7 enzimi.ppt — Agraria

Gli enzimi accelerano le reazioni

anche di un milione di volte.

Se non ci fossero gli enzimi la

maggior parte delle reazioni dei

sistemi biologici procederebbe a

velocità non apprezzabili

ENZIMI

Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di agire indipendentemente da esse

Determinano tutti i processi di degradazione,

sintesi, trasformazione e conservazione

dell’energia nella formazione ed evoluzione della

materia vivente.  

Sono PROTEINE spesso associate ad un metallo o

• Gli enzimi sono altamente

specifici sia nei riguardi della

reazione catalizzata sia nei

• Esiste in vasto repertorio chimico dei

gruppi funzionali degli aa. Tuttavia essi

spesso non riescono a soddisfare i

fabbisogni chimici della catalisi.

• L’attività catalitica di molti enzimi dipende

dalla presenza di piccole molecole,

chiamate

cofattori

, il cui ruolo può essere

diverso da enzima ad enzima

• La proteina enzimatica senza il suo

cofattore è detto

apoenzima

, mentre la sua

forma completa e cataliticamente attiva è

detta

oloenzima

.

• I cofattori possono essere suddivisi in due

gruppi:

• piccole molecole organiche dette

coenzimi

Il ΔG è utile per comprendere il

funzionamento degli enzimi

• L’energia libera (G) è una funzione

termodinamica che rappresenta una misura

dell’energia utile, cioè dell’energia in grado

di compiere un lavoro

• Il ΔG non fornisce informazioni sulla

velocità di reazione.

• ΔG < 0 non significa che la reazione

avviene ad una velocità apprezzabile

• Gli enzimi aumentano la velocità ma non

CATALISI

⇓

legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui natura e disposizione residua individua una tasca detta SITO

ATTIVO. E’ fondamentale la conformazione nativa

della proteina per la sua funzione catalitica.

DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA

La formazione del complesso

enzima-substrato è la prima tappa nella catalisi

enzimatica

• Il potere catalitico degli enzimi deriva dalla

loro capacità di avvicinare i substrati con un

orientamento favorevole e promuovere la

formazione di stati di transizione

• Gli enzimi formano il complesso

enzima-substrato (ES) in una specifica regione detta

sito attivo

Il sito attivo di un enzima è la regione a cui si

lega il substrato

E’ costituito da una tasca o fenditura

tridimensionale formata da gruppi che derivano

da parti diverse della sequenza amminoacidica

della proteina

Quasi tutti gli enzimi sono costituiti da più di

100 aa

Il sito attivo occupa una parte relativamente

piccola del volume totale di un enzima

Un enzima complementare al suo

substrato potrebbe essere un

cattivo enzima.

Per poter catalizzare una reazione,

un enzima deve essere

complementare allo stato di

transizione della reazione

CATALISI OMOGENEA sub. e cat. nella stessa fase CATALISI ETEROGENEA sub. e cat. in fasi diverse Incremento di velocità 108-1020 volte con eventuale fondamentale intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi).

Struttura tridimenzionale dell’E fondamentale per la

conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di reazione.

SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni

dell’enzima).

Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da

enzima.

PM enzimi = da 12000 a 106

Molecola su cui opera l’enzima = substrato

DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO

Apoenzima(denaturato con cal.)

+

cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento)

⇓

Enzima completo (oleoenzima)

Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere

ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole

organiche (coenzimi) che possono essere:



legati debolmente alla proteina

ATP

⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato

modificato nella reazione e dissociato)

NAD

e NADP

⇒ coenzimi nucleotidici piridinici

associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di

un H

da un substrato al nucleotide portandolo nella

forma ridotta con rilascio di H

Coenzima A ⇒ coenzima derivato dall’acido pantotenico

è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici CH

CO-Altri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A,

D, E e K.

Idrolizzano il legame peptitico e glicosidico

Enzimi identificati da 4 numeri:

1. Appartenenti a una delle classi relative alla

reazione catalizzata

2. Appartenenza ad una sottoclasse

3. Appartenenza ad una sottosottoclasse

Esempio

ATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfato

Catalizzatore esochinasi (nome comune) o

ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il

trasferimento del P da ATP a glucosio).

