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UNIVERSITÀ DI PISA
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Magistrale in Farmacia
Traslocatore Proteico (TSPO,18 kDa): Implicazioni
fisiologiche e patologiche nella Neurodegenerazione e nella
Neuroinfiammazione.
Candidata Relatore
Sig.ra Eva Benvenuti Prof.ssa Barbara Costa
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Indice
1. Traslocatore proteico TSPO (18) kDa
1.1 Struttura molecolare TSPO 3
1.2 Distribuzione tissutale e Localizzazione subcellulare di TSPO 5
1.3 Funzione Steroidogenica del TSPO 7
2. Ligandi TSPO 2.1 Ligandi endogeni 16
2.2 Ligandi di origine sintetica 16
2.3 Ligandi di origine naturale 26
3.Stimolazione farmacologica dell’attività steroidogenica di TSPO 27
4.Implicazioni fisiologiche e patologiche del TSPO nel SNC 39
4.1 Ligandi al TSPO: attività farmacologiche nella neuro infiammazione 41
4.2 Ligandi al TSPO: attività farmacologiche nella malattia di 46
Alzheimer e Sclerosi Multipla 4.3 Ligandi al TSPO: attività farmacologiche nella 52
riparazione/rigenerazione neuronale Trials clinici 61
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1. Traslocatore proteico TSPO 18 kDa
Il traslocatore proteico (TSPO) è una proteina della membrana mitocondriale esterna di 18 kDa, scoperta nel 1977 da Braestrup e Squires come sito di legame alternativo della benzodiazepina Diazepam. Per la prima volta è stato trovato a livello periferico nel rene di topo e grazie a questa caratteristica è stato chiamato “recettore benzodiazepinico periferico” (PBR) per distinguerlo dal recettore benzodiazepinico centrale (CBR) esclusivamente espresso nel sistema nervoso centrale (SNC). Le scoperte successive delle sue funzioni, che lo vedono coinvolto in traslocazioni all’interno del mitocondrio, hanno portato a cambiarne il nome nel 2006 in traslocatore proteico (TSPO, 18 kDa). (Papadopoulos et al. 06)
1.1 Struttura molecolare TSPO
Il gene di TSPO (Gene ID:706; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) è localizzato nel cromosoma 22q13.31 nel genoma umano in singola copia (Chang et al., 1992) e mostra
le caratteristiche tipiche dei geni “housekeeping”, suggerendone una funzione cellulare di base essenziale (Batarseh et al. 2010). Il confronto delle sequenze
nucleotidiche del gene TSPO di varie specie ha mostrato che è altamente conservato dagli archea ai metazoi (Yeliseev, Kaplan 1995). Nell’uomo TSPO è una
proteina di 18 kDa altamente idrofobica, ricca in triptofano costituita da 169 amminoacidi. La struttura secondaria è organizzata in 5 domini transmembrana, ognuno dei quali composto da 21 amminoacidi disposti ad α-elica, collegati fra loro da loop idrofilici. Sono inoltre presenti due catene terminali di cui l’estremità carbossil-terminale è situata nel citoplasma e quella ammino-terminale è rivolta verso l’interno del mitocondrio. (Murail et al. 2008) (Figura 1)
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La regione carbossil-terminale del TSPO presenta un coinvolgimento nel trasporto del colesterolo, evidenziando una sequenza amminoacidica consenso di riconoscimento del colesterolo (CRAC). La struttura terziaria, di per sé instabile, diventa fortemente stabile in risposta a traslocazione del colesterolo. A livello subcellulare, TSPO è presente sulla membrana esterna dei mitocondri in siti di contatto tra la membrana interna ed esterna, siti noti anche come pori della transizione della permeabilità mitocondriale (MPTP) dove interagisce con altre proteine, compreso il canale (32kDa) anionico voltaggio-dipendente (VDAC) e il trasportatore adenina nucleotide (ANT) (30kDa). VDAC è un canale anionico selettivo voltaggio-dipendente che si comporta come un poro generale di diffusione di piccole molecole idrofile, si trova all'interfaccia tra interno ed esterno delle membrane mitocondriali facilita lo scambio di ioni e molecole tra mitocondri e citosol ed è regolato da interazioni con altre proteine come TSPO e con ANT sulla membrana interna. ( McEnery et al.1992) ( Figura 2)
Figura 1: Struttura del TSPO. Sequenza amminoacidica completa. I loop citosolici 1 e 2 sono responsabili del legame a piccoli ligandi. La regione C-terminale lega il colesterolo. (Immagine adattata da Korkhov et al., 2010).
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Figura 2: Struttura del TSPO. (A) Visione tridimensionale della struttura secondaria.(B) Visione tridimensionale dei siti di legame per colesterolo (CRAC situato sul'estremità C-terminale e primi ligandi classici introdotti). (C ) Visione dall'alto. (Immagine adattata da Selvaraj et al., 2015).
1.2 Distribuzione tissutale e Localizzazione subcellulare di TSPO
Nonostante, a livello subcellulare TSPO si trovi principalmente nei mitocondri in concentrazioni minori è stato trovato anche in altri compartimenti: a livello nucleare, sulla membrana plasmatica e su membrane di altri organelli. (Garnier et
al.1993) La distribuzione di TSPO nei mitocondri e i numerosi dati derivanti da circa
quaranta anni di ricerca suggeriscono un suo ruolo nella regolazione delle funzioni mitocondriali, con particolare riferimento alla biosintesi degli steroidi/neurosteroidi. In linea con questa sua funzione, TSPO è stato trovato espresso ad alti livelli nei tessuti steroidogenici periferici come le gonadi, le ghiandole surrenali e nel SNC, come le cellule gliali. Alti livelli di TSPO sono stati trovati anche nei tessuti non steroidogenici quali il rene e il cuore. Minori suoi livelli sono stati trovati in tutti i tessuti dell’organismo incluse le cellule del sangue: nei leucociti, in particolare nei monociti, nelle cellule polimorfonucleate, nei linfociti e anche in piccole quantità nelle cellule microgliali, che sono le
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cellule immunitarie residenti del SNC. La sua localizzazione ubiquitaria insieme alla sua conservazione aminoacidica attraverso l’evoluzione ne suggeriscono un ruolo essenziale nei processi cellulari. Oltre al suo coinvolgimento nella biosintesi degli steroidi, TSPO è stato implicato in numerosi meccanismi fra cui, la modulazione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti, la crescita e la differenziazione cellulare, l’apoptosi, l’immunomodulazione, la biosintesi dell’eme, la respirazione mitocondriale e la risposta allo stress ossidativo
(Papadopoulos et al.1992). Nonostante, ad oggi i meccanismi molecolari alla base delle
funzioni attribuitegli non sono stati ancora del tutto chiariti, il suo largo coinvolgimento nelle funzioni della cellula ha spinto la comunità scientifica ad indirizzare particolare attenzione a questa proteina come potenziale target nel trattamento di numerose patologie, includenti malattie neurodegnerative e disturbi psichiatrici.
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1.3 Funzione steroidogenica del TSPO
TSPO riveste un ruolo importante nel processo steroidogenico: lega il colesterolo e ne regola il suo trasporto dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna, tappa considerata limitante dell’intero processo biosintetico. Il TSPO accoglierebbe nelle sue 5 eliche la molecola di colesterolo formando un canale tramite il quale il colesterolo verrebbe trasportato attraverso la membrana. Il principale modulatore per il riconoscimento e la veicolazione del colesterolo nel mitocondrio è la proteina STAR (Proteina di regolazione acuta steroidogenica). Tuttavia risulta fondamentale la formazione di un complesso multimolecolare, che vede l’interazione della proteina STAR con il TSPO, la proteina citosolica PAP7, la proteina VDAC e la subunità regolatoria RIα della proteinchinasi A (Miller et al.
2013). Le modalità attraverso cui queste proteine interagiscono e veicolano il
colesterolo attraverso le membrane mitocondriali sono attualmente oggetto di studio. Nella membrana mitocondriale interna è presente l’enzima citocromo P450 (CYP11A1) che converte il colesterolo in pregnenolone, il precursore di tutti gli steroidi. Tale conversione avviene attraverso tre reazioni: idrossilazione in posizione 20; idrossilazione in posizione 22; scissione del legame carbonio 20 e carbonio 22. Queste reazioni avvengono attraverso la formazione di due intermedi, il 22R-idrossicolesterolo e il 20,22- idrossicolesterolo (Miller et al.2007). Il
pregnenolone formato, può andare incontro a diversi destini: può rimanere nel mitocondrio, dove viene idrossilato a 20α- idrossipregnenolone sempre ad opera dell’enzima CYP11A1 oppure può uscire dal mitocondrio e raggiungere il reticolo endoplasmatico, dove attraverso vie enzimatiche diverse porta alla formazione di 20α-diidropregnenolone; progesterone (PROG) che viene trasformato in androstenedione, quindi in testosterone e infine estradiolo; deidropiandrosterone
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(DHEA) da cui si possono ottenere androstenedione, testosterone e estradiolo; 7α-idrossipregnenolone (anch’esso trasformato in DHEA). Figura 4 (Rupprecht et al.2009)
Figura 4: Schema sintesi degli steroidi
A livello del SNC la steroidogenesi avviene prevalentemente nelle cellule gliali e le molecole steroidee prodotte sono chiamate neurosteroidi; questi, quindi, possono essere sintetizzati nel cervello de novo dal colesterolo, oppure possono raggiungere il cervello dagli organi steroidogenici periferici e sono localmente metabolizzati.
