Attività dei farmaci

Determinazione quantitativa

dell’attività dei farmaci

Concetti basilari per lo studio del binding

recettoriale

• Lo scopo di un esperimento di binding e' di valutare l'affinità di un ligando per il suo recettore utilizzando un farmaco radiomarcato • Il binding si basa sulla possibilità di poter misurare selettivamente e quantitativamente la radioattività che si lega ai recettori

• Può essere utile anche per determinare la quantità di recettori presenti in un tessuto

• I recettori sono presenti in concentrazioni molto piccole nei tessuti.

Il recettore libero R non potrà essere misurato ma possiamo misurare la quantità di complesso ligando-recettore RD.

Ligando radiomarcato D

Recettore libero R

Recettore RD

Quando il sistema raggiunge l’equilibrio in ogni provetta avremo: Incubando il tessuto contenente i recettori R ed il ligando radiomarcato D in opportune condizioni sperimentali si formerà il complesso RD secondo l’equazione

Per poter calcolare la quantità del complesso RD è necessaria un’operazione di separazione del legato (Bound) dalla quantità di ligando radiomarcato D libero in soluzione non legato al tessuto (Free).

Metodi di separazione del RD dal mezzo di reazione

Filtrazione: Il metodo più semplice e classico è quello della filtrazione su membrane in fibra di vetro

Whatman GF/A, GF/B, GF/C dove varia la porosità _{0.7 µm-2.7 µm}

Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando aderisce al filtro mentre il radioligando libero passa attraverso la membrana.

Limiti e precauzioni della filtrazione

Le proteine possono ostruire il filtro.

Il ligando radiomarcato tende a legarsi alle fibre del filtro.

È richiesta una elevata velocità di filtrazione (deve essere completata in 4-5 secondi per evitare che il ligando radiomarcato si stacchi dal recettore. In genere si perde il 5% di RD)

Centrifugazione: Il tessuto contenente il recettore legato al radioligando viene raccolto in un pellet sul fondo del tubo da centrifuga mentre il radioligando libero viene decantato con la soluzione.

Limiti e precauzioni della centrifugazione

Una certa quantità di ligando radiomarcato (Free) potrebbe restare intrappolata nel pellet.

Dialisi

Viene impiegata quando il recettore ha bassa affinità per il ligando radiomarcato (micromolare).

Una piccola membrana simile alla cellulosa da dialisi separa due camere

La membrana è scelta in modo tale che il ligando possa passare mentre il recettore viene trattenuto.

Il ligando diffonde fino a raggiungere l’equilibrio. Nella camera azzurra [L] sarà Ligando libero

Nella camera gialla [L]= ligando libero + ligando legato

La differenza fra questi valori è la concentrazione di ligando legato.

Quella che viene misurata è la deplezione di ligando libero

RL L L _L L L L L R R

Analisi di saturazione

R + L RL

K_on

K_off

Il binding avviene quando ligando e recettore collidono mediante diffusione e quando la collisione ha un corretto orientamento e sufficiente energia. La velocità di associazione è data dal

numero di eventi di binding per unità di tempo

V

= [L] × [R] × k

R = Recettore

L = Ligando

numero di eventi per unità di tempo

Una volta avvenuto il binding, ligando e recettore restano legati per un certo periodo di tempo.

La velocità di dissociazione del complesso è data dal

V

= [RL] × k

Dopo la dissociazione il ligando e il recettore non devono aver subito modifiche.

Riarrangiando l’equazione avremo:

Per meglio comprendere il significato della K_d poniamo

[L] = K_d

L’equazione pertanto diviene:

[R]

[RL] = 1 da cui si evince che: [L] × [R] × k_on = [RL] × k_off [L] [R] [RL] = K_off = K_D K_on [R] = [RL]

Quando [Ligando] = K_D la quantità di recettore libero è esattamente uguale alla quantità di recettore occupato.

I recettori totali sono la somma di quelli liberi più quelli legati al ligando, e quando [Ligando] = K_D avremo che metà della popolazione recettoriale sarà occupata all’equilibrio.

