I
RIASSUNTO
La farmacodinamica e la farmacocinetica degli oppioidi sono sotto controllo di molti geni polimorfici che possono in parte spiegare la variabilità individuale che si osserva nella risposta alla morfina nel trattamento del dolore cronico.
In questo lavoro di tesi sono stati presi in esame 145 pazienti, di origine italiana, con diagnosi di dolore nocicettivo cronico associato sia a patologie tumorali che a varie forme di artrosi. Per questo sono sottoposti al trattamento con morfina e monitorati attraverso visite periodiche allo scopo di valutare la risposta alla cura e la relativa variazione della percezione dolorifica. I pazienti sono stati raccolti dalla Sezione Autonoma di Terapia Antalgica dell’Ospedale Santa Chiara di Pisa.
Partendo da campioni di sangue, tramite l’estrazione di DNA, è stato possibile attraverso le tecniche di indagine di biologia molecolare quali la PCR Multiplex e la PCR TaqMan Real-Time, analizzare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in geni chiave coinvolti nella farmacogenetica della morfina. Quali: il gene opioid µ receptor
(OPRM1) che codifica per il principale recettore degli oppioidi, il gene ATP-Binding
Cassette/multiple drug resistance 1 (ABCB1/MDR1), che codifica per un trasportatore con una vasta molteplicità di substrato, il gene Catecolo-O-metiltransferasi (COMT) che modifica l’attività recettoriale di OPRM1 e sembra influenzare la soglia di percezione individuale del dolore ed, infine, i geni Glutatatione S-transferasi T1 (GSTT1), Glutatione S-transferasi M1 (GSTM1) che codificano per enzimi di fase II. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare, tramite analisi statistica multivariata, l’associazione che esiste tra il genotipo dei pazienti presi in esame e la diminuzione del dolore.
Da questo lavoro è emerso che esiste una significativa associazione (p<0.0001) tra la variabilità genetica nei geni ABCB1 e OPRM1 e la risposta al dolore.
II
In particolare, è risultato che i pazienti che hanno una pompa di efflusso funzionante (omozigoti wilde-type C/C per lo SNP C3435T di ABCB1) e un recettore per la morfina difettoso (omozigoti G/G per lo SNP A118G del gene OPRM1) risultano essere i peggiori rispondenti al trattamento analgesico. Invece i pazienti con una pompa di efflusso inefficiente (omozigoti T/T per ABCB1) e un recettore funzionante (omozigoti wild-type A/A per OPRM1) sembrano essere i migliori rispondenti al trattamento. Per gli altri geni presi in esame non sono state trovate associazioni significative.
III
ABSTRACT
The pharmacokinetic and pharmacodynamic of oppioid is under the control of several polymorphic genes which can account for part of the observed interindividual variation in morphine response, in the treatment of cronic pain
In this study we examined 145 Italian patients of Caucasian origin, with chronic nociceptive pain, causated by cancer and arthrosics pathologies, undergoing, morphine based, pain relief therapy . They were recruited by the Analgesic Therapy Division of S. Chiara Hospital of Pisa and were monitored through periodic visits to the purpose of appraise the response at the therapy and the relating varation in pain perception.
From whole blood samples, with DNA extraction, it make it possible, by PCR Multiplex and PCR Taqman Real-Time, to analyze the SNPs in several key genes involved in the pharmacogenetics of morphine. Among which : the opioid µ receptor
gene (OPRM1) , which encodes for the main oppioid receptor, the ATP-Binding
Cassette/multiple drug resistance 1 gene (ABCB1/MDR1), which encodes for a transporter whith a vast multiplicity of substrates, the Catecolo-O-metiltransferase gene (COMT) which change the receptorial activity of OPRM1 and seems to influence the individual threshold of perception of pain and, finally, the Glutatathione S-transferase
T1 (GSTT1) and Glutathione S-transferase M1 (GSTM1) genes which encode for Phase II enzymes.
The aim of this study was to assess, by the multivariate analysis of variance, the association between the patient’s genotype and the pain relief.
From this work appears that there is a significantly association (p<0.0001) between the genetic variability in the ABCB1 and OPRM1 genes and the pain’s response.
Particularly it results that patients having both good functionality of efflux pump (ABCB1 homozygous C/C) and a defective morphine receptor (OPRM1 homozygous
IV
G/G) would have been the worst responders to pain relief treatment. Meanwhile, patients with ineffective efflux pump (ABCB1 homozygous T/T) and a functional receptor (OPRM1 homozygous A/A) are expected to be the best responders.
V
INDICE
Capitolo 1
INTRODUZIONE……….……. 1
1.1 Percezione del dolore……….. ………1
1.2 Fisiologia del dolore………2
1.3 Dolore e analgesia………4
1.4 Farmacogenetica del dolore………6
1.5 Metabolismo degli oppioidi………7
1.6 Enzimi di fase II……….10
1.7 Recettori………...13
Capitolo 2
SCOPO DELLA TESI………..15
Capitolo 3
MATERIALI E METODI………17
3.1 Popolazione di studio………17
3.2 Valutazione psicofisica………..17
3.3 Valutazione clinica………18
3.4 Separazione del plasma e dei linfociti da sangue intero……20
VI
3.6 Estrazione di DNA……….21
3.7 Quantificazione del DNA………..23
3.8 Genotipizzazione………25
3.8.1 Protocollo per la PCR 003………...25
3.8.2 Preparazione mix PCR 003 Hotfire………....26
3.8.3 Protocollo di amplificazione………27
3.8.4 Preparazione del gel di agarosio……….28
3.8.5 Corsa elettroforetica………28
3.8.6 Interpretazione dei risultati………28
3.8.7 TaqMan real time PCR...29
Capitolo 4
RISULTATI………...34
4.1 Caratteristiche e genotipi dei soggetti analizzati………34
4.2 Analisi dei risultati………38
4.2.1 ABCB1………...43
4.2.2 OPRM1………..44
4.2.3 GSTT1………...45
4.2.4 Distribuzione dei residui………..46
4.2.5 Interazione tra i polimorfismi dei geni OPRM1
ed ABCB1………..46
VII
