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Aislamiento y caracterización del gen de la transglutaminasa de arroz (Oryza sativa)

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Academic year: 2021

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(1)Aislamiento y caracterización del gen de la transglutaminasa de arroz (Oryza sativa) Nefertiti Campos Gorgona. ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionada a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció amb finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora.. ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.. WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author..

(2) UNIVERSIDAD DE BARCELONA FACULTAD DE FARMACIA Programa de Doctorado en Biotecnología. CENTRE DE RECERCA EN AGRIGENÒMICA (CRAG) DEPARTAMENTO DE GENÉTICA MOLECULAR. Aislamiento y caracterización del gen de la transglutaminasa de arroz (Oryza sativa). Nefertiti Campos Gorgona. 2013.

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(4) Aislamiento y caracterización del gen de la transglutaminasa de arroz (Oryza sativa). Memoria de tesis doctoral presentada por la ingeniera en biotecnología Nefertiti Campos Gorgona para optar al grado de Doctora en Biotecnología por la Universidad de Barcelona.. Este trabajo se ha realizado en el Departamento de Genética Molecular del CENTRE DE RECERCA EN AGRIGENÒMICA (CRAG).. Directores:. Dra. Mireya Santos L. Dr. Josep M Torné C.. Doctoranda:. Nefertiti Campos G.. Tutora:. Dra. Josefa Badía P. 3.

(5) 4.

(6) RESUMEN En esta tesis se describen los resultados obtenidos en la clonación y caracterización de una nueva transglutaminasa (TGasa) vegetal aislada en arroz (Oryza sativa), la segunda transglutaminasa clonada en plantas y la primera en plantas C3. Las TGasas (E.C.2.3.2.13) son una familia de enzimas que promueven modificaciones postraduccionales de proteínas. Tienen especial importancia debido a sus implicaciones en enfermedades humanas y a sus aplicaciones biotecnológicas de interés industrial. Su investigación en plantas es aún incipiente y hasta la fecha, solo se ha clonado la TGasa cloroplástica de maíz (TGZ), a partir de una librería de ADN copia (ADNc) de plántulas de maíz. El aislamiento de la nueva transglutaminasa de arroz, descrita en esta tesis, se ha realizado a partir de ADNc y genómico. Utilizando cebadores diferenciales se realizó la clonación del gen (tgo), su inserción en un vector de expresión y su caracterización. Los análisis de la secuencia de tgo han permitido deducir que este nuevo gen está constituido por una secuencia de 1605 pb y que codifica para una proteína (TGO) de 352 aminoácidos. El análisis de la secuencia de TGO ha permitido detectar diferentes dominios relacionados con la actividad TGasa, como son la triada catalítica (Cys-HisAsp), secuencias repetidas en tándem y varios sitios de N-miristoilación. Además, otros dominios detectados, como los leucine-zipper, no eran conocidos en TGasas vegetales. La expresión de la proteína TGO en E. coli ha permitido realizar la caracterización de la enzima con respecto a diferentes parámetros. Así, mediante ensayos de actividad se ha podido confirmar la preferencia de la enzima frente a diferentes sustratos, así como su dependencia de calcio y la inhibición de su actividad frente a conocidos inhibidores de la actividad TGasa. Igualmente, la enzima fue capaz de polimerizar un sustrato in vitro y se comprobó su dependencia de la luz utilizando proteínas tilacoidales como sustrato. Éstas y otras características relevantes han permitido identificar a esta enzima como una verdadera TGasa. Finalmente, ensayos realizados con plantas de arroz para determinar su localización subcelular, así como su relación con proteínas implicadas en la fotosíntesis y su dependencia de la luz, llevan a sugerir que las funciones de TGO están asociadas a procesos fotosintéticos, probablemente relacionados con fotoprotección, al igual que ya se había descrito para la TGasa de maíz, aunque no se descartan otras funciones relacionadas. 5.

(7) 6.

(8) SUMMARY This thesis presents the results of cloning and characterization of a novel transglutaminase (TGase) from rice (Oryza sativa). This is the second transglutaminase cloned in plants and the first in C3 plants. TGases (EC2.3.2.13) are a family of enzymes that promote protein post-translational modifications. These enzymes are of particular importance because of their implication in human diseases and their biotechnological applications of industrial interest. Research on plant TGases is still incipient. To date, maize chloroplast TGase (TGZ) cloned from a DNA library is the only cloned TGase. The isolation of a new rice transglutaminase (TGO), described in this thesis, was performed using differential primers designed from both genomic and copy DNA, which has allowed the cloning of the gene (tgo), its insertion into an expression vector, and further characterization. Analysis of both the gene and protein sequences shows that this new gene is comprised of 1605 bp and encodes for a protein (TGO) of 352 amino acids. During sequence analysis different domains associated with TGase activity, such as a catalytic triad (CysHis-Asp), tandem repeat sequences, and several N-myristoylation sites, were identified. Additionally, other domains not previously reported in plant TGases, such as a leucinezipper domain, were observed. TGO protein expression in E. coli, allows enzyme characterization with respect to different parameters. Thus, the enzyme preference for different substrates, as well as calcium dependence and activity inhibition in the presence of known TGase inhibitors, was confirmed by these activity assays. The enzyme was able to polymerize in vitro a substrate and was also tested for light dependence using thylakoid proteins as substrate. All of these and other relevant TGO characteristics allowed the identification of this enzyme as a true TGase. Finally, studies with rice plants to determine TGO subcellular localization, as well as its relation to photosynthesis-involved proteins and light dependence, suggested that TGO functionality is associated with photosynthetic processes, probably related to photoprotection, which has already been described for maize TGase. In addition to photoprotection there are possibly additional functions that cannot be excluded.. 7.

(9) 8.

(10) Hay dos formas de ver la vida: una es creer que no existen milagros, la otra es creer que todo es un milagro. Albert Einstein. 9.

(11) 10.

(12) Dedicatoria. A mi abuela Amalia. Siempre en mi corazón y mis pensamientos.. A pesar del poco tiempo que la vida nos permitió estar juntas, nunca nadie me ha enseñado tanto en tan poco tiempo tu herencia ha sido el coraje, el trabajo y la alegría de vivir.. Gracias.. 11.

(13) 12.

(14) Agradecimientos. Llegado este punto, debo mencionar mi satisfacción por haber hecho el máximo esfuerzo porque este trabajo se tradujera en un proceso de aprendizaje continuo, el cual me ha hecho crecer tanto intelectualmente como personalmente. Dentro de la lista de gracias debo citar primero a quienes han estado más directamente relacionados con este trabajo: en primer lugar mis directores. Mireya y Josep María: anteponer al humano antes que al científico ha sido la mayor enseñanza que me llevo de ustedes…¡Las transglutaminasas son la segunda!. He sido afortunada que Dios cruzara nuestros caminos en Costa Rica y me trajeran hasta estas tierras, más que mis directores han sido mis guías en procesos más allá de la ciencia. Gracias infinitas por su calidez, comprensión y apoyo, en especial cuando los nubarrones amenazaban tormenta. A las investigadoras de Niker Tecnalia por su gran aportación en esta tesis: Sonia Castañón, Iratxe Urreta y Paloma Moncaleán. Al personal de la UB en especial a mi tutora Josefa Badía quien me supo guiar con la información necesaria, clara y precisa y una sonrisa siempre en la cara. A todos y cada uno de los compañeros de los Servicios del CRAG, Montse Amenós, Oriol Casagran, Pilar Fontanet, Sami Irar, José Luis La Paz, Mercè Miquel, Ángel Sánchez, porque necesité de ustedes para que esta tesis fuera coherente, gracias por sus aportaciones y guía. Al Dr. Carlos Vicient por sus aportaciones en el apoyo del estudio del gen y árbol filogenético A Oriol Lopera más que un compañero de Lab un gran corazón bajo una bata blanca, no hay palabras para agradecerle el compañerismo mostrado en especial durante esos primeros días de adaptación. Marc Boix, serenidad y eficiencia…gracias por tu calidad humana, que esto nunca cambie, lo demás vendrá como consecuencia de esta gran cualidad tuya. Moltes gràcies! Jordi Gibert el optimismo y pragmatismo en esencia, estos últimos meses de mi tesis sin tu apoyo no hubieran sido posibles, tu adopción e inserción dentro del mundo catalán me han ayudado no solo a entender una cultura si no a amarla, gracias por apoyarme en momentos difíciles pero también en los de alegría, tu y tu familia maravillosa me han adoptado como una más, esos 4 abuelos son un privilegio: mi infinito agradecimiento y cariño.. 13.