Se il ligando ha elevata affinità per il recettore, la K_D sarà piccola perché basterà una piccola concentrazione di ligando per legare la metà dei recettori.

Non bisogna confondere la K_D (costante di dissociazione all’equilibrio) con K_off (costante di dissociazione). Non sono la stessa cosa ed hanno dimensioni differenti.

K_on = costante di associazione (molare-1 _min-1₎

K_off = costante di dissociazione (min-1₎

K_D = costante di dissociazione all’equilibrio (molare)

K_A = costante di associazione all’equilibrio (molare-1₎

€

K

=

K

K

=

1

K

Frazione recettoriale occupata [RL]

[R_tot] =

[RL] [R] + [RL]

Questa equazione non è utile perché non conosciamo la concentrazione di recettore libero.

Poiché

[R]

=

[

R

] -

[RL]

[RL]

[R]

[L]

K

=

La legge di azione di massa permette di definire la frazione di recettore occupata all’equilibrio in funzione della concentrazione di ligando.

[RL] = K_D = ([R_tot] - [RL]) [L] [R] [L] K_D

[RL] K

+ [RL] [L] = [R

] [L]

[R

]

[L]

[RL] =

K

+ [L]

[RL] (K

+ [L] ) = [R

] [L]

[RL] K

= [R

] [L] - [RL] [L]

da cui la frazione recettoriale occupata [RL]/ [R_tot] sarà: [Ligando] 0 0% 1K_D 50% 4K_D 80% 9K_D 90% 99K_D 99% [RL] [R_tot] [L] [L] + K_D = [RL]/ [R_tot]

La legge di azione di massa è un modello semplice che può essere usato per spiegare alcuni dati sperimentali e non è utile in tutte le situazioni.

Il modello assume che:

• Tutti i recettori sono ugualmente accessibili al ligando •  I recettori sono liberi o legati con il ligando. Non devono

esserci differenti stati di affinità recettoriale o di binding parziale •  Il binding non deve alterare il ligando o il recettore

Approccio sperimentale all’analisi di saturazione

L’esperimento di saturazione viene effettuato determinando il

Binding Totale e il Binding Non-Specifico a differenti

concentrazioni di ligando radiomarcato.

Binding Totale

Viene definito aggiungendo al tessuto concentrazioni crescenti di radioligando

Binding Non-Specifico

Viene definito in presenza di ligando non marcato ad elevata concentrazione alla quale tutto il radioattivo viene spiazzato dai siti specifici di legame

Esempio: Vogliamo determinare il binding specifico all’equilibrio

per un determinato radioligando alla concentrazione di 0.5 nM

Provetta 1 (Binding totale)

Tessuto + Rx (0.5 nM)

Lettura radioattività =2500 cpm

Provetta 2 (Binding non specifico)

Tessuto + Rx (0.5 nM) + Ligando non marcato (10 µM) Lettura radioattività= 500 cpm

Alla concentrazione 0.5 nM di Rx il complesso RD (Binding Specifico, Bound) sarà : 2500-500= 2000 cpm.

Il valore 500 cpm rappresenta la quantità di Rx che si è legato a siti non specifici di legame.

Infatti l’impiego del ligando non marcato ad levata concentrazione spiazza Rx solo da tutti i siti specifici ma non da quelli non specifici.

Realizzando differenti concentrazioni di Rx e definendo per ciascuna il Binding Totale e il binding Non-Specifico si calcola il Binding Specifico.

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.00 0.05 0.10 0.15 Binding totale Binding specifico

Binding non specifico

[3_{H]spiroperidolo, (nM)} Bound (p m o l/m g p ro te in ) Visualizzando solo la curva del binding specifico possiamo individuare la K_d e la

B_max

Le tre curve corrispondenti sono riportate in figura

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 Bmax K_d [3_{H]spiroperidolo, (nM)} Bo un d (p mo l/mg p ro te in )

Informazioni provenienti dall’analisi di saturazione

K

Indica la concentrazione di radioligando che all’equilibrio occupa il 50% dei recettori presenti nel preparato biologico

B

Indica la densità recettoriale nel tessuto studiato. Si esprime in moli/mg di proteina.

