La secrezione dell'ormone della crescita nell'iperparatiroidismo primitivo

INTRODUZIONE

L’interesse relativo alla complessità dei meccanismi di regolazione della secrezione dell’ormone somatotropo (GH) e all’azione esercitata su tessuto osseo e in particolare sul metabolismo minerale del calcio emerge con particolare rilievo dalla revisione della letteratura. Recentemente, numerosi lavori, hanno focalizzato l’attenzione, mediante indagini con colture in vitro e studi in vivo, sui rapporti di reciproca influenza tra ione calcio e GH (Ramirez e coll., 1999; Chen e coll., 2000; Van Goor e coll., 2001; Zivadinovic e coll., 2002; Johnson e coll., 2002).

Mentre risultano omogenee e consistenti le evidenze relative agli effetti del GH sul metabolismo osseo e calcico sia in vitro (Isaksson e coll., 1987; Ohlsson e coll., 1993; Werther e coll., 1993), che in vivo (Wüster e coll., 1991; Johansson e coll., 1992; Kaufman e coll., 1992; De Boer e coll., 1994; Holmes e coll., 1994), gli studi che hanno esplorato le influenze del calcio sui meccanismi di regolazione del GH mostrano osservazioni non univoche e contrastanti (Schernthaner e coll., 1983; Kovacs e coll., 1993).

Regolazione della secrezione del GH e ghrelina

Lo studio delle influenze neurotrasmettitoriali sulla secrezione somatotropinica è iniziato negli anni 60’ ed è stato oggetto di numerosi contributi che hanno sufficientemente chiarito le differenti azioni a livello sovraipotalamico, ipotalamico e ipofisario di queste sostanze. La secrezione dell’ormone della crescita è sottoposta principalmente al sistema regolatorio ipotalamo-ipofisario, costituito da due ormoni ipotalamici: il GHRH (prodotto soprattutto nel nucleo arcuato ed anche nel nucleo ventromediale) ad azione stimolatoria sia sulla sintesi che sulla secrezione (Wehrenberg e coll., 1982; Barinaga e coll., 1983; Lechan e coll., 1983; Fukata e coll., 1985) e la somatostatina (prodotta nella regione periventricolare adiacente il chiasma ottico) ad azione inibitoria sul rilascio dell’ormone, ma non sulla sua sintesi (Lechan e coll., 1983; Fukata e coll., 1985). Il GHRH e la somotostatina sono a loro volta regolati da mediatori e modulatori di origine centrale e periferica. Impulsi stimolatori centrali provengono a livello sovraipotalamico dall’ippocampo, a livello ipotalamico dal nucleo ventromediale; infine dall’amigdala, provengono impulsi sia stimolatori (amigdala basolaterale) che inibitori (amigdala corticomediale). Il prodotto delle cellule bersaglio del GH, ossia l’IGF-I, esercita a sua volta una funzione regolatoria a

tipo feed-back negativo sia a livello ipotalamico che ipofisario, nei due classici archi a lungo e breve termine. La cellula somatotropinica ipofisaria, influenzata dalla stessa concentrazione somatotropinica circolante (“autoregolazione del GH”), risente inoltre di influenze regolatorie a provenienza centrale o periferica che ne modificano la responsività ai messaggi ipotalamici.

Il GHRH, come sottolineato precedentemente, stimola sia la sintesi, attraverso un incremento della trascrizione del gene del GH, che il rilascio dell’ormone, agendo su specifici recettori di membrana delle cellule somatotrope. Il più importante meccanismo di trasduzione che media un’azione positiva sulla secrezione dell’ormone è il sistema AMP ciclico/adenilato ciclasi, ma il GHRH agisce anche mediante l’attivazione del sistema fosfatidil-inositolo/proteina chinasi C e il trasporto del calcio attraverso i canali di membrana con attivazione del sistema intracellulare calcio/calmodulina. Ramirez e coll., nel 1999, hanno rilevato che tra le cellule somatotrope porcine esistono due sottopopolazioni diverse sia nell’ultrastruttura che nella risposta secretoria e a fattori di regolazione, chiamate cellule a bassa e ad alta densità (LD e HD). L’adenilato ciclasi determina la formazione di cAMP con conseguente attivazione di una protein kinasi A che provoca la

fosforilazione e l’attivazione di alcune proteine e l’apertura di canali ionici, tra cui quelli per il calcio, che sono voltaggio dipendenti e che consentono allo ione di entrare nella cellula; la via dell’inositolo fosfato attiva una protein kinasi C con liberazione di calcio dalle riserve intracellulari reticolo-endoplasmatiche e mitocondriali. In particolare, sia nelle cellule LD che HD lo stimolo del GHRH porta all’attivazione della via del cAMP, mentre solo in quelle LD è coinvolta la via dell’inositolo fosfato (Gualillo e coll., 2001). L’esatto meccanismo che sta alla base di questa duplice attivazione di secondi messaggeri non è chiaro. Sono state considerate diverse possibili ipotesi: la prima coinvolge l’esistenza di diversi recettori per il GHRH, legati ciascuno a diversi sistemi effettori; la seconda ipotesi prende in considerazione il fatto che ci sia un unico recettore per entrambe le vie e che la modulazione avvenga attraverso enzimi o proteine G; infatti, secondo la teoria più attuale e forse più probabile, la subunità α della proteina G attiva l’adenilato ciclasi, mentre il complesso βγ attiva la fosfolipasi C, come è stato dimostrato nei granulociti umani HL-60 (Castano e coll., 1996).

La risposta al GHRH è variabile nei diversi individui, ciò è spiegato con il diverso tono somatostatinergico o di altri neurotrasmettitori. Il GHRH è richiesto per iniziare la secrezione

pulsatile del GH, mentre l’ampiezza dei picchi è modulata dalla somatostatina, infatti la somministrazione di anticorpi monoclonali diretti contro il GHRH abolisce la secrezione pulsatile di GH (Wehrenberg e coll., 1982; Lumpkin e coll., 1989; Jaffe e coll.,1993).

In aggiunta alla fisiologica stimolazione del GHRH il rilascio del GH dall’ipofisi è stimolato da piccole molecole sintetiche peptidiche e non dette “GH secretagoghi”, che agiscono mediante i recettori GHS-R, il cui ligando endogeno è stato recentemente individuato (Kojima e coll,. 1999) e nominato ghrelina (dalla radice indo-europea della parola crescita: grhe).

La ghrelina è un peptide di 28 aminoacidi prodotto principalmente a livello gastrico, piccole quantità sono state inoltre individuate anche a livello intestinale, renale, pancreatico, placentare, testicolare, ipofisario, polmonare, ipotalamico e nel sistema immunitario (Kojima e coll., 1999; Tena-Sempere e coll., 2002; Date e coll., 2000; Mori e coll., 2000; Gualillo e coll., 2001; Korbonits e coll., 2001; Volante e coll., 2001; Muccioli e coll., 1998; Hattori e coll., 2001; Tanaka e coll., 2001; Chapman e coll., 1996; Volante e coll., 2002). L’azione della ghrelina è mediata da specifici recettori tipo 1a dei secretagoghi del GH (GHR-R1a), Howard e coll., 1996).

Dalla letteratura emerge che inizialmente sono stati sintetizzati dei secretagoghi sintetici, ossia dei ligandi che includono molecole peptidiche (GHRP-6) e non peptidiche (spiroindolina, MK-0677) (Muccioli e coll., 1998; Smith e coll., 1997; Ghigo e coll., 2001; Bowers, 1993; Bowers, 1994; Bowers, 1998; Camanni e coll., 1998; Pan e coll., 2001; Raun e coll., 1998; De Vita e coll., 1998; Chang e coll., 1995; Elias e coll., 1995; McDowell e coll., 1995; Deghenghie coll., 1995; Hansen e coll., 2001) capaci di stimolare la secrezione del GH, successivamente è stato dimostrato che tali GHS agivano mediante specifici recettori, ossia i GHS-R, indicati allora come “recettori orfani”. Con la scoperta di MK-0677 si è giunti all’individuazione e clonazione di GHS-R.