(15) A mi familia en Costa Rica gracias…por el tiempo que les he robado para trabajar en mi tesis, por ser incondicionales en todo momento, por aportar alegría y optimismo en cada segundo de mi vida y por enseñarme que nada tiene más valor que la familia; me siento afortunada por formar parte de la familia Campos Gorgona con un padre y una madre ejemplares y unos hermanos únicos e inigualables. Finalmente el trabajo que aquí presento no hubiera sido posible sin el apoyo y financiamiento del programa de Becas MAEC-AECID así como los proyectos españoles MEC BFU2006-15115-01/BMC y BFU2009-08575. También del Programa Consolider-Ingenio 2010. CSD2007-00036 “CRAG” y Xarxa de Referencia en Biotecnología, de la Generalitat de Catalunya. Finalmente un Acuerdo de Colaboración CRAG y NEIKER TECNALIA.. 14.

(16) 15.

(17) 16.

(18) INDICE GENERAL. ÍNDICE DE FIGURAS ________________________________________________ 21 1.. INTRODUCCIÓN ________________________________________________ 23 1.1. La planta de arroz (Oryza sp). _______________________________________ 25. 1.1.1. Importancia económica y cultural _____________________________________ 26. 1.1.2. El arroz como planta modelo _________________________________________ 28. 1.2. Expresión, identificación y clonaje de genes. ____________________________ 29. 1.2.1. Expresión de genes, del ADN a las proteínas. ___________________________ 29. 1.2.2. Medida de la expresión génica ________________________________________ 31. 1.2.3. Identificación de fuentes de ADN para el clonaje ________________________ 32. 1.2.4. Enzimas de restricción y ligasas: enzimas necesarias para clonar el ADN. recombinante ____________________________________________________________ 34 1.3. Expresión génica en huéspedes heterólogos y obtención de proteínas. recombinantes. ___________________________________________________________ 36 1.3.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes _______________________ 36. 1.3.2. Sistemas de expresión eucariota ______________________________________ 37. 1.3.3. Sistema de expresión procariota ______________________________________ 37. 1.4. Las Transglutaminasas. _____________________________________________ 41. 1.4.1. Características, estructura y función. __________________________________ 41. 1.4.2. Los sustratos de las TGasas y sus reacciones ____________________________ 42. 1.4.3. El papel del calcio en la actividad transglutaminasa. _____________________ 45. 1.4.4. Clasificación de las transglutaminasas y su estructura ____________________ 46. 1.4.5. Transglutaminasas en animales y humanos. ____________________________ 47. 1.4.6. Aspectos biotecnológicos de las TGasas ________________________________ 49. 1.4.7. Las TGasas vegetales _______________________________________________ 52. 1.4.8. Las poliaminas y la actividad TGasa en plantas _________________________ 52. 1.4.9. Las TGasas en los procesos relacionados con la fotosíntesis ________________ 54. 1.4.10. La transglutaminasa en el arroz ____________________________________ 57. 17.

(19) 2.. OBJETIVOS DE LA TESIS ________________________________________ 59. 3.. MATERIAL Y MÉTODOS _________________________________________ 63 3.1. Objetivo 1. Clonación del gen de la Transglutaminasa de arroz. ____________ 72. 3.2. Objetivo 2. Expresión en células de E. coli ______________________________ 73. 3.3. Objetivo 3. Caracterización de la Transglutaminasa de arroz. _____________ 74. 3.4. Objetivo 4. Estudios sobre la expresión del gen tgo en la planta y su relación. con otras proteínas cloroplásticas. ___________________________________________ 77. 4.. RESULTADOS Y DISCUSIÓN _____________________________________ 83 4.1. Objetivo 1. Aislamiento y caracterización del gen tgo en arroz. ____________ 85. 4.1.1. Identificación y amplificación de la secuencia de tgo. _____________________ 85. 4.1.2. Clonaje de tgo en el vector de pCR2.1 y en el vector de expresión. __________ 86. 4.1.3. El gen tgo. Análisis computacional de la secuencia. ______________________ 91. 4.1.4. Análisis filogenéticos de tgo con respecto a otros genes codificantes para TGasa. en la familia Gramineae ___________________________________________________ 95 4.2. Objetivo 2. Expresión de TGO en E. coli _______________________________ 98. 4.2.1. Análisis de la secuencia de la proteína TGO. ____________________________ 98. 4.2.2. Determinación de la expresión de TGO en E. coli _______________________ 102. 4.2.3. Secuenciación de la proteína utilizando MALDI-TOF. ___________________ 105. 4.2.4. Purificación de TGO por FPLC y generación de un anticuerpo a partir de una. fracción semipurificada. __________________________________________________ 106 Objetivo 3. Caracterización de la Transglutaminasa de arroz. ___________________ 107 4.2.5. Caracterización bioquímica de la actividad TGasa de TGO expresada en E. coli. 107. 4.2.5.1. Actividad TGasa en distintas fracciones y condiciones de expresión. _____ 107. 4.2.5.2. Determinación del pH óptimo y concentración óptima de calcio. ________ 107. 4.2.5.3. Actividad sobre diferentes sustratos. _______________________________ 108. 4.2.5.4. Determinación de la velocidad de transformación de sustrato. __________ 110. 4.2.5.5. Actividad cross-linking de TGO ___________________________________ 111. 4.2.5.6. Efecto de los inhibidores de TGasa en la actividad de TGO. ____________ 112. 18.

(20) 4.2.5.7 4.2.6. Determinación de la influencia de la luz en la actividad de TGO ________ 113 Localización de la proteína TGO en la planta de arroz __________________ 114. 4.2.6.1. Inmunolocalización celular de TGO por microscopia confocal __________ 114. 4.2.6.2. Inmunolocalización subcelular de TGO por microscopia electrónica de. transmisión (MET) ______________________________________________________ 116 4.3. Objetivo 4. Estudiar la expresión del gen tgo en la planta y su relación con otras. proteínas cloroplásticas. __________________________________________________ 119 4.3.1. Influencia de la luz en el comportamiento de TGO en plantas de arroz. ____ 119. 4.3.1.1. Análisis de la expresión de TGO mediante western blot. _______________ 119. 4.3.1.2. Actividad TGasa en plantas de arroz _______________________________ 121. 4.3.1.3. Determinación de los niveles de expresión de tgo por medio de RT-qPCR. 122. 4.3.2. Ensayo de actividad in vitro de TGO en columna de níquel y su relación con. otras proteínas. __________________________________________________________ 124 4.3.3. Estudio de la expresión de tgo in vivo y su relación con proteínas asociadas a. fotosíntesis. _____________________________________________________________ 127. 5.. CONCLUSIONES _______________________________________________ 139. 6.. BIBLIOGRAFÍA ________________________________________________ 143. 7.. ANEXOS ______________________________________________________ 165. 19.

(21) 20.

