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COMPOSTI DI ORIGINE NATURALE INIBITORI DEL COMPLESSO DELL’INFLAMMOSOMA COME NUOVO POSSIBILE APPROCCIO TERAPEUTICO NEL TRATTAMENTO DEI DISORDINI METABOLICI

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DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in Farmacia

TESI DI LAUREA

“COMPOSTI DI ORIGINE NATURALE INIBITORI DEL COMPLESSO DELL’INFLAMMOSOMA COME NUOVO POSSIBILE APPROCCIO TERAPEUTICO NEL TRATTAMENTO DEI DISORDINI METABOLICI”

Relatrice: Candidata:

Dott.ssa Carolina Pellegrini Carolina Longone

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“There’s only now, there's only here

Give in to love or live in fear

No other path, No other way

No day but today”

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Indice

Introduzione ……… 2

Capitolo 1: L’inflammosoma ………..………. 3

1.1 L’inflammosoma NLRP3………. 4

Capitolo 2: Meccanismi di attivazione dell’inflammosoma NLRP3 …….. 6

2.1 Attivazione canonica dell’inflammosoma NLRP3……….. 6

2.2 Attivazione non canonica dell’inflammosoma NLRP3 ……….. 9

2.3 Attivazione non canonica dell’inflammosoma NLRP3 mediata da Caspase-8 ………11

Capitolo 3: Ruolo dell’inflammosoma NLRP3 nei disordini metabolici …16 3.1 Obesità ……….16

3.2 Diabete di tipo 2 ………..17

3.3 Diabete gestazionale ………23

3.3.1 Fisiopatologia del GDM ……….. 26

3.3.2 Fattori di rischio per il GDM ………27

3.3.3 NLRP3 come target contro il GDM ……….28

3.4 Comorbidità ………29

3.4.1 Comorbidità correlate all’obesità ……….29

3.4.2 Comorbidità correlate al diabete.………..32

3.4.3 Comorbidità correlate gestazionale ………..36

Capitolo 4: Effetti di composti di origine naturale nei disordini metabolici e comorbidità correlate ………39

4.1 Elenco dei composti di origine naturale che inibisco l’inflammosoma………39

4.2 Evidenze sperimentali ………46

4.2.1 Obesità e diabete di tipo 2 ………46

4.2.2 Diabete Gestazionale.………54

Capitolo 5: Conclusioni..……….61

Bibliografia..………..66

(4)

Introduzione

I disturbi metabolici, quali l’obesità, il diabete di tipo 2 e il diabete gestazionale sono spesso associati a fenomeni infiammatori [1]. In questo contesto, il complesso multiproteico dell’inflammosoma, in particolare il sottotipo NLRP3, è direttamente coinvolto nel promuovere le risposte infiammatorie associate ai disordini metabolici [1].

L’inflammosoma NLRP3 è un complesso multiproteico che in seguito a stimoli infiammatori, infettivi o ossidativi si attiva promuovendo la maturazione della caspasi-1 che a sua volta promuove la conversione di pro-IL-1β e pro-IL-18 in IL-1β e IL-18 mature, contribuendo così alla risposta infiammatoria

Vi sono prove crescenti sia cliniche che pre-cliniche che mostrano la rilevanza sia dell’inflammosoma NLRP3 nella fisiopatologia di vari disturbi metabolici (quali obesità, diabete di tipo 2 e diabete di tipo gestazionale). Infatti, una serie di studi hanno mostrato che l’inibizione dell'inflammosoma NLRP3, sia con composti naturali che di sintesi, contrastava l’infiammazione e migliorava i parametri metabolici in modelli di obesità e di diabete, suggerendo che il blocco di NLRP3 potrebbe rappresentare un promettente bersaglio molecolare per il trattamento delle malattie metaboliche [2].

Su queste basi, il presente elaborato ha lo scopo di fornire una panoramica completa delle evidenze cliniche e sperimentali attualmente disponibili sul ruolo dell'inflammosoma NLRP3 nella fisiopatologia dei disordini metabolici, quali

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obesità, diabete di tipo 2 e diabete gestazionale. Particolare attenzione è stata rivolta alle attuali evidenze scientifiche sugli effetti di composti di origine naturale in grado di inibire l’inflammosoma NLRP3 e contrastare le alterazioni metaboliche .

Capitolo 1: L’inflammosoma

La reazione infiammatoria si attiva per azione di agenti nocivi di varia natura ed in presenza di dismetabolismi, grazie ad una serie di sensori a cui è stato dato il nome complessivo di inflammosomi.

Gli inflammosomi sono complessi multiproteici intracellulari, che si assemblano in risposta ad agenti patogeni denominati pathogen associated molecular

patterns (PAMPs), o in seguito ad un danno cellulare o tissutale di varia natura

denominato danger associated molecular patterns (DAMPs).

In particolare, in seguito ad agenti biologici, fisici, chimici, metabolici, quali deposizione di cristalli di acido urico, di colesterolo nell’arteriosclerosi, di acidi grassi liberi e lipidi nell’obesità, elevati livelli di specie reattive all’ossigeno (ROS) e riduzione della concentrazione citosolica di ioni potassio possono indurre l’attivazione dell’inflammosoma.

