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RIASSUNTO
Le microparticelle (Mp) sono state descritte per la prima volta nel 1967 come frammenti di membrana cellulare presenti nel plasma umano. Originariamente considerati artefatti in vitro o detriti cellulari privi di significato fisiologico, in questi ultimi anni sono aumentate le evidenze documentate di un ruolo delle Mp stesse come modulatori di differenti processi fisiopatologici come la coagulazione, le funzioni vascolari e l’infiammazione. In vitro, il rilascio delle Mp può avvenire a partire da diversi tipi cellulari stimolati o apoptotici (cellule endoteliali, piastrine, leucociti, eritrociti) e l’origine cellulare e la composizione delle Mp cambia come popolazione nelle varie condizioni patologiche. Le Mp si possono formare durante l’attivazione cellulare attraverso
diversi meccanismi, ma in generale il rilascio di Mp è tempo e Ca2+
dipendente. In vitro, l’attivazione cellulare si può osservare in seguito a stimolazione con diversi agonisti come trombina, calcio ionoforo, LPS,
che determinano aumento di Ca2+ citosolico, specialmente nel sito di
vescicolazione.
In un lavoro precedente svolto nel nostro laboratorio è stato dimostrato che i monociti/macrofagi umani stimolati con il calcio ionoforo A23187 liberano Mp con potenzialità proinfiammatoria nei confronti dell’epitelio
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delle vie aeree. Lo scopo del mio progetto è quello di verificare l’esistenza di stimoli fisiologicamente rilevanti in grado di produrre Mp. Tra i potenziali stimoli fisiologici si è pensato all’istamina. L’istamina è un’ammina primaria accumulata in granuli di secrezione dei basofili e dei mastociti ed è implicata come mediatore nelle reazioni allergiche. In particolare, tramite l’attivazione dei recettori H1, esercita una gran varietà di effetti ed è implicata in situazioni patologiche quali l’asma bronchiale e la rinite allergica, essa influenza inoltre la risposta del sistema immunitario modulando l’attività dei linfociti T, dei monociti e dei macrofagi. Questo studio si prefissa quindi di esaminare il ruolo di basse concentrazioni fisiologicamente rilevanti di istamina sull’attivazione di monociti/macrofagi e valutarne gli effetti sulla produzione di chemochine proinfiammatorie quali IL-8 e MCP-1 da parte di cellule dell’epitelio delle vie aeree. A tale proposito sono stati fatti esperimenti in parallelo, in cui lo stesso materiale, utilizzato per le analisi citofluorimetriche, è stato incubato con cellule di una linea cellulare, A549 (cellule neoplastiche in coltura continua originariamente ottenute da un paziente affetto da carcinoma bronchiolo-alveolare, che mantengono un fenotipo alveolare e sono utilizzate come modello di epitelio delle vie aeree). I monociti sono stati isolati da sangue periferico di donatori normali in seguito a centrifugazione per gradiente con Ficoll/Histopaque e fatti aderire su
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plastica per 18h a 37°C su una piastra da 96 pozzetti (2×106
cellule/pozzetto). Il rilascio di Mp da monociti aderenti è stato stimolato con istamina (30µM) per tempi diversi a 37°C. Dopo 18h d’incubazione, il mezzo condizionato è stato recuperato, purificato centrifugandolo a 14,000 × g per 5 min a temperatura ambiente, e analizzato. I sovranatanti dei monociti/macrofagi stimolati e non stimolati sono stati esaminati per la presenza di Mp attraverso l’analisi al FACS. Per la misurazione delle Mp, nei sovranatanti si è aggiunto un numero fisso di “beads” commercialmente disponibili dalla grandezza nota. Per valutare l’attività biologica , i sovranatanti sono stati incubati con le A549 , che sono state fatte crescere a confluenza su piastre da 96 pozzetti per 24 h a 37°C. Dopo 18h di incubazione il mezzo condizionato è stato raccolto, purificato centrifugandolo per 5 min a 12,000 rpm e analizzato per il contenuto di IL-8 e MCP-1. In alcuni esperimenti il sovranatante delle cellule mononucleate è stato filtrato (0,22 µm) oppure ultrafiltrato (100 kDa m.w. cut-off). La modulazione dell’espressione di IL-8 e di MCP-1 nei sovranatanti delle A549 è stato valutato utilizzando kits ELISA commercialmente disponibili e attraverso l’ RT-PCR usando primers da noi disegnati. Da esperimenti preliminari si osserva che il sovranatante dei monociti/macrofagi stimolati con istamina inducono la sovra-espressione di MCP-1 da parte delle A549. Questo effetto è
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annullato dalla filtrazione e dalla ultrafiltrazione. La stimolazione diretta delle A549 con istamina non determina alcun cambiamento sull’espressione di MCP-1. Per IL-8 si sono ottenuti risultati analoghi. L’attivazione cellulare mediata dal recettore H1 è confermata dal fatto che il rilascio di IL-8 e MCP-1 indotto da istamina è inibito in maniera concentrazione-dipendente da un agonista selettivo per il recettore H1, la prometazina. Da questo studio preliminare, si può concludere che l’istamina svolge, tra le altre, un’attività proinfiammatoria inducendo il rilascio di Mp da parte dei monociti. Queste rappresentano un meccanismo per amplificare la concentrazione locale delle citochine infiammatorie e chemiotattiche facilitando la comunicazione tra cellule epiteliali e monociti.
