Corso di Laurea magistrale
in Scienze Ambientali
Tesi di Laurea magistrale
Studio di traccianti ambientali
organici in aree remote
Relatore
Prof. Andrea Gambaro
Correlatori
Dott.ssa Elena Barbaro
Dott.ssa Elena Argiriadis
Laureanda
Angela Arcoleo
Matricola 847923
Anno Accademico
2014 / 2015
PREMESSA 3
INTRODUZIONE 5
OBIETTIVO DELLA TESI 5
L’AEROSOL 6
COMBUSTIONE DI BIOMASSA 10
ANALITI OGGETTO DI STUDIO 12
METOSSIFENOLI 12
AMMINOACIDI 16
AREA DI STUDIO 21
AREE REMOTE 21
TRASPORTO A LUNGO RAGGIO 23
L’ANTARTIDE 25
CAMPIONAMENTO 26
MESSA A PUNTO DEL METODO ANALITICO 32
MATERIALI E METODI 38
LO STRUMENTO 38
HPLC – MS/MS 38
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) 39
SPETTROMETRIA DI MASSA A TRIPLO QUADRUPOLO (MS-MS) 39
METODOLOGIE ANALITICHE 42
FILTRI PER L’AEROSOL 42
NEVE 43
METOSSIFENOLI 43
L- E D- AMMINOACIDI 46
QUANTIFICAZIONE 49
SOLUZIONI STANDARD PER LE ANALISI 50
RISULTATI E DISCUSSIONE 53
APPLICAZIONE A CAMPIONI ANTARTICI 53
RISULTATI 58
METOSSIFENOLI 58
AMMINOACIDI 71
Premessa
L’uomo, fin dalla comparsa sulla terra, con le sue attività, ha interagito con l'ambiente, modificandolo sempre più profondamente col progredire della civilizzazione.
Col progresso tecnologico e il conseguente aumento demografico, le molteplici attività economiche e industriali necessarie per soddisfare i crescenti bisogni della popolazione hanno portato ad una alterazione degli equilibri ecologici, la quale rischia di essere irreversibile: deforestazione, effetto serra, desertificazione e contaminazione dell'ambiente.
In modo particolare l’atmosfera, a partire dalla rivoluzione industriale, è stata profondamente alterata da numerose attività antropiche: combustione di biomassa, vegetazione e grandi quantità di combustibili fossili, attività industriali, trasporto, alterazione della superficie delle terre emerse e attività agricole [1], provocando l’emissione di varie sostanze nocive per gli organismi e l’ambiente. Per tali motivi molta attenzione va posta nei confronti dell’inquinamento atmosferico, il quale ha ripercussioni sull’uomo, sugli ecosistemi e sul clima.
Alla luce di questi problemi, il continente antartico può considerarsi, data la sua posizione remota rispetto alle zone antropizzate, un osservatorio privilegiato per studiare e monitorare i livelli di contaminazione e i cambiamenti ambientali a livello globale, infatti, correnti oceaniche ed atmosferiche sono responsabili del trasporto di contaminanti dalle aree inquinate verso questa regione.
Tuttavia, la ricerca atmosferica è spesso limitata proprio a causa della posizione remota dell’Antartide, ma nonostante ciò, la presenza di fenomeni atmosferici unici, come la formazione ogni primavera di un buco nello strato di ozono sopra di essa, ha portato ad un incremento degli studi e delle ricerche [2].
Introduzione
Obiettivo della tesi
Con riferimento alle problematiche menzionate nella premessa, in questa tesi l’attenzione è stata focalizzata su due obiettivi, entrambi riguardanti la determinazione di composti organici in aree remote e il ruolo che questi giocano come traccianti ambientali.
Il primo obiettivo è stato la messa a punto di un metodo analitico per la determinazione di metossifenoli, una classe di composti organici semi-volatili, in campioni di aerosol antartico; i metossifenoli sono considerati traccianti di combustione della biomassa nell’aerosol atmosferico [3][4].
I campionamenti sono stati effettuati su spugne di poliuretano (PUF) in grado di raccogliere la frazione organica volatile presente in atmosfera, durante le campagne antartiche XXVI e XXVII (estati australi 2010-11 e 2011-12) presso la stazione scientifica italiana Mario Zucchelli (MZS). Nell’ambito della messa a punto, non si è riusciti ad individuare il più idoneo metodo di estrazione degli analiti dal PUF, a causa delle basse rese di estrazioni dovute alla semi-volatilità degli analiti.
La seconda fase del lavoro di questa tesi ha riguardato la determinazione di metossifenoli e D- e L- amminoacidi utilizzando un metodo già validato. Le analisi sono state effettuate su campioni di aerosol (raccolti su filtri) e neve, campionati durante la XXX spedizione antartica (estate australe 2014-15) presso MZS.
L’analisi degli amminoacidi, in quanto indicatori di long-range transport, consente lo studio delle dinamiche di trasporto e trasformazione dell’aerosol [5]. Inoltre, la determinazione degli enantiomeri D e L permette il loro utilizzo come traccianti dell’origine biogenica dell’aerosol [6].
La determinazione degli analiti anche nei campioni di neve ha consentito di mettere a confronto le loro concentrazioni nei campioni di aerosol con una possibile deposizione sul manto nevoso dei composti oppure un eventuale rilascio dalla neve stessa [7]. Lo studio di questi processi è fondamentale per capire se questi composti potranno essere utilizzati come indicatori biogenici in studi paleo climatici nelle carote di ghiaccio.
L’aerosol
L’aerosol è definito come una sospensione di particelle fini solide e/o liquide in un gas.
In atmosfera può verificarsi una grande varietà di reazioni, data la sua composizione estremamente eterogenea. Di conseguenza, anche l'aerosol che viene prodotto, ha proprietà sia chimiche che fisiche, molto complesse [8] e i diametri delle particelle sono nel range di 1 nm – 1 mm [9].
Le particelle di aerosol sono sempre presenti nell’atmosfera terrestre, trovandosi spesso al centro di molti problemi ambientali come il cambiamento climatico, la riduzione dell’ozono stratosferico e la qualità dell’aria [10]. Esse, infatti, diffondono e assorbono la radiazione solare e terrestre, sono coinvolte nella formazione di nubi e
precipitazioni fungendo da nuclei di condensazione e influenzano l'abbondanza e la distribuzione di gas atmosferici in traccia attraverso reazioni chimiche eterogenee. Oltre ad avere effetti su atmosfera e clima, l’aerosol gioca anche un ruolo importante sulla salute pubblica, infatti, diffonde organismi biologici e patogeni (batteri, pollini, spore, virus, ecc) e può causare o aumentare patologie respiratorie, cardiovascolari, infettive e allergiche.
Le particelle di aerosol hanno una grande varietà di sorgenti, sia naturali che antropiche. In base alla loro origine si distinguono particelle primarie e secondarie. Le primarie sono emesse direttamente, in forma solida o liquida, da fonti come la combustione della biomassa, la combustione incompleta di combustibili fossili, le eruzioni vulcaniche, l’erosione continentale, lo spray marino e i materiali biologici (frammenti di piante, microrganismi, pollini, ecc). Le particelle secondarie, invece, sono formate in seguito alla conversione gas-particella in atmosfera (formazione di nuove particelle attraverso nucleazione e condensazione di precursori gassosi).
Le particelle sospese subiscono varie trasformazioni e interazioni fisiche e chimiche, cioè, variazioni di dimensione delle particelle, di struttura e di composizione (coagulazione, ristrutturazione, assorbimento gas e reazioni chimiche). Un esempio di trasformazione avviene nelle nuvole, le quali sono formate dalla condensazione del vapore acqueo su particelle di aerosol preesistenti [10].
A causa dei processi di formazione e trasformazione, le particelle di aerosol hanno forme irregolari, quindi, ai fini della distribuzione granulometrica, si utilizza un parametro dimensionale, il diametro aerodinamico Dae, definito come il diametro di
quella della particella reale, nelle medesime condizioni di temperatura, pressione e umidità relativa.
La classificazione basata sulla distribuzione dimensionale dell’aerosol, quindi, utilizza questo parametro ed è illustrata in Figura 1 [11].
Figura 1 Distribuzione del PM sulla base del Dae e relative mode
Le particelle di aerosol sono rimosse dall’atmosfera attraverso due processi, le deposizioni secche e umide. La deposizione umida è la via principale di rimozione delle particelle ed avviene per mezzo delle acque meteoriche.