In seguito alla loro attivazione, gli inflammosomi inducono l’attivazione della caspasi-1,-11, e/o -8 che, a loro volta, attivano le citochine interleuchina-1-β

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(IL-1β) e interleuchina-18 (IL-18) che innescano una risposta infiammatoria. Inoltre Caspasi-1,- 11, attivandosi, possono anche indurre una forma di morte cellulare denominata piroptosi. [4]

1.1 L’inflammosoma NLRP3

L’inflammosoma attualmente più caratterizzato è il sottotipo Nod-like receptor

protein 3 (NLRP3). Questo viene attivato in risposta a numerosi segnali e gioca

un ruolo importante nelle risposte infiammatorie associate a disordini metabolici (obesità, diabete di tipo 2 e diabete gestazionale). [5]

NLRP3 appartiene alla famiglia dei recettori Pattern recognition receptors (PRRs) dell’immunità innata, che sono capaci di rilevare segnali provenienti da invaders cellulari. PRRs sono espressi in molte cellule immunitarie come macrofagi tissutali, cellule dendritiche, cellule epiteliali, neutrofili e cellule dell’immunità adattativa.

NLRP3 è una proteina tripartita costituita da: 1. un dominio pirinico ammino-terminale (PYD)

2. un dominio centrale di legame nucleotidico (NACHT) con attività ATP-asica

(7)

Il dominio pirinico di NLRP3 interagisce con il dominio pirinico di ASC per iniziare l'assemblaggio dell'inflammasoma [10].

Il dominio NOD presenta attività ATPasica che è richiesta per l'oligomerizzazione di NLRP3 dopo l'attivazione [11]. Questa attività ATPasica è stata recentemente implicata come obiettivo di MCC950, che è un inibitore NLRP3 comunemente usato [12].

L’inflammosoma NLRP3 è costituito da un sensore proteico intracellulare

Nod-Like Receptor (NLR), dalla procaspasi-1 e dall’adattatore molecolare ASC

“adaptor apoptosis associated speck-like protein containing a Caspase

recruitment Domain (CARD)”.

L’inflammosoma NLRP3 regola l’attivazione di caspasi-1 e induce una risposta infiammatoria sistemica mediante le potenti citochine pro-infiammatorie IL-1β e IL-18, in risposta a PAMPs e DAMPs.

Il processo si realizza per:

- incremento dei ROS in seguito a disfunzione mitocondriale

- riduzione delle concentrazioni di potassio (K) intracellulare per efflusso all’esterno della cellula

- rilascio a livello citoplasmatico di catepsine lisosomiali (catepsina B) - attivazione del fattore di trascrizione NF-kB.

(8)

L’attivazione di caspasi-1 è in grado di determinare la morte cellulare infiammatoria, nota come piroptosi. Essa può manifestarsi in presenza di stimoli infiammatori molto forti, che determinano la formazione di pori sulla membrana cellulare e la morte cellulare per lisi osmotica come accade nelle infezioni da patogeni intracellulari. [7]

Capitolo 2: Meccanismi di attivazione dell’inflammosoma

NLRP3

Attualmente esistono due modalità di attivazione dell’inflammosoma NLRP3: l’attivazione canonica e l’attivazione non-canonica.

2.1 L’attivazione canonica dell’inflammosoma NLRP3

L’attivazione canonica dell’inflammosoma NLRP3 richiede due passaggi paralleli e indipendenti: l’innesco (trascrizione) e l’attivazione (oligomerizzazione). [14]

Nella trascrizione le molecole di segnalazione MyD88 e TRIF e/o i recettori per le citochine, in risposta ai ligandi dei recettori toll like receptors, dell’immunità innata (TLR), promuovono la trascrizione della pro IL-1β e NLRP3 attraverso l’attivazione del fattore nucleare (NF-kB) [15]. La stimolazione del recettore toll like di tipo 4 (TLR4) da parte di PAMPs e/o DAMPs può attivare anche il

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complesso proteico receptor-interacting protein 1 (RIP1) - FAS-associated death

domain protein (FADD) - caspasi-8, che, a sua volta, promuove la trascrizione di

NF-kB. Il secondo passaggio è rappresentato dall’oligomerizzazione dell'inflammosoma NLRP3 che porta all'attivazione della caspasi-1 e, a sua volta, all'elaborazione e al rilascio di IL-1β e IL-18. [16]

Indipendentemente dalla maturazione dell'IL-1β, l'attivazione della caspasi-1 promuove la piroptosi e induce la fagocitosi dei batteri sopravvissuti e promuove il rilascio di ulteriori proteine citosoliche, come high-mobility group box 1 (HMGB1), un mediatore proinfiammatorio significativamente coinvolto nella patogenesi di diverse malattie infiammatorie croniche. [19] [20] (Figura 1)

(10)

Diversi stimoli possono dare il via all'oligomerizzazione e all'attivazione canonica dell'inflammasoma NLRP3; tra questi riconosciamo:

- l’RNA virale

- l'inibizione del metabolismo glicolitico o mitocondriale - l'osmolarità extracellulare

- l'accumulo di proteine come α-sinucleina (α-syn) e beta-amiloide (Aβ) - la degradazione dei componenti della matrice extracellulare

- la modifica post-traduzionale della NLRP3 (es: fosforilazione e ubiquitinazione).