Come trasformare i cpm in concentrazione

Esempio: Un campione dal volume totale di un 1 mL fornisce

5000 cpm per un Rx di attività specifica 27 Ci/mmole cpm

dpm

= efficienza (%)

Conoscendo l’efficienza strumentale (es 55%) calcolo i dpm: 5000 cpm / 0.55 = 9090 dpm

Sapendo che 2.22 x 106 _{dpm corrispondono a 1 µCi}

Il campione in esame ha un volume totale di 1 mL

La concentrazione sarà: 1.52x10-10 _{M (0.152 nM).}

Dall’attività specifica del radioligando sappiamo che 27 Ci corrispondono ad 1 mmole. Cioè 27 x 106 _{µCi ad 1 mmole}

Analisi di Scatchard

Partendo dall’equazione: _{[RL] =} [ R tot ] [L] K d + [L]

[RL] ([L] + K d ) = [L] [R tot ]

[RL] [L] + [RL] K d = [L] [R tot ]

dividendo tutto per [L] K_d avremo:

[RL] [L]

[L] K d [L] K d [L] K d

=

quindi: [RL] [L] = [ R tot ] K d - [RL] K d

Se indichiamo con B la concentrazione di ligando legato [RL]; con B_max la quantità massima di ligando legato [R_tot];

con F la quantità di ligando libero [L] avremo: B F = _ B ₊ K d B max K d

Riportando in grafico il rapporto tra la quantità di ligando legato e ligando libero (B/F) rispetto alla quantità di ligando legato (B)

Si ottiene una retta con

Slope _{= -} 1

Kd

L’intercetta sull’asse delle ascisse (B/F = 0) permette di ricavare B_max che rappresenta la densità recettoriale.

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Bound B/F B_max B F = _ B ₊ K d B max K d

Se è presente un solo tipo di recettore lo Scatchard sarà lineare.

Se sono presenti invece due tipi di recettore in uguale concentrazione ma con differenze in K_d per il radioligando avremo:

Le curve dei singoli recettori sono riportate in rosso e azzurro mentre in nero la curva somma del binding totale.

Nel grafico di Scatchard (B) la linea nera del binding totale (inteso come somma del binding specifico delle popolazioni recettoriali esistenti) evidenzia una curvatura e le due linee tratteggiate rappresentano il binding specifico di ciascun recettore.

Dall’analisi di Scatchard si può determinare l’omogeneità di una popolazione recettoriale (sempre che vi siano differenze evidenti tra i valori di K_d del radioligando per ciascun recettore). In caso contrario avremo un’informazione apparente (di un’unica popolazione recettoriale).

La soluzione del problema è realizzata utilizzando radioligandi selettivi per ciascun tipo di recettore presente.

Analisi di Hill

Considerando l’equazione: [RL] ₌ [ R tot ] [L]

K d + [L]

[RL] [L] + [RL] K_d = [R_tot] [L] che può essere scritta:

[RL] K_d = [R_tot] [L] - [RL] [L]

[RL] = [L] ([Rtot] - [RL]) K_d

da cui: [RL]

[R_tot] - [RL] =

[L] K_d

se il ligando L interagisce con n siti secondo l’equazione

nL + R RL_n [RL] [R_tot] - [RL] = [L]n K_d B B_max - B = [L]n K_d avremo:

passando ai logaritmi:

dove n è il coefficiente di Hill (n_H)

= n log [L] - log Kd B B_max - B log log [L] log B B_max - B 0

Se esiste un solo sito di

interazione per recettore (n =1) si ha una retta con pendenza = 1

Per calcolare la K_d bisogna porre log B

B_max - B = 0

Analisi di competizione

Il binding di competizione viene effettuato per determinare l’affinità di un ligando per un dato recettore.

Viene utilizzata una concentrazione fissa di RX e di proteine recettoriali.