(22) ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 1. PARTES DE LA PLANTA DE ARROZ EN DIFERENTES ETAPAS DE DESARROLLO. ........... 26 FIGURA 2: EL ARROZ REPRESENTADO COMO PORCENTAJE DE LA INGESTA CALÓRICA TOTAL POR REGIÓN. ............................................................................................................................... 27. FIGURA 3. PROCEDIMIENTO GENERAL PARA EL CLONAJE MOLECULAR DE ADN DE INTERÉS Y LA CONSTRUCCIÓN DE UNA MOLÉCULA RECOMBINANTE DE ADN. ........................................ 39. FIGURA 4. REPRESENTACIÓN TRIDIMENSIONAL DE LA ESTRUCTURA DE TG2 ............................ 46 FIGURA 5. RESULTADO DEL BLAST DE LA SECUENCIA DE TGZ21 CONTRA LA COLECCIÓN DE NUCLEÓTIDOS DE NCBI ...................................................................................................... 85. FIGURA 6. RESULTADOS DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL ADN GENÓMICO Y DEL ADNC . 86 FIGURA 7. IDENTIFICACIÓN DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO DE ADN ....................................... 86 FIGURA 8. PORCIÓN DE LA SECUENCIA DE ADNC DE TGO COMPARADA CON AK071348 .......... 87 FIGURA 9. ALINEAMIENTO UTILIZANDO CLUSTAL W DE LAS SECUENCIAS DE TGO. .................. 88 FIGURA 10. PRODUCTO DE PCR DE COLONIAS E. COLI (GIGA BLUE), TRANSFORMADAS CON TGO EN EL VECTOR PET-41 EK/ LIC. ......................................................................................... 90. FIGURA 11. PRODUCTO DE PCR DE LAS COLONIAS DE E.COLI (BL21) TRANSFORMADAS CON TGO.. .................................................................................................................................... 90. FIGURA 12. UBICACIÓN DE LOS GENES TGZ (A) Y TGO (B) EN SUS RESPECTIVOS CARIOTIPOS ... 92 FIGURA 13. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA SECUENCIA DEL ADNG DE TGO ............... 95 FIGURA 14. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA PROTEÍNA TGO. .................................... 100 FIGURA 15. CLUSTALW. ALINEAMIENTO COMPARATIVO DE LA SECUENCIA DEDUCIDA DE AMINOÁCIDOS (ESTRUCTURA PRIMARIA) DE TGO CONTRA TGZ. ................................... 101. FIGURA 16. EXPRESIÓN DE TGO EN E. COLI EN DIFERENTES CONDICIONES. ............................ 102 FIGURA 17. MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS RECOMBINANTES DE E.COLI EXPRESANDO TGO.. .......................................................................................................................................... 103 FIGURA 18. CUANTIFICACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE TGO EN EXTRACTOS DE E. COLI. ............ 104 FIGURA 19. IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA DE TGO A PARTIR DE EXTRACTOS DE E. COLI SOBRE-EXPRESORES .......................................................................................................... 105. FIGURA 20. WESTERN BLOT (ABS·TAG) Y SDS-PAGE DE DIFERENTES FRACCIONES DE EXTRACTO DE. IBS SEMIPURIFICADAS MEDIANTE FPLC UTILIZANDO COLUMNA DE NÍQUEL. Y GRADIENTE DE IMIDAZOL .............................................................................................. 106. FIGURA 21. ACTIVIDAD TRANSGLUTAMINASA DE TGO SOBREEXPRESADA EN CÉLULAS DE E. COLI................................................................................................................................... 107. FIGURA 22. ACTIVIDAD TGASA DE LA TGO A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE CALCIO Y EN PRESENCIA DEL QUELANTE EGTA ................................................................................... 108. FIGURA 23. VELOCIDAD DE TRANSFORMACIÓN DE SUSTRATO. ................................................ 111. 21.

(23) FIGURA 24. ENSAYO DE ACTIVIDAD CROSS-LINKING PARA TGO.. ........................................... 112 FIGURA 25. INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD TGASA DE TGO…………………………………..113 FIGURA 26. DETERMINACIÓN DE LA DEPENDENCIA A LA LUZ……………………………….. 114 FIGURA 27. INMUNODETECCIÓN DE TGO POR MICROSCOPIA CONFOCAL EN HOJAS DE ARROZ. .......................................................................................................................................... 115 FIGURA 28. LOCALIZACIÓN SUBCELULAR DE TGO MEDIANTE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN EN HOJAS DE ARROZ................................................................................... 117. FIGURA 29. WESTERN BLOT DEL EXTRACTO TOTAL DE PROTEÍNAS DE HOJAS DE ARROZ DE PLANTAS SOMETIDAS A DIFERENTES PERÍODOS DE ILUMINACIÓN ................................... 120. FIGURA 30. ACTIVIDAD DE TGO ASOCIADA A LA LUZ EN EXTRACTOS TOTALES DE HOJAS DE ARROZ. .............................................................................................................................. 121. FIGURA 31. NIVELES DE EXPRESIÓN RELATIVA DE TGO EN PLANTAS DE ARROZ ENSAYADAS EN DIFERENTES PERÍODOS DE ILUMINACIÓN CONTINUA. ....................................................... 122. FIGURA 32. SDS-PAGE Y WESTERN BLOT (ABPEPTGO) DE FRACCIONES ELUIDAS TGO EN COLUMNAS DE NÍQUEL. .................................................................................................... 125. FIGURA 33. NIVELES DE EXPRESIÓN RELATIVA DE LHCB5 EN PLANTAS DE ARROZ ENSAYADAS A DIFERENTES PERÍODOS DE LUZ CONTÍNUA.. ...................................................................... 127. FIGURA 34. MAPA DE COLOR (HEAT MAP VIEW) DE LOS VALORES DE EXPRESIÓN CT OBTENIDOS EN CADA ENSAYO CON BIOMARK™.. ............................................................................... 129. FIGURA 35. DISTRIBUCIÓN DE LOS VALORES DE EXPRESIÓN OBTENIDOS PARA CADA UNA DE LAS RÉPLICAS BIOLÓGICAS DE 3 GRUPOS DE LAS PROTEÍNAS DE INTERÉS .............................. 130. FIGURA 36. AJUSTE DE PREDICCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE TGO. ............................................... 132 FIGURA 37. CONDITIONAL MARGINAL EFFECTS PARA TGO Y NDH. ........................................... 134 FIGURA 38. NIVELES DE EXPRESIÓN RELATIVA DE TGO EN PLANTAS DE ARROZ ENSAYADAS A DIFERENTES PERÍODOS DE LUZ CONTINUA. ....................................................................... 135. FIGURA 39. ANÁLISIS DE REGRESIÓN LINEAL MÚLTIPLE DE TGO CON OTROS GENES ASOCIADOS A PROCESOS DE FOTOSÍNTESIS. ............................................................................................ 136. FIGURA 40. PARÁMETROS FOTOSINTÉTICOS MEDIDOS EN PLANTAS DE ARROZ DE 30 DÍAS DE CRECIMIENTO .................................................................................................................... 137. 22.

(24) 1.. INTRODUCCIÓN. 23.

(25) 24.

(26) 1.1. La planta de arroz (Oryza sp).. El arroz es una planta monocotiledónea anual, pertenece a la familia de las Poaceas, crece generalmente entre 1 y 1,8 metros de altura y posee hojas largas y delgadas (50100 cm de largo y 2-2.5 cm de ancho). Las semillas son granos de 5-12 mm de largo y 3.2 mm de espesor, que crecen formando espigas. El grano es la parte económicamente más importante de la planta y su endospermo es el producto final de consumo. Pertenece al grupo de las Gramíneas, donde también se encuentran el maíz y el trigo. Se cree que el arroz ha evolucionado desde hace unos 130 millones de años, y se considera que se cultiva desde hace nueve mil años (1). Etapas del crecimiento y desarrollo de la planta de arroz. En la vida de la planta de arroz, como en la de todas las plantas superiores, se identifican 3 fases importantes: la fase vegetativa, la fase reproductiva y la fase de maduración. Dentro de estas fases podemos encontrar diferentes etapas, las cuales se suelen codificar del 1 al 9, donde 1 se refiere a la etapa de la germinación y 9 se refiere a la madurez. La fase vegetativa se refiere al período desde la germinación hasta el macollaje. La fase reproductiva se refiere al período desde la iniciación de los primordios de la espiga hasta la floración. La etapa de la maduración corresponde al período desde la formación de la espiga hasta la madurez (ver Figura 1). Como en la mayoría de plantas, los factores climáticos tales como la temperatura, la radiación solar y el viento tienen influencia directa sobre el rendimiento, ya que afectan al crecimiento y a los procesos fisiológicos relacionados con la formación del grano. En cuanto al suelo, las mayores limitaciones para su producción son la erosión, deficiencia de nutrientes, toxicidad y los suelos inadecuados por su composición. El nivel recomendado de agua o de humedad en el suelo es esencial para mantener un adecuado manejo de los nutrientes, de las malezas y de las pestes y enfermedades. Bajo condiciones de secano, la lluvia es un factor crítico, de lo contrario el cultivo sufre por falta o exceso de agua (2).. 25.