Quando invece non c’è l’intervento delle precipitazioni, si parla di deposizione secca, la quale avviene ad opera di trasporto convettivo, diffusione e adesione alla superficie terrestre. È meno importante a livello globale, ma è molto rilevante per quanto riguarda la qualità dell'aria a livello locale (Figura 2).
Figura 2 Ciclo atmosferico dell’aerosol [9]
Così come la distribuzione delle dimensioni delle particelle, anche la composizione chimica è molto variabile. In generale, i componenti chimici principali del particolato atmosferico (PM) sono solfato, nitrato, ammonio, sale marino, polveri minerali, composti organici, carbonio elementare e black carbon. Le loro abbondanze relative possono, tuttavia, variare in base a diverse località, orari, condizioni meteorologiche e granulometria delle particelle [9].
Le particelle di aerosol di interesse per la salute umana solitamente vengono suddivise in due gruppi:
− PM10, costituite da particelle inferiori a 10 µm, vengono classificate come polveri
inalabili e sono in grado di raggiungere la laringe;
− PM2.5, con diametro inferiore a 2.5 µm, sono le più pericolose per la salute umana
perché riescono a penetrare sino agli alveoli polmonari e sono denominate polveri respirabili [12] (Figura 3).
Figura 3 Penetrazione delle polveri nell’apparato respiratorio1
Combustione di biomassa
La combustione di biomassa, provocata da incendi sia spontanei che prescritti, provoca l’emissione in atmosfera di una grande quantità di particelle e composti volatili. Le polveri sottili formatesi hanno un impatto significativo sul clima attraverso le interazioni con la radiazione solare in arrivo e la modificazione delle proprietà delle nubi [13]. Inoltre, le particelle inalabili e i composti organici prodotti sono spesso cancerogeni [14].
I composti principali che di solito vengono identificati nelle polveri del fumo comprendono: alcani, alcheni, aldeidi, chetoni, acidi grassi, alcoli grassi, metossifenoli, derivati monosaccaridi, fitosteroli, diterpenoidi, triterpenoidi, ed esteri cerosi [13].
I dati riguardanti la composizione del PM emesso dalla combustione sono molto importanti per comprendere il contributo che i diversi composti organici hanno sulla chimica dell'atmosfera.
La maggior parte delle aree urbane/industriali produce composti organici analoghi associati al particolato atmosferico (cioè prodotti di combustione, gas di scarico veicolare, oltre ad una serie di emissioni industriali). Per quanto riguarda, invece, la copertura vegetale, è stato dimostrato che essa produce anche marker molecolari [15]. L’applicazione di questi costituenti molecolari come traccianti, provenienti da fonti sia naturali che antropiche, è molto utile alla chimica troposferica, in quanto forniscono un contributo prezioso alla qualità dell’aria e ai modelli di dispersione e ripartizione delle fonti [15][16].
Le diverse condizioni di temperatura durante la combustione di biomassa determinano l'alterazione e la trasformazione molecolare dei composti organici emessi. Inoltre, intensità del calore, aerazione, durata e condizioni della combustione determinano la distribuzione e i rapporti tra la produzione di composti naturali e composti alterati presenti nel fumo.
Quindi, i traccianti molecolari emessi direttamente dalla combustione della biomassa e quelli termicamente alterati forniscono una “impronta digitale” chimica che è sorgente-specifica e utile per identificare i contributi di specie singole o multiple di vegetazione in campioni di aerosol atmosferico [15].
Analiti oggetto di studio
Metossifenoli
I metossifenoli sono marker molecolari specifici in grado di fornire indicazioni nella valutazione delle sorgenti di combustione [17]. Si tratta di composti organici polari, semi-volatili, piuttosto reattivi e costituiti da un anello fenolico al quale sono legati uno o più sostituenti metossile (-OCH3) (Figura 4). La loro presenza nel PM
atmosferico è principalmente dovuta alla combustione della biomassa, inoltre sono relativamente stabili come traccianti [18].
A temperatura ambiente i metossifenoli tendono a condensare, quindi sono presenti nell’aerosol insieme ai composti non volatili. Solo piccole quantità di metossifenoli, più volatili, rimangono in forma gassosa nel fumo proveniente dai diversi tipi di biomassa [19].
Figura 4 Formula di struttura 4-methoxyphenol
I metossifenoli derivano dalla pirolisi della lignina: quest’ultima è un biopolimero che funge da rinforzo alla maglia fibrosa formata dalla cellulosa (costituisce circa il 30% del tessuto legnoso).
La lignina deriva a sua volta principalmente da tre alcoli aromatici: alcol p-cumarilico, alcol coniferilico e alcol sinapilico, contenenti prevalentemente nuclei anisilici, vanillici (guaiacilici) e siringilici [15][20] (Figura 5).
Figura 5 Classificazione e composizione delle lignine a partire dagli alcoli precursori [21]
Le abbondanze relative di questi monomeri variano notevolmente tra le principali classi di piante, consentendo di distinguere 3 tipi di lignina:
− lignina hardwood: è arricchita di prodotti che si originano dall’alcol sinapilico. Appartengono a questa categoria le Angiosperme [20].
− lignina softwood: comprende le Gimnosperme, molte delle quali sono prolifiche produttrici di resina [15]; ha un'alta percentuale di prodotti provenienti dall’alcol coniferilico e una quantità minore dall’alcol sinapilico.
− lignina erbacea: è costituita soprattutto da prodotti dell’alcol p-cumarilico.
I prodotti di degradazione ottenuti dalla pirolisi della lignina e del legno sono fenoli, aldeidi, chetoni, acidi e alcoli, i quali, generalmente, conservano i sostituenti originali (OH, OCH3) sull'anello fenilico (Figura 6) [20].
Figura 6 Prodotti della pirolisi della lignina e diversi tipi di lignina [20]
Le emissioni e i rapporti di concentrazione dei composti fenolici dipendono fortemente dal tipo di biomassa bruciata (hardwood, softwood o erbacea), così come dalle condizioni atmosferiche (umidità, vento, temperatura) e di combustione.
Nel presente lavoro di tesi sono stati scelti i metossifenoli che rappresentano le tre principali categorie di biomassa combusta [17] (Tabella 1).
Tabella 1 Metossifenoli analizzati nel presente studio e loro principali caratteristiche
Composto Peso
Molecolare Formula chimica Struttura chimica
Anisil-derivati Acido p-cumarico PA 164 C9H8O3 Siringil-derivati Siringaldeide SyAH 182 C9H10O4
Acido siringico SyA 198 C9H10O5 Acido sinapico SA 224 C11H12O5 Acetosiringone SyAC 196 C10H12O4 Guaiacil-derivati Acido vanillico VA 168 C8H8O4 Acido isovanillico IVA 168 C8H8O4 Acido omovanillico HA 182 C9H10O4 Vanillina VAH 152 C8H8O3 Acido ferulico FA 194 C10H10O4
Coniferaldeide
CAH 178 C10H10O3
Acetovanillone
VAC 166 C9H10O3
L’analisi di questi composti consente di migliorare la comprensione riguardo la loro presenza e origine nell’aerosol polare [17], tenendo in considerazione il trasporto a lungo raggio da zone antropizzate ad aree remote come l’Antartide.
Amminoacidi
Un amminoacido (Figura 7) è una molecola organica che consiste in un carbonio centrale, detto carbonio α, su cui giacciono un atomo di idrogeno, un gruppo amminico (con l’eccezione della prolina che possiede un gruppo imminico), un gruppo carbossilico e una catena laterale R. Quest’ultima svolge una serie di funzioni ed è diversa per ogni amminoacido.
Gli amminoacidi si trovano in natura soprattutto come costituenti delle proteine, uniti da un legame peptidico, il quale si forma per reazione fra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico di quello successivo, con liberazione di una molecola d’acqua [22].
In base alla natura della catena laterale R è possibile la suddivisione degli amminoacidi nei seguenti gruppi:
− apolari − polari neutri
− acidi (catena laterale con carica negativa) − basici (catena laterale con carica positiva).