Questo recettore è presente sopratutto a livello ipotalamo-ipofisario, anche se è stato trovato in altre aree cerebrali e tessuti periferici endocrini e non endocrini (Kojima e coll., 1999; Tena-Sempere e coll., 2002; Date e coll., 2000; Mori e coll., 2000; Gualillo ecoll., 2001; Korbonits e coll., 2001; Volante e coll., 2001; Muccioli e coll., 2002; Hattori e coll., 2001; Gnanapavan e coll., 2002; Muccioli e coll., 1998; Muccioli e coll., 2000; Papotti e coll., 2000; Guan e coll., 1997; Bluet-Pajot e coll., 2001; Korbonits e coll., 1998), così da spiegare sia l’effetto rilasciante GH dei GHS sia le loro altre attività

biologiche endocrine e non endocrine (Tena-Sempere e coll., 2002; Muccioli e coll., 2002; Hattori e coll., 2001; Smith e coll., 1997; Arvat e coll., 2001; Ghigo e coll., 2001; Muccioli e coll., 2000; Cassoni e coll., 2001; Kamegai e coll., 2000; Masuda e coll., 2000; Tschop e coll., 2000; Wren e coll., 2000; Broglio e coll., 2001; Date e coll., 2001; Kamegai e coll., 2001; Nagaya e coll., 2001; Nakazato e coll., 2001; Wren e coll., 2001; Egido e coll., 2002; Zhang e coll., 2001; Nieminen e coll., 2002; Tolle e coll., 2002; Asakawa e coll., 2001; Jeffery e coll., 2002; Bennett e coll., 1997; Casanueva e coll., 1999; Bodart e coll., 2002; Okumura e coll., 2002; Horvath e coll., 2001; Inui, 2001; Furuta e coll., 2001; Furuse e coll., 2001; Frohman e coll., 2000; Yoshihara e coll., 2002; Ghigo e coll., 1999).

La ghrelina è prodotta principalmente dallo stomaco (dalle cellule enteroendocrine X/A simili che rappresentano la più importante popolazione endocrina nella mucosa oxintica), ma espressa anche in altri tessuti, come soprariportato.

Le principali azioni della ghrelina sono: stimolazione della secrezione di GH

stimolazione della secrezione di PRL e ACTH

azione inibitoria sull’asse ipofisi-gonadi sia a livello periferico che centrale

stimolazione dell’appetito e di un bilancio energetico positivo influenza sul sonno e sul comportamento

controllo della motilità gastrica e della secrezione acida

regolazione della funzione endocrina ed esocrina del pancreas

condizionamento dei livelli di glucosio

Inoltre la ghrelina e i GHS agiscono anche sul cardiovascolare (influenzando la performance cardiaca e la resistenza vascolare) e modulano la proliferazione delle cellule neoplastiche.

La ghrelina è il primo ormone naturale ad essere identificato in cui il gruppo ossidrilico di uno dei suoi residui di serina è acetilato da un acido n-octanoico; questo è essenziale per il legame al GHS-R 1a. La forma non acetilata, che è presente nel siero umano in maggiori quantità rispetto alla forma acetilata, è priva di funzioni endocrine; infatti, nell’uomo la somministrazione di ghrelina non acetilata non induce alcuna modificazione dei parametri ormonali o dei livelli di glucosio (Broglio e coll., 2003). La forma non acetilata sembra in ogni caso svolgere effetti cardiovascolari ed anti proliferativi probabilmente mediati da diversi sottotipi di GHS-R o da altre famiglie recettoriali (Date e coll., 2000; Cassoni e coll., 2001).

Il legame della ghrelina al GHS-R 1a porta all’attivazione della fosfolipasi C con aumento del turnover dell’inositolo fosfato, attivazione della proteinchinasi C seguita dal rilascio di Ca++ _dai

depositi intracellulari (Smith e coll., 1997; Kojima e coll., 2001). L’attivazione del GHS-R 1a porta anche ad un'inibizione dei canali di K+, permettendo l’ingresso di Ca++ attraverso i canali voltaggio-dipendenti di tipo L, ma non di tipo T (Chen e col., 1996; Casanueva e coll., 1999). La ghrelina e i segratogoghi sintetici possiedono una potente e dose-dipendente attività di rilascio del GH, che è più spiccata nell’uomo che non nell’animale. GHS naturali e sintetici stimolano il rilascio di GH dalle cellule somatotrope in vitro (Kojima e coll., 1999; Sartor e coll., 1985; Bowers e coll., 1991; Akman e coll., 1993; Badger e coll., 1984; Cheng e coll., 1989; Cheng e coll., 1993; Cheng e coll., 1993; Goth e coll., 1992; Herrington e coll 1994; Locatelli e coll., 1994; Smith e coll., 1993; Wu e coll., 1994; Wu e coll., 1994; Glavaski-Joksimovic e coll., 2003; Hashizume e coll., 2003) probabilmente attraverso la depolarizzazione della membrana e un aumento della quantità di GH secreto per cellula (Goth e coll., 1992). In vitro, questa attività di rilascio è meno potente rispetto a quella del GHRH (Sartor e coll., 1985; Bowers e coll., 1991; Badger e coll., 1984; Blake e coll., 1991). L’effetto stimolatorio sul rilascio di

GH è più forte in vivo che in vitro. Infatti, in vivo, i GHS mostrano effetti sinergici al GHRH (Bowers e coll., 1991; Malozowski e coll., 1991), indicando che essi agiscono, almeno parzialmente, attraverso diversi meccanismi. L’azione della ghrelina e degli altri GHS sintetici si svolge principalmente a livello ipotalamico, come dimostrato dalla riduzione se non abolizione del rilascio del GH, quando si hanno delle lesioni a livello del peduncolo ipofisario nell’animale. Nell’uomo, la risposta di GH ai GHS è fortemente inibita, se non abolita, da antagonisti del recettore del GHRH, come pure da disconnessioni ipotalamo-ipofisarie, ad indicare che l’azione della ghrelina sia mediata dai neuroni secernenti GHRH (Hickey e coll., 1996; Popovic e coll., 1995; Pandya e coll., 1998; Popovic e coll., 2003).

Il modello di azione dei GHS/ghrelina potrebbe coinvolgere: 1) attivazione dei neuroni producenti GHRH, con incremento del suo rilascio, 2) amplificazione degli effetti del GHRH sulle cellule somatotrope, 3) azione antagonista alla somatostatina.

L’effetto dei GHS sul rilascio di GH è correlato all’età: aumenta nella pubertà, raggiunge il plateau nell’adulto e diminuisce nell’anziano (Ghigo e coll., 2001). L’aumento che avviene durante la pubertà è dovuto all’influenza positiva degli estrogeni, che aumentano l’espressione di GHS-R (Kamegai e coll., 1999; Arvat e

coll., 1997; Arvat e coll., 1998; Arvat e coll., 1997; Carmignac e coll., 1998; Loche e coll., 1997; Bellone e coll., 1995), comunque l’insufficienza di estrogeni non spiega sufficientemente la ridotta risposta di GH ai GHS nelle donne in postmenopausa (Ghigo e coll., 2001; Arvat e coll., 1997; Anderson e coll., 2001; Anderson e coll., 2001; Giustina e coll., 1998). I ridotti livelli presenti nella vecchiaia sono causati da variazioni età-correlate nel controllo neuronale della funzione somatotropa (Ghigo e coll., 2001; Giustina e coll., 1998), oppure da una riduzione dell’attività del sistema GHS endogeno (Muccioli e coll., 1998; Giustina e coll., 1998; Thorner e coll., 1997).

Recentemente molti studi sono stati indirizzati ad indagare se il rilascio del GH sia la fondamentale azione fisiologica della ghrelina. Gli antagonisti del GHRH inibiscono la secrezione di GH nelle 24h ma non hanno effetti sui livelli di ghrelina (Barkan e coll., 2003); ciò è supportato anche dal fatto che la secrezione di ghrelina è pulsatile e correlata più con l’introito calorico che con le pulsazioni di GH (Tolle e coll., 2002).

In questi anni i vari GHS sono stati utilizzati a scopo diagnostico e ipotizzati come agenti terapeutici. In particolare negli ultimi anni ghrelina è stata indicata come test di stimolo nella diagnosi di GHD (Hataya e coll., 2001; Ghigo e coll., 1998; Popovic e

coll., 2000; Aimaretti e coll., 2002). Dal punto di vista terapeutico gli analoghi della ghrelina a lunga durata di azione e attivi per os potrebbero essere usati come trattamento anabolico nei soggetti anziani (nei quali si ha la cosiddetta somatopausa), alcuni benefici sono stati riportati nei soggetti affetti da osteoporosi.

I recettori α2-adrenergici e la serotonina stimolano la

secrezione di GH e GHRH, mentre il GABA inibisce la secrezione di GHRH. Le vie α-adrenergiche rappresentano i principali regolatori del rilascio di GHRH, i farmaci che mimano l’azione della noradrenalina (esempio la clonidina), aumentano la produzione, mentre i bloccanti (fentolamina) la inibiscono.

Anche i fattori metabolici, influenzano la secrezione del GH: glucidi, aminoacidi, lipidi.