- la permeabilizzazione delle membrane cellulari nell’efflusso di potassio; tale efflusso è ottenuto tramite attivazione della proteina Mixed lineage kinase

domain like (MLKL), esposizione al gasdermin D che forma i pori,

attivazione del recettore purinergico P2X7 da adenosina trifosfato extracellulare (ATP) e dal danno lisosomiale e rilascio di catepsine. [17] [18] - rilascio di DNA mitocondriale ossidato

- aumento delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) - esternalizzazione della cardiolipina

(11)

2.2 L’attivazione non-canonica dell’inflammosoma NLRP3

È stato scoperto che un aumento di lipopolisaccaride (LPS) può portare a shock endotossico indipendentemente dalla segnalazione TLR4. Ciò causa un’ attivazione dell’inflammosoma NLRP3 che è detta non canonica e risponde ai batteri Gram - negativi [22].

Il componente di LPS che viene rilevato da queste caspasi è il lipide A penta-acilato, ma non viene rilavato il lipide A tetra-penta-acilato, proprio per questo motivo, alcuni batteri come Francisella possono sopravvivere nel citosol. [22]

L’attivazione non-canonica dell’inflammosoma coinvolge le caspasi-4 e 5 nell’uomo e la caspasi-11 nel topo [23]

È interessante notare che i topi privi dell'espressione genica della caspasi-1 (Casp1 - / - ), ma non dell'espressione genica della caspasi-11, sono più sensibili all'infezione da Salmonella rispetto ai topi privi sia della caspasi-1 che della caspasi-11 [24].

Le caspasi-4/5/11 inducono la piroptosi attraverso l'elaborazione di Gasdermin D (GSDMD) e pannexin-1, canale proteico che rilascia ATP dalla cellula [25, 26]. Questo ATP extracellulare attiva il recettore P2X7 (P2X7R) [27], un canale selettivo cationico ATPasico che apre un poro che a sua volta attiva l' efflusso di K + [28]. Il fosfolipide ossidato 1-palmitoil-2-arachidonoil-sn-glicerero-3-fosforilcolina (oxPAPC) inibisce la piroptosi indotta da LPS attraverso

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l’attivazione non canonica legandosi direttamente a caspase-4 o caspase-11 nei macrofagi, dove compete con la proteina legante LPS [29].

In questo contesto, nella prima fase della trascrizione, i batteri gram-negativi (quali Citrobacter rodentium , Escherichia coli , Legionella pneumophila ,

Salmonella typhimurium e Vibrio cholerae) attivano i percorsi TLR4-MyD88 e

toll/IL-1 (recettori che hanno analogie dell’adattatore contenenti il dominio dell’interferone-beta, TRIF) che a loro volta, inducono la trascrizione di IL-1β, IL-18 e NLRP3 così come il fattore di regolazione dell’interferone (IRF)-3 e i geni di IRF7 tramite l’attivazione di Nf-kB. Il complesso IRF3-IRF7 promuove l’espressione dell’interferone IFN-α/β che, a sua volta attiva il recettore IFN- α-β1 (IFNAR)/(IFNAR2), i trasduttori Janus chinasi e gli attivatori della trascrizione (JAK/STAT) che portano alla trascrizione del gene Caspase 11 (Figura 2).

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Figura 2: Attivazione Non Canonica dell’Inflammosoma NLRP3

Nella seconda fase, le proteine o i recettori ausiliari non identificati, indotti dai batteri Gram-negativi, scindono e attivano la Caspasi 11, che induce piroptosi, rilascio di HMGB1 e IL-1α e promuove il rilascio di IL-1β grazie all’attivazione di tipo canonico NLRP3-ASC-Caspasi-1. [17]

2.3 Attivazione dell’inflammosoma NLRP3 non-canonica mediata dalla caspasi-8

Recentemente è stata caratterizzata un'ulteriore attivazione non canonica di NLRP3 dipendente dalla caspasi-8 (Figura 2). In particolare, la stimolazione TLR4 da parte di PAMP e/o DAMP, può attivare la caspasi-8 e interagisce con

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RIP1 - fatty acid synthase (FAS), FADD, che, a loro volta, promuovono sia la fase di trascrizione, sia l'oligomerizzazione e l'attivazione canonica della NLRP3 [15]. Inoltre, il β-glucano della parete cellulare fungina funghi, quali la Candida

albicans e micobatteri, stimolano la dectina-1, e promuovono la trascrizione

dell'IL-1β, nonché la formazione e l'attivazione di un complesso formato dalla proteina di traslocazione del linfoma del tessuto linfoide associato alla mucosa 1 (MALT1) – Caspase-8 - ASC, che contribuisce all'elaborazione e al rilascio di IL-1β.