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Le azioni genomiche classiche coinvolgono il legame delle molecole neurosteroidee a recettori intracellulari e la regolazione del processo di trascrizione. I neurosteroidi possono anche esercitare effetti rapidi, che si verificano in pochi secondi tramite l’attivazione di recettori di membrana per neurotrasmettitori. E’ stato documentato che i neurosteroidi determinano modulazioni allosteriche su canali quali il complesso ionoforo Cl- associato al recettore del tipo A per l’acido γ-ammino-butirrico (GABA), N-metil-D-aspartato (NMDA) e i recettori nicotinici. Queste differenti interazioni portano a multiple azioni dei neurosteroidi, influenzando sia la glia che i neuroni.
La neurosteroidogenesi può anche verificarsi nei neuroni di diverse aree del cervello che possiedono il macchinario enzimatico necessario per convertire il colesterolo in steroidi neuroattivi . (Agis-Balboa et al.2007) I più potenti steroidi
neuroattivi sono il metabolita del progesterone (3α, 5α)-3idrossipregnan-20-one (3α, 5α-THP o allopregnanolone) e il desossicorticosterone (DOC) metabolita (3α, 5α)-3,21-diidrossipregnan-20- uno (3α, 5α-THDOC o allotetraidrodeossicorticosterone), che aumentano la neurotrasmissione mediata dal recettore GABAA e producono effetti neurocomportamentali inibitori.
Specifici siti di legame per steroidi neuroattivi sono stati individuati sulla subunità alfa del recettore GABAA modulandolo in maniera allosterica (Carver et al.2013). A
concentrazioni nanomolari, 3α, 5α-THP migliora l’affinità di GABA per il suo recettore, mentre a concentrazioni micromolari, attiva direttamente il recettore canale. (Akk et al.2007) Figura 5
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Figura 5. Schema di neurosteroidogenesi. steroidi neuroattivi ed enzimi neurosteroidogenici. La catena laterale di colesterolo viene scisso mediante P450scc e viene trasportato alla membrana mitocondriale interna e quindi convertito in pregnenolone. 17β-HSD10 catalizza l'ossidazione di steroidi neuroattivi nei mitocondri con NAD + come coenzima. Questo enzima catalizza più efficacemente l'ossidazione di 3α, 5α-THP e 3α, 5α-THDOC .
La neurosteroidogenesi è compromessa in numerosi disturbi psichiatrici e malattie neurodegenerative. Per esempio, una riduzione delle concentrazioni di alcuni steroidi neuroattivi (3α,5α-THP, 3α,5β-THP, 3α,5α-THDOC, 3α,5α- e 3a,5β-androsterone), o dei loro precursori (pregnenolone, progesterone, DOC, DHEA) è
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stata riportata nel siero e/o di liquido cerebrospinale di pazienti con depressione maggiore, disturbo disforico premestruale, disturbo da stress post-traumatico, schizofrenia, disturbo bipolare, e negli alcolisti astinenti (Melcangi et al.2006). È
interessante notare che il trattamento farmacologico con antidepressivi come la fluoxetina, reboxetina, venlafaxina, imipramina o mirtazapina, ma anche con antipsicotici come clozapina e olanzapina, o stabilizzatori dell'umore come carbamazepina o litio, ripristina concentrazioni centrali e periferiche di 3α,5α-THP nei ratti e nell'uomo, suggerendo che gli steroidi neuroattivi possono contribuire alla efficacia terapeutica dei farmaci antidepressivi. (Schule et al.2001) Date
le loro proprietà anticonvulsivanti, gli steroidi neuroattivi sono anche stati proposti come agenti terapeutici per l'epilessia. La scoperta delle proprietà neuroprotettive, neurotrofiche e anti-infiammatorie di steroidi neuroattivi ha spinto numerose indagini verso il loro potenziale terapeutico per le malattie neurodegenerative. Numerosi studi preclinici hanno avuto successo in questo senso. Pregnenolone (PREG), normalmente considerato come un precursore neurosteroide, ha determinato effetti neuroprotettivi nei confronti della neurotossicità indotta da glutammato e amiloide β nella linea cellulare ippocampale del topo (Gursoy et al.2001). PREG ha ridotto il rilascio di LDH indotto da
staurosporina e glutammato e ha diminuito il numero di cellule apoptotiche nelle colture corticali neuronali primarie. (Leskiewicz et al.2008) Inoltre, PREG ha esercitato
effetti neuroprotettivi contro la morte cellulare indotta da kainato nell'ippocampo dei ratti gonadectomizzati. (Luchetti et al.2011). L'identificazione delle proprietà
neuroprotettive del Progesterone (PROG) è iniziata con l'osservazione di una migliore ripresa di ratti femmina dopo il trauma cerebrale (TBI) ( Roof et al.1993). È
stata osservata una correlazione inversa tra la concentrazione di PROG del siero e il grado di edema del cervello dopo lesioni (Wright et al.2001).
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Nei ratti, la somministrazione di PROG (nel 1 °, 6 °, 24 ° e 48 ° giorno dopo TBI) ha significativamente protetto gli animali contro lo sviluppo dell'edema nel cervello e la disfunzione cognitiva (Stein, Wright et al.2010). In uno studio è stata provata
la somministrazione di PROG al terzo e quinto giorno dopo TBI ed è stata osservata una significativa riduzione della necrosi indotta da lesioni e diminuzione della perdita di cellule nel nucleo dorsomediale del talamo. Quest'ultimo processo ha favorito il recupero comportamentale degli animali. (Shear et al.2013) In un altro
studio, il trattamento con PROG dopo TBI ha ridotto la produzione di proteine infiammatorie nei ratti (Pettus et al.2005). Nilsen e Brinton hanno dimostrato che
PROG ha aumentato l'espressione del gene anti-apoptotico Bcl-2, che ha impedito la morte delle cellule nelle colture neuronali ippocampali del topo. Nel modello TBI nei ratti, la somministrazione di PROG ha aumentato i livelli di mRNA delle proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-XL. Al contrario, l'ormone ha ridotto i livelli di mRNA di proteine pro-apoptotiche, come Bax (Yao et al.2005). Inoltre, il
neurosteroide attenua il rilascio di citocromo c (Stein e Wright 2010). La
somministrazione post-lesione di PROG in ratti con ischemia globale del cervello ha determinato una significativa riduzione delle perdite di cellule nelle aree CA1/CA2 ippocampali e nelle zone del nucleo caudato (Cervantes et al.2002).
Vantaggiose proprietà di PROG sono state osservate anche nei modelli di lesione del midollo spinale e del nervo periferico. L'ormone somministrato per 3 giorni dopo la lesione del midollo spinale ha migliorato la mielina, ha aumentato il livello del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e la cromatolisi ridotta (De Nicola et al.2006). PROG ha significativamente migliorato l'espressione
neuronale del BDNF, la proteina 43 associata alla crescita (GAP-43) necessaria per la rigenerazione assonale, ha impedito i cambiamenti cromatolitici dei neuroni spinali, l'aumento dell'attività degli enzimi fondamentali per il normale
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metabolismo neuronale, la neurotrasmissione e restaurato l’espressione danneggiata delle subunità della Na/K-ATPasi e della colina acetiltransferasi.
(Labombarda et al.2010) Nei nervi periferici del ratto PROG ha aumentato la crescita e la
differenziazione delle cellule gliali, ha indotto la sintesi di proteine specifiche di mielina in oligodendrociti e ha potenziato la formazione di nuova guaina di mielina da parte delle cellule di Schwann (Baulieu et al.2001). Altre possibili azioni di
PROG includono: riduzione della cascata infiammatoria mediante reazioni indotte da citochine (IL-1, IL-6, TNFα), rallentamento dell'attivazione delle cellule immunitarie e migrazione (Stein et al.2008). Questo neurosteroide limita la necrosi
cellulare e l'apoptosi: abbassando la concentrazione del fattore nucleare κβ e l'espressione dei suoi geni bersaglio come IL-1β, C3, iNOS, COX2; riducendo l'esocitotossicità mediante inibizione dei recettori del glutammato; aumentando gli effetti del recettore GABAA; stimolando le cellule di Schwann attraverso il recettore nucleare per la produzione di mielina e la riduzione delle cicatrici gliali nel SNC (Plassart-Schiess et al.2001 e Baulieu et al.2001); provocando diminuzione della
perossidazione lipidica e dello stress ossidativo, inibizione della produzione di TNF-α o sovra-regolazione di enzimi antiossidanti. Le proprietà neuroprotective di PROG e dei suoi due metaboliti, il diidroprogesterone (DHP) e il tetraidroprogesterone (THP) sono stati mostrati nel modello di neuropatia diabetica indotta da streptozotocina nei ratti. Il trattamento cronico (di durata di 1 mese) con questi neurosteroidi ha mantenuto la velocità di conduzione del nervo, la soglia termica, la densità intra-epidermica della fibra nervosa, l'attività della pompa Na/K-ATPasi ed i livelli di mRNA delle proteine mieliniche. (Leonelli et all.2007)
L'Allopregnanolone sembra svolgere un ruolo significativo nella patogenesi della malattia di Alzheimer.
