Biomarcatori associati al processo d'invecchiamento: valutazione dei livelli trascrizionali dell’asse OPN/ miRNA 181-a nel tessuto epatico di ratti in funzione dell’età
Introduzione: L’invecchiamento è un fenomeno universale e inarrestabile che dipende da fattori molecolari endogeni ma anche dall’interazione dell’individuo con agenti esterni ed ambientali. Cambiamenti patologici e funzionali legati all’invecchiamento sono stati ampiamente studiati in vari organi tra cui il fegato, dove resta ancora controverso quale sia il loro contributo. I principali network legati all’invecchiamento di questo organo sembrano essere l’infiammazione, il cancro, l’omeostasi proliferativa e il metabolismo lipidico, ma ad oggi, la risposta infiammatoria sembra essere il meccanismo principalmente coinvolto. È infatti noto che l’invecchiamento è accompagnato da un basso grado di infiammazione caratterizzata da un aumento di proteine di fase acuta e citochine pro-infiammatorie, fenomeno denominato “inflamm-aging”. L’osteopontina (OPN), una glicoproteina della matrice extracellulare, svolge un ruolo importante come citochina nella risposta infiammatoria ed è stata recentemente individuata come marcatore di danno epatico ma quale sia la sua funzione durante l’invecchiamento non è stato ancora definito. Recentemente una sempre più crescente attenzione è stata rivolta al ruolo degli RNA non codificanti tra cui i miRNA e i long non-coding RNA identificati come nuovi biomarcatori associati al processo d'invecchiamento. Scopo: Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare, nel tessuto epatico di ratti di età diverse, le variazioni di espressione dell’OPN e del miRNA 181-a, mitomiR coinvolto nell’inflamm-aging e diretto regolatore dell’OPN a livello epatico; i profili trascrizionali del complesso lncRNA GAS-5/miRNA222 e del lncRNA NEAT-1 associati ai meccanismi molecolari fisiopatologici alla base dell’invecchiamento. Inoltre per monitorare il processo di senescenza è stata misurata la lunghezza telomerica e l’espressione di entrambe le subunità telomerasiche TERT e TERC.
Materiali e metodi: Sono stati studiati 29 ratti Wistar di sesso maschile, in funzione dell’età, suddivisi in tre gruppi: Gruppo A (n=6; età= 248±0.00 giorni-giovani), Gruppo B (n=13; età= 413.8±8,20 giorni-adulti), Gruppo C (n=10; età= 597,6±10,3 giorni-anziani). Da ciascun animale è stato prelevato tessuto epatico e conservato a -80°C. RNA totale e miRNA sono stati estratti contemporaneamente dai campioni tessutali con metodo specifico. L’espressione dei geni target è stata valutata attraverso reazioni di Real-Time PCR previo settaggio delle condizioni ottimali di reazione. Per la normalizzazione dei dati sono stati utilizzati geni di riferimento specifici. La valutazione ecografica “in vivo” e le analisi istologiche “ex-vivo” del tessuto epatico di ciascun animale hanno completato lo studio.
Risultati: i livelli di espressione di OPN sono risultati ridotti nel gruppo C (0,65±0,12) rispetto ai gruppi A (1,07±0,12) e B (1,32±0,26; p= 0,03 gruppo B vs gruppo C) mentre l’espressione del miRNA181-a è risultata aumentare significativamente in funzione dell’età (gruppo A=0,72±0,29; gruppo B= 1,09±0,08; gruppo C= 1,33±0,24; p= 0,03 A vs B; p= 0,02 A vs C). Per quanto concerne il complesso miRNA222/lncRNA-GAS5 è stato osservato un incremento della loro espressione nelle diverse fasce di età del miRNA222 (gruppo A=0,9+2±0,22; gruppo B= 1,54±0,16; gruppo C= 1,94±0,21; p= 0,02 A vs B; p= 0,003 A vs C) in parallelo ad una diminuzione dell’espressione del lncRNA-GAS5 nei ratti giovani ed anziani ma non negli adulti (gruppo A= 0,01±0,003; gruppo B= 1,89±0,19; gruppo C= 0,07±0,01; p< 0,001). NEAT-1, lncRNA ad azione oncogenica, ha mostrato invece un trend opposto aumentando nei tre gruppi studiati (gruppo A= 0,22±0,04; gruppo B= 0,24±0,05; gruppo C= 0,49±0,09; p= 0,02 B vs C). Una correlazione positiva è stata osservata tra miRNA181a e miRNA222 (R= 0,73; p<0,0001). L’analisi ecografica ha rilevato aree di iperecogenicità di grado crescente in funzione dell’età mostrando nel gruppo C una diffusione a tutto il parenchima epatico con ispessimento della glissoniana.
Lo studio dei telomeri ha evidenziato, come atteso, una riduzione significativa della lunghezza dei telomeri in funzione dell’età mentre l’espressione delle due subunità telomerasiche TERT e TERC hanno evidenziato un andamento tra loro opposto.
Conclusioni: in questo lavoro di tesi è stata valutata, per la prima volta nell’invecchiamento, l’espressione dell’OPN e del miRNA-181a. I risultati hanno mostrato una contro-regolazione dell’OPN miRNA-181a mediata sottolineato il loro ruolo come potenziali marcatori sia di inflamm-aging che di invecchiamento di successo. Dalla valutazione dell’asse miRNA222/GAS5, è emerso che l’espressione di GAS5 è diminuita nei ratti anziani rispetto agli adulti mentre miRNA222 aumenta in funzione dell’età, sottolineando un feedback regolatorio reciproco tra i due target. Inoltre, il bilanciamento tra i livelli di espressione di GAS5, oncosoppressore, e NEAT-1, oncogene, indicano l’assenza formazioni neoplastiche come anche confermato dalle analisi ecografiche effettuate sugli animali. Sebbene ulteriori studi siano necessari per comprendere il ruolo dell’OPN e degli RNA non codificanti nei processi molecolari alla base dell’invecchiamento, questo studio fornisce un valido punto di partenza per la comprensione dei cambiamenti fisiopatologici che si verificano con l'età individuando nell’asse OPN/miRNA181a un potenziale marcatore di infiammazione durante l’invecchiamento.