La via di attivazione alternativa dell'inflammasoma NLRP3 non richiede l’efflusso di K + , ne induce la formazione di speck ASC, ne porta a successiva piroptosi [30].

Nelle cellule dendritiche murine, l'esposizione prolungata a LPS, senza altri segnali di attivazione, ha portato all'elaborazione e alla secrezione di IL-1β mediata da NLRP3 indipendentemente da P2X7 [31]. La segnalazione TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8 è coinvolta in questa via alternativa [30].

Quindi caspase-8 può agire come un enzima di conversione IL-1β diretta, anziché caspase-1. In effetti, l'elaborazione dell'IL-1β e l'attivazione della caspasi-8 non erano evidenti nelle cellule dendritiche (BMDC) NLRP3 - / - o ASC - / - derivate dal midollo osseo [20 , 23]. Inoltre, il rilascio di IL-1β dalle cellule dendritiche stimolato con un'infezione fungina si è verificato

(15)

indipendentemente dalla caspasi-1, attraverso l'associazione della proteina ASC con la caspasi-8 [22].

Nel complesso, tutte queste evidenze sottolineano il fatto che l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 è regolata da diversi processi molecolari, che possono essere strettamente interconnessi o verificarsi indipendentemente. Tuttavia, sono necessari ulteriori esperimenti in vitro su cellule in coltura per chiarire i meccanismi molecolari alla base dell'interazione tra caspasi-1, -8 e -11 nel promuovere le attivazioni NLRP3 canoniche e / o non canoniche.

(16)

Capitolo 3: Ruolo dell’inflammosoma NLRP3 nei disordini

metabolici

3.1 Obesità

(Figura 3)

Figura 3: Obesità ed infiammazione

L'incidenza dell'obesità in tutto il mondo è aumentata notevolmente negli ultimi decenni. 1,4 miliardi di adulti (il 35% della popolazione mondiale) ha infatti problemi di eccesso di peso (tra loro, mezzo miliardo è obeso). Il fenomeno è in forte crescita e interessa sempre più anche le fasce giovani della popolazione. Una recente ricerca pubblicata su Lancet ha rilevato che in 25 anni l'obesità tra i ragazzi è aumentata del 125%. L'Italia è sul podio con una delle prevalenze più alte di obesità e sovrappeso rispetto al resto d'Europa, seppure con segnali di

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tiepida deflessione. Un terzo degli adulti (35,3%) è sovrappeso, 1 su 10 è obeso. [32]

L'obesità è associata ad alterazioni multiorgano (ad es., tessuto cardiaco, adiposo, muscolare, ipotalamico, pancreatico ed epatico), alterazioni metaboliche e infiammatorie croniche che insieme sono chiamate sindrome metabolica. Il rischio di sviluppare condizioni patologiche gravi come DMT2, steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e malattie cardiovascolari (CVD) è significativamente associato all'obesità e alle sue concomitanti anomalie multiorganiche. Queste patologie rappresentano un grande fardello per le società occidentali, poiché richiedono risorse significative dai sistemi sanitari; si stima che i costi globali arriveranno a 760 miliardi di dollari entro il 2025 [33, 34]. Pertanto, la comprensione dei processi patogeni tessuto-specifici che portano alla progressione della malattia è necessaria per lo sviluppo di approcci terapeutici più efficaci.

Molti studi hanno dimostrato che l'obesità è caratterizzata da un'infiammazione sistemica cronica di basso grado, che sembra contribuire allo sviluppo dell'insulino-resistenza e alla patogenesi del diabete mellito di tipo 2 [35, 36]. Infatti, i pazienti obesi mostrano un'attivazione incontrollata di cellule immunitarie/infiammatorie innate, con conseguente rilascio massiccio di citochine pro-infiammatorie, che a loro volta interferiscono con diversi processi

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metabolici, tra cui sintesi e segnalazione dell'insulina, e livelli di glucosio nel sangue [36].

È stato scoperto che il complesso di inflammasoma NLRP3 agisce come un sensore immunitario chiave coinvolto nella formazione delle risposte immunitarie / infiammatorie [37, 38]. Studi clinici hanno evidenziato un aumento dell'attività della caspasi-1 e della secrezione di IL-1β nei macrofagi del tessuto adiposo di pazienti obesi e con diabete di tipo 2. Questo aumento è strettamente correlato ad una condizione di insulino-resistenza [37, 39, 40]. Inoltre, è stato rilevato un aumento dell'attività della caspasi-1 e dei livelli di IL-1β nei monociti del sangue periferico di pazienti obesi e DMT2, rispetto a soggetti sani, confermando così un ruolo critico della citochina pro-infiammatoria IL-1β nell’obesità (e nella sua infiammazione associata) e DMT2 [41, 42].