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Ridotti livelli di questo steroide sono stati trovati nel plasma del paziente e nella corteccia prefrontale. La soppressione di ALLO è stata associata a livelli ridotti di RNA e proteine delle isoforme murine degli enzimi AKR1, akr1c14 e akr1e1. Sembra che l’alterata sintesi di ALLO possa comportare una disfunzione di effetti neuroprotettivi endogeni. Allo stesso modo, la diminuzione della concentrazione di ALLO e la ridotta attività degli enzimi che sintetizzano il neurosteroide sono stati riscontrati nei pazienti con sclerosi multipla (Luchetti et al.2011). Tale fenomeno
come l'esocitotossicità indotta da NMDA nelle colture cellulari P-19 (cellule embrionali pluripotenti differenziate in neuroni) è stata attenuata da ALLO e DHEA, mentre DHEAS è risultato meno efficace. ALLO ha impedito il rilascio del citocromo c dal mitocondrio al citoplasma. Tuttavia, la somministrazione diretta di 3α,5α-THP determina fenomeni che ne limitano l'uso terapeutico. Questi includono una breve emivita, una bassa biodisponibilità e scarsa solubilità in formulazioni acquose, che limita la sua somministrazione orale, lo sviluppo di tolleranza, effetti collaterali quali sedazione, deficit della memoria e potenziale dipendenza.
Il Deidroepiandrosterone (DHEA) e il suo estere disolfato (DHEAS) sono stati riportati come fattori neurotropici o neuroprotettivi, difendendo i neuroni da molti eventi dannosi, inclusa l'eccitotossicità. Le proprietà protettive del DHEA possono essere correlate all'inibizione della produzione di ossido di azoto (NO) indotta da NMDA nelle cellule ippocampali o nella modulazione del percorso di segnalazione di calcio. DHEAS è stato dimostrato attenuare l'azione distruttiva di glutammato e NMDA sulle cellule granulari cerebellari nei ratti. L'azione neuroprotettiva dipendente dal tempo e dalla dose di DHEA è stata documentata nel modello in vivo di ischemia cerebrale globale nei ratti. La somministrazione di DHEA alla dose di 20 mg / kg durante 3-48 h dopo l'ischemia ha ridotto la morte
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neuronale nella regione CA1 ippocampale e ha migliorato i deficit di ischemia nell'apprendimento spaziale. Mentre il trattamento di DHEA (20 mg / kg, 1 ora prima o dopo l'ischemia) può intensificare il danno neuronale indotto da ischemia e il fallimento dell'apprendimento. Inoltre, il trattamento con dosi da 25 a 100 mg / kg per 15 giorni, ha portato ad effetti neuroprotettivi più pronunciati e a lesioni neuronali CA1 minori dell'ippocampo. Questi studi possono suggerire che DHEA, presenta una duplice azione -può essere neurotossico o neuroprotettivo, a seconda del tempo dell'inizio e della durata del trattamento (Li et al.2009). Anche il DHEAS è
stato studiato nel modello di ischemia reversibile del midollo spinale. Il neurosteroide ha mostrato un effetto preventivo quando è stato somministrato 5 minuti, ma non 30 minuti, dopo l'ischemia. Il fluasterone (DHF), un nuovo DHEA analogo, è stato considerato come un candidato per un farmaco usato nel trattamento del TBI negli esseri umani. Questo steroide ha migliorato il recupero funzionale nel modello TBI del ratto. Così, diversi approcci per indirizzare la via biosintetica degli steroidi neuroattivi sono stati esplorati. I recenti progressi nella neurosteroidogenesi sottolineano l'importanza di modulare la sintesi degli steroidi neuroattivi come un approccio terapeutico putativo per le malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative che colpiscono milioni di persone. (Timby et al.2006)
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2.Ligandi TSPO
2.1 Ligandi endogeni
Porfirine e DBI: le Porfirine come la protoporfirina IX e l’eme sono ligandi
endogeni ad alta affinità per il TSPO. Fino ad oggi sono stati proposti una serie di probabili ligandi endogeni quali il Diazepam Binding Inhibitor (DBI), alcune porfirine. Il DBI, un neuropeptide di 11 kDa costituito da 86 aminoacidi isolato inizialmente nel cervello di ratto, deve il suo nome alla capacità di spiazzare il radioligando [3H]Diazepam con un affinità nanomolare sia dal CBR che dal PBR; è stato dimostrato essere altamente espresso anche nei tessuti endocrini periferici.
(Papadopoulos et al.1995) Il DBI e il suo prodotto post-traslazionale (TTN) sono finora i
maggiori candidati per il ruolo di ligandi endogeni del TSPO e anche l'octadecaneuropeptide (ODN). (Gavish et al.1999) Altri importanti ligandi endogeni
sono le porfirine, già note per la loro capacità di modulare l’attività di diversi enzimi e per il loro coinvolgimento con molte proteine mitocondriali. In particolare la Protoporfirina IX ha una costante di inibizione (Ki) del valore di 20-50 nM per il TSPO ed un valore 1000 volte superiore per il CBR. Questa specificità di legame al TSPO implica un ruolo fisiologico delle porfirine nell’interazione con la proteina che va al di là della semplice biosintesi dell’eme.
2.2 Ligandi di origine sintetica
Sono state individuate numerose molecole sintetiche in grado di legarsi al TSPO con diversi gradi di affinità e selettività. Negli ultimi anni sono state sviluppate diverse serie di composti al TSPO, sperimentalmente già in uso in studi di
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imaging, la cui potenziale utilità terapeutica o diagnostica dovrà necessariamente essere valutata mediante studi in vivo. La ricerca e la sintesi di nuovi ligandi sintetici al TSPO è oggetto di interesse di numerosi gruppi di ricerca. Infatti, solo attraverso la valutazione delle differenze strutturali dei vari ligandi e della loro conseguente capacità di modulare l’attività del TSPO, è possibile far luce non solo sulla struttura del sito di legame di tali molecole al TSPO, ma anche sul ruolo fisiologico e patologico di questa proteina.
Benzodiazepine:
il farmaco a struttura benzodiazepinica Diazepam è stato il primo ad essere scoperto come ligando sintetico in grado di interagire con il TSPO. Si lega con la stessa affinità (nell’ordine della nanomolarità) sia al TSPO che al CBR. Al contrario, il suo derivato 4'-clorodiazepam, clinicamente inattivo e denominato Ro5-4864, è risultato avere un’ alta affinità di legame solamente per il TSPO, dimostrandosi il primo potente e selettivo ligando a tale proteina. Lo svantaggio principale dell’uso di Ro5-4864 nella ricerca di base è la differenza di affinità di legame specie-dipendente che rende difficile l’estrapolazione dei risultati dai modelli sperimentali animali all’uomo e perciò attualmente si preferisce utilizzare altri ligandi che non presentano questo limite. (Taliani et al.2009)
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Derivati isochinolin-carbossamidici
: Il ligando PK11195 (1-[2-clorofenil]-N-metil-N-[1-metil-propil]-3-isochinolincarbossamide) è stato il primo composto a struttura non benzodiazepinica a mostrare un’alta affinità e selettività per il TSPO. I primi saggi di analisi termodinamica hanno evidenziano che mentre [3H] Ro5-4864 ha un legame al TSPO termodinamicamente sensibile, [3H] PK11195 mostra un’interazione con la proteina di natura entropica (Park et al.1996). InoltrePK11195 sopprime la steroidogenesi indotta da un altro ligando sintetico classico, noto come FGIN-1-27, mentre se somministrato da solo sembra stimolarla. Per tali motivi, il ligando PK11195 è stato suggerito agire sul TSPO come antagonista o più probabilmente come agonista inverso. Tuttavia tale classificazione di PK11195 è attualmente oggetto di discussione poiché è stato documentato che in determinati modelli sperimentali PK11195 si comporta come altri ligandi TSPO considerati agonisti. Questo composto è considerato il prototipo di ligando al TSPO; lo spiazzamento di [3H]PK11195 dal TSPO rappresenta il metodo più usato per saggiare la affinità di legame di nuovi potenziali ligandi al TSPO. La funzione carbonilica risulta essere l'elemento farmacoforico primario per il riconoscimento del TSPO. I ligandi con maggior affinità sono caratterizzati da un ristretto range di orientamento del carbonile (compreso tra 80° e 110°), suggerendo così il coinvolgimento di questa porzione nella formazione di legami a idrogeno con determinati amminoacidi della proteina recettoriale. Alcuni anni dopo l’introduzione di PK11195, è stata studiata la radio marcatura di tre derivati chinolinici (N-[11C]-III, N-[11C]-IV, N-[11C]-V), con l’obiettivo di sviluppare potenziali strumenti per una valutazione non-invasiva del TSPO in vivo mediante PET, in diverse condizioni patologiche tra le quali sclerosi multipla, glioma umano, infarto cerebrale e anomalie dei canali del calcio nelle malattie cardiache. La valutazione di questi ligandi nella misurazione in vivo dell’espressione del
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TSPO in un modello preclinico nella malattia di Huntington, ha indicato che N-[11C]-V è un candidato promettente per monitorare i processi neurodegenerativi
in vivo con la PET. (Matarrese et al.2001) Tra i nuovi composti di sintesi, le ammidi
terziarie portanti un gruppo clorometilico o 2-fluorofenilico hanno mostrato un’affinità sub-nanomolare per il TSPO e si sono mostrati più potenti del composto di riferimento PK11195, risultando interessanti nella radio marcatura e negli studi PET. Inoltre sono in grado di interagire con il TSPO in vivo e stimolare il trasporto di colesterolo sia nel cervello che nei mitocondri dei tessuti periferici.