(27) B C. A. D. D.. Figura 1. Partes de la planta de arroz en diferentes etapas de desarrollo. A) Semilla. B) Parte vegetativa de arroz en germinación. C) Cariópside (grano) y D) espiga.. El cultivo de arroz. El arroz es un cereal muy popular de uso común como alimento humano, es considerado uno de los cultivos más importantes del mundo y durante mucho tiempo ha sido el alimento de mayor cosecha a nivel mundial, ya que más de la mitad de la nutrición de la población mundial depende de este cultivo. Aunque el género Oryza incluye a cerca de 20 especies, actualmente existen dos especies de suma importancia para la alimentación humana: Oryza sativa, que se cultiva en todo el mundo, y Oryza glaberrima, que se cultiva en algunas partes de África occidental. En el Banco Internacional de Germoplasma de arroz, es posible encontrar más de 112.000 tipos diferentes, incluyendo las especies de arroz silvestre, las variedades tradicionales y las variedades modernas (3). 1.1.1. Importancia económica y cultural. Los orígenes del arroz han sido ampliamente debatidos, esta planta presenta tal antigüedad que es muy probable que el sitio y momento exacto de su desarrollo sea difícil de precisar, pero es claro que su domesticación es uno de los acontecimientos más importantes de la historia de los cultivos. El proceso de difusión ha llevado al arroz. 26.

(28) en todas las direcciones y en la actualidad se cultiva en todos los continentes excepto la Antártida. Las fuerzas combinadas de la selección natural y humana; diversidad de clima, estaciones, y suelos, así como las prácticas culturales (preparación de las tierras secas, con la siembra directa y el encharcamiento del suelo con el trasplante) llevó a la enorme gama ecológica que podemos evidenciar hoy en día. En los últimos 2.000 años, la dispersión y el cultivo de las variedades de arroz en nuevos hábitats, han acelerado aún más el proceso de diversificación. Hoy en día, muchas variedades se cultivan en más de 100 países. El arroz es el único cultivo que puede crecer de forma continua sin necesidad de rotación y puede producir hasta tres cosechas al año. Los agricultores también cultivan arroz en las tierras bajas de secano, las tierras altas, manglares y zonas de aguas profundas (2). El arroz como alimento. La seguridad alimentaria, que es la condición de contar con alimentos suficientes para proporcionar una nutrición adecuada para una vida sana, es un tema crítico en el mundo en desarrollo. El arroz es el cultivo más importante de los países en desarrollo y el alimento básico de más de la mitad de la población mundial. A nivel mundial, más de 3000 millones de personas dependen de este cereal, el cual aporta más del 20% de sus calorías diarias. En muchos países asiáticos, el consumo de arroz puede ser muy alto, superior a 100 kg por habitante al año y proporciona más del 50% de la oferta calórica. Como se muestra en la Figura 2, el consumo total de arroz (expresada como % del consumo total de calorías) varía ampliamente entre las diferentes regiones mundiales (3, 4).. ia As. Su. ra m. Áf. er. ric a. a an í Oc e. er ica te am No r. Eu. ica. 35 30 25 20 15 10 5 0 ro pa. Aporte calórico (%). Aporte calórico del arroz expresado en relación al % total de calorias (Por región). Región del mundo. Figura 2: El arroz representado como porcentaje de la ingesta calórica total por región (2007). Fuente: World rice statistics, IRRI.. 27.

(29) 1.1.2. El arroz como planta modelo. Los cereales cultivables que conocemos hoy en día, pertenecen a la familia de las Gramíneas. Esta es una extensa familia que guarda muchas similitudes pero igualmente una gran cantidad de diferencias, tanto desde una perspectiva agrícola como genética. Algunos de los muchos aspectos de esta gran diversidad son: las variaciones en los períodos de luz (día corto, día largo), los requerimientos de temperatura y agua y la eficiencia fotosintética, que incluye tanto el ciclo del carbono C3 como el C4. El arroz fue el primer cereal completamente secuenciado, este dato, asociado a una serie de características que se describirán más adelante, lo han convertido en una especie de referencia entre los cereales, tanto para estudios agrícolas como genéticos. El genoma de la subespecie japonica, fue secuenciado y ensamblado por el sistema de secuenciación masiva conocido como “whole-genome shotgun sequencing”. La secuencia ya ensamblada publicada en 2002 cubría el 93% de los 420 megabases del genoma y representó una fuente importante de conocimiento para la investigación de otros cereales (5) . El arroz tiene el genoma más pequeño de todos los cereales (ver Tabla 1), y guarda un alto grado de colinerealidad cromosómica, con otros cereales, ésta característica, unida a su gran importancia socioeconómica, no solo ha hecho posible la secuenciación de su genoma, sino su utilización como planta modelo (6). Aparte de las dos especies domesticadas de Oryza, hay otras veintiuna especies silvestres, nueve de las cuales, son tetraploides. Las especies restantes, incluso las dos cultivadas, son diploides. Todas las variedades de arroz tienen 12 cromosomas. El género Oryza tiene diez tipos reconocidos del genoma: AA, BB, CC, CCBB, CCDD, EE, HHKK, HHJJ, FF y GG. La composición de su genoma está determinada por el apareamiento meiótico de los cromosomas. Estas variaciones en las especies silvestres, son la principal fuente de genes agronómicamente importantes y muchos han sido incorporados en el arroz cultivado. De las dos especies cultivadas: O. glaberrima, y O. sativa, (con tres variedades, japónica, indica, y javanica), O. sativa, es la de mayor consumo (7). Una comparación del mapa genético del arroz, con otros cereales indica que el orden de los genes es similar a los de maíz y el trigo (8). Dado que el tamaño del genoma de trigo y el maíz es 34 y 6 veces mayor que el de arroz, respectivamente, el uso de la información obtenida a partir del mapa genético de arroz ayuda enormemente a la identificación de los genes en otros cereales. 28.

(30) Debido a los avances en la genómica del arroz, ahora son posibles una serie de estudios novedosos, como por ejemplo el análisis comparativo en genómica funcional entre el arroz y otros cereales y los estudios comparativos entre plantas monocotiledóneas (arroz) y dicotiledóneas (Arabidopsis thaliana).. Tabla 1. Comparativa del tamaño del genoma de arroz con el de otras especies. ORGANISMO. NOMBRE COMÚN TAMAÑO DEL GENOMA (MB). Oryza sativa. Arroz. 430. Sorghum bicolor. Sorgo. 772. Zea mays. Maíz. 2365. Hordeum vulgare. Cebada. 5000. Triticum aestivum Trigo. 17000. En resumen, es posible decir que el arroz es una planta modelo en cereales debido a que: 1) su genoma ha sido secuenciado en su totalidad, 2) existe una gran cantidad de “expressed sequence tag (EST)”, en las bases de datos, lo que facilita una rápida identificación de los genes de interés, 3) en la actualidad existen gran cantidad de herramientas de genómica funcional, prediseñados para su estudio, como los microarrays y 4) la transformación genética (por ejemplo vía Agrobacterium) es relativamente sencilla, si se compara con otros cereales (8). 1.2 Expresión, identificación y clonaje de genes. Desde que Gregor Mendel en la mitad del siglo XIX describió la posibilidad de que determinadas características se heredaban, este principio ha servido para asumir que ciertas características heredables están determinadas por un conjunto de genes. Esta sencilla reflexión ha dado paso a que casi dos siglos después, nos hayamos adentrado de forma muy significativa en el intento de comprender los genes. 1.2.1. Expresión de genes, del ADN a las proteínas.. Los genes se expresan porque en primer lugar se transcriben a ARN y a continuación se traducen, en general, a proteínas, o bien a otro producto génico, como es el caso del ARN ribosomal, cuyo producto es un ARN funcional. En todos los organismos, el contenido del ADN de sus células es idéntico, es, decir, que contienen toda la información necesaria para la síntesis de proteínas. Sin embargo, no todos los genes se expresan al mismo tiempo ni en todas las células, sino únicamente 29.