Gli amminoacidi fanno parte, insieme ad altre specie (acidi organici, ammine e composti carbonilici), dei composti organici idrosolubili (WSOC) contenuti nella frazione organica dell’aerosol marino [23]. Quest’ultimo contribuisce in modo rilevante all’intera massa di aerosol mondiale [24], ciò avviene perché gli oceani, data la loro estensione, sono una delle principali sorgenti di aerosol a livello globale [25]. Tuttavia, diverse sorgenti di emissione, oltre quella marina, possono influenzare la concentrazione di amminoacidi in atmosfera, infatti, la presenza di questi composti nell’aerosol continentale è dovuta a piante, pollini e alghe, così come funghi e spore batteriche [26] [27]. Anche le emissioni vulcaniche e la combustione di biomassa sono considerate possibili fonti di amminoacidi in atmosfera [28] [29]. Tra le sorgenti antropiche si annoverano, invece, il fumo di sigaretta [30], gli inceneritori, le discariche e gli impianti di depurazione [31].
Gli amminoacidi sono una componente attiva importante dell’azoto organico presente nell’aerosol poiché, grazie alla loro igroscopicità, hanno la capacità di agire come nuclei di condensazione, con conseguenze importanti sul bilancio radiativo [32]. In questa tesi sono stati analizzati i D- e L- amminoacidi. La loro distinzione è basata sul tipo di configurazione spaziale. Si tratta di enantiomeri, molecole speculari e non sovrapponibili. Essi possiedono le medesime proprietà chimico-fisiche, eccetto la capacità di ruotare il piano della luce polarizzata, quest’ultima ha, infatti, lo stesso valore assoluto, ma segno opposto per ognuno dei due enantiomeri.
Gli L-amminoacidi sono le unità di base, dotate di versatilità funzionale e metabolica, per la costruzione delle proteine, tramite legami peptidici [5]. In natura sono stati selezionati venti amminoacidi per costituire le proteine [22]. I D-amminoacidi, invece, derivano dal peptidoglicano, il principale componente strutturale della parete cellulare batterica [5].
Il rapporto tra i due enantiomeri può essere un marker efficace per la caratterizzazione di azoto organico da fonti biogeniche [6]. È possibile, quindi, indagando la frequenza e la concentrazione dei livelli di L- e D- amminoacidi disciolti nell’aerosol, determinare come questi composti siano distribuiti nelle classi dimensionali delle particelle e studiarne così la composizione e i cambiamenti dopo il
long-range transport [5].
A tal proposito, è preferibile utilizzare gli amminoacidi meno reattivi come traccianti atmosferici di azoto organico, in quanto, queste molecole sono soggette a diverse trasformazioni in atmosfera. Molti composti radicalici, infatti, sono responsabili della
loro degradazione, ad esempio il radicale ossidrile è il principale ossidante per la maggior parte degli amminoacidi, invece l’ossigeno singoletto lo è per l’istidina [33]. In Tabella 2 sono illustrati gli amminoacidi analizzati nel presente lavoro di tesi.
Tabella 2 Amminoacidi analizzati nel presente studio e loro principali caratteristiche
Composto (isomeri L-)
Peso Molecolare
Formula
chimica Struttura chimica
Apolari Glicina Gly 75 C2H5NO2 Alanina Ala 89 C3H7NO2 Valina Val 117 C5H11NO2 Prolina Pro 115 C5H9NO2 4 Idrossiprolina 4-Hyp 131 C5H9NO3 Leucina Leu 131 C6H13NO2
Metionina Met 149 C5H11NO2S Fenilalanina Phe 165 C9H11NO2 Triptofano Trp 181 C11H12N2O2 Polari Serina Ser 105 C3H7NO3 Treonina Thr 119 C4H9NO3 Asparagina Asn 132 C4H8N2O3 Glutammina Gln 146 C5H10N2O3 Acidi
Acido aspartico Asp 133 C4H7NO4 Acido glutammico Glu 147 C5H9NO4 Tirosina Tyr 181 C9H11NO3 Basi Istidina Hys 155 C6H9N3O2 Ornitina Orn 132 C5H12N2O2
Area di studio
Aree remoteUna località remota è definita, in senso geografico, “molto lontana nello spazio, desolata, appartata” e, in relazione all’aerosol, indica una grande distanza dalla sorgente di emissione.
L’aerosol primario proveniente da sorgenti naturali può essere emesso in qualunque parte della superficie terrestre non antropizzata, come le superfici degli oceani, i deserti, i terreni ricoperti di ghiaccio, le alte catene montuose etc.
Invece l’aerosol secondario, formato da precursori sia naturali che antropogenici, di solito si origina lontano dalla sorgente di emissione, per cui il processo di trasporto gioca un ruolo importante.
Il vento è il principale mezzo di trasporto dell’aerosol e la distanza percorsa dipende dal tempo di vita di quest’ultimo. Il tempo di vita dipende, a sua volta, dal diametro della particella e dall’ambiente in cui l’aerosol è trasportato.
In generale, il tempo di vita dell’aerosol è piuttosto breve: nell’ordine delle settimane vicino alla superficie terrestre, fino ad arrivare ai mesi nell’alta troposfera. Tuttavia, le particelle possono restare intrappolate nella stratosfera per anni. Quindi, il trasporto verticale dovuto ai moti convettivi può avere effetti diretti sul tempo di vita dell’aerosol e sulla distanza del trasporto.
Per definire il concetto di area remota la distanza da sola non è un criterio sufficiente, ma vanno incluse anche la densità di popolazione e le attività umane.
In tal senso, poiché le sorgenti naturali di aerosol, come oceani e deserti, interessano grandi aree del pianeta e contribuiscono alla maggior parte delle emissioni globali primarie, le aree remote possono definirsi come luoghi ove l’influenza antropogenica è minima e la composizione atmosferica è molto vicina a quella osservata nel
background naturale. Dunque, oceani, deserti e foreste possono considerarsi “remoti”
nonostante, a volte, ci siano aumenti del carico di aerosol in seguito a processi naturali.
Per quanto riguarda le aree polari, l’Antartide è considerato lontano dalle sorgenti di aerosol (tranne qualche emissione locale dalle stazioni di ricerca) e l’Artico risente del trasporto a lungo raggio di masse d’aria inquinate, soprattutto dal continente euroasiatico [34].
Trasporto a lungo raggio
Le particelle secondarie si originano durante il loro trasporto dalla sorgente di emissione al sito di osservazione, nel corso del quale subiscono una serie di reazioni e trasformazioni che possono alterarne le caratteristiche chimiche.
Un esempio delle vaste dimensioni dei processi di trasporto è illustrato dall’immagine satellitare di una tempesta di sabbia dal Sahara (Figura 8), in cui i plume di sabbia verso l’Atlantico mostrano il trasporto a lungo raggio.
Figura 8 Tempesta di sabbia dal Sahara osservata il 25 giugno 20123
L’insieme di tutte le possibili alterazioni viene denominato ageing e può interessare, oltre che le singole particelle, l’intera massa d’aria di aerosol.
Le masse d’aria aged quando giungono nelle località remote, di solito hanno già perso gran parte del loro contenuto di aerosol.
Il trasporto dei costituenti atmosferici può avvenire attraverso i moti convettivi o avvettivi ed è fondamentale nel processo di alterazione dell’aerosol; i cambiamenti nella composizione chimica della massa d’aria, però, non sono sempre presenti. Durante il trasporto avvettivo, le particelle vengono eliminate mediante deposizione secca o umida. Questa diminuzione è proporzionale alla distanza percorsa e al tempo di trasporto, per cui le aree remote sono tipicamente siti con aria pulita.
Il moto verticale invece, gioca un ruolo importante per la chimica dell’aerosol, poiché, in seguito all’evaporazione delle goccioline all’interno delle nubi, possono emergere particelle che avevano reagito con altre specie all’interno della gocciolina stessa. Si ipotizza così che all’interno della nuvola vi sia una separazione tra specie di gas solubili e insolubili.
Un altro fattore che influenza il trasporto è la stratificazione termica dell’atmosfera, la quale può inibire o aumentare i moti convettivi.
Nel primo caso il mescolamento verticale è ridotto o assente, ma l’aerosol che si trova già negli strati più alti può essere trasportato orizzontalmente per lunghe distanze, anche a livello globale.
Nel secondo caso, l’aerosol e i suoi precursori possono essere trasportati negli strati più alti dell’atmosfera, dove il tempo di vita delle particelle è superiore [34].
L’Antartide
Grazie alla sua posizione isolata, l’Antartide (Figura 9) è un laboratorio naturale per studiare l’aerosol atmosferico [35].
L’aerosol aged arriva nella zona costiera attraverso la circolazione catabatica e i composti fenolici osservati sono presenti nel particolato fine (34 pg m-3).