Il sistema viene portato all’equilibrio in presenza di concentrazioni differenti di ligando e quindi viene separato il legato (Bound) da tutto il resto.

Binding totale

Il binding totale viene determinato in presenza del radioligando e del solo tessuto.

Binding non specifico

Viene determinato in presenza di ligando “freddo”, cioè non marcato, ad elevate concentrazioni (10 µM) in modo che esso spiazzi dai siti recettoriali specifici tutto il radioligando.

La radioattività residua è data dal legame non specifico del radioligando con proteine non recettoriali.

Binding specifico

Viene ottenuto per differenza tra il binding totale e quello non specifico

Calcolo del valore di IC

Concentrazione radioligando 0.81 nM

Binding totale 9200 cpm

Binding non specifico 920 cpm

[8-OH-DPAT ] cpm RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento percentuale 1 x 10-10 8700 9200-8700 500/8280 6 % 1 x 10-9 7500 9200-7500 1700/8280 21 % 1 x 10-8 2500 9200-2500 6700/8280 81 % 1 x 10-7 1800 9200-1800 7400/8280 89 % 1 x10-6 920 9200-920 8280/8280 100 %

Curva di spiazzamento del composto 8-OH-DPAT

Alla concentrazione 1x 10-6 _{viene definito il binding non specifico (920}

cpm) che sottratto al binding totale (9200 cpm) fornisce il binding specifico (8280 cpm). A questa concentrazione tutto il radioligando è stato spiazzato dai siti recettoriali specifici (100 %).

cpm RX spiazzato Binding specifico Spiazzamento percentuale 9000 9200-9000 200/8280 2 % 8100 9200-8100 1100/8280 13 % 6500 9200-6500 2700/8280 33 % 2800 9200-2800 6400/8280 77 % [Composto 1] 1 x 10-10 1 x 10-9 1 x 10-8 1 x 10-7 1 x10-6 1720 9200-1720 7480/8280 90 % Curva di spiazzamento del composto 1

Le curve di spiazzamento da cui ricavare il valore di IC₅₀, si ottengono riportando in grafico le percentuali di spiazzamento in funzione del log della dose

Il valore di IC₅₀ indica la concentrazione di ligando in grado di spiazzare il 50 % di radioligando dai siti recettoriali all’equilibrio

E’ preferibile esprimere il valore di affinità come K_i in quanto si

eliminano le variabili

- concentrazione del radioligando utilizzato nel saggio di binding ([RX])

- natura del radioligando impiegato (K_D)

Equazione di Cheng-Prusoff

K _{i =}

IC ₅₀

1 + [RX] K _d

Saggi Funzionali

Studio biochimico dell’attivazione dei recettori

Si utilizzano saggi che permettono di misurare l’effetto

derivante dall’attivazione di un dato recettore e lo mettono in relazione con la quantità di ligando utilizzata.

Tecniche utilizzate:

•  misure elettrofisiologiche •  impiego di ligandi marcati •  saggi ELISA •  geni reporter • Assorbanza UV-Vis •  luminescenza •  Fluorescenza •  FRET •  BRET •  Fluorescenza Polarizzata

G_q R GTP GDP + - GTP GDP G_i R AC ATP cAMP R G_s GTP GDP PK-A + Ca++ RS + Ca++ Ca++ PL-C PIP₂ IP_{3 +} DAG PK-C +

Sfruttando il meccanismo di attivazione dei GCPR si può determinare l’attività agonista, agonista inverso, agonista parziale, antagonista su questi recettori.

Utilizzando _GTPγS35_{, analogo non idrolizzabile del GTP, si può}

misurare l’attività di un ligando in base all’accumulo di

α-GTPγS35_.