PK11195
Derivati fenossifenil-acetamidici:
dall’apertura dell’anello diazepinico del Ro5-4864 derivano i composti N-(4-cloro-2-fenossifenil)-N-(2-isopropossibenzil)-acetamide (DAA1097) e l’N-(2,5-dimetossibenzil)-N-(5-fluoro-2-fenossifenil)-acetamide (DAA1106). Sono selettivi e potenti ligandi del TSPO, presentano un’affinità e una lipofilia maggiore rispetto a PK11195, e i loro metaboliti sono inattivi. Sebbene entrambi esplicano una potente azione ansiolitica in animali da esperimento, sulla steroidogenesi mostrano effetti opposti: mentre DAA1097 promuove un aumento di pregnenolone nelle cellule tumorali, DAA1106 non ha effetti e, anzi, sembra parzialmente inibire l’effetto del suo analogo. La capacità di entrambi i composti di inibire il legame del20
PK11195 a concentrazioni nanomolari suggerisce che queste due classi di composti hanno un dominio di legame sovrapponibile. (Maeda et al.2004)
DAA1097 DAA1106
Benzossazepine:
questi composti hanno una struttura modellata su uno scheletro pirrolobenzossazepinico. Tali derivati hanno dimostrato essere ad alta affinità e ligandi selettivi per TSPO; OXA-17f (0.26 nM)e OXA-17j (0.36 nM) sono i ligandi più potenti della serie. Le nuove pirrolobenzossazepine sono state sperimentate nella corteccia del ratto, un tessuto che esprime un'elevata densità di TSPO mitocondriale. Tali ligandi hanno dimostrato valori di Ki nell’ordine della nanomolarità o subnanomolarità, misurati mediante saggi di competizione dei ligandi sintetici verso il legame del radioligando [3H]PK11195. Un sottoinsieme di ligandi ad alta affinità di legame è stato trovato avere affinità elevata anche al sito di legame per il radioligando [3H] Ro5-4864 nei mitocondri surrenali di topo La stimolazione della steroidogenesi da parte di questi ligandi risulta comparabile con quella di PK11195 e di Ro5-4864. Nuovi derivati di questa serie, NF-213 e NF-182, sono stati usati per valutare il coinvolgimento del TSPO nella crescita cellulare, anche se il loro potere antiproliferativo sembra non essere proporzionale21
alla potenza del ligando. Infatti la concentrazione efficace per determinare tale effetto risulta essere 1000 volte maggiore di quella necessaria a saturare i siti del TSPO. (James et al.2006)
Derivati indolacetamidici:
composti 2-aril‐3-indolacetamidici affini e selettivi al TSPO furono sviluppati più di 15 anni fa come risultato della sintesi indolica di Fischer. Il legame ad alta affinità di FGIN- dipende dalla dialchilazione dell'amide, dalla lunghezza della catena di questa sostituzione alchilica e dall'alogenazione di gruppi arilici aggiunti al nucleo dell'indolo. I derivati FGIN-1 non si legano al recettore GABAA.L’N,N-di-n-esil-2-(4-fluorofenil) indol-3-acetamide, o FGIN-1-27, ha mostrato in animali proprietà anticonvulsivanti, sedative e ansiolitiche nonostante non abbia affinità per il recettore GABAA. Probabilmente esso attiva indirettamente il
recettore GABAA stimolando la sintesi di steroidi neuroattivi, ha una grande
capacità di penetrazione a livello centrale. (Primofiore et al.2004 ) Un derivato di questa
classe di composti, il 7-cloro-N,N,5-trimetil-4-oxo-3-fenil-3,5-diidro-4H-piridazino[4,5‐b]indol-1-acetamide o SSR180575, si è rivelato interessante per la grande capacità di attraversare la barriera ematoencefalica; in vivo stimola la sintesi di neurosteroidi e si è mostrato capace di ridurre la neurodegenerazione e il danno da ischemia-riperfusione in numerosi modelli sperimentali. (Ferzas et al.2002)
22
Derivati imidazopiridinici:
l’ Alpidem è il primo membro di questa classe a presentare un’affinità nanomolare sia per il CBR sia per il TSPO . Modellati sullo scheletro 2-fenilimidazo[1,2-α]piridinico dell’Alpidem sono stati creati una serie di ligandi, nei quali la disostituzione delle posizioni 6 e 8 con vari gruppi funzionali (diCl, diBr, CF3, CH3) rappresenta l’elemento strutturale chiave nel promuovere la selettività verso il TSPO. CB34, CB50 e CB54 sono risultati i composti più attivi di questa serie. In particolare il CB34 (N,N-di-n-propil-[2-(4-clorofenil)-6,8dicloroimidazo[1,2-a]-piridin-3-il]acetamide) è risultato il più promettente (1.03 nM) ed è stato sottoposto ad un approfondito studio in vivo su roditori. Recenti studi che utilizzano come ligando marcato [3H]CB34, hanno valutato lo spiazzamento di tale composto dal sito di legame usando i ligandi selettivi PK11195 e Ro5‐4864. Mentre PK11195 mostra un certo grado di spiazzamento per [3H]CB34, Ro5-4864 ha evidenziato scarsa potenza nell’inibire l’interazione ligando-proteina.Derivati pirazolopirimidinici:
le pirazolopirimidine sono bioisosteri dei derivati imidazopiridinici che hanno l’Alpidem come capostipite. L’N,N-dietil-2-[2-(4-metossifenil)-5,7-dimetil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-acetamide (DPA-713), mostra non avere effetti sulla steroidogenesi, evidenziando ancora una volta che per i ligandi al TSPO non c’è relazione diretta tra l’attività intrinseca e l’affinità recettoriale. (Selleri et al.2005)23
DPA-713 DPA-714
N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossiammidi: s
ono stati sviluppati una nuova serie di ligandi potenti e selettivi per il TSPO, che rappresentano una variazione della struttura base dell’alpidem. Un esempio di affinità di legame di tali ligandi N,N-dialchil-2-fenilindol-3-ilgliossiammidi (PIGA) sono riportate nella tabella seguente.Composto R1 R2 Ar Ki (nM) a PIGA1228 (CH2) 3CH3 (CH2)2CH3 3-Tienil 2.83 ± 0.30 PIGA1248 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 3-Tienil 0.89 ± 0.10 PIGA1175 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 p-Bifenil 0.53 0.05 PIGA1165 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 p-Bifenil 5.50 1.00 PIGA1174 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 p-Bifenil 1.84 0.20 PIGA1128 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 2-Naptil 0.30 0.04 PIGA1136 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 2-Naptil 0.53 0.06 PIGA1130 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 2-Naptil 0.52 0.06 PIGA1137 CH3 (CH2)3CH3 2-Naptil 0.56 0.06 PIGA1138 CH3 (CH2)4 CH3 2-Naptil 0.37 0.04 PIGA1226 (CH2)3CH3 (CH2)3CH3 p-Metossifenil 20.3 2.21 PIGA1244 (CH2)5CH3 (CH2)5CH3 p-Metossifenil 4.04 0.44 PIGA1212 (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 p-Metilfenil 5.50 0.38 PK 11195 9.3 0.50
24
Le SAR di questa classe di composti sono state razionalizzate sulla base di un modello di farmacoforico costituito da tre tasche lipofile (L1, L3 e L4) e da un sito donatore capace di formare un legame a idrogeno (H1) . (Taliani et al.2009)
XBD-173 (AC-5216, Emapunil):
N-benzil-N-etil-2- (7,8-diidro-7-metil-8-oxo-2-fenil-9H-purin-9-il) acetammide, ligando di fenilpurina molto selettivo e ad alta affinità per TSPO.XBD-173
Ha mostrato un valore di Ki pari a 0.297 nM nei mitocondri preparati da cervello di ratto, pari a 3.04 nM in cellule di glioma di ratto e pari a 2.7 nM in cellule di glioma umane. Testato alla concentrazione 1 M non ha interagito con altri recettori, trasportatori e canali inonici. (Rupprecht et al.2009)
Etifossina:
2-etilamino-6-cloro-4-metil-4-fenil-4H-3,1-benzossazina idrocloride (Etifossina) agisce aumentando la funzione del recettore GABAA e stimolando la biosintesi acuta di steroidi attraverso l'attivazione della proteina traslocatore a 18 kDa. Etifossina inibisce in modo non competitivo il legame di [3H]PK11195.25
al.2005)
Olesoxime: (detto
