fig. 12 A) ed è stato dimostrato che, come per H×mCYC2cA il peptide codificato da questo secondo allele, H×mCYC2cB, è costituito da 383 residui amminoacidici con una massa molecolare calcolata di 43.679 Da e un punto isoelettrico teorico di 7,25 (Fig. 12 B). Tuttavia, l’allineamento delle due sequenze hanno rilevato l’inserimento di 865 nucleotidi nella regione del promotore di H×mCYC2cB, 56 pb prima del codone di inizio ATG (Fig. 10 B e Fig. 12 A).
Fig. 11: Amplificazione dei due alleli di Helianthus × multiflorus (2.719 e 1.885
pb). M: Marker; 1, 2 e 3: campioni di DNA.
Fig. 12: Analisi delle sequenze di due alleli di H×mCYC2c di Helianthus ×
multiflorus. (A) L’allineamento delle sequenze nucleotidiche di H×mCYC2cA e H×mCYC2cB è stato ottenuto con ClustalW2 (MUSCLE 3.8). In H×mCYC2cB è inserito l'elemento trasponibile (ET) CACTA. In verde e magenta sono evidenziati rispettivamente i codoni di inizio e di stop della regione codificante. In giallo è evidenziato l'introne, posizionato nella regione 3'-UTR. Nella regione 5', l’elemento trasponibile CACTA è evidenziato in nero con lettere bianche. Il trasposone è fiancheggiato all'estremità 5' da una sequenza CACTA e all’estremità 3' dalla sequenza revertita complementare (evidenziata in blu con lettere bianche). In rosso, sono indicate le tre basi duplicate, generate dall'inserimento del trasposone. Gli asterischi indicano nucleotidi identici. Infine, in grigio sono evidenziati due polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) tra l'allele H×mCYC2cA e H×mCYC2cB. (B) L’allineamento delle sequenze amminoacidiche di H×mCYC2cA e H×mCYC2cB è stato ottenuto con ClustalW Omega. In verde e in azzurro sono evidenziati rispettivamente i domini conservati della clade CYC2, TCP e R. Gli asterischi indicano residui amminoacidici identici.
(A)
H×mCYC2cA TTTGTAATTTCTAAAATGTTAGCTTTTTTCATCATGTACAGTGTACTTTATAGTATTGAA H×mCYC2cB TTTGTAATTTCTAAAATGTTAGCTTTTTTC-TCATGTACAGTGTACTTTATAGTATTGAA