La secrezione somatotropinica soggiace anche all’influenza, diretta o indiretta, di altri assi ormonali. Gli effetti più noti ed importanti dal punto di vista fisiopatologico sono quelli prodotti dagli steroidi sessuali: la somministrazione di androgeni o di estrogeni produce un incremento della responsività somatotropinica agli stimoli utilizzati comunemente nella pratica clinica (Mauras e coll., 1990; Ulloa-Aguirre e coll., 1990). Il testosterone incrementa l’ampiezza dei picchi secretori del GH (Ulloa-Aguirre e coll., 1990), mentre

l’estradiolo incrementa il numero dei picchi e potrebbe inoltre aumentarne anche l’ampiezza (Mauras e coll., 1990). La secrezione integrata delle 24 ore del GH è approssimativamente 50% più alta nelle giovani donne mestruate che non nei giovani adulti maschi (Ho e coll., 1987; e Hartman e coll., 1990), soprattutto in virtù di un aumento del numero e dell’ampiezza dei picchi secretori (Hartman e coll., 1990), ciò avviene durante la fase follicolare tardiva del ciclo mestruale; da sottolineare infatti che i livelli di GH sono positivamente correlati con i livelli di estrogeni e negativamente correlati con i livelli di progesterone (Faria e coll., 1992). La terapia sostitutiva estrogenica nelle donne in menopausa incrementa la secrezione del GH nelle 24 ore e la risposta del GH allo stimolo con GHRH (Dawson-Hughes e coll., 1986; Weissberger e coll., 1991). Da notare inoltre che la somministrazione orale di estrogeni diminuisce i livelli di IGF-I attraverso una inibizione della loro sintesi a livello epatico (Murphy e coll., 1988). E’ quindi ipotizzabile anche una riduzione del feedback di questi ultimi come responsabile dell’aumentata secrezione di GH indotta dagli estrogeni (Dawson-Hughes e coll., 1986; Weissberger e coll.,1991).

Anche gli ormoni tiroidei influenzano positivamente la secrezione del GH, come dimostrato da dati clinici e sperimentali,

mentre la secrezione corticosteroidea ha effetto inibitorio sull’ormone della crescita. La massima stimolazione dei tessuti da parte del GH richiede la presenza di ormoni tiroidei. L’ipotiroidismo primario, causa una riduzione sia del numero di cellule somatotrope, sia del contenuto di GH nell’ipofisi anteriore e conduce anche ad una mancata risposta del GH alla stimolazione con ipoglicemia insulinica o l-arginina.

Regolazione della secrezione di GH e livelli di calcemia

Le cellule somatotrope sono distinte, morfologicamente e funzionalmente, in due sottopopolazioni: cellule a bassa e ad alta densità (Chen e coll., 2000). Ramirez e coll. (1999) hanno rilevato in cellule porcine, che il GHRH condiziona differenti patterns di incremento della concentrazione Ca++ intracellulare citosolica e che le cellule a bassa densità richiedono non solo un flusso di Ca++ _ma

anche una mobilizzazione calcica intracellulare. Nonostante la prevalente via di trasduzione del segnale intracellulare, impiegato dal GHRH, sia in entrambe le popolazioni l’adenilato ciclasi/cAMP/Ca++

extracellulare, il peptide necessita anche dell’attivazione della fosforilasi C/Ca++ _{intracellulare per esercitare una completa azione}

hanno dimostrato, nelle cellule ovine ed umane, che il GHRH stimola la secrezione di GH attraverso modificazioni del flusso di calcio.

Nei pesci, in uno studio su cellule somatotrope (Johnson e coll., 2002) è stato indagato, mediante impiego di tapsigargina, rianodina e KCl, il ruolo dei depositi di Ca++ _{intracellulari sulla}

secrezione, sintesi e livelli di mRNA del GH, emergendo come alcune vie secretorie possono essere controllate indipendentemente dalla funzione specifica dei depositi di Ca++_{. Sempre nei pesci, la}

regolazione per il rilascio di gonadotropine e di GH è condizionata significativamente dal flusso o dalla mobilizzazione intracellulare di Ca++, che gioca un importante ruolo nella trasduzione del segnale. Nei mammiferi lo ione Ca++ sembra agire anche sulla trascrizione dei geni di tali ormoni. L’esposizione di colture primarie di cellule pituitariche di tilapia a correnti ionoforetiche di calcio incrementa la secrezione di gonadotropine e GH dopo 5-24 ore, senza significative variazioni dei livelli di mRNA. E’ stato inoltre ipotizzato che l’effetto apoptosi-like sulla cellula provocato dal calcio e dimostrato in vitro potrebbe essere coinvolto nella regolazione dimensionale della cellula stessa (Melamed & Yaron,1999).

Zivadinovic e coll. (2002) hanno mostrato nell’uomo, su cellule dell’ipofisi anteriore, le potenziali funzioni extracellulari del Ca++,

studiando come questo ione possa intervenire anche come agonista della proteina G associata ai recettori sensibili al Ca++ in rapporto al tipo cellulare specifico, evidenziando una responsività delle cellule somatotrope e lattotrope, ma non delle gonadotrope.

Van Goor e coll. (2001) hanno mostrato che l’espressione dei canali del Ca++ è più alta nelle cellule somatotrope, che non in quelle lattotrope e gonadotrope; queste evidenze indicano l’esistenza di pattern di cellule tipo specifiche per l’espressione dei canali ionici di membrana, che può essere di significato fisiologico per il controllo dell’omeostasi calcica e della secrezione ormonale nelle cellule dell’ipofisi anteriore, indipendentemente dalla stimolazione recettoriale.

Gli effetti del blocco dei canali del calcio mediante l’impiego di verapamil sulla risposta prolattinica al TRH, L-dopa e bromocriptina sono stati indagati da Kamal & Molitch (1992). Il calcioantagonista somministrato per 1 settimana al dosaggio di 240 mg/die per os in 8 volontari sani ha indotto elevazione dei livelli basali di PRL, incremento della risposta prolattinica al TRH. Il verapamil non ha mostrato effetti sui livelli basali o stimolati mediante L-dopa di GH. Cervia e coll. (2002) riportano che le cellule pituitariche di ratto sono inibite dalla somatostatina mediante l’azione sui recettori SS1 e SS2.

Quando la somatostatina si lega a questi ultimi inibisce la secrezione di GH tramite l’inibizione del flusso intracellulare del Ca++, mentre quando si lega agli SS1 riduce l’attività dell’adenilato ciclasi.

In vivo gli studi nell’uomo sugli effetti dell’eccesso o deprivazione di calcio sulla secrezione del GH non sono definitivi. In letteratura sono riportati pochi e contraddittori lavori sulla funzione ipofisaria nei soggetti affetti da iperparatiroidismo primitivo.

Schernthaner e coll. (1983) hanno riportato livelli di GH significativamente più alti prima dell’intervento di paratiroidectomia rispetto al post-intervento, mentre i livelli di PRL non subivano modificazioni.

Kovacs e coll. (1993) invece, hanno evidenziato nei soggetti affetti da iperapartiroidismo primitivo, sottoposti ad intervento di paratiroidectomia, un incremento della secrezione del TSH dopo stimolo, associato ad un aumento della secrezione spontanea di GH e di PRL, in assenza di modificazioni a carico di FSH e LH.

Nel 1989 Gillet e coll., hanno rilevato valori di TSH basali e dopo stimolo diminuiti nel pre-intervento, con T3 e T4 nella norma, e

loro ritorno a valori usuali nel post-intervento a distanza di 2-12 mesi. I risultati di tale lavoro sono in accordo con quelli di Hiramatsu e coll.

(1983), che inoltre, hanno osservato un aumento dei livelli di TSH basali e dopo stimolo nei soggetti affetti da ipoparatiroidismo.

Sowers e coll. (1980) hanno riportato che nel ratto la funzione dell’ipofisi anteriore è inibita dall’infusione di calcio in maniera proporzionale ai livelli raggiunti.

Veldhuis e coll. (1984) hanno studiato la funzione ipofisaria nei soggetti normali durante l’infusione acuta di calcio associata ai test di stimolo, concludendo che l’ipercalcemia acuta non modifica la concentrazione di GH, mentre aumenta la risposta delle gonadotropine allo stimolo e diminuisce quella del TSH e della PRL.

Ormone della crescita e metabolismo osseo

Il metabolismo minerale ed osseo è un fenomeno complesso, regolato da un intricato influsso reciproco tra sistema ormonale e fattori prodotti localmente (citochine, prostaglandine, fattori di crescita), che esercitano azioni autocrine e paracrine sulle cellule dell’osso e sui loro precursori (Canalis e coll., 1983; Canalis e coll., 1989; Ohlsson e coll., 1993).

Gli ormoni coinvolti nella regolazione del metabolismo minerale ed osseo sono principalmente il PTH e la vitamina D; l’osso inoltre, è un tessuto “target” degli ormoni tiroidei e dell’ormone della

crescita, così come gli steroidi gonadici e il cortisolo esercitano un’azione su di esso (Canalis e coll., 1983; Ohlsson e coll., 1993). Gli effetti del GH sull’osso sono più evidenti nei bambini, dove stimola la crescita longitudinale dell’osso; successivamente, nella vita adulta, tale ormone continua ad esercitare un effetto anabolico sullo stesso tessuto per il mantenimento della massa minerale, come evidenziato ampiamente in letteratura, dalle alterazioni della densità minerale ossea in condizioni di eccesso e di deficit ormonale.