(31) aquellos que codifican proteínas esenciales para su funcionamiento general y se conocen como genes constitutivos (9). En los procesos biológicos es de vital importancia que la transmisión de la información genética se realice con fidelidad y que la expresión se realice con precisión. En el proceso de expresión de los genes encontramos tres etapas: la replicación del material genético, la transcripción y la traducción. La replicación es el mecanismo que permite la duplicación del ácido nucleico, generando una copia idéntica; éste mecanismo se produce de manera semi-conservativa, ya que las dos cadenas de ADN complementarias iniciales sirven de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. En la transcripción se transmite la información del ADN al ARN; la producción de copias de ARN la lleva a cabo la enzima ARN polimerasa, que añade un nucleótido de ARN cada vez a una cadena creciente de ARN, la cual es complementaria de los nucleótidos de ADN que se transcriben. En este proceso, la ARN polimerasa reconoce un sitio específico de la molécula de ADN al que se van a unir las enzimas del complejo, este sitio es conocido como promotor del gen y permite que se produzca la transcripción. Genes sin promotores no pueden ser transcritos, aunque un promotor puede servir para transcribir varios genes seguidos, formando lo que se denomina un operón. Un paso intermedio antes de la traducción es la edición o procesamiento del ARN, el más común es la eliminación de los intrones y la preparación para posteriores modificaciones postraduccionales. En la traducción, la información genética contenida en el ADN, transcrita, editada (solo en eucariotas) y convertida en ARN mensajero, es utilizada para sintetizar una proteína. El proceso, se lleva a cabo en los ribosomas. Para que los ribosomas puedan reconocer la molécula a traducir, además de tener la secuencia de nucleótidos adecuada, este debe contener: un codón de iniciación el cual permite saber dónde iniciar la traducción y un codón de terminación, que permite saber cuándo terminar la traducción. Para que la proteína se exprese correctamente, es necesario que el polipéptido sintetizando se pliegue de forma adecuada para que pueda desarrollar su función biológica; sin embargo, en muchos casos esto no ocurre de una manera completamente espontánea por lo que es necesario la participación de un grupo de proteínas esenciales denominadas chaperonas o proteínas tutoras, que ayudan al péptido a adquirir la configuración tridimensional correcta. Estas proteínas son muy importantes, también,. 30.

(32) para corregir errores pequeños que se produzcan en proteínas maduras y que causan su inactivación. En el proceso de la expresión génica, además de las modificaciones postraduccionales, los tres procesos anteriores requieren necesariamente ser regulados. La regulación de la expresión génica, permite a la célula controlar los procesos de estructuración y de función, en tiempo y cantidad y es la base para la morfogénesis, diferenciación celular y versatilidad en procesos adaptativos. En general, la expresión génica es regulada a través de cambios en el número y tipo de interacciones entre moléculas que participan en la transcripción del ADN y la traducción al ARN. Por tanto, las células regulan la expresión de sus genes mediante diferentes procesos, pero la forma más eficiente y usual es por medio del control transcripcional, sin embargo existen también niveles de control postranscripcionales y postraduccionales. El modelo de regulación génica más conocido es el Operón. Un Operón se utiliza como una unidad genética funcional y está formada por un grupo o complejo de genes, capaces de ejercer una regulación de su propia expresión, por medio de los sustratos con los que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. Este complejo está formado por genes estructurales que codifican para la síntesis de proteínas, que participan en vías metabólicas y cuya expresión está regulada generalmente por otros 3 factores de control: el promotor, el operador y el regulador (10, 11). 1.2.2. Medida de la expresión génica. Cuando se desea estudiar la expresión de una determinada proteína, tanto en el organismo o tejido de origen, como aislada en un organismo recombinante, la medida de la expresión génica es una herramienta clave que nos acerca al entendimiento de los procesos biológicos. La capacidad de cuantificar el nivel en el que un gen en particular se expresa en determinadas condiciones, tejidos, etc. representa una fuente de información valiosa, al igual que la localización o detección de la proteína. Actualmente, la cuantificación de la expresión es una tarea relativamente sencilla; técnicas como el Northern blot (que detecta ARNm), RT-qPCR, o microarrays, entre otros, nos proporcionan esta información. Para, conocer el nivel de expresión de una proteína de forma cualitativa, éste se puede medir directamente por la técnica del western blot, siempre que se disponga de un anticuerpo específico para la proteína en estudio.. 31.

(33) La localización celular o subcelular de la proteína o producto de expresión, también es importante; para ello técnicas como la hibridación in situ, inmunolocalización mediante microscopía confocal y electrónica, así como la existencia de las proteínas de fusión o tags como la green fluorescent protein, han ayudado de manera muy importante al entendimiento de la expresión génica y la asociación de determinadas funciones en sitios específicos de la célula (12–14). 1.2.3. Identificación de fuentes de ADN para el clonaje. Hoy en día, la piedra angular de la biología molecular son los genes. Para facilitar su estudio, estos pueden ser aislados y amplificados como lo que hoy conocemos como un clon. La clonación, mediante el uso de técnicas de la biotecnología moderna, ha conducido de manera directa a la exploración y elucidación de secuencias y revelado de genomas completos de diversos organismos. Todo ello ha favorecido la exploración de la diversidad genética y las relaciones e interacciones funcionales entre organismos. La posibilidad de aislar y estudiar de manera individual un gen, representa una puerta abierta a la generación de conocimiento, uno de cuyos interrogantes más interesantes siempre ha sido la expresión, regulación e interacción de unos genes con otros, en los procesos biológicos. El ADN que se desea estudiar puede ser, desde un gen o genoma completo, a una porción de este o, una secuencia particular. Los “insertos” de ADN típicos pueden ser: ADN copia (ADNc), productos de PCR, e incluso oligonucleótidos sintetizados. Las fuentes de este material genético pueden ser diversas. Por ejemplo, cuando el gen que se busca se conoce en otro organismo, los diseños in silico, y la búsqueda de homologías haciendo uso de bases de datos que contienen secuencias o genomas, son muy útiles. Una vez se asocia una secuencia de interés a un organismo en particular, es posible ir a esa fuente, consultar colecciones tipo y acceder a librerías de ADN. Actualmente, gracias a la gran cantidad de bases de datos con secuencias accesibles para muchos organismos, es más común que una secuencia de ADN de interés sea aislada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que por un cribado de librerías.. 32.

(34) Librerías de ADN La construcción de librerías de ADN permite compilar un conjunto de fragmentos de ADN, que han sido aislados de genomas de organismos. Esta colección, pueden ser utilizada para el aislamiento de genes particulares o secuencias específicas de interés. Los fragmentos de ADN son generados mediante el uso de endonucleasas de restricción, estas moléculas, a su vez, son ligadas a un vector, la colección de estos vectores recombinantes, es trasladada a un huésped y el conjunto de estas moléculas de ADN conforman la librería. En el proceso de búsqueda, a partir de dichas librerías, de fragmentos de ADN, o de genes, se diseñan sondas específicas que permiten identificar la existencia o no del fragmento en particular. Existen dos tipos de librerías: las de ADN copia, y las de ADN genómico (ADNg). El principio del clonaje a partir de ADNc se basa en que un ARNm aislado ya sea de un tejido, una célula, o estado de desarrollo, podría contener ARN específico que codifica para las proteínas y los genes constitutivos de esa condición en particular, es decir que se expresan en ese estadio, tejido, condición etc. De esta manera, una vez aislado el ARNm, puede ser estudiada una pequeña cantidad de los genes de todo un genoma. Debido a que el ARN no puede ser clonado directamente, se genera una transcripción reversa que permite generar el ADNc. Como las librerías de ADNc se derivan de un ARNm, éstas contienen únicamente regiones codificantes de genes que se expresan y por lo tanto, no contienen intrones. Para la búsqueda de una secuencia específica dentro de una librería, se suelen diseñar sondas, a este proceso se le llama cribado (screening) y consiste básicamente en un ácido nucleico (generalmente ADN), de la misma o similar secuencia de un gen en particular o fragmento de ADN de interés, de tal manera que esta sonda desnaturalizada es capaz de hibridar con la secuencia de interés, una vez que conjuntamente son renaturalizadas. Esta sonda, además de ser una secuencia similar, se debe poder detectar una vez ocurra la hibridación, para ello, las sondas se marcan o etiquetan. Usualmente, este marcaje suele ser radioactivo, aunque también existe el etiquetaje químico que detecta la proteína al entrar en contacto con una solución de revelado. Una librería también puede ser cribada mediante la utilización de un anticuerpo (inmunocribado), que detecte la proteína correspondiente al gen de interés, que ha sido aislada anteriormente (15–17).. 33.

