Riassunto
La malattia di Alzhemer (AD) è un disordine neurodegenerativo caratterizzato da una progressiva perdita di memoria e da un deterioramento delle funzioni intellettive. Da un punto di vista clinico l'AD è caratterizzato dalla formazione di placche senili e grovigli neurofibrillari che causano una progressiva atrofia cerebrale localizzata prevalentemente a livello dell'area corticale temporale mediale con interessamento dell'amigdala, ippocampo e corteccia entorinale. Il 5% dei casi della malattia è riconducibile a forme ereditarie in gran parte dovute a mutazioni causative a carico di tre geni implicati nel metabolismo del peptide β-amiloide: APP (precursore del peptide β-amiloide), PSEN1 (presenilina 1) e PSEN2 (presenilina 2); nella maggior parte dei casi invece l'AD ha un carattere sporadico (familiare non ereditario) e mostra una patogenesi complessa e multifattoriale. Diversi studi hanno proposto un possibile coinvolgimento di fattori di rischio legati allo stile di vita, ai fattori infiammatori, ai fattori ormonali, allo stress ossidativo alle abitudini alimentari.Dalla letteratura è emerso che pazienti affetti da AD sono caratterizzati da iperomocisteinemia, ridotti livelli ematici di folati e di vitamina B12; vi sono inoltre evidenze che i livelli di S-adenosilmetionina (SAM) e di metilazione del DNA siano alterati nel cervello di pazienti AD, suggerendo che modificazioni epigenetiche giochino un ruolo chiave nell’eziogenesi delle forme sporadiche della malattia. Il metabolismo dei folati fornisce le unità monocarboniose necessarie per la sintesi di SAM, il principale agente metilante intracellulare, e riveste pertanto un ruolo fondamentale nei meccanismi di controllo dell’espressione genica dovuti a metilazione/demetilazione del DNA. La metilazione del DNA è affidata alle DNA-metiltransferasi (DNMT), questi sono enzimi espressi a livello cerebrale e possono svolgere due funzioni diverse: una metilazione di mantenimento oppure una metilazione de novo. La DNA-metiltransferasi-3B (DNMT3B), in particolare, converte la SAM in S-adenosilomocisteina, donando il gruppo metilico al carbonio in posizione 5 della citosina presente in isole CpG nella regione promotrice dei geni. I
polimorfismi DNMT3B-149C>T e DNMT3B -579G>T situati nel promotore del gene DNMT3B sono stati ampiamente studiati in relazione a patologie neoplastiche; da studi biochimici è emerso che la presenza del polimorfismo è associata con aumentati livelli di espressione genica.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di valutare il ruolo di tali polimorfismi quali fattori di suscettibilità per le forme sporadiche (non familiari) della malattia di Alzheimer e la loro possibile associazione con i livelli ematici di omocisteina, folati e vitamina B12. La popolazione oggetto dello studio è costituita da 378 pazienti e 216 controlli, appaiati per sesso e per età. La tecnica utilizzata è la PCR-RFLP che consiste nell’amplificazione del frammento di nostro interesse e nella successiva digestione enzimatica che permette di discriminare i diversi genotipi attraverso una corsa elettroforetica e successiva visualizzazione ai raggi UV. Dai risultati è emersa una differenza statisticamente significativa per quanto riguarda le concentrazioni ematiche di folati, omocisteina e vitamina B12 in un sottogruppo di pazienti rispetto a un sottogruppo di controlli. I pazienti mostravano infatti un aumento significativo (P<0,001) di omocisteina e una riduzione altrettanto significativa dei livelli di folati e vitamina B12 (P<0,001 e P=0,02).
Per quanto riguarda invece l'associazione tra i polimorfismi e i livelli ematici di omocisteina, folati e vitamina B12 non è emersa nessuna differenza statisticamente significativa.
La distribuzione delle frequenze genotipiche sia del polimorfismo DNMT3B-149C>T che di DNMT3B -579G>T, nei controlli, sono in accordo con quelle attese in base all'equilibrio di Hardy-Weimberg.