Tuttavia, resta da chiarire la relazione causale dell'attivazione dell'inflammasoma con l’infiammazione cronica, l’obesità e DMT2. In questo contesto, sono state avviate varie ricerche per studiare gli effetti della delezione del gene NLRP3 e dei suoi componenti in modelli preclinici di obesità e diabete. In particolare, diverse indagini hanno dimostrato che i topi NLRP3- / -, caspase-1- / - e ASC /

-sono meno suscettibili allo sviluppo dell'obesità indotta dalla dieta ricca di grassi (HFD). Altre hanno evidenziato che la deplezione del gene IL-1β nei topi obesi HFD ha attenuato l'infiammazione del tessuto adiposo e la resistenza all'insulina

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[43, 44], evidenziando così la rilevanza dei pathway dell'inflammasoma NLRP3 nella fisiopatologia dell'infiammazione indotta dall'obesità e dalla insulino-resistenza. Tuttavia, ulteriori indagini dovrebbero essere implementate per identificare i meccanismi esatti attraverso i quali NLRP3 modella le risposte immunitarie / infiammatorie nell'obesità.

Una serie di studi hanno dimostrato che l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 nei topi obesi, oltre a rilevare le risposte immunitarie innate, condiziona le risposte dell’immunità adattativa, causando l'accumulo e l'attivazione delle cellule T nel tessuto adiposo, che, a loro volta, contribuiscono ad alterare la sensibilità all'insulina [37]. In particolare, l'esaurimento del gene NLRP3 nei topi obesi HFD ha ridotto significativamente il numero di linfociti T di memoria effettrice (CD4 + e CD8 +) e ha aumentato i linfociti T naive (vergini) nel tessuto adiposo [37, 45, 46].

3.2 Diabete di tipo 2

DMT2 si sviluppa, nell’arco di molti anni, per un deficit di produzione di

insulina che però non è mai tanto grave come quello presente nel diabete tipo 1 e non dipende dall’autoimmunità. Multiple alterazioni genetiche e fattori acquisiti (ambientali) sono responsabili di un deficit di insulina che, in genere, si associa ad una sua minore efficacia. L’ insulino-resistenza è causata da multiple alterazioni genetiche che interagiscono con fattori acquisiti. In questo tipo di

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diabete non c’è abbastanza insulina per far fronte alle necessità dell’organismo (carenza relativa di insulina). Il diabete tipo 2 compare soprattutto dopo i 40 anni ma l’età di insorgenza si sta abbassando per la sempre maggiore diffusione dell’obesità anche fra i più giovani.

Fra i diabetici di tipo 2 esiste un’estrema eterogeneità eziopatogenetica che si estrinseca in una variabile combinazione di deficit di secrezione insulinica e di insulino-resistenza. Entrambi i difetti trovano origine in anomalie funzionali in vari organi e tessuti quali il fegato, il muscolo scheletrico, il tessuto adiposo, l’intestino, il cervello e le cellule α e β delle isole pancreatiche. Queste anomalie funzionali sono variamente combinate da soggetto a soggetto. Non è lontano dalla verità dire che ogni singolo paziente con diabete tipo 2 presenta molteplici cause all’origine della sua malattia. In questo tipo di diabete assume un ruolo rilevante l’eccesso di peso corporeo che determina insulino-resistenza e influisce negativamente anche sulla secrezione dell’ormone, difatti gran parte dei soggetti con diabete tipo 2 ha eccesso di peso. [47]

Il DMT2 è una malattia cronica caratterizzata da livelli elevati di glucosio come conseguenza dell'insulino-resistenza periferica accompagnata da una ridotta secrezione di insulina pancreatica. Nel 2011, 25,8 milioni di bambini e adulti negli Stati Uniti, l'8,3% della popolazione, vivevano con DMT2. Inoltre, si stima che DMT2 sia la causa sottostante o un fattore che contribuisce a 231.000 decessi all'anno e che i costi totali del trattamento associato DMT2 negli Stati

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Uniti abbiano raggiunto i 245 miliardi di dollari nel 2012 [48]. Pertanto, la comprensione del ruolo dell'infiammazione nella patogenesi di questa malattia altamente diffusa è essenziale per limitare i suoi effetti devastanti nelle società occidentali.

Il primo collegamento tra l'infiammazione metabolica associata all'obesità e la sensibilità all'insulina proveniva da primi studi che hanno dimostrato che i livelli di citochine proinfiammatorie come TNF-α, IL-6 e IL-1β erano aumentati nella circolazione e nel tessuto adiposo di soggetti obesi e diabetici [49-50].

Studi successivi, utilizzando modelli genetici murini, hanno dimostrato che le citochine proinfiammatorie inibiscono la segnalazione dell'insulina mediante fosforilazione diretta della serina del substrato 1 del recettore dell'insulina (IRS1) [51, 52]. Si suggerisce che i macrofagi attivati nel tessuto adiposo siano la principale fonte di citochine proinfiammatorie. Le popolazioni di macrofagi del tessuto adiposo (ATM) di individui obesi sono composte principalmente da macrofagi M1 proinfiammatori attivati in modo classico, piuttosto che composti da macrofagi M2 antinfiammatori attivati alternativamente. Inoltre, la presenza di queste popolazioni caratteristiche di ATM è direttamente correlata all'accumulo ectopico dei lipidi e alla sensibilità all'insulina in più modelli murini [53, 54, 55].