Nell’acromegalia attiva, l’escrezione urinaria di calcio e l’idrossiprolina, indici del catabolismo osseo, sono aumentati (Halse & Gordeladze 1978; Ho e coll., 1992), rientrando nei limiti della norma nei soggetti responsivi al trattamento specifico. Molti studi inoltre dimostrano la correlazione positiva tra l’aumento dei livelli dell’idrossiprolina urinaria ed i livelli di GH e IGF-I nell’acromegalia attiva (Halse & Gordelazede 1981; Ezzat e coll., 1993). L’osteocalcina, indice dell’attività degli osteoblasti, è aumentata nell’acromegalia attiva (Johansen e coll., 1990; Ezzat e coll., 1993; Terzolo e coll., 1993) ed i suoi livelli positivamente correlati con quelli di GH e IGF-I nella patologia attiva, si normalizzano nei soggetti con risposta al trattamento medico o chirurgico (De la Piedra e coll., 1988; Terzolo e coll., 1993).

Il deficit di GH, ad insorgenza in età pediatrica o in età adulta, si associa ad una riduzione della densità minerale ossea (BMD) e della massa ossea, più evidente a livello della colonna lombare (Wüster e coll., 1991) o dell’avambraccio (Elgindy e coll., 1991), ciò favorisce l’ incremento del rischio di frattura in tali pazienti (Wüster e coll., 1991), sovrapponibile a quello dei pazienti affetti da osteoporosi di diversa etiologia. Gli adulti con deficit dell’ormone della crescita (GHD) non trattato hanno una riduzione sia della formazione dell’osso (Amato e coll., 1993) che una riduzione della massa minerale (Johansson e coll.,1992; Holmes e coll., 1994).

Inoltre, numerosi studi hanno rilevato un’ampia omogeneità tra la densità minerale ossea nei pazienti con GHD isolato e con GHD associato ad altri deficit ipofisari, dimostrando che la deficienza di GH gioca un ruolo chiave nella riduzione della massa ossea (Kaufman e coll., 1992; De Boer e coll., 1994). Tale evidenza è supportata dal fatto che i soggetti in trattamento sostitutivo correggono o migliorano la densità minerale ossea.

Analogamente alle alterazioni densitometriche, la carenza di GH sembra esercitare effetti negativi sul turnover osseo del paziente adulto, anche se in misura minore rispetto a quanto dimostrato nel bambino. E’ stata infatti, documentata la presenza di una ridotta

attività osteoblastica, sostenuta dai ridotti livelli di osteocalcina (Delmas e coll., 1986), in presenza di una normale attività osteoclastica. Si deve comunque considerare che i soggetti adulti, avendo generalmente raggiunto un normale picco di massa ossea, sono probabilmente meno sensibili agli effetti negativi della carenza di GH.

Clinicamente rilevante è il declino della secrezione del GH e dell’IGF-I durante l’invecchiamento, proposto da differenti autori come fattore causale nello sviluppo dell’osteopenia in questa età (Aitken e coll., 1973; Rudman e coll., 1990). Tale effetto può essere mediato primariamente da due meccanismi che possono agire inpendentemente o associati quali l’incremento dell’attività degli osteoclasti e la riduzione dell’attività osteoblastica. E’ stato inoltre riportato in letteratura che la riduzione della massa minerale ossea con l’età diminuisce parallelamente alla riduzione dei livelli di GH, IGF-I (Finkelstein e coll., 1972; Ho e coll., 1987).

Ulteriori ricerche si sono rese necessarie per circoscrivere le disomogeneità emerse dagli studi attualmente disponibili e nel tentativo di delineare un profilo conclusivo dei complessi meccanismi sottostanti la base delle influenze tra lo ione Ca++ _{ed il GH.}

Secrezione dell’ormone della crescita e iperparatiroidismo primitivo Dalla letteratura si delinea un profilo complesso e contrastante, che non consente di individuare definiti meccanismi fisiopatologici nei rapporti tra ione calcio e GH.

In questa linea di ricerca nel nostro Dipartimento è stata valutata la secrezione dell’ormone della crescita nei pazienti affetti da iperparatiroidismo primitivo.

Negli anni 1999-2002 sono stati arruolati 45 pazienti affetti da iperaparatiroidismo primitivo (9 maschi, 36 femmine, di cui 4 in età fertile, con età media di 58,1 anni, range 23-77, BMI 25,42±2.1). La secrezione dell’ormone della crescita è stata studiata mediante il test di stimolo massimale classico con GHRH+arginina in tutti i pazienti e mediante la secrezione di GH durante le 24 ore in 5 pazienti. Inoltre in un sottogruppo di soggetti (12 femmine e 4 maschi, di età media di 58.5 ±9.8 anni, range 39-73), è stata valutata la secrezione delle altre tropine ipofisarie mediante i test di stimolo classici con “realising ipotalamici” (TRH, CRH, GnRH).

I risultati di tali studi hanno evidenziato che i pazienti affetti da iperparatiroidismo primitivo mostrano una riduzione significativa della secrezione di GH (71%), in associazione ad una normale secrezione

delle altre tropine ipofisarie (100%), Cecconi e coll,. 2002, Gasperi e coll., 2002.

In dettaglio i valori di picco del GH dopo lo stimolo massimale evidenziavano un deficit di GH severo (ossia valori di picco inferiori al 1° centile: 9 µg/L) nel 35.55% dei casi, e una insufficiente secrezione di GH in un altro 35.55%, (ossia valori di picco inferiori al 3° centile 16.5 µg/L).

Confrontando la risposta del GH al test di stimolo con la presenza o meno di sintomatologia emergeva che il 62.5% dei pazienti che presentavano una risposta deficitaria al test erano affetti da osteoporosi, contro il 15% dei soggetti con risposta nella norma. Inoltre un secondo sottogruppo di pazienti formato da 5 soggetti (4 femmine, 1 maschio, di età compresa tra 46 e 60 anni) è stato studiato mediante la secrezione del GH durante le 24 ore (ritmo circadiano del GH), in tali pazienti l’indice di produzione del GH durante le 24 ore e la media dell’ampiezza di secrezione ai picchi erano significativamente più basse rispetto ai controlli, mentre la frequenza delle pulsazioni risultava simile a quella dei soggetti normali.

Sono state inoltre reclutate due famiglie, i cui componenti erano affetti da ipercalcemia ipocalciurica familiare (FHH), rara

condizione autosomica dominante caratterizzata da ipercalcemia asintomatica non associata ad ipersecrezione di PTH. Tale condizione benigna di ipercalcemia è causata da una mutazione inattivante del gene del sensore del calcio, che risulta in una diminuita sensitività delle cellule ai livelli di calcemia. Tali famiglie sono state studiate valutando la secrezione di GH, basale e dopo stimolo e la funzione ipofisaria. In tali soggetti la risposta del GH allo stimolo risultava deficitaria nel 82% dei casi, Cecconi e coll., 2003.

Trenta pazienti (23 femmine e 7 maschi) sottoposti ad intervento di paratiroidectomia sono stati nuovamente sottoposti alla valutazione basale e dinamica della secrezione del GH: 6 pazienti che avevano mostrato nella fase pre-intervento una risposta al test GHRH+arginina nella norma, hanno confermato tale responsività nel post-intervento, 24 pazienti con risposta deficitaria nel pre-intervento hanno mostrato nel 58.3% dei casi un miglioramento statisticamente significativo nel post-intervento, Cecconi e coll., 2004.

Il diretto ruolo della condizione patologica di iperparatiroidismo, quale causa della ridotta secrezione di GH è supportata dall’assenza di altre condizioni note associate a deficit dell’ormone della crescita nei soggetti adulti, quali obesità, pregresso trauma cranico ed alterazioni

ipotalamo/ipofisarie (sindrome della sella vuota, tumori, pregresso intervento e/o irradiazione).

La riduzione della secrezione di GH nei pazienti con PHP non è correlata con i livelli di calcio ionizzato, nè con quelli di PTH o del BMI; è invece presente una correlazione positiva con la durata presunta della malattia associata ad alterazioni d’organo ed apparato tipici dell’iperparatiroidismo primitivo (calcolosi renale e osteoporosi).

La ridotta secrezione dell’ormone della crescita sembra essere una risposta alla condizione cronica di ipercalcemia, indipendentemente dalla causa della stessa, come dimostrato dalla presenza di tale alterazione in differenti condizioni (PHP e FHH). Infatti, un’altra condizione di ipercalcemia cronica quale è quella che si riscontra nell’ipercalcemia ipocalciurica familiare è associata ad una riduzione dei livelli di GH indagati sia basalmente che dopo stimolo.