(35) 1.2.4. Enzimas de restricción y ligasas: enzimas necesarias para clonar el ADN recombinante. En el proceso de clonaje,. existen dos importantes tipos de enzimas que son. herramientas clave en los procesos de ADN recombinante, estas son las enzimas de restricción y las ADN ligasas. Enzimas de restricción. Las enzimas de restricción, reconocen una secuencia corta de nucleótidos dentro de una molécula doble de ADN, y cortan a estas secuencias en ese punto, llamado sitio de restricción o sitios adyacentes. Los sitios de restricción poseen entre 4 y 14 pares de bases. Por otro lado, las ligasas unen dos piezas de ADN, mediante la formación de enlaces fosfodiester. Con las enzimas de restricción, el mecanismo de corte de ADN se realiza a través de la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de ADN. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o cohesivos. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía. Las primeras evidencias de la existencia de enzimas capaces de reconocer secuencias específicas de ADN y cortarlas se llevaron a cabo en observaciones y experimentación con el bacteriófago lambda. Hoy en día, se estima que, cerca de 3000 enzimas de restricción reconocen alrededor de 230 secuencias diferentes de ADN. La mayoría han sido encontradas en bacterias, aunque también han sido aisladas de virus, arqueas y eucariotas (18). A inicios de los años 50, Luria y colaboradores, informaron de un fenómeno llamado: “restricción de las modificaciones controladas por el huésped”, en inglés “hostcontrolled restriction modification”. Observaron que el bacteriófago lambda, que crecía bien en un determinado huésped normalmente crecía mal en otro, los fagos aislados de esta placa, eran capaces de reinfectar al segundo huésped pero perdían su habilidad de crecer en su huésped original. Mas tarde, Arber y Dussoix (19, 20), propusieron un modelo que pudiera explicar este fenómeno postulando que ciertas cepas bacterianas contenían una endonucleasa capaz de cortar el ADN y que algunas cepas, contenían un sistema específico de modificación apto para proteger el ADN de sus propias endonucleasas. De esta manera, el ADN foráneo como el de un fago infectado, es degradado por la endonucleasa.. 34.

(36) Sin embargo, una pequeña parte del ADN era modificada por la endonucleasa antes de la degradación, esto lo hacía capaz de replicarse e infectar al segundo huésped; pero como el huésped no contenía el mismo sistema de modificación, este fago modificado perdía su capacidad para replicarse en su huésped original. En 1968, Kühnlein y col. (21), detectaron actividad nuclease de la EcoB, mientras que Meselson y col. (22) purificaron una enzima similar en E. coli K y esta constituyó la primera tipo I. De esta manera, las enzimas de restricción reciben su nombre por su capacidad para restringir o prevenir infecciones virales por medio de la degradación del ADN foráneo. En 1970, se describe la purificación de la primera del tipo II, (Hind II) y la caracterización de su sitio de restricción y corte (23). Las enzimas de restricción se clasifican basándose en la estructura de su subunidad, requerimientos de cofactores, especificidad de corte y actividad metilasa asociada en 4 grupos generales: tipo I, II, III y enzimas “homing”. La endonucleasa tipo “homing”, aún no está del todo descrita, pero se sabe que está codificada por intrones y actúan sobre el ADN de la célula que la sintetiza. Las endonucleasas tipo I y III, no son útiles para el clonaje de genes, debido a que éstas cortan el ADN en otros sitios además del de reconocimiento, con lo cual, se generan cortes al azar. Las endonucleasas tipo II son ampliamente usadas en procesos de clonaje, debido a su especificidad. Bajo unas condiciones óptimas, la diferencia entre la tasa de cortes en el sitio de reconocimiento y el siguiente mejor sitio (por ejemplo variación por una sola base) en las endonucleasas de tipo II es muy alta. De todas maneras, en condiciones no óptimas, la diferencia en las tasas entre sitios de corte afines y el siguiente mejor sitio, cambia dramáticamente para la mayoría de enzimas, esta pérdida de fidelidad, o incremento de la tasa de sitios de corte similares es comúnmente denominado como actividad de inicio. Los parámetros que influyen son: el pH, tipo de iones presentes, fuerza iónica, cofactores diferentes al Mg2+, ratios altos entre ADN y enzima y la presencia de factores que alteran el volumen, como el glicerol (18). ADN Ligasa. El estudio de los procesos de replicación y reparación del ADN llevó al descubrimiento de las ligasas, las cuales catalizan la formación de enlaces fosfodiester entre el fosfato 5’ de un nucleótido de un fragmento de ADN y el hidroxilo 3´ de otro. Se unen de manera linear y a estos fragmentos de ADN unidos covalentemente se les llama ligación. La ligasa necesita el ATP como cofactor (24).. 35.

(37) Si los fragmentos de ADN digeridos por enzimas de restricción se colocaran juntos en condiciones adecuadas, estos podrían llegar a unirse, aún proviniendo de fuentes diferentes, y generar moléculas recombinantes, debido a la formación de puentes de hidrógeno, mediante las bases complementarias de los extremos susceptibles de unirse. Sin embargo, las dos cadenas no están unidas covalentemente por enlaces fosfodiester, por lo cual la ligasa es requerida para sellar los espacios, uniendo covalentemente las dos cadenas y regenerando la molécula circular. La ligasa más utilizada es la T4 derivada del bacteriófago con el mismo nombre, también se utiliza para ligar fragmentos con extremos romos, pero la reacción es menos eficiente y se requieren grandes cantidades; para solucionar este problema, se utiliza la enzima deoxinucleotidil transferasa la cual modifica los extremos romos. 1.3 Expresión génica en huéspedes heterólogos y obtención de proteínas recombinantes. Como ya se mencionó, cuando se desea caracterizar un gen o una proteína, las tecnologías actuales nos permiten encontrar y aislar este gen de manera relativamente sencilla. Por otra parte, la expresión de un gen es lo que usualmente suele presentar mayores complicaciones, ya que deben tenerse en cuenta diversos factores relacionados con el propio crecimiento de la bacteria huésped, las condiciones de inducción de la proteína de interés, su producción por el sistema bacteriano y su posible modificación o degradación. Sin embargo, una vez establecido el sistema de expresión y purificación, se pueden efectuar ensayos de interacción de la proteína con otras proteínas, cinética enzimática (si fuera una proteína sustrato o una enzima) o estudios funcionales y estructurales, entre otros. En la expresión de genes en huéspedes heterólogos, es frecuente observar que la proteína recombinante se degrade, con lo que se obtienen bajos rendimientos. Una de las maneras de solucionar este problema, consiste en lograr proteínas híbridas, es decir, fusionadas junto con la proteína heteróloga de interés. Esta unión debe ser covalente, de modo que sea estable y que no sea degradada por las proteasas del huésped. 1.3.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes. Existen dos sistemas de expresión para proteínas recombinantes: Los sistemas procariotas, donde E. coli es el de mayor éxito y los sistemas eucariotas, donde las levaduras y células de mamíferos son las más comunes. 36.