Recenti studi hanno dimostrato che l’inflammosoma NLRP3 è coinvolto nelle risposte immunitarie-infiammatorie associate al DMT2.

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L'espressione dei componenti dell'inflammasoma NLRP3 (NLRP3, ASC e caspase-1) è aumentata nel tessuto adiposo e nel fegato di topi e umani obesi; inoltre, il livello di espressione è direttamente correlato alla gravità del DMT2 negli individui obesi [61], e la riduzione di tale espressione nel tessuto adiposo è associata ad un miglioramento della sensibilità all’insulina [61, 62].

NLRP3, ASC e caspasi-1 sono espressi preferenzialmente negli ATM, dove l'acido grasso saturo palmitato e le ceramidi lipotossiche innescano l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 attraverso un meccanismo che coinvolge l'autofagia difettosa e l'accumulo di ROS mitocondriali. I topi privi di caspase-1 o NLRP3 sviluppano una ridotta adiposità con infiammazione attenuata del tessuto adiposo e mostrano una migliore sensibilità all'insulina su HFD [61, 63].

I livelli elevati di attivazione dell'inflammasoma NLRP3 negli ATM di topi obesi provocano almeno due conseguenze deleterie nei tessuti insulino-sensibili: 1. la secrezione di IL-1β inibisce la segnalazione dell'insulina mediante

fosforilazione serina diretta di IRS1 e induce l'espressione di TNF-α, a citochine ben caratterizzate che promuovono la resistenza all'insulina [52, 64]

2. IL-1β e IL-18 inducono un profilo proinfiammatorio Th1 effettore nel tessuto adiposo [61], che può peggiorare gli esiti metabolici nell'obesità. In accordo con gli effetti deleteri sulla segnalazione dell'insulina, il deficit di IL-1β protegge i topi dall'insulino-resistenza indotta da HFD [62, 63] e il

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trattamento con un antagonista del recettore dell'IL-1 (IL-1RA) riduce l'iperglicemia nei roditori obesi / diabetici e migliora il controllo glicemico nei pazienti con DMT2 [57, 65].

Inoltre, il polimorfismo nei geni che codificano per IL-18 e IL-1RA viene associato ad un aumento del rischio di anomalie metaboliche [66, 67].

Nel tessuto adiposo, gli inflammasomi possono anche avere funzioni non ematopoietiche. La caspasi-1 è sovraregolata durante la differenziazione degli adipociti e la sua attivazione promuove la secrezione di IL-1β e la resistenza all'insulina attraverso gli effetti autocrini. Interessante anche l’azione dei precursori degli adipociti caspasi-1 - / - che si differenziano in adipociti maturi in modo più efficiente e hanno un tasso di ossidazione aumentato [68], suggerendo che le proteine specifiche degli adipociti possono servire come substrati della caspasi-1, portando a cambiamenti metabolici negli adipociti di animali obesi. Tuttavia, resta da chiarire la natura delle proteine sensore che innescano l'attivazione della caspasi-1 specifica degli adipociti.

Una risposta fisiologica a livelli glicemici cronicamente elevati come conseguenza della resistenza all'insulina è l'aumento della secrezione di insulina da parte delle cellule β pancreatiche. L'esposizione cronica ad alti livelli di acidi grassi liberi e glucosio favorisce l'infiammazione delle isole e si traduce in un aumento dell'apoptosi e in una ridotta secrezione di insulina delle cellule β, che induce la progressione dall'obesità e dall'insulino-resistenza a DMT2 manifesto

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[57]. È importante sottolineare che l'IL-1β sembra svolgere un ruolo critico nel deterioramento patologico della funzione delle isole pancreatiche. IL-1β è preferenzialmente espressa nelle cellule β e nei macrofagi infiltranti [69]. Inoltre, studi clinici sull'uomo che utilizzano IL-1RA hanno migliorato significativamente la funzione delle cellule beta e il controllo glicemico nei pazienti con DMT2 [70].

La secrezione di IL-1β nell'insufficienza delle isole pancreatiche durante DMT2 dipende principalmente dalla segnalazione di TLR4 (segnale 1) e dall'attivazione dell'inflammasoma NLRP3. L'attivazione della segnalazione TLR4 innescata da livelli elevati di palmitato pancreatico porta alla disfunzione delle cellule β e promuove il reclutamento di monociti infiammatori nelle isole [71]. L'inflammasoma NLRP3 viene attivato nelle isole pancreatiche attraverso due diversi meccanismi in un modo specifico per tipo di cellula. In primo luogo, la gravità del DMT2 è strettamente correlata agli alti livelli di deposizione di polipeptide amiloide isolotto (IAPP; noto anche come amilina) all'interno delle isole pancreatiche [72]. L'accumulo di alti livelli di IAPP attiva l'inflammasoma NLRP3 nell'infiltrazione di macrofagi pancreatici precedentemente innescati (segnale 1), con l'abbondante lipoproteina a bassa densità minimamente ossidata (mmLDL), attraverso la rottura dei lisosomi e l'aumento della produzione di ROS. La rilevanza di questa attivazione patologica è ulteriormente supportata dai livelli significativamente più alti di IL-1β trovati nei macrofagi pancreatici infiltranti, da topi transgenici IAPP umani [73]. In secondo luogo, le cellule β