Figura 9 Cartina geografica dell’Antartide4
L’Antartide, essendo circondata dall’oceano, ha scarse o assenti sorgenti di combustione di biomassa [35], infatti non sorprende che le concentrazioni di PM siano estremamente basse, spesso vicine al limite di rivelabilità degli strumenti [36]. In generale, le stazioni costiere mostrano concentrazioni più alte rispetto alle stazioni interne a causa dei meccanismi di trasporto [34].
Il PM che si trova in Antartide è dovuto esclusivamente al trasporto a lungo raggio o a sorgenti locali come la crosta terrestre, la superficie dei mari circostanti, i meteoriti e le eruzioni vulcaniche (Monte Erebus) (Figura 10) [36].
Figura 10 Monte Erebus5
Dato che non vi sono sorgenti locali sulla superficie di ghiaccio, l’aerosol è costituito da materiale particolato aged, inoltre predominano particelle con diametri di 0.01-1 µm, poiché quelle più grandi vengono eliminate o depositate prima di giungere all’interno del continente [34].
Campionamento
I filtri e i campioni di neve analizzati sono stati campionati durante la XXX spedizione in Antartide, campagna 2014-2015, nel sito di campionamento denominato campo Faraglione (Figura 11). Questo è situato presso la stazione scientifica italiana Mario Zucchelli, nella Baia di Terranova, Antartide meridionale (Figura 12). La posizione è stata scelta in seguito allo studio sui venti catabatici che caratterizzano l’area [sito internet: www.italiantartide.it/spedizioni/xxvi/].
Figura 11 Campo Faraglione
Figura 12 Ubicazione della stazione scientifica italiana Mario Zucchelli
I venti catabatici sono una caratteristica del continente antartico e la loro presenza dipende dal raffreddamento radiativo dei versanti ghiacciati [37].
Per il campionamento dell’aerosol sono stati utilizzati due strumenti: un impattore a cascata multistadio Andersen TE-6000 Series, Tisch Environmental Inc. (Figura 13) e un campionatore per aerosol ad alto volume TE-5000, Tisch Environmental Inc. (Figura 14).
L’impattore a cascata consente di selezionare l’aerosol, in base al diametro aerodinamico, in sei frazioni dimensionali.
Una pompa aspira l’aria verso l’interno dello strumento e ne mantiene costante il flusso.
La prima selezione dimensionale avviene alla testa del campionatore, in cui riescono ad entrare solo le particelle con diametro inferiore a 10 µm. Successivamente, le
Figura 13 Impattore a cascata multistadio Andersen (TE-6000 Series, Tisch Environmental Inc.)
particelle più fini riusciranno a passare i vari stadi impattori, poiché in grado di deviare il loro moto inerziale, invece le particelle più grandi saranno raccolte sul filtro posto sulla superficie di impatto.
Per ogni campionamento vengono utilizzati 5 filtri in fibra di quarzo con 10 scanalature (filtri scanalati) (Figura 15a) posti sulle piastre dell’impattore e un filtro in fibra di quarzo privo di scanalature, chiamato backup (Figura 15b), che raccoglie per filtrazione la frazione di particolato inferiore a 0.49 µm e che non è stata trattenuta negli stadi precedenti.
Figura 15 a) Filtro scanalato; b) Filtro backup
In Tabella 3 sono specificate le classi dimensionale per ogni stadio.
Tabella 3 Tipologia e caratteristiche dei filtri utilizzati per il campionamento
Tipo di supporto Stadio Classe dimensionale raccolta Scanalato 1 10.0 – 7.2 µm Scanalato 2 7.2 – 3.0 µm Scanalato 3 3.0 – 1.5 µm Scanalato 4 1.5 – 0.95 µm Scanalato 5 0.95 – 0.49 µm Backup 6 < 0.49 µm a b
Il campionatore ad alto volume, invece, consente il campionamento sia del particolato totale (TSP), sia dei composti organici in forma gassosa. Anche in questo caso la presenza di una pompa di aspirazione garantisce un flusso d’aria per permettere il campionamento.
Il contenitore per i campioni è costituito da due parti: una testa contenente un filtro tondo in fibra di quarzo per la raccolta del TSP (Figura 16a) ed un bicchiere di vetro sottostante in cui è alloggiato il PUF (polyurethane foam) per i composti gassosi (Figura 16b).
Figura 16 a) Filtro in fibra di quarzo per TSP; b) bicchiere di vetro con PUF
Nel presente lavoro di tesi sono stati presi in esame solo i filtri, quindi l’analisi è stata condotta sui composti che si trovano in fase particolata. I motivi di questa scelta sono descritti nel capitolo successivo. Il confronto delle concentrazioni di analiti sui filtri ottenuti dai due diversi campionatori è uno degli obiettivi di questo lavoro di tesi allo scopo di investigare quale sia il migliore sistema di campionamento nell’area remota antartica.
a
Nello stesso periodo di campionamento dell’aerosol sono stati prelevati anche i campioni di neve superficiale al fine di valutare i processi di scambio atmosfera-neve.
Figura 17 Raccolta dei campioni di neve nei pressi di Campo Faraglione
Messa a punto del metodo analitico
La prima parte del lavoro svolto nella presente tesi ha riguardato la ricerca di una metodologia analitica per la determinazione dei metossifenoli in fase gassosa su campioni di aerosol antartico.
La ricerca bibliografica ha evidenziato che i metossifenoli sono composti molto interessanti dal punto di vista ambientale, in quanto sono traccianti di combustione di biomassa [38]. Numerosi lavori sono stati condotti al fine di identificarli e determinarne la concentrazione nell’aerosol atmosferico.
Alcuni studi sono stati effettuati su campioni di aerosol provenienti da aree urbanizzate, per monitorare i fumi prodotti dalla combustione di biomassa e la conseguente emissione di inquinanti [39].
Ad esempio, R. Dhammapala et al. (2007) hanno determinato i metossifenoli tramite gascromatografia accoppiata a spettrometria di massa (GC-MS) per quantificarne i fattori di emissione (EFs), ovvero la quantità di inquinanti emessi per unità di biomassa secca combusta, necessari per creare modelli di dispersione dei fumi. Questi modelli sono utili nel valutare il contributo della combustione di biomassa in episodi di inquinamento atmosferico [15] [39].
Ward et al. (2006), invece, hanno esaminato la relazione tra i marker dei fumi e i PM2.5, in seguito agli incendi boschivi che hanno caratterizzato l’area occidentale del
Montana durante l’estate 2003. In questo caso l’analisi dei metossifenoli, effettuata sempre servendosi della GC-MS, ha fornito informazioni sul tipo di vegetazione bruciata (ad esempio, hardwood rispetto a softwood) [40].
Studi sui composti fenolici sono stati condotti anche in aree remote come l’Artide e l’Antartide, utilizzando come metodica la cromatografia liquida ad alta risoluzione con analizzatore a triplo quadrupolo (HPLC/(−)-ESI-MS/MS) [17] [35]. I livelli di metossifenoli ritrovati nelle differenti frazioni dimensionali del particolato riflettono il trasporto a lungo raggio legato alla combustione di biomassa [17], tuttavia la loro presenza non dipende unicamente da questo.
Come dimostrato da Zangrando et al. (2016) grazie al confronto con il levoglucosan, anche sorgenti locali, come quella marina, possono influenzare la concentrazione dei composti fenolici in Antartide [35]. Tuttavia, la maggior parte degli studi trovati in letteratura durante la ricerca per questo lavoro di tesi, utilizza dei metodi analitici per la determinazione dei metossifenoli in fase particolata, campionati su filtri in fibra di quarzo. Per questo motivo, nella presente tesi, ci si è posti come obiettivo la messa a punto di un metodo analitico per la determinazione dei metossifenoli in fase gassosa, campionati su PUF.
Per il metodo di analisi la scelta è ricaduta sulla GC-MS, poiché, sebbene esistano metodi già validati, per l’analisi dei metossifenoli in aree remote, che utilizzano l’HPLC/(−)-ESI-MS/MS [17] [35], questi richiedono che i campioni siano estratti in acqua.
L’estrazione degli analiti dal PUF necessita di volumi maggiori di solvente di estrazione, rispetto ai filtri in fibra di quarzo. Se si utilizzasse acqua, invece di solventi organici, non sarebbe possibile concentrare l’estratto e quindi si otterrebbero valori al di sotto del limite di rivelabilità, trattandosi di campioni cosiddetti “puliti”.