Nel caso in cui il composto sia antagonista è necessario realizzare la curva di attività in presenza di un agonista pieno e verificare lo spostamento parallelo a destra a dosi crescenti di antagonista. CH₂O P O P O P O O 35_S OH OH OH OH O N N N N O H N H₂ OH OH

10-11 ₁₀-10 ₁₀-9 ₁₀-8 ₁₀-7 ₁₀-6 ₁₀-5

0 50

100 Agonista pieno_{Agonista parziale}

Agonista inverso log dose Bound (G T P γS 35 )

cAMP coniugato alla fosfatasi alcalina

Anticorpo primario, legato al pozzetto

cAMP indotto dall’attivazione recettoriale

del ligando

Anticorpo secondario, lega cAMP

AP

Dosaggio del secondo messaggero

La reazione è basata sulla competizione per l’anti-anticorpo tra cAMP legato alla fosfatasi alcalina e quello libero proveniente dalla stimolazione recettoriale

cAMP

Dosaggio del secondo messaggero

AP AP AP AP + S S S S

La quantità di cAMP cellulare è inversamente proporzionale alla quantità di colorazione gialla svolta.

Attivazione di PK-A

Substrato PK-A-R110 (bisammide Rhodamina 110 peptide) PK-A R110 non fluorescente PK-A PK-A R110 fluorescente PK-A R110

non fluorescente fosforilato

proteasi proteasi

non fluorescente

Eccitazione 485 nm Emissione 530 nm

% peptide fosforilato 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RFU 100,000 50,000 0

L’intensità di fluorescenza misurata nel saggio è inversamente correlata all’attività della PK-A

Dosaggio del Ca

_{intracellulare}

IP

Saggio dell’Aequorina

L’Aequorina è una fotoproteina riscontrata nella medusa Aequorea Victoria.

L’apoaequorina è una proteina di 21 KDalton e necessita di un gruppo prostetico idrofobico celenterazina per essere convertita nella forma enzimatica attiva: aequorina.

In presenza di Ca++ _{aequorina ossida la celenterazina in}

celenteramide con produzione di CO₂, ed emissione di luce.

Questi saggi vengono effettuati in linee cellulari stabili in grado di esprimere il GPCR ed apo-aequorina

Gene reporter assay

•  Sono geni che codificano un prodotto la cui attività è facilmente rilevabile e

quantificabile, privi della regione del promotore

•  Vengono posti a valle di una regione del promotore che normalmente controlla geni diversi

•  L’attività della proteina codificata da gene reporter indica l’avvenuta

attivazione del promotore

•  Rappresentano un potente strumento per lo studio della regolazione genica e dei fattori di trascrizione

Gene reporter assay: studio recettori nucleari

PPAR

GAL4 PPAR

DNA

3’ PPRE Gene Target 5’

Transattivazione e trascrizione

PPAR luciferasi

3’ PPRE Gene Reporter 5’

Plasmide

Transattivazione e Gene reporter

Plasmide

3’ GAL4RE Gene Reporter 5’

Transattivazione con chimera e gene reporter

luciferasi

Vari geni del metabolismo lipidico e glucidico RNA POL II RNA POL II PPAR RNA POL II

Geni reporter

•  Facilmente rivelabili

•  Non espressi dalla cellula ospite

•  Minima interferenza col metabolismo delle cellula ospite I principali Geni reporter :

! Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT)

! LacZ (b-galattosidasi)

! SEAP (secreted alkaline phosphatase)

! GFP (Green Fluorescent Protein)

! Luc (Firefly Luciferase) ! Ruc (Renilla Luciferase)

Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT)

LacZ (β-galattosidasi)

La galattosidasi procariotica catalizza l’idrolisi del lattosio e di altri

β-galattosidi. L’attività galattosidasica di lisati di cellule trasfettate può essere misurata con tecniche diverse utilizzando opportuni substrati:

•  Assorbanza (o-nitrophenyl-β-D-galactoside)

•  Fluorescenza (4-methyl-umbelliferyl-β-galactopyranoside) •  Chemiluminescenza (1,2-dioxetangalactopyranoside)

LacZ è spesso co-trasfettato assieme ad altri costrutti reporter e usato come controllo interno

La CAT microbica catalizza il trasferimento di un acetile dal coenzima A al cloranfenicolo e rappresenta il più vecchio sistema reporter ancora in uso. Il

Cloranfenicolo Acetilato può essere facilmente separato dal non acetilato mediante TLC e dosato per autoradiografia o tecniche ELISA.