Come già riportato precedentemente nel 58,3% dei soggetti che sono stati sottoposti ad intervento di paratiroidectomia si ha, un miglioramento post-operatorio statisticamente significativo della risposta del GH allo stimolo con GHRH + arginina, anche se solo nel 21% dei casi si ha il ripristino di una risposta di picco nel range della normalità.

In considerazione di queste evidenze è possibile sostenere che, in pazienti adulti con iperparatiroidismo primitivo, l’associazione dell’insufficiente secrezione del GH è transitoria e non necessita di trattamento sostitutivo, in quanto a distanza di tempo, variabile tra 3 e 12 mesi, è ipotizzabile attendere la riattivazione della secrezione di GH, conseguente alla normalizzazione del metabolismo calcico.

OBIETTIVI

Lo scopo primario dello studio è quello di verificare che la condizione di cronica ipercalcemia sia la responsabile della diminuita secrezione dell’ormone della crescita nei soggetti affetti da iperaparatiroidismo primitivo, mediante la dimostrazione di assenza di modificazioni della secrezione ormonale nei pazienti affetti da iperparatiroidismo secondario.

Inoltre vogliamo documentare che anche un altro secretagogo, diverso da quello classico e con un meccanismo d’azione distinto, quale è la ghrelina, conferma la presenza di una ridotta secrezione dell’ormone della crescita nell’iperparatirodismo primitivo.

Altro obiettivo è quello di verificare l’influenza dell’eventuale deficit di GH sulla densità minerale ossea nelle pazienti affette da iperparatiroidismo primitivo in età menopausale, poiché, come è ampiamente evidenziato in letteratura, il GH oltre a stimolare la crescita longitudinale dell’osso nel bambini, continua ad avere nella vita adulta un effetto anabolico sull’osso per il mantenimento della massa minerale.

In vitro verifica dell’importanza del calcio nella secrezione del GH.

MATERIALI e METODI

Soggetti

Nel presente studio abbiamo ampliato la nostra casistica, arrivando a reclutare 60 pazienti (51 femmine e 9 maschi). Tutti i pazienti sono affetti da iperparatiroidismo primitivo sporadico, causato da un adenoma paratiroideo (PHP), sono stati scelti indipendentemente dal sesso e dall'età, escludendo quelli con indice di massa corporea (BMI) > di 28. In tali pazienti di età compresa tra 20 e 75 anni, media 56 anni, range 20-75, con valore medio di BMI pari a 26,0 ± 1,3, la diagnosi di PHP è stata stabilita mediante il dosaggio del calcio ionizzato (Ca++), del paratormone, della calcemia totale corretta per i livelli di albuminemia e proteinemia totale, della fosforemia, della calciuria e della fosfaturia, del rapporto clearance calciuria/clearance della creatinina, dei markers di rimodellamento osseo (osteocalcina, cross laps urinario e sierico, fosfatasi alcalina ossea), della 1,25 OH vitamina D e 25 OH vitamina D; l’ecografia del collo con sonda lineare di 7,5 MH; la scintigrafia paratiroidea con sesta-mibi, la densitometria ossea radiale, vertebrale e femorale.

I segni e sintomi clinici di iperparatiroidismo, quando presenti, risalivano a 1-10 anni prima della diagnosi.

In tutti i pazienti è stata inoltre eseguita la risonanza magnetica della sella turcica, al fine di escludere dallo studio i soggetti con alterazioni morfologiche ipotalamo/ipofisarie, così come in tutti è stata esclusa l’associazione di altre neoplasie endocrine (MEN I e II), mediante il dosaggio delle tropine ipofarie (PRL, GH, ACTH, FSH, LH, TSH), degli ormoni gastroenterici (gastrina, insulina, glucagone, VIP, serotonina), della calcitonina, delle catecolamine plasmatiche ed urinarie, l’ecografia del collo e dell’addome.

Sono stati esclusi dallo studio i pazienti che presentavano malattie concomitanti (endocrine e/o sistemiche e/o psichiatriche), che assumevano farmaci interferenti con la secrezione del GH (estro-progestinici, glucocorticoidi, α2-agonisti/antagonisti, precursori

della serotonina e antagonisti serotoninergici, β-agonisti/antagonisti, dopamino agonisti/antagonisti, agonisti colinergici e antagonisti colinergici muscarinici), i soggetti obesi e quelli con anamnesi positiva per pregresso trauma cranico e per pregressa irradiazione sulla regione cervicale.

Tutti i 60 pazienti sono stati studiati mediante:

valutazione della secrezione del GH dopo stimolo con GHRH associato ad arginina, ossia il test di stimolazione massimale classico.

Sono stati inoltre arruolati 10 pazienti affetti da iperparatiroidismo secondario (7 femmine e 3 maschi, età media di 57 anni, range 48-79; BMI 25.3±1.6), la cui diagnosi è stata stabilita mediante l’evidenza di bassi livelli di vitamina D associati ad elevati livelli di PTH e normali livelli di calcemia. In tali pazienti la secrezione del GH è stata ugualmente valutata mediante il test di stimolo massimale con GHRH+arginina.

In 50 pazienti donne in età menopausale (età media 62,5 anni, range 48-85, BMI 26±0,2) è stata valutata l’influenza dell’eventale deficit ormonale di GH sulle modificazioni della densità minerale dell’osso. Tali pazienti erano le pazienti incluse nello studio la cui secrezione del GH è stata valutata sempre con il test massimale GHRH+arginina, la densità minerale dell’osso è stata mediante la densitometria (apparecchio dual energy X-ray absorptiometry).

A completamento del nostro studio inoltre sono stati arruolati nell’anno 2006 altri 15 nuovi pazienti (3 maschi/12 femmine, di età media di 54 anni, range 32-70 anni, BMI 25.0±0.7) affetti da iperparatiroidismo primitivo da adenoma paratiroideo singolo, arruolati con i criteri precedentemente descritti, la cui diagnosi è stata stabilita con i criteri soprariportati. In tali pazienti la secrezione del GH è stata valutata mediante:

il test di stimolazione classico con GHRH+arginina.

il test di stimolo con ghrelina, secretagogo di recente scoperta. Tali test sono stati effettuati in due giorni diversi e a distanza di un giorno l’uno dall’altro.

I soggetti di controllo sono paragonabili per l’età, sesso e BMI.

Per confermare l’ipotesi che fosse il calcio il responsabile dell’alterata secrezione del GH nel PHP è stato anche effettuato uno studio in vitro, in cellule GH3 di ratto, cellule capaci di secernere sia il GH che la PRL. Tali cellule sono state incubate a varie concentrazioni di cloruro di calcio (CaCl2) nel mezzo di coltura con

valori da 10 a 100 mM e con incrementi di 10 mM nei vari pozzetti; tutte le cellule sono state incubate alla diverse concentrazioni per 4 giorni.

Al termine dei quattro giorni sono stati eseguiti: il test di vitalità con trypan blue

dosaggio del GH nel mezzo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico locale e tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato.

Metodi

Il paratormone intatto sierico è stato dosato nel nostro laboratorio mediante il metodo immunoradiometrico (Nichols Institute Diagnostic, San Juan Capistrano, CA, USA), il calcio ionizzato mediante il metodo selettivo del calcio ione (Nova Biomedical, Waltham, Mass, USA), il GH e l’IGF-I sierici mediante specifici analisi radioimmunometriche (Nichols Institute Diagnostic, San Juan Capistrano, CA, USA), previo trattamento con etanolo per evitare interferenze con le proteine di trasporto.

Le tropine ipofisarie sono state dosate mediante kits commerciali (il TSH con Chemiluminescent immunometric assay, Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA; la PRL, l’FSH, l’ LH, con Chemiluminescent microparticle immonoassay CMIA, Abbot Laboratories, Diagnostics Division, Abbot Park, IL, USA, l’ACTH con Immunometric assay, Nichols Institute Diagnostic, San Juan Capistrano, CA, USA).

Anche i marker di rimodellamento osseo e gli anticorpi anti-tiroide sono stati dosati presso il nostro laboratorio mediante kit commerciali.

PTH 10-65 pg/ml, calcio ionizzato 1.13-1.32 mmol/L, per l’IGF-I è stata costitutita una tabella con valori di riferimento per sesso ed età. La sensitività del metodo per l’IGF-I è di 0.3 µg/L, per il GH 0.15 µg/L. Il coefficiente di variazione inter ed intra-assay era: 5.6-6.2% e 1.8-3.3% per il PTH, 2.9-4.5% e 2.4-4% per il GH, 10.1-15.7% e 7.6-5.5% per l’IGF-I.