Fase critica, nell’ambito della messa a punto, è stata proprio l’estrazione, in quanto, nonostante le diverse prove effettuate, non è stata trovata la tecnica più idonea per evitare la perdita degli analiti.
Figura 18 Schema con le diverse fasi del lavoro di messa a punto del metodo analitico
• solvente utilizzato: diclorometano (DCM)
• concentrazione soluzioni singole: 10 ng µL-1
• concentrazione miscela standard: 1 ng µL-1 Preparazione delle soluzioni standard • 20 µL di miscela standard • 80 µL di piridina • 100 µL di BSTFA • 75 °C x 70 min Metodo di derivatizzazione • SIM • 100° C x 1 min
• 10 °C/min fino a 240 °C x 0 min • 5 °C/min fino a 290 °C x 10 min • Run time: 35 min
• Post run: 15 min Metodo e corsa
cromatografica
• concentrazione in Turbovap a 23°C • estrazione con PLE (Pressurized
liquid extraction): • DCM:ACE (1:1) • DCM:MeOH (9:1) • Etilacetato • Diclorometano • DCM:HEX (1:1) • DCM:MeOH (98:2) • estrazione in ultrasuoni: • Acetone 60 mL x 2h • DCM:MeOH (98:2) 110 mL x 1h + 50 mL x 1h Concentrazione e prove di estrazione
In Figura 18 sono schematizzati gli step che hanno caratterizzato il lavoro di messa a punto del metodo.
Come già accennato, la messa a punto del metodo analitico non è stata completata per via della procedura di estrazione.
Per le prove di estrazione sono stati aggiunti sui PUF spike di 100 µL della miscela standard 1 ng µL-1.
Durante le prove in PLE (Figura 19) sono stati utilizzati diversi solventi organici per l’estrazione, o miscele binarie di essi. La temperatura è stata abbassata da 100 °C a 70 °C, per ridurre la perdita degli analiti. Tuttavia non sono stati ottenuti risultati soddisfacenti.
Figura 19 Pressurized Liquid Extraction (PLE)
In letteratura viene suggerita anche l’estrazione dei metossifenoli dal PUF in ultrasuoni [41]. Nonostante pressione e temperatura, in questo caso, siano decisamente inferiori rispetto all’estrazione in PLE, quindi dovrebbe essere garantito
il recupero degli analiti semi-volatili, non si è ugualmente riusciti a estrarre i metossifenoli dal PUF in modo efficiente.
L’analisi strumentale degli estratti ottenuti è avvenuta sempre previa concentrazione in Turbovap tramite flusso di azoto a 23 °C, riduzione a secco e derivatizzazione. Lo strumento analitico utilizzato è un gascromatografo (Agilent Technologies 7890A GC System) con sorgente ad impatto elettronico (EI) accoppiato a un analizzatore di massa a singolo quadrupolo (Agilent Technologies 5975C inert MSD) utilizzato in modalità SIM (Single Ion Monitoring).
Prove di concentrazione sono state effettuate per confermare che la perdita degli analiti è dovuta unicamente alla fase di estrazione. 100 µL della miscela 1 ng µL-1 sono stati aggiunti a 100 mL di diclorometano, la soluzione ottenuta è stata concentrata in Turbovap a 23 °C fino a 500 µL, portata a secco e derivatizzata.
In Figura 20 sono messi a confronto i cromatogrammi di due prove di estrazione con quello della miscela standard derivatizzata tal quale.
Figura 20 a) cromatogramma della miscela standard derivatizzata tal quale; b) cromatogramma dell’estratto ottenuto tramite PLE con DCM:MeOH (98:2) a 70 °C; c) cromatogramma dell’estratto
ottenuto in ultrasuoni con DCM:MeOH (98:2).
b
Materiali e metodi
Lo strumento
HPLC – MS/MS
Le analisi dei campioni della XXX campagna antartica sono state condotte nella presente tesi utilizzando un cromatografo liquido ad alta prestazione (HPLC, high performance liquid chromatography) Agilent 1100 (Agilent, Waldbronn, Germania) accoppiato ad uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 4000 (Applied Biosystem/MDS SCIEX, Concord, Ontario, Canada) con sorgente ionizzante ESI (Electronspray Ionization) (Figura 21).
Figura 21 HPLC-MS/MS utilizzato nella presente tesi
L’utilizzo di questa tecnica non richiede pretrattamenti delle molecole polari, come la derivatizzazione, permettendo così un risparmio in termini di tempo. Inoltre, consente di ottenere selettività e sensibilità elevate.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
La cromatografia liquida (LC) è un metodo in grado di separare gli analiti per mezzo di una fase mobile liquida dove viene disciolto il campione, la quale viene fatta passare attraverso una fase stazionaria posta in una colonna. Le due fasi sono scelte al fine di ottenere una buona separazione cromatografica degli analiti oggetto di studio. Nell’HPLC il diametro interno della colonna e quello delle particelle della fase stazionaria sono molto inferiori rispetto alla cromatografia liquida classica, di conseguenza è necessario l’uso di pompe ad alta pressione per favorire il flusso della fase mobile. Questo si traduce in un miglioramento in termini di trasporto di massa della fase mobile, con conseguente aumento dell’efficienza e diminuzione dei tempi di separazione.
Spettrometria di massa a triplo quadrupolo (MS-MS)
La spettrometria di massa è una tecnica analitica utilizzata sia per la determinazione qualitativa che quantitativa. Lo spettrometro di massa converte le molecole di un campione in ioni gassosi per poi separarli in base al loro rapporto massa carica. Lo strumento è composto da tre componenti (Figura 22):
• la sorgente produce i frammenti della molecola e li ionizza, produce il segnale; • l’analizzatore rileva il rapporto m/z degli ioni prodotti;
• il detector rivela gli ioni che arrivano all’analizzatore, misura il segnale.
Figura 22 Componenti di uno spettrometro di massa
Per i campioni analizzati in questa tesi è stata utilizzata una sorgente di tipo
electrospray ionization (ESI) che produce la ionizzazione del campione a pressione
atmosferica. In questo modo si mette in collegamento il cromatografo con lo spettrometro di massa, che lavora in alto vuoto.
Il campione viene iniettato, in soluzione col solvente, nella sorgente per mezzo di un ago capillare metallico. La tensione applicata all’ago genera la nebulizzazione, con la formazione di goccioline di solvente cariche nelle quali è contenuto l’analita. Un gas ausiliario fa evaporare il solvente, ottenendo gocce sempre più piccole, fino alla cosiddetta “esplosione coulombiana”. Gli ioni prodotti vengono così catturati per mezzo di lenti focalizzatrici e inviati all’analizzatore di massa (Figura 23).
Figura 23 Processo di desolvatazione ed “esplosione coulombiana”
In questo lavoro di tesi l’analizzatore utilizzato è un triplo quadrupolo, costituito da tre quadrupoli allineati (Figura 24).
Figura 24 I tre quadrupoli in sequenza
Il primo quadrupolo (Q1) seleziona e fa la scansione degli ioni che andranno al secondo quadrupolo. Questo funge da cella di collisione, frammenta gli ioni che arrivano da Q1 grazie all’interazione con un gas (CAD: Collisionally Activated
Dissociation gas).
Gli ioni frammentati giungono al terzo quadrupolo (Q3) che, come il primo, opera da selezionatore di massa. In questo modo è possibile monitorare e misurare solo gli ioni di interesse e i loro frammenti, selezionati da Q1 e Q3.
La modalità di lavoro del triplo quadrupolo appena descritta è denominata MRM (Multiple Reaction Monitoring) e viene utilizzata per analisi quantitative sensibili e specifiche.
Ai fini della quantificazione, di ogni analita è stata misurata la transizione più intensa. L’altra serve per confermare che si tratta proprio dell’analita di interesse, grazie al confronto dei tempi di ritenzione e del rapporto delle intensità di entrambe le transizioni.
Metodologie analitiche
Per l’analisi dei metossifenoli e degli L- e D- amminoacidi presenti nella frazione particolata dell’aerosol atmosferico e nei campioni di neve, sono stati utilizzati metodi analitici messi a punto e validati da altri ricercatori.
Filtri per l’aerosol
La procedura pre-analitica è comune alle due classi di composti e si è svolta sotto una cappa a flusso laminare, per garantire una protezione da eventuale contaminazione dei campioni.
Di ogni filtro ne è stata utilizzata solo metà, la quale è stata spezzettata in beute da 50 mL precedentemente decontaminate in bagno ultrasuoni con acqua ultrapura.