(38) Una desventaja de expresar células de eucariotas en procariotas, es que pueden ocurrir degradaciones de la proteína de interés o que esta se acumule en cuerpos de inclusión, lo que en ocasiones es una ventaja para purificar. Esto se debe a que ambos sistemas son diferentes y fenómenos como las modificaciones postraduccionales (ausentes en procariotas) suelen generar ciertos inconvenientes. Por ello, en cada caso se deben valorar las ventajas e inconvenientes de cada sistema de expresión, hacer una buena elección del vector y sus características, así como las del propio huésped. 1.3.2. Sistemas de expresión eucariota. Cuando se expresan genes eucariotas dentro de un procariota, éstos no se encuentran en su hábitat natural y a pesar de estar expresados, bajo el control de un vector procariota, las células de E.coli reconocen a las proteínas expresadas como foráneas y frecuentemente son destruidas. Por otra parte, los procariotas no llevan a cabo las modificaciones postraduccionales que si pueden hacer los eucariotas. Entre los sistemas eucariotas más exitosos se incluyen: levaduras, células de mamíferos y baculovirus (insectos). En este sistema, además de no presentar los problemas referentes a las modificaciones postraduccionales y degradación de la proteína, permite elegir plásmidos que secreten la proteína al exterior. Sin embargo, una desventaja es que los sistemas de purificación no son tantos ni tan conocidos como los de los procariotas y su crecimiento es normalmente más lento. 1.3.3. Sistema de expresión procariota. La expresión en células procariotas (principalmente E. coli), presenta muchas ventajas, entre las que se encuentra una rápida tasa de multiplicación y un cultivo sencillo; además, la expresión puede ser inducida fácilmente, usando el IPTG (isopropil-β-D-1 tiogalactopiranósido). Por otra parte, debido a que es el método más común, existe una gran cantidad de sistemas de purificación comercial disponible y de vectores diseñados para expresar genes en este organismo. Sin embargo, para estudios funcionales o enzimáticos este sistema presenta la desventaja de que muchas proteínas producidas son insolubles y llegan a formar cuerpos de inclusión, con lo que su recuperación como proteína funcional suele ser más laboriosa. A continuación, se describe la clonación en un sistema procariota de E. coli, que es el utilizado en la esta Tesis.. 37.

(39) Clonación de fragmentos de ADN o genes de interés en un sistema procariota El paso fundamental para el inicio de la clonación de genes, se realiza cuando nace la ingeniería genética o la tecnología de ADN recombinante a inicios de los años 70. El clonaje de genes, se puede describir como la estrategia mediante la cual un fragmento de ADN de interés, previamente identificado y aislado, se extrae del genoma del organismo de estudio y se replica en una célula huésped para generar una gran población celular que contiene moléculas idénticas de ADN. El clonaje usualmente implica la participación de dos secuencias de ADN diferentes: la especie que es la fuente del ADN de interés y la célula que sirve de huésped para la replicación del ADN recombinante (25) . En el proceso de clonación, se pueden identificar 4 pasos básicos: 1. Un fragmento de ADN que contiene el gen de interés, se inserta (mediante diferentes técnicas de biología molecular) dentro de una molécula de ADN circular, llamada vector de clonación, para producir una molécula de ADN recombinante. 2. El vector transporta este gen a un huésped, el cual usualmente es un organismo modelo, siendo E. coli el más común. 3. Cuando las células huésped se dividen, las copias del ADN recombinante se transmiten a la progenie y tiene lugar la replicación del vector de interés, incluyendo el ADN del gen que ha sido insertado. 4. Después de sucesivas réplicas, se obtiene una colonia o clon (en el caso de microorganismos), que contienen al menos una copia del gen de interés y que, por tanto, está formada por células recombinantes (25) (Figura 3).. 38.

(40) Figura 3. Procedimiento general para el clonaje molecular de ADN de interés y la construcción de una molécula recombinante de ADN. (1). En este ejemplo el ADN foráneo está cortado con la enzima de restricción EcoRI y el vector contiene una característica de selección de resistencia a ampicilina junto con una gran cantidad de sitios de restricción que conforman el sitio de clonaje múltiple. Se hace una mezcla en una reacción que contiene ligasa. (2) Se transfiere la reacción de ligación a la célula huésped, células competentes de E. coli, que son transformadas con la reacción de ligación. Cualquier fragmento de ADN con estructura linear, no será incorporada por el huésped. (3) Multiplicación del ADN plasmídico. En cada huésped transformado, se pueden obtener cerca de 500 copias del vector y algunas bacterias también pueden no llevar el ADN de interés.. Un vector de expresión necesita poseer ciertas características para ser considerado como tal. Una de las mas importantes es que debe ser capaz de replicarse en su huésped y así garantizar las copias del ADN recombinante. Dicho vector también debe ser pequeño, idealmente menor de 10 kb. En la naturaleza se han encontrado dos tipos de vectores que cumplen con estas características: los plásmidos y los bacteriófagos. Seguidamente haremos una breve descripción de los plásmidos, vectores con los que se ha trabajado en esta Tesis. Los plásmidos son moléculas de ADN circulares que actúan de forma independiente dentro de la célula, la mayoría de ellos llevan la información de uno o varios genes cuyas características son deseables en la bacteria huésped. La mayoría de plásmidos poseen al menos una secuencia que se utiliza como origen de replicación, y por esta razón, son capaces de replicarse de manera independiente a la bacteria. Otro factor de relevancia para los plásmidos es el número de copias que inducen en la célula huésped. Pueden variar ampliamente, dependiendo del origen de replicación que contengan, si están bajo un control relajado o riguroso, así como el tamaño del plásmido y su inserción asociada. Algunos plásmidos, tales como la serie pUC y derivados, tienen mutaciones que les permiten alcanzar un número de copias muy alto dentro de la célula 39.

(41) bacteriana. Los plásmidos basados en pBR322 y cósmidos se mantienen generalmente en un número de copias más bajas (26). Los plásmidos se pueden agrupar de varias maneras, dos de las formas más conocidas son: a) Por su capacidad para transferirse a otras bacterias y b) Por su función. Entre los de capacidad para transferirse a otras bacterias encontramos: 1. Los plásmidos conjugativos, son capaces de transferirse al contener genes tra. 2. Los plásmidos no conjugativos, que son incapaces de iniciar la conjugación, por lo que pueden ser transferidos únicamente con la ayuda de los conjugativos. 3. Los plásmidos movilizables, que son una clase intermedia de los dos anteriores y tienen únicamente una parte de genes necesarios para la transferencia, si bien pueden parasitar un plásmido conjugativo y transferirse con una alta tasa, pero solo en su presencia. En la clasificación de plásmidos por su función, encontramos cinco clases principales: 1. Los de fertilidad o plásmidos F: que contienen genes tra. Son capaces de conjugación. 2. Los plásmidos de resistencia (R), que contienen genes que pueden conferir resistencia contra antibióticos o toxinas y ayudar a las bacterias en la producción de Pili. Estos son históricamente conocidos como factores-R. 3. Los plásmidos Col, que contienen genes que codifican para las bacteriocinas, las proteínas que pueden atacar a otras bacterias. 4. Los plásmidos degradativos, que permiten la digestión de sustancias inusuales, como el ácido salicílico y tolueno. 5. Los plásmidos de virulencia, que convierten la bacteria en un patógeno (27). Se puede decir que, gracias a las tecnologías de ADN recombinante y de ingeniería genética, hoy es posible comprender mejor la funcionalidad y características de los genes, su capacidad de clonación y expresión, así como, los procesos de su aplicación biotecnológica, que a menudo operan con sistemas de expresión basados en plásmidos bien establecidas en huéspedes procariotas y eucariotas. Los organismos genéticamente modificados pueden producir, por ejemplo, sustancias químicas importantes, como los biopolímeros, los biocombustibles, o proteínas de alto valor médico aplicado, como la insulina. En esos bioprocesos los plásmidos recombinantes y sus huéspedes, tienen un impacto esencial en la productividad, tanto en el mundo de la industria, como en el de la investigación (28, 29). 40.