TRO19622), colest-4-en-3-one, ossima, agisce come target sulle proteine di membrana mitocondriale esterna, previene l’apertura del poro di transizione di permeabilità. TRO19622 è legato direttamente a due componenti della porosità di permeabilità mitocondriale: il canale di anione voltaggio-dipendente e la proteina traslocatore 18 kDa, suggerendo un meccanismo potenziale per la sua attività neuroprotettiva studiato per SLA e SM. TRO19622 interagisce con il sito di legame del colesterolo su TSPO con un valore Ki di 100 nM. Tuttavia, dato che il valore di Kd per il colesterolo è inferiore a 10 nM e che la concentrazione plasmatica del colesterolo è circa 1000 volte superiore a quella richiesta per l'efficacia di TRO19622, è improbabile che il legame TRO19622 a questo sito abbia un impatto sul metabolismo del colesterolo o sulla steroidogenesi. Tuttavia, è possibile che questo sito possa consentire l'assorbimento di TRO19622 nei mitocondri e la sua concentrazione nei tessuti steroidogenici. (Bordet et al.2010)26
Alcuni di questi farmaci sono già stati testati con successo in modelli preclinici di lesioni o malattie del sistema nervoso. Nel SNP, alcuni ligandi TSPO hanno mostrato proprietà neuro protettive in modelli di neuropatie tossiche. L'uso di ligandi TSPO per proteggere i tessuti nervosi e anche migliorare la rigenerazione assonale è di particolare interesse perché TSPO viene up-regolato in risposta al danno. Di conseguenza, questi ligandi possono esercitare i loro effetti protettivi e trofici dove sono necessari. Tuttavia, l'utilizzo di alcuni di essi è limitato, sia a causa della loro bassa solubilità, la loro scarsa penetrazione nei tessuti nervosi, i loro effetti incoerenti quando testato negli esseri umani, o anche i loro effetti collaterali tossici.
2.3 Ligandi di origine naturale
Vinpocetina: è estratta dalla pianta di periwinkle, Vinca minor, originariamente
scoperta e commercializzata nel 1978 con il nome commerciale Cavinton. Da allora, Vinpocetina è stata ampiamente usata nel trattamento di disturbi cerebrovascolari e nel miglioramento di malattie cognitive, ictus, malattia di Alzheimer e disturbi della memoria (Bagoly et al., 2007). Il suo effetto clinico benefico
si basa su una vasta gamma di azioni, inclusi effetti antiossidanti, antiinfiammatori, vasodilatatori e neuroprotettivi. Gli iniziali studi di autoradiografia effettuati con [11C]vinpocetina in campioni di emisferi cerebrali umani hanno mostrato che il composto radiomarcato si lega in maniera specifica a TSPO con una affinità moderata. Sebbene vinpocetina si lega con affinità moderata a TSPO (IC50= 200 nM) può essere un radioligando per analisi PET in
27
Vinpocetina
3.Stimolazione farmacologica dell’attività steroidogenica
di TSPO
PK11195, Ro5-4864: i ligandi classici al TSPO sono stati impiegati in vari
modelli cellulari sia periferici che centrali per valutare il potenziale ruolo di TSPO nella steroidogenesi.. I ligandi TSPO sperimentati hanno stimolato in maniera concentrazione-dipendente la produzione del prodotto steroideo primario α -idrossiprogesterone nelle cellule steroidogeniche periferiche Y-1 (linea cellulare tumorale surrenale di topo). La potenzialità di ciascun ligando TSPO che stimolavano la steroidogenesi delle cellule Y-1 sono state strettamente correlate con le loro affinità di legame a TSPO, suggerendo che l'effetto di questi farmaci sulla steroidogenesi è dovuto al loro legame con TSPO. (Mukhin et al.1989) Gli studi
che seguirono subito dopo lo studio iniziale sono stati eseguiti usando ligandi di TSPO, in quel periodo disponibili, quali le isochinoline, PK11195 e PK14067 e la benzodiazepina 4'-C1-diazepam (Ro5-4864). Utilizzando le cellule di Leydig MA-10 di topo, è stato dimostrato che PK11195 e PK14067 erano i più potenti ligandi TSPO, stimolando la produzione di progesterone da 3 a 4 volte.
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Tra le benzodiazepine, Ro5-4864 è stato il più potente, inducendo un aumento di steroidogenesi di 3,5 volte, mentre il diazepam ha raggiunto solo una stimolazione di 2 volte. In questo studio è stata mostrata anche una correlazione tra l'affinità del ligando TSPO e l'effetto di stimolazione steroidogenica. Inoltre, è stato studiato se i ligandi TSPO, PK1115 (1 pM) e Ro5-4864 (10 pM), potessero esercitare un effetto stimolante additivo sulla produzione di steroidi rispetto ad altri regolatori della steroidogenesi quali la gonadotropina corionica (CG) o il fattore di crescita epidermico (EGF). Le azioni dei ligandi TSPO non hanno migliorato la stimolazione CG-indotta, ma hanno migliorato la stimolazione EGF-indotta. Utilizzando mitocondri isolati in presenza di colesterolo esogeno e trilostano, inibitore dell’ulteriore metabolismo di pregnegnolone, è stato dimostrato che i ligandi TSPO stimolavano la produzione di pregnenolone. Questo effetto non è stato osservato con i mitocondri privi della membrana esterna (mitoplasti), che è d'accordo con la localizzazione di TSPO nell'OMM. Per identificare lo step esatto nella formazione mitocondriale di pregnegnolone attivato dai ligandi TSPO, è stato quantificato il livello di colesterolo presente nell'OMM e IMM, prima e dopo il trattamento con i ligandi TSPO. I risultati ottenuti hanno dimostrato che i ligandi TSPO stimolavano la formazione di pregnenolone inducendo la traslocazione del colesterolo mediata da TSPO dall'esterno alla membrana mitocondriale interna. Il meccanismo alla base della stimolazione steroidogenica indotta dall'azione ormonale e dai ligandi TSPO è stato investigato nelle cellule tumorali surrenali Y-1 e mitocondri isolati. È stata scoperta una relazione con la produzione di steroidi indotta da ormone e da TSPO nelle cellule Y-1, precedentemente osservate nelle cellule MA-10. Infatti, la stimolazione della produzione di 20α-idrossiprogesterone da parte dell'adrenocorticotropina (ACTH) non era additiva a quella della stimolazione da PK11195.
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Quando le cellule sono state trattate con l'inibitore della sintesi proteica, cicloesimide, è stato mostrato il blocco della sintesi dello steroide indotta da ACTH, che è un effetto caratterizzato da un accumulo di colesterolo nel OMM. Al contrario, la steroidogenesi stimolata da PK11195 non è stata inibita da cicloesimide. Quando sono stati utilizzati mitocondri isolati, la stimolazione della produzione di pregnenolone da parte di PK11195 era indipendente dal colesterolo esogeno fornito, indicando che il TSPO agiva sul colesterolo già presente all'interno di membrane mitocondriali. (Krueger et al.1990) Per studiare la funzione
steroidogenica di TSPO nel SNC, in due studi è stato scelto come modello steroidogenico un subclone della linea di glioma di ratto C6-2B. Un primo modello sperimentale consisteva in cellule intatte C6-2B che sono state incubate con il precursore mavalonolactone triziato ([3H] MVA), per rilevare l'incorporazione di [3H] MVA in pregnenolone e quindi, quantificare la formazione di questo steroide. È stato misurato il tempo di formazione di pregnenolone in cellule C6-2B trattate e non trattate con Ro5-4864. In queste condizioni è stata mostrata un’incorporazione bifasica di [3
H]MVA in coleresterolo e pregnenolone, con una fase iniziale rapida (entro 1 minuto), seguita da una fase più lenta. La formazione di pregnenolone è stata stimolata da concentrazioni nanomolari di Ro5-4864 dopo 5 minuti di incubazione con [3H]MVA. L'effetto stimolante è stato dipendente dalla concentrazione di farmaci e l'effetto massimo è stato raggiunto a 10 nM. (Guarneri et al.1992) Il secondo modello
sperimentale consisteva in mitocondri isolati dalle cellule C6-2B. Nei mitocondri isolati, è stato studiato l'effetto del ligando naturale TSPO, DBI, sulla produzione di pregnenolone. L'occupazione di TSPO con concentrazioni nanomolari di DBI e il suo prodotto di trasformazione naturale, DBI-(17-50), hanno aumentato la formazione di pregnenolone.