Sui filtri scanalati e quelli per il TSP sono stati aggiunti 100 µL di una soluzione acquosa standard di metossifenoli e amminoacidi marcati, alla concentrazione media di circa 5 µg mL-1, invece sui filtri backup sono stati aggiunti 300 µL della medesima soluzione. Come solvente di estrazione è stata utilizzata acqua ultrapura nei seguenti volumi:
• 1a estrazione à 9 mL filtri scanalati e TSP 25 mL filtri backup
• 2a estrazione à 1 mL filtri scanalati e TSP 5 mL filtri backup.
Le beute sono state quindi poste in un bagno a ultrasuoni, dove sono avvenuti i due cicli di estrazione da 15 minuti l’uno. I due estratti unificati sono stati raccolti e
filtrati con filtro a siringa PTFE (Ø 25 mm, 0,45 µm) al fine di eliminare eventuale particellato e mandati all’analisi strumentale.
Neve
Anche per i campioni di neve la procedura pre-analitica è stata comune ai metossifenoli e agli amminoacidi.
Poiché la neve è considerata una matrice particolarmente pulita, questa fase del lavoro è stata svolta in una clean room. Si tratta di uno spazio delimitato, a contaminazione controllata, nel quale le condizioni ambientali sono costanti e i livelli di microbi e di particelle presenti sono mantenuti entro un certo limite. Anche il personale deve rispettare dei protocolli al fine di minimizzare la contaminazione. Sono stati prelevati 990 µL di neve disciolta da ogni campione, ai quali sono stati aggiunti spike di 10 µL della miscela standard contenente metossifenoli e amminoacidi marcati a una concentrazione media di 5 µg mL-1.
Metossifenoli
L’analisi dei metossifenoli è stata condotta utilizzando la metodica messa a punto da Zangrando et al. [17]. Per l’analisi cromatografica sono stati iniettati 100 µL di campione in una colonna Zorbax Extend C18 (150 mm × 4.6 mm, 3.5 µm, Agilent),
che consiste in un supporto di silice neutra alla quale sono legati gruppi C18. La fase
mobile è costituita da:
• solvente A à soluzione acquosa di acido formico 0.01%; • solvente B à soluzione di metanolo 80% - acetonitrile 20%.
La presenza di acido formico consente di ottenere la separazione dei picchi (Figura 25), in particolare per le due specie isobare, acido vanillico e isovanillico.
Il flusso utilizzato nell’analisi è stato 500 µL min−1.
In Tabella 4 è mostrato il programma di eluizione a gradiente.
Tabella 4 Programma di eluizione a gradiente e durata della corsa cromatografica
t (min) % Ac. Formico 0.01% in H
2O % MeOH/ACN 80/20 0 85 15 2 85 15 3 70 30 8 70 30 16 30 70 17 0 100 27 0 100 29 85 15 34 85 15
Al fine di aumentare risoluzione e sensibilità, la corsa cromatografica è divisa in tre finestre temporali, in modo tale che in ognuna di esse siano analizzati solo alcuni analiti, aumentando così i punti di acquisizione per ciascun cromatogramma (Figura 26). Le condizione strumentali dello spettrometro di massa sono descritte in Tabella 5.
Figura 25 Picchi dei metossifenoli ottenuti dalla separazione cromatografica [17]
Tabella 5 Parametri strumentali dello spettrometro di massa
Scan Type MRM
Polarity Negativa Ion Source Turbo Spray
T (°C) 650 GSI1 (psi) 45 GSI2 (psi) 60 CUR (psi) 25 CAD (psi) 6 IS (V) -4450 L- e D- amminoacidi
La determinazione degli enantiomeri è stata condotta mediante il metodo strumentale utilizzato già da Barbaro et al. [5].
La separazione cromatografica è stata ottenuta grazie a una colonna CHIROBIOTIC TAG (2.1×250 mm, Advanced Separation Technologies Inc, USA).
La fase stazionaria di questa colonna cromatografica è costituita da teicoplanina aglicone, un glicopeptide macrociclico legato covalentemente ad un supporto di silice (Figura 27).
La presenza di siti di legame chirali all’interno della colonna consente la formazione temporanea di diastereoisomeri con i due enantiomeri degli analiti, ottenendo in questo modo la loro separazione cromatografica (Figura 28) grazie ai tempi di eluizione differenti.
È stato osservato che vi è un’affinità superiore tra la fase stazionaria e gli enantiomeri D, i quali, di conseguenza, hanno tempi di ritenzione maggiori rispetto agli enantiomeri L.
La fase mobile prevede:
• solvente A à soluzione acquosa di Acido Formico 0.1%; • solvente B à soluzione di Metanolo con Acido Formico 0.1%
L’acido formico è un additivo chimico fondamentale per migliorare la cromatografia e per aumentare la ionizzazione positiva nello spettrometro di massa.
In Tabella 6 è riportato il programma di eluizione a gradiente, eseguito con un flusso di 0.2 mL min−1. Il volume di iniezione è di 100 µL.
Tabella 6 Programma di eluizione a gradiente e durata della corsa cromatografica
t (min) % Ac. Formico 0.01% in H
2O % MeOH/Ac. Formico 0.01% 0 70 30 15 70 30 20 0 100 25 0 100 27 0 100 30 70 30
I dati sono stati ottenuti in modalità multiple reaction monitoring (MRM). I parametri dello spettrometro di massa sono descritti in Tabella 7.
Tabella 7 Parametri strumentali dello spettrometro di massa
Scan Type MRM
Polarity Positiva Ion Source TurboV electrospray
T (°C) 500 GSI1 (psi) 22 GSI2 (psi) 70 CUR (psi) 30 CAD (psi) 4 IS (V) 5450 Figura 28 Picchi dei D- e L- amminoacidi ottenuti dalla separazione cromatografica [42]
Quantificazione
In questo lavoro di tesi la quantificazione è stata effettuata con il metodo dello standard interno, al fine di compensare errori ed imprecisioni che possono verificarsi
durante le fasi di trattamento del campione e di analisi.
Questo metodo consiste nell’aggiunta di una quantità nota e costante di una molecola marcata con un isotopo stabile poco diffuso in natura, 13C, che abbia una risposta simile a quella dell’analita, a concentrazione incognita, da analizzare.
Dunque, il segnale restituito dall’analita viene riferito a quello del marcato: in questo modo le quantità misurate vengono corrette tenendo conto del rapporto tra le loro risposte strumentali. La seguente formula consente la quantificazione sfruttando la relazione tra i segnali strumentali di nativo e marcato e le loro concentrazioni.
Ai : Ci = Am : Cm
Equazione 1
In cui: Ai: area del picco cromatografico dell’analita
Ci: concentrazione dell’analita
Am: area del picco cromatografico dello standard interno
Cm: concentrazione dello standard interno.
Quindi, per quantificare la concentrazione di analita nel campione (Equazione 3) si utilizza il fattore di risposta (FR) (Equazione 2), ottenuto analizzando una soluzione standard a concentrazione nota, contenente gli analiti e gli standard marcati.
𝐹𝑅 = 𝐴! 𝐴!
𝐶!
𝐶! Equazione 2
𝐶! = 𝐴! 𝐴! 𝐶! 𝐹𝑅 Equazione 3
Soluzioni standard per le analisi
Tutte le soluzione standard utilizzate sono state ottenute partendo da uno standard solido.
Gli standard dei metossifenoli sono stati disciolti in metanolo, invece quelli degli amminoacidi in una soluzione di acqua ultrapura e acido cloridrico (HCl 0.1 M) al fine di aumentare la stabilità degli analiti (ad eccezione di glutammina e asparagina che sono stati disciolti in acqua ultrapura).
La soluzione standard contenente gli standard marcati, utilizzata poi nelle aggiunte ai campioni, è stata preparata in acqua ultrapura.
Nelle Tabelle 8 e 9 sono riportate le concentrazioni nelle soluzioni standard, rispettivamente di metossifenoli e amminoacidi, utilizzate per le analisi e le loro concentrazioni nei fattori di risposta (FR).