Il polimorfismo DNMT3B-149C>T ha mostrato una differenza statisticamente significativa, tra pazienti e controlli. Il genotipo eterozigote DNMT -149CT mostra una tendenza ad aumentare il rishio di sviluppare l'AD (OR= 1,44; IC 95%= 1,00-2,09) rispetto al genotipo DNMT -149 CC con un P=0,051; la combinazione genotipica DNMT-149CT/ -149TT sembra essere associata ad un aumento del rischio di AD (OR= 1,44; IC 95%= 1,01-2,04 ; P=0,042) rispetto al genotipo DNMT -149 CC.
Per quanto riguarda invece il polimorfismo DNMT3B -579G>T le frequenze genotipiche e alleliche non mostrano differenze statisticamente significative tra i pazienti e i controlli.
Abstract
Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive impairment of memory and cognitive functions. From a clinical point of view AD shows prominent histopathological features that includes the extracellular plaques and intraneuronal neurofibrillary tangles that result in the irreversible loss of neurons and atrophy particularly in the entorinal cortex, hippocampus and amygdala. About 5% of the cases of AD are familial autosomal dominant forms (early-onset) often caused by rare and usually highly penetrant mutations in three genes (APP, PSEN1 and PSEN2), all of which alter the production of the amyloid-β- peptide. Most of the cases are late-onset forms that show a complex and multifactorial etiology. Several studies suggest a possible involvment of lifestyle, oxidative damage, diet, inflammatory and ormonal factors in disease pathogenesis.AD individuals are characterized by decreased plasma folate levels, as well as increased plasma homocysteine (Hcy) levels and there is indication of impaired S-adenosylmethionine (SAM) levels and methylation in AD brains. Increasing evidence supports a role for epigenetic modifications in late-onset AD pathogenesis.
Folate metabolism is required for the production of SAM, the major DNA methylating agent, and it covers an essential role in gene expression regulated by DNA methylation/demethylation. DNA-methyltransferase (DNMTs) catalyze DNA methylation, these enzymes are expressed in the brain and may have two functions: DNA methylation levels or a de novo methylation
The DNA-methyltransferase-3B (DNMT3B) catalyzes the transfer of a methyl group from SAM to a cytosine ring, usually located within the context of a CpG dinucleotide in DNA. Two polymorphisms of DNMT3B (DNMT3B-149C>T and DNMT3B -579G>T) have been found to be associated with an increased risk of different types of cancer; in the in vitro promoter assay both SNPs revealed a significative change in the transcriptional activity of the DNMT3B promoter.
The aim of this study was to evaluate the role of this two polimorphisms as possible late onset AD IV
risk factors Moreover we wanted to investigate the possible association between the studied polymorphisms and plasma homocysteine, folate and vitamin B12 values.
The study population consisted of 378 cases and 216 controls matched by age and gender. The technique used is PCR-RFLP; it is based on PCR amplification followed by the digestion using specific restriction enzymes; this allowed us to discriminate different genotypes through the resulting restriction fragments which are separated according to their lengths by gel electrophoresis. This study showed a statistically significant difference for blood concentrations of folate, homocysteine and vitamin B12. We observed a significant increase in plasma homocysteine values in AD patients respect to controls (P<0,001), while plasma folate and vitamin B12 levels were significantly decreased in the AD cohort (P<0,001 and P=0,02).
None of the studied polymorphisms correlated with plasma Hcy, folate or vitamin B12 values. Genotype distribuition of the two selected polymorphisms in control subjects were consistent with those expected from the Hardy-Weimberg equilibrium.
We observed borderline significant and significant differences in genotype frequencies for the DNMT3B -149C>T polymorphism between AD patients and controls. The DNMT -149CT genotype showed a tendency to increase the risk of developing AD (OR= 1,44; IC 95%= 1,00-2,09; P=0,051) respect to DNMT -149 CC one; the combined genotype DNMT-149CT/ -149TT seems to be associated with an increased risk of AD (OR= 1,44; IC 95%= 1,01-2,04 ; P=0,042) respect to DNMT -149 CC genotype. No difference in allele and genotype frequencies was observed for the DNMT3B -579G>T polymorphism between groups.