Numero dell’enzima 2.7.1.1.

2. classe delle transferasi

7. sottoclasse fosfotransferasi

1.   sottosottoclasse fosfotransferasi con OH

come gruppo accettore

1.glucosio come accettore del gruppo

fosforico.

Enzima Chirale riesce a distinguere tra gruppi della

molecola stericamente non equivalenti.

Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi

stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici)

SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI Un enzima può avere diversi gradi di specificità:

Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa specificità)

Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di gruppo)

Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che le unisce (specificità assoluta).

Es.

A-B + H

O = AOH + BH

•la natura di A e B non è importante

•A o B devono essere determinate

•A e B devono essere del tipo appropriato.

Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa

può operare sugli -glucosidi cioè sul glucosio

legato con legame -glucosidico ad un altro

Meccanismo reazione enzimatica

Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica del complesso attivato e/o + corretto orientamento

geometrico per la formazione del complesso attivato

E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati (specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono

gruppi funzionali che: •Reagiscono temporaneamente con S

I gruppi catalitici di E interagendo con S lo

preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea.

Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la

cui energia di legame serve per:

ridurre l’entropia (avvicinamento e orientamento

substrato)

desolvatare il substrato

indurre binding produttivo o adattamento indotto

Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi

e la specificità.

DIVERSI TIPI DI CATALISI

Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene

laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula)

Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato

La velocità iniziale di una reazione aumenta quasi linearmente all'aumentare della concentrazione di substrato.

La velocità è direttamente

proporzionale alla concentrazione del substrato e la reazione è di primo ordine V = k [S]

[S] Vo

La proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce.

La velocità iniziale diventa indipendente dalla [substrato] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato.

V_max

[S] V

Il complesso ES è la chiave per comprendere la cinetica enzimatica E + S ES ES K1 K-1 K2 K-2 E +P

La seconda reazione è più lenta e quindi limita la velocità globale.

In qualsiasi istante l’enzima è presente nella forma libera e in quella combinata. Quando la [S] è bassa, l’enzima sarà per lo più nella forma libera. Quindi via via che [S] tende ad aumentare viene favorita la formazione di ES.

• La velocità iniziale massima della reazione

(Vmax) si osserva quando tutto l’enzima è

presente sotto forma di complesso ES.

• Questa condizione, però, esiste solo quando

[S] è elevata. L’effetto saturante del

substrato è una proprietà caratteristica degli

enzimi responsabile dell’appiattimento della

curva.

• E +S ES E +P

• La velocità di catalisi Vo, definita come

moli di prodotto formate al secondo, viene

determinata dalla demolizione di ES per

dare origine a P, quindi

• Vo = K2[ES]

K1 K-1

Equazione di Michaelis-Menten

dove:

costante di Michaelis-Menten Quando Vo= 1/2Vmax

= Alla fine Vo = Vmax [S] Km + S Vmax [S] Km + S Vmax 2

Dividendo per Vmax si ha: 1

2 =

[S] Km +[S]

Risolvendo per Km abbiamo Km+[S] = 2S Oppure Km=[S] quando Vo=1/2 Vmax

Quindi Km è equivalente alla concentrazione del substrato a cui Vo è metà della Vmax

Vmax e Km possono variare considerevolmente passando da un enzima all’altro. Sono parametri calcolabili

Significato delle costanti cinetiche

• Lo studio della cinetica enzimatica è importante

per vari motivi:

1) Aiutano a comprendere come lavorano gli enzimi

2) Aiutano a comprendere come lavorano in vivo: le

costanti cinetiche Km e Vmax, sono di estrema

importanza per capire come gli enzimi si

coordinano tra loro a livello metabolico

3) Permettono confronti tra organi e tra specie

V_max [S] V

Cinetica Enzimatica

La costante di Michaelis (K

)

k_M k_M

k

k

k

k

k

_M

affinità

K_M = K₂ +K_-1 /K₁

K₂ è la costante che limita la velocità (stadio lento) per cui è >> di K_-1 che è la costante di dissociazione del complesso ES

Quindi la K_M è la concentrazione del substrato alla quale la metà dei siti per il substrato sono saturati. Quindi K_M fornisce una misura della conc di

K

e V

sono importanti

caratteristiche degli enzimi

• Per la maggior parte degli enzimi K

varia

da 10

a 10

Effetti della concentrazione dell’enzima

Vmax è direttamente proporzionale alla [E] Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]

• La V

esprime il numero di turnover degli

enzimi, cioè il numero di molecole di

substrato convertite in prodotto da una

molecola enzimatica nell’unità di tempo

quando l’enzima è totalmente saturato dal

substrato

la quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto

Unità Internazionale

il numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è saturata con il substrato.