GFP (Green Fluorescent Protein)

La GFP della medusa Aequorea victoria emette una

fluorescenza verde senza bisogno di altri cofattori o enzimi. Permette lo studio dell’espressione genica e la localizzazione

di proteine in situ e in vivo.

Aequoria victoria

Geni reporter

SEAP (secreted alkaline phosphatase)

Luc (Firefly Luciferase)

Non richiede lisi cellulare: questo enzima può essere dosato direttamente nel mezzo di coltura, usando substrati fluorescenti o chemi-luminescenti

Photinus pyralis

L'enzima luciferasi della lucciola americana Photinus pyralis catalizza la

decarbossi-lazione ossidativa della luciferina causando luminescenza. Questo effetto può essere quantificato con un luminometro o un contatore a scintillazione.

"  NO radioattivi "  Alta sensibilità "  Alta linearità "  Compatibilità "  HTS 560 nm

Geni reporter

Ruc (Renilla Luciferasi)

Simile al gene Luc, ma codifica per una fotoproteina diversa

Usata in abbinamento alla GFP nella Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), nello studio delle interazioni proteina-proteina

BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)

Sono stati sviluppati sistemi basati su processi di trasferi- mento non radiattivo di energia ad un accettore fluorescente da parte di un donatore fluorescente.

Questi processi sono comuni in organismi bioluminescenti come nel celenterato Renilla reniformis in cui il donatore luciferasi (che emetterebbe una bioluminescenza blu)

trasferisce energia ad una proteina fluorescente (GFP) deter- minando un'emissione nella zona verde dello spettro.

+

GFP

Ruc Ruc _GFP

Poiché l'efficienza del trasferimento di energia non radiattivo dipende fortemente dalla distanza tra il donatore e l'accettore, questi sistemi sono particolarmente adatti per lo studio di interazioni molecolari a corto raggio (10-100 Å), quali interazioni proteina-proteina e ligando-recettore, o per studi conformazionali di proteine ed enzimi

Studio dell'interazione fra due proteine mediante Bret luciferina luciferasi hν 480 nm proteina A proteina B GFP luciferina hν 530 nm 480 nm 480 nm 530 nm

L'aggiunta del substrato per la luciferasi determina l'emissione di bioluminescenza: in assenza di interazione proteina-

proteina si osserva soltanto l'emissione della luciferasi con un massimo a 480 nm; in presenza di interazione fra le

due proteine (a destra) si osserva anche l'emissione della GFP (Green Fluorescent Protein) a 530 nm dovuta al processo di trasferimento di energia

Alla proteina A viene legato un donatore bioluminescente (in questo caso una luciferasi), mentre la seconda (B) porta un accettore fluorescente (GFP)

FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Consiste in un accoppiamento diretto fra l'emissione di un fluoroforo e l'eccitazione di un secondo fluoroforo

E’ un'interazione fra gli stati eccitati di due molecole di fluoroforo, in cui l'eccitazione di una molecola donatore è trasferita ad una molecola accettore, senza emissione di fotoni

Condizioni essenziali perchè possa avvenire la FRET sono: 1- lo spettro di assorbimento dell'accettore deve essere in buona parte sovrapponibile allo spettro di emissione del donatore

2- vicinanza tra donatore e accettore

La FRET dipende dall'inverso della sesta potenza della separazione intermolecolare, diventando molto evidente a distanze fra donatore e accettore dell'ordine di 10 ÷ 100 Å

Schema di un’onda elettromagnetica piana

Il campo elettrico E e magnetico B sono perpendicolari fra loro e sono entrambi perpendicolari alla direzione di propagazione indicata dal vettore c, velocità di propagazione

Polarizzazione di Fluorescenza (FP)

Emetteranno luce in un piano differente se le molecole

dovessero ruotare durante l’eccitazione del fluoroforo

Le molecole fluorescenti in soluzione, se eccitate con

luce polarizzata emettono luce nello stesso piano a

condizione che durante l’eccitazione il fluoroforo resti in

“stato stazionario”

Luce polarizzata

Ligando marcato con molecola fluorescente Rapida rotazione Lenta rotazione molecola-recettore La luce è depolarizzata La luce resta polarizzata

La polarizzazione di fluorescenza permette di

analizzare l’interazione carboidrati-proteina,

antigene-anticorpo, proteina-proteina in soluzione.