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DBI, che presenta una maggiore affinità per i recettori GABAA ma una bassa
affinità per TSPO, era inefficace nel stimolare la sintesi di pregnenolone.
(Papadopoulos et al.1992) Gli studi condotti da diversi laboratori hanno confermato
l'osservazione che i ligandi TSPO Ro5-4864 e PK11195 e DBI e DBI (17-50), stimolano la steroidogenesi.
DAA1097, DAA1106: derivati fenossifenil‐acetamidici sono stati testati per valutare la loro capacità di promuovere la biosintesi steroidea in modelli di cellule steroidogeniche ben validati. Due derivati di fenossifenil-acetamide, DAA1097 e DAA1106, sono stati testati usando cellule MA-10 Leydig, cellule di glioma C6-2B e mitocondri derivanti da cervello di ratto. DAA1097 ha attivato la steroidogenesi in modo simile al ligando classico PK11195, più efficacemente sul cervello rispetto alle cellule Leydig. Al contrario, DAA1106 non ha attivato la steroidogenesi, ma ha parzialmente inibito la steroidogenesi indotta da hCG. Per tali ligandi è stata effettuata anche una caratterizzazione sulle loro proprietà di legame al TSPO. In particolare, l'affinità di legame di [3H]DAA1106 per TSPO è risultata simile a quella di [3H]PK11195 nelle cellule MA-10, C6-2B e al TSPO ricombinante, ma era 10 volte più alta nei mitocondri di cervello. Gli studi di competizione hanno rivelato che DAA1097 e DAA1106 hanno inibito il legame di [3H] PK11195 a concentrazioni nano e picomolare, rispettivamente, mentre l'IC50 di PK11195 contro [3H]DAA1106 era nell’ordine della micromolarità.
Questi risultati suggeriscono che: i siti di legame DAA1097 e DAA1106 presenti nel TSPO condividono il dominio comune con quello di PK11195, ma contengono anche motivi che non interagiscono in modo efficiente con PK11195; il legame di DAA1097 a TSPO induce variazioni nella proteina simile a quello innescato da PK11195, consentendo l'attivazione della steroidogenesi; il fatto che DAA1106 non attivi la steroidogenesi nonostante la sua elevata affinità per TSPO
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suggerisce che il suo legame a TSPO porta a cambiamenti conformazionali che non consentono o antagonizzano la funzione steroidogenica. (Culty et al.2001)
Derivati piridopirrolo- e pirrolo-benzoxazepina: Tutti i ligandi testati
appartenenti a questa classe di derivati sono risultati in grado di stimolare la steroidogenesi, stimolando la produzione di pregnegnolone, con un' efficacia simile a quello di PK11195 e Ro5-4864 nelle cellule Y-1 e MA-10 Leydig.
(Campiani et al.1996)
Derivati dell'indoleacetamide: la classe di derivati dell'indoleacetamide,
denominati collettivamente FGIN-1, sono stati osservati stimolare la produzione di pregnenolone nei mitocondri delle cellule C6-2B. I derivati 2 b,f,o,s,t,v,z stimolavano la formazione di pregnegnolone, i 2z accumulavano pregnegnolone nei motocondri nel cervello di ratto. (Kozikowski et al.1993) I derivati
2-arilindol-3-acetamide, l'acido 2-esil3-acetamide (FGIN-1-27) e l'acido 2-esil -indolo-3-acetamide-N-benzentricarbossilico (FGIN-1-44) stimolano più velocemente la sintesi di pregnenolone nei mitocondri isolati da cervello di ratto. FGIN-1-27 ha aumentato il contenuto di pregnenolone cerebrale in ratti ai quali erano stati asportati il surrene e testicoli e pretrattati con trilostano un inibitore della 3-β-idrossiesteroide-deidrogenasi che impedisce la conversione del pregnenolone nel progesterone. L’aumento di pregnenolone indotto dai ligandi è stato bloccato dal pretrattamento con PK11195. (Romeo et al.1992)
Gli effetti di SSR180575 sull'accumulo di pregnenolone nel cervello, nel nervo sciatico e nel plasma sono stati determinati in animali trattati con trilostano. In animali trattati con il solo solvente impiegato per solubilizzare il composto, le concentrazioni di pregnenolone erano molto più elevate nel cervello e nel nervo sciatico rispetto al plasma. L'iniezione di trilostano ha significativamente aumentato la concentrazione di pregnenolone nei tre distretti.
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La somministrazione intraperitoneale di una singola dose di SSR180575 (3 mg/kg), 15 minuti dopo l'iniezione di trilostano, ha determinato un aumento significativo di pregnenolone pari a 2 volte nel cervello e nel nervo sciatico. I livelli di pregnenolone nel plasma degli animali trattati non erano significativamente diversi da quelli del gruppo trattato con trilostano. (Ferzaz et al.2002)
Pirazolopirimidine DPA-713 e DPA-714: Pur essendo strutturalmente simili,
DPA-714 è in grado di stimolare la sintesi di steroidi dell'80% rispetto al controllo, con potenza significativamente superiore rispetto al composto DPA-713 che non ha alcun effetto sulla sintesi di steroidi. (James et al.2006)
Derivati dell'arrilpirazolo-pirimidina-acetamide: tali ligandi hanno stimolato la
produzione di pregnenolone in cellule C6 di ratto simile a PK11195. (Selleri et al.2005)
PIGAs: I PIGAs sono risultati efficaci nello stimolare la produzione di
pregnenolone in vari modelli neurosteroidogenici in vitro. La quantità di pregnenolone rilasciata dalle cellule è stata misurata dopo un'incubazione di 2 ore con una concentrazione fissa di PIGA. I risultati ottenuti hanno mostrato che la maggior parte dei derivati PIGA hanno significativamente aumentato la sintesi di pregnenolone in cellule C6 rispetto al controllo (settato al valore di 100%).
(Primofiore et al.2004) Di seguito è riportata una figura (Fig. A) riportante l’attività
stimolatoria indotta da alcuni dei PIGAs testati. Il livello più elevato di pregnenolone è stato osservato dopo che le cellule C6 sono state trattate con PIGA1137 e PIGA1138 (aumento della sintesi pregnenolone del 208% e del 215% rispettivamente p <0,001). I ligandi PIGA hanno anche indotto in modo significativo la steroidogenesi in un modello astrocitico umano (cellule U87MG) in maniera confrontabile a quella osservata nelle cellule C6. I derivati PIGA1137 e PIGA1138 hanno mostrato un aumento della sintesi di pregnenolone del 288% e del 299% rispettivamente (p <0.001, Figura 2B).
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Il ligando classico PK11195, usato come standard di riferimento, ha aumentato la produzione di pregnenolone in maniera simile nei due modelli cellulari (139% nelle cellule C6 e 144% nelle cellule U87MG, p <0.01).
Figura: Effetti dei ligandi PIGA sulla produzione di pregnenolone. Le cellule C6 gliomi (A) e U87MG (B) sono state incubate con diversi ligandi PIGA (40 μM) per 2 ore a 37 ° C.