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cronicamente esposte ad alti livelli di glucosio hanno aumentato la produzione di ROS mitocondriali, come conseguenza della maggiore attività della catena di trasporto degli elettroni, che a sua volta porta alla dissociazione della proteina che interagisce con la tioredossina e quindi all'attivazione della NLRP3. [74]. L'IL-1β secreta può quindi agire in modo paracrino o autocrino per indurre l'espressione di molecole chemiotattiche o la morte delle cellule β [73].

Sono stati fatti grandi progressi nella comprensione del ruolo degli inflammasomi nella funzione delle isole. La ricerca futura dovrebbe affrontare il contributo esatto dell'attivazione cellulo-specifica degli inflammasomi durante la progressione del DMT2 nel contesto dell'obesità e della resistenza all’insulina.

3.3 Diabete Gestazionale

Il diabete mellito gestazionale (GDM) è un disturbo metabolico nelle donne in gravidanza che è caratterizzato dall'intolleranza al glucosio durante il secondo o terzo trimestre di gravidanza [2]. Nelle donne in gravidanza, gli esiti avversi causati dalla patogenesi del GDM includono resistenza all'insulina, iperinsulinemia, iperglicemia e sviluppo anormale dell'embrione [3]. Le conseguenze derivanti dalla GDM durante lo sviluppo dell'embrione comprendono la morte in utero, disturbi metabolici e macrosomia fetale [4]. Il GDM causerà il diabete dopo la gravidanza in quasi il 5% dei pazienti e la sua patogenesi è difficile da prevedere poiché non presenta sintomi precedenti [5].

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L'aumento dell'incidenza del GDM è favorito dalla maggiore incidenza dell'obesità e dall'aumento dell'età materna [6].

Il diabete mellito gestazionale è la complicanza medica più comune della gravidanza. È associato a esiti avversi materni e neonatali. Il mantenimento di adeguati livelli di glucosio nel sangue nel GDM riduce la morbilità sia per la madre che per il bambino. Vi è una mancanza di strategie uniformi per lo screening e la diagnosi della GDM a livello globale.

La gravidanza è associata a resistenza all'insulina (IR) e iperinsulinemia che possono predisporre alcune donne a sviluppare il diabete. [75] L'International Association of Diabetes and Pregnancy Study Groups (IADPSG) classifica l'iperglicemia rilevata per la prima volta durante la gravidanza come `` diabete manifesto '' o `` diabete mellito gestazionale (GDM) ‘'. [76]

La prevalenza di GDM varia dall'1 al 20% e sta aumentando in tutto il mondo, parallelamente all'incremento dell’obesità e del diabete mellito di tipo 2. La quantità di GDM varia in proporzione diretta alla prevalenza di DMT2 in un data popolazione o gruppo etnico. I tassi di prevalenza per GDM sono più alti per le donne africane, ispaniche, indiane e asiatiche che per le donne caucasiche. [77, 78]. Recentemente, la prevalenza di GDM è aumentata di 2-3 volte, variando dall'8,9 al 53,4% . Questo è principalmente dovuto all'adozione dei nuovi criteri proposti dall'IADPSG (International association of the diabetes and pregnancy study groups) sullo screening e sulla diagnosi di GDM. [77]

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L'IADPSG raccomanda lo screening universale per il GDM e richiede un singolo valore di glucosio al di sopra del valore di cut-off (invece di 2) durante il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) per la diagnosi. [79] (Figura 4)

Figura 4: Linee guida nazionali per lo screening di GDM in Italia

Questo drammatico aumento della prevalenza di GDM avrà un impatto importante sui sistemi sanitari. [80, 81]

In un Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcomes Study (HAPO), [80] uno studio epidemiologico multinazionale su larga scala (25.000 donne in gravidanza) ha trovato associazioni significative tra esiti avversi della gravidanza e livelli più elevati di glucosio materno senza livelli definiti, dopodiché il rischio aumenta.

Inoltre, l'Australian Carbohydrate Intolerance Study (ACHOIS) su donne in gravidanza, [82] e lo studio multicentrico randomizzato statunitense sul

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trattamento per studi sul diabete gestazionale lieve [83] hanno indicato che l'iperglicemia materna che non soddisfa i criteri diagnostici per il diabete manifesto ha comunque una correlazione con disturbi e problemi perinatali. Questa associazione suggerisce la necessità di rivalutare i criteri standard per la diagnosi e il trattamento dell'iperglicemia in gravidanza e accogliere i nuovi criteri.