I valori di normalità del nostro laboratorio per le altre tropine ipofisarie sono: PRL 2-25 ng/ml per la femmina, 1-13 ng/ml per il maschio, dopo che il siero è stato precipitato con PEG per eliminare possibili interferenze con la macroprolattina, ACTH 9-52 pg/ml, TSH 0.4-4.5 µU/ml, FSH e LH nelle donne in menopausa rispettivamente di 18-160 e 10-95, nei maschi di 1.8-17 e di 1.4-12.7, testosterone totale nei maschi di 2.7-10.9 ng/ml.

I valori di normalità del nostro laboratorio per i marker di rimodellamento osseo sono: cross laps urinario < 407 µg/mM, cross laps sierico < 4520 pM/l, osteocalcina 6.8-34 ng/ml, per la 25 OH-Vitamina D sono di 8.9-46.7 ng/ml, per la FT3 di 2.3-4.5 pg/ml, FT4 6.5-16.5 pg/ml, AbTg 5-50 U/ml, AbTPO < 10 U/ml, TRAb < 1 U/L

Valutazione della secrezione di GH

Test Arginina + GH-releasing ormone (GHRH).

I livelli sierici di GH sono stati misurati basalmente (00’) e 15’, 30’, 45’, 60’ e 90’ minuti dopo la simultanea somministrazione e.v. di GHRH (1 µg/kg in bolo al tempo 00’, GHRH-29, GEREF, Serono, Roma, Italia) e l’infusione di arginina (0.5 grammi pro kg di peso corporeo in 30’ minuti). Tale test è stato eseguito al mattino, dopo il digiuno notturno, mediante l’inserimento di una cannula endovenosa in una vena antecubitale, con infusione continua lenta di soluzione salina isotonica.

Test di stimolo con ghrelina.

I livelli sierici sono stati ugualmente misurati basalmente e 15’, 30’, 45’, 60 e 90’ minuti dopo la somministrazione di una dose di 1 µg/kg iv di ghrelina (Ghrelin human, Phoenixpeptide, USA).

Il picco di risposta del GH al test con GHRH associato ad arginina (0.5 gr/kg fino ad un massimo di 30 gr, infusi da 0 a 30 minuti) varia tra 16,4 e 113 µg/L (3°-97° centile nei soggetti di età compresa tra 20 e 80 anni). Il 1° centile è rappresentato da un valore di 9

µ

µ

Il test GHRH+arginina, è potente, sicuro, non influenzato dall’età e con scarsa variabilità inter ed intra-individuale, è ottimamente tollerato in tutto il corso della vita, può essere presente un modesto e transitorio “flushing” del viso conseguente al bolo di GHRH.

Il test di stimolo con ghrelina è anch’esso ottimamente tollerato, ma la risposta del GH allo stimolo risulta essere influenzata dall’età, produce tuttavia un picco di risposta maggiore ed anticipato rispetto a quello con GHRH+arginina. Il valore medio di picco risulta essere di 75

µ

La densità minerale dell’osso (BMD) è stata valutata mediante la dual energy X-ray absorptiometry (Hologic 4500 Elite, Hologic Inc, Waltham, MA, USA). La BMD è stata misurata in grammi per cm2 ed espressa in T-score. In accordo con l’Organizzazione mondiale della Sanità (WHO, 1994), secondo la definizione riguardante donne in età menopausale, si considera osteoporosi un valore di Tscore < 2,5, osteopenia un valore compreso tra 1 e -2,5, e normale quando è superiori a -1.

Analisi statistica

I risultati dei dosaggi ormonali sono stati espressi come media ± deviazione standard (ds). Le analisi statistiche sono stati eseguite mediante il t-test unpaired di Student per gruppi non appaiati per quanto concerne il confronto dei valori tra i controlli e i pazienti. Un valore della p < 0.05 è stato considerato “significativo”.

RISULTATI

Tutti i 60 pazienti arruolati nello studio sono affetti da iperapartiroidismo sporadico causato da un adenoma a carico di una delle paratiroidi, come dimostrato dalla contemporanea presenza di valori elevati di calcio ionizzato e di paratormone, presenza di un nodulo ipoecogeno all’ecografia del collo ed evidenza di una zona di ipercaptazione alla scintigrafia con sesta-mibi.

I valori della media±ds di Ca++ e PTH sono risultati rispettivamente di 1,5 ± 0,15 mmol/l e 149 ± 93 pg/ml, significativamente più alti rispetto ai valori riscontrati nei soggetti di controllo: 1,18 ± 0,03 mmol/l e 41 ± 3,1 pg/ml, con p < 0,001. All’ecografia del collo è stato evidenziato un nodulo ipo-anecogeno, con i caratteri primitivamente paratiroidei ed in presentazione tipica in tutti i pazienti.

Nei 10 pazienti affetti da iperparatiroidismo secondario la diagnosi è stata stabilita mediante il riscontro di valori di Vitamina D bassi, PTH elevati e calcio ione nella norma, con valori medi±DS rispettivamente di 8±0,2 ng/ml, 118,22±22 pg/ml, e 1,2±0,2 nmol/l, i valori della vitamina D erano significativamente (p < 0,01) più bassi rispetto a quelli dei soggetti con PHP (32,1±5,7). Nessuno dei

pazienti arruolati presentava alterazione della funzione tiroidea, surrenale, gonadica e della secrezione della prolattina; nei pazienti affetti da iperparatiroidismo primitivo i valori della media ± ds erano di 2,8 ± 0,7 pg/ml per l’FT3; 11,2 ± 0,9 pg/ml per l’FT4; 1,44 ± 1,05 µU/ml per il TSH; 23,46 ± 11,29 pg/ml per l’ACTH; 54,17 ± 28 mU/ml per l’ FSH e 39,3 ± 13 mU/ml per l’LH, nelle donne in età post-menopausale, 9,7 ± 5,3 ng/ml per la PRL dopo precipitazione con PEG, il testosterone totale nei soggetti maschi era di 3,8 ± 0,7, tutti questi valori non risultavano significativamente diversi da quelli dei soggetti di controllo. Tutti i pazienti mostravano l’assenza di AbTg, AbTPO, TRAb e valori nella norma di gastrina, insulina, glucagone, VIP, serotonina, calcitonina, catecolamine urinarie e plasmatiche.

Nessuno dei pazienti presentava alterazioni morfologiche a carico di fegato, reni, cuore, torace, ipofisi, malattie psichiatriche e malattie neoplastiche. La concentrazione sierica di IGF-I, correlata per età, era diminuita in 21 patienti affetti da iperparatiroidismo primitivo, in nessuno in quelli con deficit di Vitamina D.

Il picco secretorio di GH dopo stimolo massimale con GHRH + arginina è risultato significativamente diminuito nei pazienti affetti da iperparatiroidismo primitivo, mentre nei soggetti affetti da iperatiroidismo secondario e nei soggetti di controllo è risultato nella

norma (i valori della media ± ds sono stati rispettivamente di 15,84 ± 13.74 nei soggetti con PHP, 37,5 ± 16 nei soggetti con SHP, 42,30 ± 26,7 µg/L, nei soggetti di controllo, (con p < 0.01 tra il primo gruppo e gli altri). In particolare 23 pazienti hanno presentato un deficit di secrezione del GH, ossia valori < al 1° centile, altri 19 pazienti una insufficiente secrezione del GH, ossia valori inferiori al 3° centile.

In tabella 1 sono riportate le caratteristiche e biochimiche dei soggetti inclusi nello studio e quelle dei soggetti di controllo, Cecconi e coll., 2005.

Nella figura 1 sono riportati i valori di picco di GH dopo stimolo sia dei soggetti di controllo sia dei pazienti, con evidenziata l’area di normalità tra il 3° e il 97° centile. Con la linea tratteggiata è indicato il valore del 1° centile. La secrezione di GH dopo stimolo nei pazienti con PHP e con SHP non era correlata con i livelli di BMI, di Ca++_{, di}

PTH. Nella tabella 2 è riportata la secrezione del GH in relazione ai livelli di PTH e calcio ione nelle diverse condizioni studiate.

In 50 donne in età menopausale è stata valutata in dettaglio la densità minerale ossea. In 34 pazienti affette da PHP la secrezione del GH è risultata deficitaria (media ± DS di 8.8±4.2 µg/L, range 1,1-16,5 µg/L), nelle rimanenti 16 pazienti nella norma (28,7±11,8 µg/L, range 17,9-55,7), così come nei soggetti di controllo (32,6±7,8 µg/L,

range 21,7±63,2 µg/L). L’osteoporosi era presente nel 73,5% delle pazienti deficitarie contro il 37,5% delle pazienti con secrezione di GH nella norma e 3,1% dei controlli, l’osteopenia era presente invece nel 17,6% delle pazienti con GHD e nel 43,7 delle pazienti con secrezione nella norma, mentre nei soggetti di controllo nel 27% dei casi. I valori di T-score e BMD non erano correlati con i valori di calcio ione, età, età della menopausa, BMI, pGH e IGF-I, mentre erano correlati con i valori di PTH in entrambi i gruppi. Inoltre il T-score era correlato con i livelli dei markers di rimodellamento osseo solamente nei soggetti con deficit di GH.