Tabella 8 Concentrazione dei metossifenoli nella soluzione standard e nel FR
Composto Soluzione standard
(µg mL-1) FR (ppb) Acido Omovanillico 6 63 Acido Vanillico 4 43 Acido Isovanillico 6 56 Coniferaldeide 6 60 Acetosiringone 5 45 Acetovanillone 7 65 Acido P-Cumarico 6 55
Siringaldeide 7 73 Vanillina 6 60 Acido Siringico 7 73 Acido Ferulico 7 73 Vanillina 13C 5 48 Acido Vanillico 13C 7 70
Tabella 9 Concentrazione degli amminoacidi nella soluzione standard e nel FR
Composto standard (µg mLSoluzione -1) FR (ppb)
Glicina 5 50 L-Valina 6 55 L-Tirosina 6 60 L-Triptofano 6 58 L-Istidina 5 53 L-Treonina 8 83 L-Idrossiprolina 15 150 L-Acido Glutammico 5 45 L-Glutammina 5 48 L-Fenilalanina 4 40 L-Serina 4 43 L-Asparagina 5 50 L-Ornitina 5 53 L-Metionina 5 50 L-Acido Aspartico 6 63 L-Arginina 6 63 L-Alanina 5 50 L-Leucina 4 43 L-Prolina 7 73
D-Valina 7 73 D-Tirosina 4 40 D-Triptofano 5 50 D-Istidina 5 50 D-Treonina 5 45 D-Idrossiprolina 6 58 D-Acido Glutammico 5 50 D-Glutammina 6 55 D-Fenilalanina 9 88 D-Serina 10 98 D-Asparagina 5 50 D-Ornitina 6 60 D-Metionina 6 55 D-Acido Aspartico 6 55 D-Arginina 4 40 D-Alanina 6 58 D-Leucina 6 63 D-Prolina 5 53 Leucina 13C 6 60 Valina 13C 6 63 Acido Aspartico 13C 6 58 Prolina 13C 8 80 Acido Glutammico 13C 5 48 Fenilalanina 13C 8 78 Alanina 13C 8 80 Arginina 13C 5 50
Risultati e discussione
Applicazione a campioni antartici
Le metodologie analitiche descritte nel capitolo precedente sono state utilizzate per l’analisi di aerosol e neve antartici campionati presso il sito Campo Faraglione, in prossimità della Stazione Mario Zucchelli durante la XXX spedizione italiana (estate australe 2014-2015).
Sono stati analizzati 9 campioni di neve superficiale raccolti (condizioni meteorologiche permettendo) prima e dopo il periodo di campionamento dell’aerosol atmosferico. Al fine di calcolare i limiti di rivelabilità e quantificazione procedurali sono stati considerati 3 “bianchi di campo”, ottenuti prelevando l’acqua ultrapura della stazione antartica e un bianco tal quale (TQ), ottenuto considerando un materiale di campionamento che ha subito tutte le fasi di preparazione e di trasporto in Antartide ma tornato in Italia vuoto e quindi riempito con acqua ultrapura.
Nella tabella 10 vengono riportate le date di campionamento della neve superficiale. I campioni di aerosol analizzati, invece, sono 14, per un totale di:
• 35 filtri scanalati; • 7 filtri backup; • 7 filtri TSP.
Nella tabella 11 sono riportate le date di campionamento dei campioni di aerosol atmosferico.
Tabella 10 Campioni di neve e bianchi di campo
Campione Data di campionamento
Bianco 1 6 Nov 2014 Bianco 2 7 Dic 2014 Bianco 3 13 Gen 2015 Bianco TQ 14 Gen 2015 C 1 6 Nov 2014 C 2 17 Nov 2014 C 3 27 Nov 2014 C 4 7 Dic 2014 C 5 27 Dic 2014 C 6 10 Gen 2015 C 7 12 Gen 2015 C 8 13 Gen 2015
Tabella 11 Campioni di aerosol e bianchi di campo ottenuti con l’impattore a cascata e con il campionatore TSP.
Campione PM10 Campione TSP campionamentoPeriodo di
Bianco 1 Bianco 1 27 Nov 2014
Bianco 2 Bianco 2 17 Dic 2014
Bianco 3 Bianco 3 5 Gen 2015
Bianco 4 Bianco 4 13 Gen 2015
C 1 C 1 6-17 Nov 2014 C 2 C 2 17-27 Nov 2014 C 3 C 3 27 Nov - 7 Dic 2014 C 4 C 4 7-17 Dic 2014 C 5 C 5 17-27 Dic 2014 C 6 C 6 27 Dic 14 - 5 Gen 2015 C 7 C 7 5-13 Gen 2015
È stata effettuata anche l’analisi di 4 “bianchi di campo” e un “bianco procedurale” per ogni tipologia di filtro. I bianchi di campo sono filtri portati sul luogo del campionamento (decontaminati precedentemente), posizionati all’interno del campionatore spento, prelevati e conservati in fogli di alluminio, come i campioni reali.
Utilizzando i bianchi di campo si è calcolato il method detection limit (MDL) e il
method quantification limit (MQL), cioè la minore concentrazione che può essere
rispettivamente rivelata e quantificata per ciascun analita, con il 99% di probabilità che la concentrazione dell’analita sia diversa da zero. L’MDL è stato calcolato come 3 volte la deviazione standard del bianco di campo mentre l’MQL come 10 volte. I valori delle concentrazioni di analita ritrovati nei campioni sono stati corretti sottraendo le medie dei rispettivi bianchi.
Nelle Tabelle 12 e 13 sono riportati, rispettivamente per i metossifenoli e gli amminoacidi analizzati nella presente tesi, i valori di media dei bianchi, MDL e MQL per filtri TSP, scanalati e backup e per i campioni di neve. Per i filtri i valori sono espressi come pg m-3 considerando il volume medio di campionamento, per i campioni di neve i valori sono in ng g-1, al fine di confrontarli con i risultati ottenuti nei vari campioni.
Tabella 12 Valori dei bianchi, di MDL e MQL dei metossifenoli per i campioni di aerosol e neve
Filtri TSP Filtri scanalati Filtri backup Neve
Media dei bianchi MDL pg m-3 pg mMQL -3 Media dei bianchi MDL pg m-3 pg mMQL -3 Media dei bianchi MDL pg m-3 pg mMQL -3 Media dei bianchi MDL ng g-1 ng gMQL -1 VA 4.88 0.14 0.48 6.68 0.08 0.28 19.58 0.08 0.27 0.18 0.06 0.2 HA 0.75 0.07 0.24 0.7 0.03 0.09 1.97 0.04 0.13 0.09 0.31 1.02 CAH 0.92 0.15 0.5 1 0.07 0.22 2.18 0.1 0.34 0.02 0.03 0.1 IVA 0.95 0.05 0.18 0.73 0.06 0.21 1.88 0.19 0.63 0.2 0.16 0.53 VAH 6.3 0.6 2.1 11.2 0.4 1.2 37.1 0.6 2.1 0.01 0.02 0.05 SyA 0.32 0.09 0.31 0.49 0.03 0.11 2.03 0.06 0.2 0.01 0.01 0.03 P-CA 0.25 0.02 0.07 0.44 0.03 0.09 0.61 0.05 0.15 0.04 0.05 0.18 VAC 0.85 0.05 0.17 1.15 0.07 0.24 4.28 0.05 0.17 0.01 0.03 0.09 SyAH 0.81 0.13 0.45 1.37 0.1 0.32 3.46 0.13 0.44 0.004 0.01 0.03 FA 0.21 0.02 0.08 0.1 0.01 0.03 0.17 0.01 0.03 0.01 0.01 0.03 SyAC 0.44 0.1 0.32 0.76 0.05 0.15 1.47 0.1 0.33 0.18 0.06 0.2
Tabella 13 Valori dei bianchi, di MDL e MQL degli amminoacidi per i campioni di aerosol e neve
Filtri TSP Filtri scanalati Filtri backup Neve