(42) 1.4 Las Transglutaminasas. 1.4.1 El. Características, estructura y función.. descubrimiento. de. la. primera. “protein. remodeling. enzyme”. (llamada. transglutaminasa 2, TG2), por el grupo de Heinrich Waelsch a mitad de la década de los 50 y su posterior descripción 1957 por Clarke y col. (29) del mismo grupo, abrió una puerta de entendimiento a este interesante grupo de enzimas involucradas en una gran cantidad de funciones. Esta transglutaminasa (TGasa), fue reconocida gracias a su característica de catalizar la incorporación de aminas primarias de bajo peso molecular, a proteínas, sin embargo hoy en día se sabe que las funciones de estas enzimas son mucho mas amplias. El nombre de transglutaminasa, fue acuñado por Waelsch, y de alguna manera es poco apropiado, debido a que estas enzimas no reaccionan con los residuos libres de glutamina (Gln), mas bien realizan funciones carbonilamida en la cadena lateral de residuos de glutamina en sustratos de proteínas (31). A partir de los estudios actuales, es posible decir que esta familia de enzimas (EC 2.3.2.13-R-glutaminil-peptido-aminasa- -glutamil transferasa) originan modificaciones post-traduccionales de proteínas, catalizando uniones amidas covalentes entre un grupo amino primario de una poliamina o de una lisina (donador amino) y un grupo carboxiamida de un residuo glutamil de algunas proteínas (amino receptor). El resultado de esta actividad es: a) la modificación de la conformación de la propia proteína y b) otros cambios de conformación más extensos como resultado de uniones entre la misma proteína y entre proteínas diferentes para formar conjugados de elevado peso molecular. También han sido descritas otras actividades catalíticas como la hidrólisis de ATP o GTP (en el caso de la TGasa tisular) (32) y otras funciones biológicas debidas a procesos especializados no catalíticos, como es la adhesión celular y posiblemente señales de transducción. En la reacción catalizada por las TGasas, los grupos -carboxiamida de residuos glutámicos en enlaces peptídicos, son acil donadores mientras que los grupos amino primarios de una gran variedad de compuestos pueden funcionar como acil aceptores, con la subsiguiente formación de mono-derivados -amida del residuo ácido glutámico. Cuando se presentan los niveles más bajos de saturación de grupos amino primarios, el agua puede actuar como acil aceptor (33).. 41.

(43) Las transglutaminasas mejor descritas son las TGasas de mamíferos y entre ellas el factor XIIIa de coagulación de la sangre es la más estudiada, debido a su función. La TG2, por su parte, se encuentra relacionada con funciones que van desde la señalización celular hasta la apoptosis y otras patologías, como la enfermedad celiaca y el Huntington. La TGasa epidermal (TG3) está relacionada con procesos de queratinización epidérmica. En general, estas enzimas están implicadas en fenómenos de protección y estabilización celular, así como en fenómenos de cicatrización de heridas, diabetes y enfermedades autoinmunes (34). Más adelante, se presenta una revisión detallada sobre las TGasas en mamíferos y sus implicaciones. 1.4.2. Los sustratos de las TGasas y sus reacciones. Podemos definir las TGasas esencialmente como enzimas que catalizan reacciones de transaminación, ésta es su función más estudiada y por ende más conocida. La enzima, funciona como un catalizador de modificaciones postraduccionales de las proteínas mediante la formación de enlaces isopeptídicos. Los sustratos de esta enzima, se pueden dividir en dos grupos principales: a) proteínas y b) otras moléculas que contiene grupos amino primarios, que reaccionan como donadoras de estos residuos. Las proteínas sustrato se pueden dividir a su vez, en dos familias principales, aquellas que actúan como acil donadoras, por ejemplo, que poseen el residuo de glutamina y aquellas que actúan como acil aceptoras, las que poseen el residuo de lisina. Una excepción a esta clasificación es el caso del factor V, el cual actúa como proteína sustrato de transglutaminación. En algunas ocasiones, una proteína sustrato, puede contener ambos residuos de reacción (glutaminas y lisinas), en este caso, la disponibilidad y cantidad de estos residuos, representan las características bioquímicas que conducen a la formación de dímeros o polímeros por reacción de reticulación ó “cross-linking” catalizada por TGasa (35). Estas enzimas, presentan diferencias de especificidad, con respecto a la modificación del residuo glutamina, lo que parece depender de los residuos cercanos a éste. Dentro de las otras moléculas que pueden funcionar como sustrato, es decir, los acil aceptores, se ha demostrado que las poliaminas (moléculas de naturaleza policatiónica presentes tanto en plantas, como en animales y microorganismos) son sustratos fisiológicos de las transglutaminasas (36, 37); de hecho, la medida de la actividad. 42.

(44) TGasa mediante la incorporación de poliaminas marcadas radiactivamente es un método altamente empleado (38, 39). Cuando un grupo amino se une a una proteína mediante la actividad TGasa, esta unión da lugar a la formación de monoderivados (ver Esquema 1); cuando, por la misma actividad, se unen dos grupos amino, se obtienen los bisderivados. PROTEIN-Gln-NH-(CH2)4-NH3+ N-mono(γ-glutamyl)-putrescine. PROTEIN-Gln-NH-(CH2)3-NH2+-(CH2)4-NH3+ N1-mono(γ-glutamyl)-Spermidine PROTEIN-Gln-NH-(CH2)4-NH2+-(CH2)3-NH3+ N8-mono(γ-glutamyl)-Spermidine. PROTEIN-Gln-NH-(CH2)3-NH2+-(CH2)4-NH2+-(CH2)3-NH3+ N1/N12-mono(γ-glutamyl)-Spermine. Esquema 1. Formación de monoderivados, mediante la interacción de poliaminas y proteína mediada por la transglutaminasa.. En el Esquema 2, se representan las distintas formas de actuación de la TGasa y los distintos productos formados a partir de su reacción enzimática, dependiendo de los sustratos que utilice. Así, la unión del primer sustrato, que contiene el residuo Gln, con la cisteína del centro activo de la enzima, forma un intermediario acil-enzima ( -glutamil-tiol-éster), con la consecuente liberación de amonio. El segundo sustrato (donador) se une entonces al intermediario y ataca el enlace tiol-éster y reestablece la cisteína del sitio activo de la enzima en su forma original. Dependiendo de la naturaleza del donador, se pueden obtener varios productos. La formación del intermediario acil-enzima es la etapa limitante de estas reacciones.. 43.

(45) Changes in protein configuration. Q donor protein (CH2)2 C=O TG. .. SH. Thioester intermediate formation. (CH2)2. Transamidation O-C Q donor protein. NH2. Polyamine or lysine .. NH 2. Ca 2+. (CH2)2. NH3 TG. Glutamine deamidation. Q donor protein. SH. C=O. Q donor protein. .. NH2 K donor protein. Crosslinking. (CH 2)2 O-C. (CH2)2 TG. Polyamine or lysine. Protein networks. .. H2O. Q donor protein. TG. .. SH. NH2. .. SH. TG. C=O. .. SH. NH2 K donor protein. OH. Esquema 2. Diferentes reacciones catalíticas mediadas por las transglutaminasas y sus productos.. Como vemos en el esquema anterior, una molécula de poliamina puede formar una unión covalente intra o intermolecular, lo cual puede dar lugar a una red de alto peso molecular. Dependiendo de la poliamina, la carga total de la proteína puede cambiar. La putrescina en forma de mono-(- -glutamil)-putrescina, añade cargas positivas a la molécula, pudiendo causar un cambio en la conformación de la proteína. Una proteína presentando dicha modificación, es más susceptible para formar bis-derivados, produciendo una unión covalente intra o intermolecular. La primera etapa es regulada por la concentración de poliaminas libres, ya que altos niveles de poliaminas libres pueden saturar a los residuos acil donadores de las proteínas sustrato, evitando la segunda reacción. De ésta manera, el nivel de poliaminas juega un papel crítico en la modulación de la unión covalente intra o intermolecular a proteínas. Los ε-(- -glutamil)-lisina y los N-Nbis-(- -glutamil)-amina, son los productos identificados más abundantes de la unión covalente intra o intermolecular formada por la catálisis enzimática. Además, el tamaño de la poliamina puede afectar a la red producida por la abundante unión covalente intra o intermolecular, la cual adquiere características de plasticidad y reactividad en función al sustrato incorporado. El colágeno, la elastina, la fibrina y la capa externa de la epidermis son ejemplos de esta estructura, formada a partir de la actividad TGasa, 44.

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