Nelle pazienti la concentrazione sierica dei markers di rimodellamento osseo era incrementata nel 42% per quanto riguarda la fosfatasi alcalina ossea, nel 54% per osteocalcina e nel 67% per i cross-laps sierici. La media del T-score non era statisticamente differente tra i due gruppi di pazienti (-2,4±1,2 nelle pazienti deficitarie contro -2,05±1,01 nelle pazienti non deficitarie), mentre la prevalenza dell’osteoporosi nelle pazienti deficitarie era significativamente più alta che nelle pazienti con secrezione del GH nella norma e nei soggetti di controllo. I risultati del presente studio sono riportati nella Tabella 3 e nelle figure 2 e 3; Cecconi e coll., 2006.

Nell’anno 2006 sono stati arruolati altri 15 pazienti, nei quali è stata valutata la secrezione del GH sia mediante lo stimolo massimale classico con GHRH+arginina sia mediante il test di stimolo con ghrelina. In questi pazienti la diagnosi di PHP è stata confermata dalla presenza di valori di calcio ione di 1,55±0,1 mmol/L, PTH 177,3±27,4 pg/ml, presenza di una zona di ipercaptazione alla scintigrafia con sesta-mibi e di un nodulo ipoecogeno con i caratteri primitivamente paratiroidei all’ecografia del collo. Nessuno dei pazienti presentava alterazioni morfologiche a carico di fegato, reni, cuore, torace, ipofisi, malattie psichiatriche o neoplastiche.

Il picco di risposta del GH al test di stimolo massimale classico ha evidenziato la ridotta secrezione in 10 pazienti (8,88±4,8 µg/L, pari al 67%), nei rimanenti 5 era nella norma (32.6±7.8 µg/L, pari al 33%). In tutti questi pazienti i valori delle altre tropine ipofisarie è risultato nella norma: TSH 0,91±0,94 µU/ml, PRL 7,96±4,65 ng/ml, ACTH 14,47±12,92 pg/ml, FSH 50,88±47,73 mU/ml, LH 18,34±15,83 mU/ml, anche i valori di cortisolo 137,31±49.76 ng/ml, FT4 10,19±1,93 pg/ml, FT3 3,7±0,41 pg/ml, sono risultati nella norma e non statisticamente diversi dai soggetti di controllo.

significativamente inferiore a quello dei soggetti di controllo pari a 70,41±31,41 µg/L, in particolare la secrezione è risultata insufficiente in 12 pazienti (80%) e normale in 3 (20%).

La caratteristiche cliniche e biochimiche di tali soggetti sono riportate nella tabella 4 ed i valori di picco del GH nella figura 4.

Non vi è correlazione tra i valori di picco del GH ad entrambi gli stimoli e i valori di calcio ionizzato, PTH, BMI, T-score, IGF-I.

Per quanto concerne la sintomatologia dei 10 pazienti che presentavano il deficit secretivo dell’ormone della crescita 4 presentavano osteoporosi, 5 osteopenia, 1 presentava una densità minerale ossea nella norma, inoltre in 4 pazienti era presente una anamnesi positiva per nefrolitiasi. Nei pazienti con secrezione di GH normale 3 presentavano osteopenia, 1 osteoporosi e nefrolitiasi, 1 aveva una densità ossea nella norma, Cecconi e coll., abstract Sie 2007, abstract ECE 2007, Cecconi e coll.; 2007, in press.

In vitro nelle cellule GH3 incubate a concentrazioni di CaCl2 diverse con incrementi di 10 mMol/L è stata valutata la secrezione del GH, misurando la sua concentrazione nel mezzo di coltura, confrontandola con la vitalità cellulare. Come vediamo dalle figure 5 e 6 all’aumentare della concentrazione del calcio nel mezzo di

coltura la quantità di GH secreto diminuisce, ma non dipende dall’apoptosi cellulare.

DISCUSSIONE

I risultati evidenziati mediante questa indagine confermano che i pazienti affetti da iperparatiroidismo primitivo sporadico (PHP) associano una diminuita secrezione dell’ormone della crescita con una normale secrezione delle altre tropine ipofisarie.

La ridotta secrezione del GH sembra essere una risposta alla condizione cronica indipendentemente dalla causa stessa, come dimostrato dalla presenza di tale alterazione in un’altra condizione quale la FHH e dalla sua assenza nell’iperaparatiroidismo secondario a deficit di vitamina D, condizione associata a normali livelli di calcemia. Il diretto ruolo della condizione patologica di iperparatiroidismo, quale causa della ridotta secrezione di tale ormone, è supportata infatti dall’assenza di altre condizioni associate a tale deficit ormonale nei soggetti adulti, quali l’obesità, un pregresso trauma cranico e alterazioni ipotalamo/ipofisarie (sindrome della sella vuota, neoplasie, pregresso intervento e/o irradiazione).

Il test GHRH + arginina, utilizzato per la valutazione della secrezione del GH è stato preferito per l’elevato grado di affidabilità con scarsa variabilità intra- e inter-individuale, risultando indipendente dai fattori di sesso e di età. Inoltre, il test consente la

massima stimolazione, mediante cui differenziare maggiormente le risposte tra soggetti sani e soggetti deficitari rispetto al test con ipoglicemia insulinica e alla valutazione dell’IGF-I. Nei nostri pazienti infatti, i livelli di IGF-I rientravano nel range di normalità per età in circa la metà dei pazienti, mentre il deficit della secrezione del GH era presente in circa il 70% dei casi.

La concentrazione sierica dell’IGF-I è prevalentemente espressione della secrezione spontanea di GH, i suoi livelli sierici si riducono progressivamente lungo il corso della vita raggiungendo i livelli più bassi nell’età senile senza significative differenze rispetto al sesso (Corpas e coll., 1993, Juul e coll., 1994, Ghigo e coll., 1996); Gli stessi risultano parzialmente condizionati dallo stato nutrizionale del soggetto (Clemmons e coll 1984, Giordano & Minuto.,1991), essendo ridotti nelle condizioni di denutrizione, epatopatie, diabete scompensato e tendenzialmente normali nell’obesità e nel morbo di Cushing, nonostante la marcata contrazione della secrezione somotropica in tali condizioni. La sua valutazione viene generalmente eseguita per la diagnosi del deficit di GH anche nel soggetto adulto (Giordano & Minuto., 1991). Tuttavia i lavori in cui i livelli sierici di IGF-I dei pazienti con deficit di GH sono stati confrontati con quelli riscontrati nella popolazione normale

documentando un’ampia sovrapposizione dei valori nei due gruppi (Ghigo e coll., 1996., Hoffman e coll., 1994). Ghigo e coll., (1996) riportano che tra i 20-40 anni l’IGF-I può essere considerato un indice diagnostico ancora relativamente affidabile, mentre risulta di minore affidabilità nei soggetti tra i 40 e i 60 anni e ancor meno nei soggetti con età > di 60 anni. Pertanto nella pratica clinica si può ritenere che valori normali di IGF-I non permettono di escludere la presenza di un deficit di GH, mentre valori ridotti di IGF-I sono indicativi di una compromissione della funzione dell’asse GH/IGF-I, qualora siano escluse particolari alterazioni dello stato nutrizionale.

In aggiunta alla fisiologica stimolazione del GHRH il rilascio del GH dall’ipofisi è stimolato anche da piccole molecole sintetiche peptidiche e non, dette “GH secretagoghi”, che agiscono mediante i recettori GHS-R, il cui ligando endogeno è stato solo recentemente individuato e nominato ghrelina. Tale ormone prodotto principalmente dallo stomaco è stato oggetto negli ultimi anni di vari studi volti ad indagare se il rilascio del GH sia la sua fondamentale azione fisiologica.

La biologia della ghrelina nell’uomo è risultata infatti sino ad oggi sconosciuta e le recenti conoscenze sembrano indicarla come un cruciale punto di collegamento capace di modulare nutrizione,

composizione corporea e crescita (Horvath e coll., 2001). Nello specifico, la ghrelina sembra avere il compito di garantire sufficienti quantità di energia affinché il GH stimoli la crescita e la riparazione, oltre a stimolare il SNC in funzione della necessità che l’energia sia consumata o conservata (Horvath e coll., 2001). Le evidenze fisiologiche osservate consentono di riferire alla ghrelina l’introito di cibo e la diminuzione dell’ossidazione dei grassi (Tschop e coll., 2000). Questo profilo funzionale, che può essere stato sviluppato dai processi di selezione evolutiva per la sopravvivenza in periodi di ristretto supporto calorico, sostiene ancora oggi un positivo equilibrio energetico, nonostante l’obesità e non la cachessia indotta da privazione calorica sia attualmente il disturbo nutrizionale predominante nei paesi industrializzati.