• Il numero di turnover dipende da k

che è

detta anche k

. Se è nota la conc totale di

siti attivi [E]

, allora

• V

= k

[E]

quindi

• K

= V

/ [E]

V

= k

[E

]

k

= k

k_cat

k

k

k

k

k

_cat

efficienza

catalitica

E + S ES

E + P

k_-1

Enzima

k

catalasi

40 000 000

anidrasi carbonica

1 000 000

acetilcolinesterasi

14 000

lattato deidrogenasi

1 000

chimotripsina

100

DNA polimerasi

15

lisozima

0,5

Il rapporto K

/K

è una misura

dell’efficienza catalitica

• Quando la conc del substrato è molto più

elevata di K

la velocità della reazione

catalizzata è uguale a V

• Però dentro la cellula la maggior parte degli

enzimi non sono saturati dal substrato

• Riportando l'equazione di Michaelis-Menten nella forma

è possibile ottenere il grafico dei doppi reciproci (o di Lineweaver-Burk), rappresentando graficamente

l'andamento di 1/V in funzione di 1/[S]. In tal modo si ottiene una retta con intercetta sull'asse delle ascisse nel punto - 1/KM, sull'asse delle ordinate nel punto 1/Vmax e con coefficiente angolare pari al rapporto KM/Vmax.

















[S]

1

V

K

V

1

V

1

Che cosa influenza la velocità della reazione?

La velocità aumenta all’aumentare di T, ma nella catalisi enzimatica un aumento di T può portare ad una variazione di conformazione con perdita

conseguente dell’attività catalitica. Di solito si ha un max di attività tra 40°C e 60°C e la denaturazione completa a 90-95 °C.

Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: •si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima

•si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES

•si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S •si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES Gli effetti 2 e 3 influenzano la K_M il 4 la Vmax.

Influenza della temperatura

Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di Arrhenius

K=A e-Ea/RT

dalla cui linearizzazione si possono calcolare:

Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate)

Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità quando T aumenta di 10°C.

Reazioni non catalizzate Q₁₀= 2 Reazioni catalizzate 1<Q₁₀< 2

Influenza del pH

Andamento variabile con uno o più massimi di attività a

diversi pH. A pH estremi:

•si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima

•si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame

ES

•si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone

l’affinità per S

•si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del

complesso ES

Fattori che influenzano la velocità di

reazione

• Temperatura

• pH

• Concentrazione dell’enzima

• Concentrazione del substrato

• Nel caso di enzimi allosterici anche la

[S]

Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che:

•A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente con l’aumentare di [S].

•Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più piccoli (iperbole rettangolare).

•L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,V_max •La concentrazione di substrato che produce una V che è la

La maggior parte delle reazioni

chimiche ha più substrati

Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti affinchè si abbia la liberazione di prodotti

Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano stati legati.

S₁ per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo substrato S₂ formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma originaria.

SISTEMI MULTIENZIMATICI

Reagiscono in una serie consecutiva di

reazioni in cui P diventa S della reazione

successiva (azione concertata da 2 a 20 E di

reazioni in sequenza).

INIBIZIONE ENZIMATICA

Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazione

L’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami:

Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si ripristina l’attività di E

Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I.

Inibitori enzimatici (piccole molecole o ioni)

Reversibili

Irreversibili

INIBIZIONE REVERSIBILE

Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia K_M non cambia Vmax Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal sito attivo.