Media dei bianchi MDL pg m-3 MQL pg m-3 Media dei bianchi MDL pg m-3 MQL pg m-3 Media dei bianchi MDL pg m-3 MQL pg m-3 Media dei bianchi MDL ng g-1 MQL ng g-1 L-Ala 15 0.5 2 43 0.3 1 42 0.2 1 3 0.3 1 D-Ala 0.3 0.2 1 2 0.4 1 0.2 0.04 0.1 Gly 26 0.6 2 83 2 5 66 1 4 158 87 289 L-Leu 7 0.5 2 21 0.5 2 29 0.1 0.4 7 10 34 D-Leu 31 4 18 31 2 5 37 2 6 0.2 0.2 1 L-4 Hyp 17 1 3 57 1 4 55 1 2 0.3 0.2 1 D-4 Hyp 0.3 0.03 0.2 0.2 0.03 0.1 1 0.1 0.4 1 0.4 1 L-Met 0.3 0.1 1 0.4 0.05 0.2 1 0.1 0.3 1 0.5 2 D-Met 0.3 0.002 0.01 0.3 0.04 0.1 1 0.05 0.2 1 0.3 1 L-Arg 4 0.2 1 7 1 2 8 0.3 1 0.1 0.1 0.3 D-Arg 0.1 0.04 0.1 0.04 0.01 0.02 0.1 0.04 0.1 0.02 0.04 0.1 L-Thr 10 0.1 0.3 23 0.3 1 22 0.2 1 2 2 8 D-Thr 0.2 0.1 0.4 0.2 0.04 0.1 0.4 0.1 0.2 0.02 0.01 0.02 L- Orn 46 12 39 149 2 6 60 3 11 2 1 3 L-Pro 6 1 2 15 0.3 1 25 0.3 1 1 3 8 L-Glu 8 2 7 16 1 2 35 1 2 0.2 0.03 0.1 D-Glu 0.05 0.02 0.1 0.1 0.002 0.01 0.2 0.1 0.2 0.1 0.2 1 L-Asp 7 0.3 1 14 0.5 2 21 1 2 3 2 7 D-Asp 0.2 0.1 0.4 0.2 0.03 0.1 1 0.1 0.3 1 0.3 1 L-Phe 3 1 2 7 0.4 1 13 0.4 1 0.4 0.04 0.1 D-Phe 0.03 0.02 0.1 0.1 0.01 0.05 0.1 0.01 0.04 0.05 0.04 0.1 L-Ser 46 20 67 133 17 56 114 18 58 7 11 37 L-Trp 5 1 2 7 1 3 0.02 0.01 0.04 L-Tyr 1 2 6 8 1 4 6 1 5 2 0.4 1 L-Val 14 1 3 31 1 2 43 1 2 9 1 4 D-Val 0.03 0.01 0.02 0.1 0.1 0.2 0.1 0.04 0.1 0.2 0.5 2 L-Asn 3 2 7 13 1 5 14 3 10 5 1 2 D-Asn 0.4 0.2 1 0.4 0.1 0.2 1 0.2 1 2 3 11
Risultati
Metossifenoli
In tabella 14 sono riportate le concentrazioni totali dei metossifenoli nel PM10
ottenute sommando la concentrazione di ogni specie fenolica e di ogni singolo stadio per ogni campione. La concentrazione media di metossifenoli nel PM10 campionato
dal 6 novembre 2014 al 13 gennaio 2015 è 32 pg m-3. I dati sono in accordo con le
concentrazioni dei composti fenolici determinate a Campo Faraglione nell’estate australe 2010-2011, nei quali la concentrazione media era di 34 pg m−3 [35].
Tabella 14 Concentrazione atmosferica dei metossifenoli nei campioni di PM10
Campioni Metossifenoli (pg m-3) 6-17 Nov 2014 9 17-27 Nov 2014 33 27 Nov - 7 Dic 2014 16 7-17 Dic 2014 44 17-27 Dic 2014 35 27 Dic 14 - 5 Gen 2015 47 5-13 Gen 2015 33
In figura 29 si riporta l’andamento temporale della concentrazione dei singoli metossifenoli nel PM10, dato dalla somma di tutti gli stadi relativi alle sei classi
dimensionali delle particelle (10-7.2 µm, 7.2-3 µm, 3-1.5 µm, 1.5-0.95 µm, 0.95-0.49 µm, <0.49 µm).
Figura 29 Concentrazione atmosferica dei metossifenoli nei campioni di PM10
Il composto fenolico più abbondante nel PM10 è la vanillina (89%), seguita da
acetovanillone (6%), acido vanillico (3%) acido omovanillico (1%) e acido siringico (1%).
La Figura 30 riporta, invece, un confronto tra l’andamento temporale e la distribuzione dimensionale di ogni singolo composto fenolico e l’andamento temporale dei singoli analiti nei campioni prelevati dal TSP, i quali rappresentano la concentrazione nell’aerosol con diametro superiore a 0.1 µm.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
6-17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7
Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dic - 5 Jan 5-13 Jan
pg m
-3
Distribuzione dei metossifenoli nei campioni
di PM
10 SyAH VAC SyA VAN HA VA0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP 6 - 17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3
VAH
10-7.2 um 7.2-3 um 3-1.5 um 1.5-0.95 um 0.95-0.49 um <0.49 um >0.1 um MQL (pg/m3) 0 1 2 3 4 5 6 PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP 6 - 17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3VAC
>0.1 um <0.49 um 0.95-0.49 um 1.5-0.95 um 3-1.5 um 7.2-3 um 10-7.2 um MQL (pg/m3) 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP 6 - 17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3VA
10-7.2 um 7.2-3 um 3-1.5 um 1.5-0.95 um 0.95-0.49 um <0.49 um >0.1 um MQL PM10 MQL TSP (pg/ m3)Figura 30 Distribuzione dimensionale dei metossifenoli nel particolato atmosferico
Dai dati si evince che la maggior parte degli analiti è presente nella frazione ultrafine (<0.49 µm), ovvero in quella raccolta nei filtri backup. Questi risultati concordano
con quanto riportato da studi precendenti [17].
Gli analiti sono quasi del tutto assenti nel TSP (>0.1 µm). Ciò può essere legato al
fatto che il volume di campionamento medio (4458 m3) è inferiore rispetto a quello
dell’impattore multistadio (15480 m3), rendendolo, così, meno efficiente per il campionamento di analiti con concentrazioni prossime al limite di quantificazione.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP 6 - 17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3
SyA
>0.1 um <0.49 um 0.95-0.49 um 1.5-0.95 um 3-1.5 um 7.2-3 um 10-7.2 um MQL PM10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP PM1 0 T SP 6 - 17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3SyAH
7.2-3 um 10-7.2 um 3-1.5 um 1.5-0.95 um 0.95-0.49 um <0.49 um >0.1 um MQLLe concentrazioni dei singoli composti fenolici presenti nella frazione ultrafine sono mostrate in Tabella 15.
Tabella 15 Concentrazioni dei metossifenoli (pg m-3) raccolti sui filtri backup
pg m-3 VA HA VAH SyA VAC SyAH
6-17 Nov <MQL 0.4 8 <MQL < MQL <MQL 17-27 Nov <MQL <MQL 32 <MQL 0.4 <MQL 27 Nov - 7 Dic <MQL <MQL 16 <MQL 0.2 <MQL 7-17 Dic 0.5 <MQL 38 <MQL 2 <MQL 17-27 Dic 2 <MQL 23 0.2 3 <MQL 27 Dic 14 - 5 Gen 1 1 27 <MQL 4 0.6 5-13 Gen 2 1 22 <MQL 3 <MQL
L’abbondanza relativa dei composti fenolici nella frazione <0.49 µm è paragonabile a
quella dei PM10: vanillina (89%), acetovanillone (7%), acido vanillico (3%) e acido
omovanillico (1%).
In figura 31 è riportato il trend temporale dei due composti fenolici più abbondanti considerando le frazioni dimensionali coarse (>1 µm), fine (<1 µm) e TSP.
Nel campione del 27 Dec - 5 Jan si osserva un aumento delle particelle coarse per entrambi gli analiti. Tuttavia questo non può essere associato alla crescita igroscopica delle particelle, poiché è l’unico periodo di campionamento, tra quelli considerati nel presente studio, in cui la temperatura media è sopra lo zero [43].
Figura 31 Trend temporale delle frazioni dimensionali per i metossifenoli più abbondanti
Una causa potrebbe essere attribuita a contaminazione proveniente dalla base russa Vostok, come visibile dalle retrotraiettorie (Figura 32) nei periodi 17-27 Dec e 27
Dec - 5 Jan, in cui si nota come le traiettorie delle masse d’aria lambivano l’area della
stazione scientifica, fenomeno che invece sembrava non verificarsi durante le altre date di campionamento (Figura 32).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 6-17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3
VAH
Coarse Fine TSP 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 6-17 Nov 17-27 Nov 27 Nov - 7 Dec 7-17 Dec 17-27 Dec 27 Dec - 5 Jan 5-13 Jan pg m -3VAC
Coarse FineFigura 32 Back-trajectories dei venti antartici per i periodi di campionamento considerati in questa tesi
6-17 Nov 17-27 Nov
27 Nov-7 Dic 7-17 Dic
17-27 Dic 27 Dic-5 Gen