Il valore di polarizzazione è determinato dalla

rotazione molecolare durante il periodo compreso

Dal momento che la lettura è leggermente ritardata dall’eccitazione la quantità di fluorescenza di fondo è molto bassa


Emission wavelength nm 500 600 0 200 400 Emi ss ion in te n si ty

[3_H-Farmaco] nM N° tubo Quantità di radioattivo legato (dpm) N° tubo Quantità di radioattivo legato (dpm) in presenza di

eccesso di farmaco non radioattivo 1 1 710 2 50 2 3 1300 4 100 5 5 2540 6 240 10 7 3800 8 480 20 9 5230 10 920 50 11 7520 12 2350 100 13 10250 14 4700 esercizio

Una preparazione biologica (cellule, membrane, etc.) viene incubata con diverse concentrazioni di ligando radioattivo, avente un’attivita’ specifica di 60 Ci/mmol. Per valutare il non-specifico, esperimenti paralleli sono stati fatti con un eccesso di ligando non radioattivo e le conte relative sono riportate in tabella. Sapendo che sono stati usati 0.01 mg di proteina in ogni tubo, determinare la KD del farmaco e la concentrazione di recettori nel tessuto.

[3_H-Farmaco] nM N° tubo Quantità di radioattivo legato (dpm) N° tubo Quantità di radioattivo legato (dpm) in presenza di eccesso di farmaco non

radioattivo legame specifico (dpm) 1 1 710 2 50 660 2 3 1300 4 100 1200 5 5 2540 6 240 2300 10 7 3800 8 480 3320 20 9 5230 10 920 4310 50 11 7520 12 2350 5170 100 13 10250 14 4700 5550 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 0 20 40 60 80 100 120 D p m [3_{H-Farmaco] nM} totale "non-specifico" specifico esercizio

Una preparazione biologica (cellule, membrane, etc.) viene incubata con diverse concentrazioni di ligando radioattivo, avente un’attivita’ specifica di 60 Ci/mmol. Per valutare il non-specifico,

esperimenti paralleli sono stati fatti con un eccesso di ligando non radioattivo e le conte relative sono riportate in tabella. Sapendo che sono stati usati 0.01 mg di proteina in ogni tubo, determinare la KD del farmaco e la concentrazione di recettori nel tessuto.

Dal grafico possiamo dedurre che il massimo numero di siti legati e' all'incirca 5500 (plateau) e che la K_D (la concentrazione necessaria per legare meta' dei recettori) e' circa 5-10 nM .

Per una stima più precisa faccio lo “Scatchard plot”

Calcolo il legame

specifico per differenza tra il totale e il

“Scatchard plot”

dobbiamo trasformare i nostri dati:

[3_H-Farmaco] (farmaco libero) nM legame specifico (farmaco legato) (dpm) Farmaco specifico/ farmaco libero 1 660 660 2 1200 600 5 2300 460 10 3320 332 20 4310 215,5 50 5170 103,4 100 5550 55,5 0 100 200 300 400 500 600 700 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 le gato/ li b er o legato

Calcolo la pendenza (-1/K_D) e l’intercetta sulle ascisse (B_MAX)

€ pendenza = ΔY ΔX = 660 −55.5 660 −5550 = −0.1236 ⇒ KD = − 1 −0.1236 = 8nM q = y − mx = 55.5 − (−0.1236 × 5550) = 741.59 ⇒ B max = −q m = −741.59 −0.1236 = 6000dpm € [recettori] = 1Ci 2.2⋅ 1012_dpm × 6000dpm 60Ci⋅ mmol−1 × 1012_pmol 103_mmol × 1 0.01mg = 4.6pmol⋅ mg −1