Si abbassa la Vmax ma non si modifica la K_M

Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES. E + S  ES  E+P; ES+I  ESI

Inibizione Competitiva

Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo. I è spesso simile al substrato e si lega al sito attivo dell’enzima

impedendo al substrato di legarsi

Un inibitore competitivo diminuisce la velocità della reazione perché riduce la frazione di molecole enzimatiche legate al substrato

Un inibitore competitivo ridurrà l'affinità enzima substrato, cioè aumenterà il valore di K_M.

Si può rimuovere aumentando [S]. Ad alte concentrazioni di substrato la reazione non viene rallentata e Vmax è sempre la stessa.

Alcuni inibitori competitivi sono farmaci molto utili. La sulfanilammide è un antibiotico contenente S

strutturalmente identico all’acido p-amminobenzoico (PABA) un metabolita richiesto dai batteri per la sintesi dell’acido folico. La sulfanilammide si lega all’enzima che

sintetizza la PABA e lo inibisce in modo competitivo inibendo la sintesi di acido folico.

Altri inibitori competitivi sono le statine che inibiscono la sintesi del colesterolo

Inibizione non competitiva: inibitore e substrato si

legano

simultaneamente in siti diversi dell’enzima

Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione

Gli inibitori non competitivi agiscono diminuendo il numero di turnover ma non agiscono sulla proporzione di molecole che legano il substrato

I 

Il substrato può ancora legarsi al complesso EI oltre che all’enzima da solo. In ogni caso il complesso ESI non procede verso la formazione dei prodotti

Inibizione incompetitiva: l’inibitore si lega

solo al complesso ES

Il complesso ESI non procede verso la formazione di alcun prodotto.

Il substrato non viene più convertito in prodotto.

L’inibizione incompetitiva non può essere rimossa da un eccesso di substrato

Inibizione non competitiva

Inibitori irreversibili

• Alcuni inibitori irreversibili sono farmaci importanti. La penicillina agisce modificando covalentemente l’enzima transpeptidasi e in questo modo la sintesi della parete batterica viene bloccata e i batteri tendono a morire.

• L’aspirina agisce modificando covalentemente l’enzima cicloossigenasi riducendo la sintesi dei segnali

Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un

gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività

catalitica.

Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo

che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica

normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di

reazione diventando composti molto reattivi che si legano

irreversibilmente all’enzima.

specificità

reazioni

substrati

regolazione

modulazione dell’attività

quantità di proteina enzimatica

ENZIMI REGOLATORI

• Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la

attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei

metabolismi possono lavorare insieme in modo

sequenziale, ma almeno uno determina la velocità

complessiva catalizzando la reazione più lenta

(enzima regolatore).

• In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni

sequenza è un enzima regolatore.

Vi sono due classi di enzimi regolatori:

Enzimi allosterici che agiscono mediante il

legame reversibile di un metabolita

chiamato modulatore

• Enzimi regolati mediante modificazioni

covalenti reversibili

• Queste due classi di enzimi sono proteine a

struttura quaternaria che spesso non hanno

sulla stessa subunità sito attivo e sito

regolatore.

• Quando il substrato si comporta da

modulatore l’enzima è detto omotropico

Gli E regolatori non seguono il modello di Michaelis e Menten con andamento a sigmoide invece che iperbolico della curva Vo –[S] dovuto a interazioni cooperative tra le subunità dell’E.

ENZIMI NEL TERRENO

Sono prevalentemente liberi ed extracellulari e possono rimanere stabili ed attivi per migliaia di anni.

Nel suolo esiste attività catalitica inorganica ed enzimatica, ma quest’ultima è molto più efficiente e eliminabile con trattamenti termici energici (110-150 °C per 15-30 h per una distruzione totale)

Nel suolo 4 classi di E: •Ossidoreduttasi

•Idrolasi •Liasi

•Transferasi

La prime due sono predominanti

Polisaccaridasi e proteinasi (idrolasi) demoliscono macromolecole come carboidrati e proteine e sono essenziali per i cicli biologici di C e N.

Fosfatasi e solfatasi (idrolasi extracellulari) producono P e S nutrienti per le piante. Altre idrolasi demoliscono fitofarmaci e xenobiotici.

Deidrogenasi (ossidoreduttasi intracellulari) danno informazioni sull’attività biologica delle popolazioni microbiche.