Recenti studi di linkage hanno mostrato che rari polimorfismi del gene “preproghrelin” potrebbero proteggere dai sintomi correlati all’obesità, indicando che potenzialmente un meccanismo di segnalazione sviluppato ad un tempo per prolungare la vita, può successivamente tradursi in un rischio per la salute in presenza di condizioni ambientali modificate come la disponibilità di cibo palatabile ad alto contenuto calorico ed un incremento di uno stile di vita sedentaria.

Differenti studi odierni riportano livelli ematici di ghrelina ridotti in pazienti obesi (Cummings e coll., 2002, Tschop e coll., 2002) così come le concentrazioni post-prandiali, mentre sono incrementati in condizioni cachettiche ed anoressiche (Ariyasu e coll., 2001) allo stesso modo che durante la deprivazione da cibo (Taschop e coll., 2000, Ariyasy e coll., 2001) o in fase preprandiale.

Il fatto che la concentrazione di ghrelina sia negativamente associata all’introito e positivamente associata al bilancio energetico è interpretato da molti come una risposta adattiva fisiologica (Horvath e coll., 2001), che, almeno nel caso dell’obesità, non riesce a ristabilire un appropriato bilancio energetico (Tschop e coll., 2001). Cummings e coll., 2002 hanno recentemente dimostrato che un’ulteriore riduzione dei bassi livelli di ghrelina nel plasma di soggetti obesi potrebbe dare l’avvio ad una riduzione della massa grassa corporea, o prevenire il recidivare dell’obesità dopo la perdita di peso indotta dalla dieta.

In seguito a by-pass gastrico chirurgico, i pazienti obesi evidenziano una più significativa perdita di peso, che può generalmente essere sostenuta da una volontaria restrizione calorica e che si associa con bassi livelli di ghrelina prossimi al limite di rilevazione, mentre la perdita ponderale indotta dalla restrizione

calorica volontaria è correlata ad elevazione delle concentrazioni di ghrelina, più probabilmente innescata dall’accentuazione della sensazione di fame e dalla riduzione dell’ossidazione dei grassi.

Per quanto sia intrigante l’ipotesi che risposte adattive della ghrelina alla restrizione calorica possano contribuire all’obesità, solo la disponibilità di un potente antagonista ghrelinico consentirà di valutare se una stimolazione farmacologica “invece” del by-pass gastrico chirurgico può rappresentare un’opzione terapeutica efficace per l’obesità.

Una singola eccezione alla generale osservazione delle variazioni adattive nella secrezione di ghrelina in risposta alle modificazioni acute o croniche nell’introito calorico si sta aggiungendo per consolidare la teoria che individua nella ghrelina uno stimolo clinicamente rilevante della fame e dell’accumulo adiposo. I pazienti con Sindrome di Prader-Willi non solo soffrono di una sensazione di fame incontrollata, massa grassa aumentata ed ipoattività fisica, ma anche un incremento dei livelli plasmatici di ghrelina quando confrontato con il BMI del gruppo di controlli sani; ogni altra condizione di obesità conosciuta si associa a bassi livelli ghrelinici, incluse le cause monogeniche di obesità. Nonostante l’eziologia genetica di PWS non offra un ruolo patogentico per la ghrelina,

meccanismi indiretti come l’ipoinsulinemia cronica o il GHD potrebbero essere responsabili dell’iperghrelinemia e delle sue rispettive conseguenze (Burman e coll., 2001).

Sebbene sia stato stabilito che le concentrazioni ghreliniche in differenti condizioni con bassa massa grassa corporea come la cachessia neoplastica, l’anoressia nervosa o la cachessia cardiaca (Nagaya e coll., 2001), sono significativamente elevate, l’esistenza di una riferita sindrome di resistenza alla ghrelina in queste condizioni non è ancora stato verificato.

Sembra possibile comunque che una diminuzione della responsività della ghrelina ad un’esposizione costante di ghrelina possa essere realizzata in modo sovrapponibile alla sindrome leptina-resistente postulata in pazienti obesi con iperleptinemia. Se questo scenario può essere provato, potrebbe essere difficile deputare alla ghrelina o ad uno dei suoi agonisti recettoriali un potenziale terapeutico nell’anoressia o nella cachessia, sebbene alte dosi potrebbero ancora mostrare un effetto favorevole. In conclusione, la ghrelina potrebbe suggestivamente essere, all’interno di un equipaggiamento di sopravvivenza naturale, un’essenziale responsabile della regolazione della crescita da sincronizzare con l’equilibrio energetico al fine di garantire la disponibilità di energia per

le azioni del GH durante lo sviluppo ed i processi di riparazione. Ad oggi la disponibilità di condizioni ambientali con regimi alimentari altamente palatabili ed abbondanti potrebbero comunque trasformare questo ormone e lasua spinta adipogenica ed orexigenain un fattore di rischio.

Poiché il GH è una proteina dimensionalmente così rilevante che deve esser iniettata, gli agonisti della ghrelina (e/o GHS) potrebbero in futuro avere uno spazio terapeutico, in considerazione della loro maneggevolezza e convenienza con associata una maggiore accettabilità sociale. Gli agonisti potrebbero essere usati soprattutto in ambito pediatrico e geriatrico, soprattutto per combattere il catabolismo nelle malattie terminali. Alcune indagini cliniche hanno anche valutato la capacità degli agonisti della ghrelina di liberare GH attraverso meccanismi diversi dal GHRH, suggerendo il loro impiego anche in campo diagnostico (Ghigo e coll., 2001).

Nel momento in cui si è iniziato a svelare la biologia della ghrelina nell’uomo come l’ormone stimolante l’appetito si è avvertita l’esigenza di poter individuare un agente da candidare come antagonista. Nonostante si possa ritenere che una tale sostanza sia efficace nel ridurre i livelli di GH, la disponibilità di altri agenti efficaci nella terapia dell’acromegalia ha stimolato numerosi studi alla ricerca

di un antagonista della ghrelina da indirizzare prioritariamente nella terapia dei pazienti obesi PWS.

Nel presente studio abbiamo voluto utilizzare la ghrelina quale test di stimolo, per verificare se, anche con un meccanismo diverso da quello predominante in natura, quale è lo stimolo con GHRH, si confermava l’insufficiente secrezione dell’ormone della crescita nell’iperparatiroidismo primitivo.

Infatti il GHRH agisce principalmente attraverso l’adenilato ciclasi, che determina la formazione di cAMP e quindi l’attivazione di una proteina kinasi A che provoca la fosforilazione e l’attivazione di alcune proteine e l’apertura di canali ionici, tra cui quelli per il calcio, un’altra via è quella dell’inositolo fosfato che attiva una proteina chinasi C con liberazione di calcio dalle riserve intracellulari reticolo-endopalstiche e mitocondriali, anche se questa via è secondaria.

Dalla letteratura emerge che le cellule somatotrope sono distinte in due sottopopolazioni sia morfologicamente che funzionalmente: cellule ad alta densità e cellule a bassa densità, (Chen e coll., 2000). Il GHRH stimola sia la sintesi attraverso una trascrizione del gene del GH, sia il rilascio dell’ormone, agendo su specifici recettori di membrana delle cellule somatotrope. Il più importante meccanismo di trasduzione del segnale che media

l’azione positiva sulla secrezione del GH è il sistema AMPc/adenilato ciclasi, tuttavia il GHRH stimola l’ingresso del calcio nella cellula attraverso i canali al calcio, con conseguente attivazione del sistema intracellulare calcio/calmodulina. In vitro è stato dimostrato infatti che il GHRH per esercitare una completa azione nelle cellule somatotrope a bassa densità necessita anche dell’attivazione della fosforilasi C/Ca++ intracellulare (Ramirez e coll 1999, Johnson e coll 2002). Van Goor e coll (2001) hanno mostrato che l’espressione dei canali del Ca++ è più alta nelle cellule somatotrope che non in quelle lattotrope e gonadotrope, indicando pertanto differenti pattern di cellule tipo specifiche per l’espressione dei canali ionici di membrana, che potrebbe spiegare la riduzione dei livelli dell’ormone somatotropo in condizioni di ipercalcemia, in assenza di alterazioni secretorie a carico delle altre tropine ipofisarie, così come si verifica nei pazienti inclusi nello studio.

Inoltre sempre in vitro è stato dimostrato l’effetto apoptosi-like sulla cellula somatotropa provocato dal calcio (Melamed & Yaron, 1999), che potrebbe spiegare il motivo dell’assenza dell’immediato ripristino della secrezione ormonale somatotropa, quando i livelli di Ca++ _{vengono corretti dall’intervento di paratiroidectomia.}