Di questa classe di ligandi TSPO, il ligando N, N-di-n-propil-2–metilmetil indol-3-ilglyossilammide (MPIGA) è stato testato non solo per la sua potenziale attività steroidogenica, ma anche per ulteriori attività funzionali collegate con la produzione di steroidi. In particolare, MPIGA è risultato in grado di stimolare la produzione di pregnenolone da cellule di glioma umano ADF quando il trilostano è stato aggiunto al terreno di coltura salina. Senza l'aggiunta di trilostano, MPIGA ha aumentato la formazione di allopregnanolone, il principale modulatore di steroidi positivi dell'attività del recettore GABAA. A seguito del trattamento
cellulare con MPIGA, la quantità del principale neurosteroide con attività modulatoria allosterica negativa del recettore GABAA, DHEAS, non era rilevabile
nel terreno di coltura salina. Il terreno di coltura salina condizionato (derivato dalle cellule ADF trattate con MPIGA) ha determinato un effetto modulatorio
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dell'attività del recettore GABAA in un modello in vitro ben validato, costituito da
sinaptoneurosomi ottenuti dalla corteccia cerebrale di ratto. In particolare, il mezzo condizionato ha aumentato l'uptake di 36Cl- nei sinaptoneurosomi. Al fine di dimostrare che l'effetto osservato era mediato dalle molecole di steroidi che sono state rilasciate dalle cellule ADF dopo il trattamento con MPIGA, le cellule trattate con MPIGA sono state incubate con aminoglutetimide un inibitore del primo enzima del pathway steroidogenico (citocromo P450scc), Sotto queste condizioni sperimentali, non è stato osservato l’aumento di uptake di 36
Cl- nei sinaptoneurosomi, suggerendo che l’effetto osservato possa essere mediato in maniera specifica dai neurosteroidi rilasciati dalle cellule a seguito del trattamento con il ligando TSPO. (Costa et al.2010)
Derivati imidazopiridinici: un certo numero di analoghi alpidem, sostituiti in C
(6) con x= Cl e C (8) y= Cl del nucleo dell'imidazo [1,2-a] piridina, e in posizione para (Z) del gruppo 2-fenil, sono stati studiati per la loro capacità di influenzare la steroidogenesi in una linea di cellule tumorali di Leydig del topo. Quattro composti si sono comportati come stimolatori steroidogenici, due composti invece, si sono rivelati inibitori della biosintesi steroidea, mentre i restanti composti non hanno alterato in modo significativo la produzione di steroidi. In particolare, due hanno mostrato profilo simile di stimolazione di steroidogenesi come quello di FGIN-1-27. (Midzak et al.2015) Tre derivati di 2-fenil-imidazo [1,2-a]
piridina (CB34, CB50 e CB54) sono stati studiati in relazione alla loro capacità di stimolare la steroidogenesi centrale e periferica nei ratti. La somministrazione intraperitoneale di composti CB (3-50 mg kg (-1)) ha indotto un aumento dose-dipendente delle concentrazioni degli steroidi neuroattivi nel plasma e nel cervello.
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Aumenti nelle concentrazioni cerebrali di pregnenolone (circa 96%), progesterone (circa 126%), allopregnanolone (circa 110%) e THDOC (70%) rispetto al controllo dopo 30-60 min dalla somministrazione di CB34 (25 mg/kg). CB 34 ha anche aumentato le concentrazioni cerebrali di steroidi neuroattivi nei ratti deprivati degli organi steroidogenici periferici, suggerendo che i composti CB stimolino lo steroidogenesi del cervello indipendentemente dalla periferia. (Serra et al.1999)
XBD173: questo ligando testato a quattro concentrazioni (0.1, 1, 3 e 10 M) su due modelli neurosteroidogenici in vitro (cellule di microglia di topo BV-2 e cellule C6) ha stimolato la produzione di pregnenolone dopo 24 h di trattamento, raggiungendo circa il 130% di stimolazione rispetto al controllo (settato al 100%).
(Wolf et al.2015). E’ stato osservato che XBD173 migliora la neurosteroidogenesi in
aree del cervello, potenziando l'ampiezza e la durata delle correnti postinaptiche inibitorie mediate da GABA. Questo effetto potenziometrico sulla neurotrasmissione GABAergica è impedito dalla finasteride, inibitore dell’enzima 5α-reduttasi. Inoltre, XBD173 non ha modulato le correnti di cloruro nelle cellule WSS-1 (esprimenti il sottotipo recettoriale del recettore GABAA costituito dalle
subunità α1γ2β3), dimostrando quindi che XBD173 non rivela effetti diretti modulatori al recettore GABAA. Pertanto, il miglioramento della
neurotrasmissione GABAergica da XBD173 sembra essere mediata indirettamente attraverso la generazione di neurosteroidi. (Rupprecht et al.2009)
Etifossina:
iniezioni intraperitoneali di Etifossina in ratti (50 mg/kg) hanno aumentato le concentrazioni di pregnegnolone, progesterone, 5 alfa– diidroprogesterone e allopregnagnolone nel plasma e nel cervello da due a quattro36
volte. Nei ratti adrenalectomizzati e castrati, l'etifossina ha aumentato i livelli cerebrali di questi steroidi, suggerendo una stimolazione della loro sintesi locale e/o una diminuzione del loro ulteriore metabolismo. (Verleye et al.2005) Nelle
preparazioni di membrana provenienti dal cervello di ratto maschio, l'etifossina ha inibito in modo non competititvo il legame di [3H]PK11195 con un IC50=18,3 +/-
1,2 M, un valore coerente con le concentrazioni di etifossina nel plasma e nel cervello misurate dopo una dose di 50 mg/kg.
In un altro studio sono stati effettuati esperimenti dose-risposta, in acuto e in cronico, con iniezioni intraperitoneali di etifossina, sui livelli di steroidi nel cervello e nel plasma del topo maschio adulto analizzati mediante gas-cromatografia-massa spettrometria. Le concentrazioni di pregnenolone, progesterone ei suoi metaboliti 5α ridotti sono significativamente aumentati in entrambi i tessuti in risposta a 25 e 50 mg/kg di etifossina rispetto ai controlli e hanno raggiunto valori massimi dopo 0,5-1 h dall’iniezione. Le iniezioni giornaliere di etifossina (50 mg/kg, 15 giorni) li mantengono aumentati al 15 ° giorno. I confronti tra i tessuti steroidogenici hanno rivelato che 1 h dopo 50 mg/kg di trattamento con etifossina, i livelli di pregnenolone, progesterone e corticosterone erano significativamente aumentati insieme ai loro metaboliti ridotti. (Liere et al.2017)
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Tabella attività steroidogenica dei ligandi TSPO.
Ligandi TSPO Modelli in vitro Effetti in vitro Referenze
Ro5-4864 PK11195 Pk14067
Y-1 linea cellulare tumorale surrenale di topo
Stimolazione della produzione di 20α-idrossiprogesterone. Mukhin et al.1989 Ro5-4864 PK11195 Pk14067 cellule di Leydig MA-10 di topo
Stimolazione di produzione del progesterone.
Le azioni dei ligandi TSPO non hanno migliorato la stimolazione CG-indotta, ma hanno migliorato la stimolazione EGF-indotta. Papadopoulos et al., 1997
Mitocondri isolati Stimolano la produzione di pregnenolone in presenza di colesterolo esogeno. PK11195 Y-1 linea cellulare tumorale
surrenale di topo
Stimolazione della produzione di 20α-idrossiprogesterone nelle cellule.
Krueger et al.1990 Mitocondri isolati Stimolazione di pregnegnolone
indipendentemente dalla presenza di colesterolo esogeno.
Ro5-4864 Linea di glioma di ratto C6-2B. cellule intatte
Stimolazione formazione pregnegnolone a seguito di incubazione con concentrazioni nano molari di Ro5-4864
Guarneri et al.1992 DBI
TTN, DBI-(17-50) ODN, DBI-(33-50)
Mitocondri di C6-2B Stimolazione produzione pregnegnolone da DBI, TNN, DBI-(17-50) Papadopoulos et al.1992 DAA 1097 DAA1106 cellule di Leydig MA-10 di topo DAA 1097: stimolazione steroidi su cervello isolato e cellule di Leydig
DAA1106: nessun effetto
Culty et al.2001 Linea di glioma di
mitocondri di ratto C6-2B Cervello isolato di ratto Derivati
piridopirrolo- e pirrolo-benzoxazepina
Y-1 linea cellulare tumorale surrenale di topo Stimolano la produzione di pregnegnolone Campiani et al.1996 cellule di Leydig MA-10 di topo
38 Derivati dell'indoleacetamide FGIN-1 Linea di glioma di mitocondri di ratto C6-2B Stimolano la formazione di pregnegnolone
Accumulano pregnegnolone nei mitocondri del cervello di ratto
Kozikowski et al.1993 FGIN-1-27 FGIN-1-44 Mitocondri isolati di cervello di ratto
Stimolazione della sintesi di pregnegnolone. Effetto inibito da PK11195.
Romeo et al.1992 SSR180575 Modello in vivo:
Ratti deprivati degli organi endocrini steroidogenici e pre trattati con trilostano
Aumento dei livelli di pregnegnolone nel cervello
Ferzaz et al.2002 DPA-713
DPA-714
Cellule C6 glioma ratto DPA-714 stimola produzione pregnegnolone James et al.2006 Derivati dell'arrilpirazolo- pirimidina-acetamide
Cellule C6 glioma ratto Stimolano la produzione pregnegnolone
Selleri et al.2005 PIGAs Cellule C6 glioma ratto Stimolano la produzione di
pregnegnolone.
PIGA1137 e PIGA1138 sono più efficaci.
Primofiore et al. 2014 MPIGA Linea cellulare ADF
glioblastoma multiforme umano Stimolazione di produzione di allopregnagnolone e progesterone Costa et al.2010 terreno di coltura salina
condizionato, derivato dalle cellule ADF trattate con MPIGA
Ha aumentato l'uptake di 36Cl -nei sinaptoneurosomi corticali del cervello di ratto.
Derivati
imidazopiridinici
linea di cellule tumorali di Leydig del topo
Alcuni composti stimolano steroidogenesi altri la inibiscono.
Midzak et al.2015
CB34, CB50, CB54 Modello in vivo:
ratti intatti e ratti deprivati degli organi endocrini steroidogenici
Incrementano i livelli di pregnegnolone, progesterone, allopregnagnolone e THDOC nel cervello e nel plasma.
Serra et al.1999 XBD173 cellule di microglia di topo
BV-2, cellule C6 Stimolazione di produzione di pregnegnolone Wolf et al.2015 Parti neocorticali di topo Potenziamento trasmissione
GABAergica
Rupprecht et al.2009 Etifossina Modello in vivo:
ratti intatti e ratti deprivati degli organi endocrini steroidogenici
Aumento dei livelli di pregnegnolone, progesterone, allopregnagnolone e THDOC
Verleye et al.2005
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4.Implicazioni fisiologiche e patologiche del
TSPO nel SNC
La capacità di integrare informazioni da una varietà di fonti esterne ed interne definisce il ruolo del SNC. La principale unità funzionale del SNC è il neurone. I neuroni presentano forti differenze fra loro, nel ruolo funzionale, nelle interconnessioni o nei neurotrasmettitori usati. Poiché i neuroni del SNC sono cellule differenziate, essi non vanno incontro a risposte proliferative in seguito a lesione e questo fa si che la distruzione anche di un piccolo numero di essi possa provocare deficit neurologici clinici anche gravi. Il processo infiammatorio rappresenta una risposta fisiologica dell’organismo ad uno o più danni a livello tissutale; esso dà luogo ad una cascata di eventi antiinfiammatori che consistono in una serie di reazioni chimiche e cellulari, di cui sono protagoniste, ad esempio, le citochine. Tutti gli eventi della cascata infiammatoria portano, generalmente, alla formazione di una cicatrice della parte lesa, che risulta così isolata dal tessuto circostante sano. La degenerazione neuronale può essere il risultato di lesioni cellulari acute o progressive oppure di morte cellulare programmata. Tra le affezioni neurologiche di maggior rilievo troviamo: malattie cerebrovascolari (ipossia, ischemia, infarto), infezioni, malattie demielinizzanti, tumori e malattie degenerative. Alcune malattie del SNC sono caratterizzate da depositi neuronali intracitoplasmatici come gli ammassi neurofibrillari della malattia di Alzheimer e i corpi di Lewig nella malattia di Parkinson. Le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da una progressiva e irreversibile perdita di neuroni in specifiche regioni del cervello. La gliosi rappresenta l’indicatore patologico e istologico più importante di danno al SNC: gli astrociti reagiscono alla lesione mediante
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ipertrofia e iperplasia; la microglia si ritrova sottoforma di aggregati intorno a zone di neuroni in degenerazione. La presenza di TSPO nella microglia, monociti, linfociti, leucociti implica il suo coinvolgimento nella risposta immunitaria. Il TSPO è coinvolto nella regolazione del metabolismo ossidativo fagocitario, un processo che è normalmente richiesto per indurre eliminazione di antigeni estranei. Nel SNC il TSPO è minimamente espresso sulle cellule della microglia. Tuttavia, dopo l'iniezione di composti tossici, si verifica un aumento dose-dipendente del livello di TSPO, una up-regolazione che è correlata strettamente con attivazione della microglia. I meccanismi infiammatori avviati da queste cellule portano a implicazione nei meccanismi primari e secondari di malattie infiammatorie neurodegenerative, per cui l'attivazione di microglia avvia una risposta infiammatoria che può aggravare i danni neuronali. (Versijpt et al.2003)
L'infiammazione che si verifica nel cervello durante tali malattie neurodegenerative coinvolge TSPO e l’uso di suoi specifici ligandi può far prevenire o limitare la neuroinfiammazione. In risposta a lesioni cerebrali, le cellule microglia migrano verso il sito del danno e proliferano per contenere e regolare eventuali danni. Le cellule microgliali rispondono anche a qualsiasi evento patologico che influenza direttamente o indirettamente il SNC, attraverso la produzione e il rilascio di potenti citochine neuroinfiammatorie come TNF-alfa e interleuchina-1beta, dei derivati dell'acido arachidonico come cicloossigenasi-2, di aminoacidi eccitatori, e ROS. (Banati et al.1993) Con l'utilizzo di TSPO come marker
per le cellule della microglia attivate, è possibile determinare quale ruolo la neuroinfiammazione gioca in specifici stati di malattia del sistema nervoso centrale, aprendo la strada per il trattamento o l'inibizione della progressione della malattia.
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4.1 Ligandi al TSPO: attività farmacologiche nella
Neuroinfiammazione
PK11195: Le azioni antiinfiammatorie di PK11195 sono state studiate in
microglia umana. E’ stato osservato che PK11195 riduce la microgliosi e la proliferazione della microglia nell’ippocampo di ratti maschi che avevano ricevuto un infusione intracerebroventricolare dell’ agente infiammatorio lipopolisaccaride (LPS). (Veiga et al.2005) Il trattamento di cellule microgliali mediante
LPS (100 ng/mL per 3 ore) ha indotto l’espressione dell'enzima inducibile, cicloossigenasi-2 (COX-2) e della citochina pro-infiammatoria, fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α). PK11195 (50 μM) ha inibito in modo significativo
l'up-regolazione indotta da LPS di entrambi i fattori infiammatori; a una concentrazione inferiore di PK11195 (2 μM) ha inibito l’espressione di TNF-α, ma non di COX-2. L'applicazione acuta di LPS ha indotto un aumento transitorio di Ca2+ intracellulare. Questo aumento di [Ca2+]i consisteva di una componente
principale di afflusso di Ca2+ accompagnato da una minore mobilitazione da depositi di Ca2+ intracellulari. In presenza di PK11195, l'ampiezza della risposta [Ca2+]i indotta da LPS è stata ridotta del 54%. Un altro agente mitocondriale
ciclosporina A, che agisce sul poro di transizione di permeabilità della membrana mitocondriale ma in un sito diverso dal TSPO, era inefficace sulla riduzione dell'espressione LPS-indotta di COX-2 e TNF-α o sull'aumento di [Ca2+]i. Questi
risultati indicano che PK11195 è un agente specifico ed efficace per inibire le espressioni microgliali LPS-indotte di COX-2 e TNF-α e che la modulazione di vie di segnalamento Ca2+-mediate potrebbe essere coinvolta nelle azioni antiinfiammatorie. (Choi et al.2002.)
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In un modello di neuroinfiammazione indotta da LPS in cellule della microglia PK11195 ha inibito il rilascio di IL-6 e di NO. (Wilms et al.2003)
Ro5-4864: in un modello in vivo di neuro infiammazione (somministrazione
sistemica di acido kainico in ratti maschi) la sommistrazione di Ro5-4864 ha ridotto la perdita neuronale, astrogliosi e microgliosi (Veiga et al.2005).
L’effetto farmacologico di Ro5-4864 è stato investigato anche in un modello di neuroinfiammazione in vitro (cellule della microglia BV-2 di topo) e in un modello in vivo (iniezione stereotassica di tossina a livello della substantia nigra). Ro5-4864 attenuava l’attivazione del fattore nucleare kappa B (NF-kB) e diminuiva la produzione di citochine pro-infiammatorie. (Bae et al.2014)
E’ stato documentato che Ro5-4864 sopprime fortemente l’attivazione ATP-indotta dell’infiammasome NLRP3 in cellule THP1 e BMDM. L’inflammasone è un complesso multiproteico che consiste di “Nod-like receptor family, pyrin domain containing 3 (NLRP3), “apoptosis-associated speck-like protein”, caspase-1, e che regola positivamente la processazione di interleukin (IL)-1β e IL-18. Ro5-4864 attenuava in maniera efficiente la traslocazione di NLRP3 ai mitocondri, l’assemblaggio/oligomerizzazione dell’inflammasone, attivazione di caspasi-1, e la successiva secrezione delle forme mature di interleuchina-1β e -18. Ro5-4864 riduceva anche la produzione di superossido mitocondriale e preservava il potenziale di membrane mitocondriale in cellule ATP-trattate, suggerendo che Ro5-4864 può agire sul mitocondrio o a target mitocondriali più a monte nel signaling dell’inflammasome NLRP3. (Lee et al.2016)
PIGAs: derivati PIGAs sono stati testati per le loro potenziali attività
antiinfiammatorie a livello centrale, utilizzando un modello in vitro ben validato di neuroinfiammazione. Cellule C6 coltivate in condizioni serum-free sono state trattate con agenti pro-infiammatori (LPS/IFNγ o l-butionina(S, R)-sulfoximina-