3.3.1 Fisiopatologia del GDM

Durante la gravidanza normale, una IR progressiva si sviluppa intorno alla metà della gravidanza e progredisce durante il terzo trimestre. [84] Ormoni e adipochine secreti dalla placenta, incluso il fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, il lattogeno placentare umano e l'ormone della crescita placentare umano sono possibili cause di IR in gravidanza. Inoltre, un aumento degli estrogeni, del progesterone e del cortisolo durante la gravidanza contribuisce ad una interruzione dell'equilibrio dell'insulina del glucosio. [85] Per compensare l'IR periferica durante la gravidanza, la secrezione di insulina aumenta. Lo sviluppo del GDM si verifica quando il pancreas di una donna non secerne abbastanza insulina per tenere il passo con lo stress metabolico dell'IR. Inoltre, l'aumento della deposizione adiposa materna, la diminuzione dell'esercizio fisico e l'aumento dell'apporto calorico, contribuiscono a questo stato di relativa intolleranza al glucosio.

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All'inizio della gravidanza, la secrezione di insulina aumenta, mentre la sensibilità all'insulina rimane invariata, diminuita o può persino aumentare. A metà della gravidanza, la sensibilità all'insulina inizia a diminuire progressivamente e peggiora durante il resto della gravidanza.

Pertanto, il GDM di solito si sviluppa alla fine del secondo trimestre e scompare, istantaneamente, dopo il parto.

3.3.2 Fattori di rischio per il GDM

Diversi fattori di rischio sono associati allo sviluppo del GDM. I fattori di rischio più comuni sono:

- obesità

- età materna avanzata - familiarità con GDM - familiarità con diabete

- appartenenza ad un gruppo etnico con un'elevata prevalenza di DMT2 - sindrome dell'ovaio policistico

- glicosuria persistente.

Una storia di parto grande (peso alla nascita ≥4000 g), di aborti ricorrenti, di nati morti inspiegabili, di ipertensione o ipertensione correlata alla gravidanza sono altri fattori di rischio per la GDM. [86]

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3.3.3 NLRP3 come target contro il GDM

In alcune donne in gravidanza, il diabete è favorito dall'iperinsulinemia correlata alla gravidanza e dalla resistenza all'insulina [89]. È stato dimostrato che la patogenesi del GDM è innescata simultaneamente da fattori ambientali e genetici, ma il meccanismo molecolare che instaura questo processo non è ancora chiaro [90]. Nei pazienti con GDM, la secrezione di insulina è ridotta dal tasso di insulino-resistenza promosso [91]. Precedenti studi hanno dimostrato la connessione tra l'attivazione dell'inflammosoma NLRP3 e la resistenza all'insulina [92]. Poiché il GDM è diventato un grave rischio per la salute sia della madre che del bambino, è urgentemente necessaria una strategia terapeutica efficace del GDM. Il topo C57BL / KsJ-Lepdb / + (db / +) ha dimostrato essere un ottimo modello animale GDM poiché può imitare la maggior parte dei sintomi GDM nelle donne in gravidanza e nel feto [93].

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3.4 Comorbidità

3.4.1 Comorbidità correlate all’obesità

Figura 5: Comorbidità legate all’Obesità

- Steatosi epatica non alcolica: È una complicanza che affligge il 10-25% della popolazione adulta e il 58-77% delle persone affette da obesità. In un quarto dei casi si sviluppa fibrosi e necrosi infiammatoria, una grave malattia del fegato non reversibile che può anche portare alla morte.

- Malattie della colecisti: la colelitiasi, cioè lo sviluppo di calcoli nella colecisti, si verifica da tre a quattro volte più frequentemente nelle persone affette da

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obesità, rispetto a quelle normopeso. L’incidenza aumenta con l’età e con l’aumentare del livello di obesità. Le donne sono particolarmente a rischio. - Cancro: numerosi studi hanno trovato un’associazione positiva tra obesità e

incidenza di certi tipi di cancro (es. endometrio, ovaie, cervice uterina, mammelle nelle donne in post-menopausa, prostata, colon, colecisti e rene). L’aumentata incidenza di cancro si pensa sia la diretta conseguenza di modificazioni ormonali e/o di una dieta ricca di grassi e povera di fibre. - Malattie cardiovascolari: l’obesità aumenta il rischio di sviluppare gravi

malattie cardiovascolari (es. angina pectoris, infarto miocardico non fatale e morte improvvisa). È stato osservato che il rischio di malattie cardiovascolari, confrontato ad un IMC < 21, aumenta di due volte con un IMC compreso tra 25 e 28,9 e di 3,6 volte con un IMC >29. Un altro problema cardiaco spesso osservato nelle persone affette da obesità è lo sviluppo di ipertrofia del muscolo cardiaco, che nel tempo può portare a una grave condizione di scompenso cardiaco. Le persone affette da obesità, infine, hanno un aumentato rischio di ictus ischemico che può causare la morte o determinare gravi conseguenze sulla qualità della vita.

- Artrosi: nelle gravi obesità le artropatie o i dolori articolari da carico (colonna lombo-sacrale, anche, ginocchia, caviglie e piedi) sono molto frequenti, interessando circa l’80% dei pazienti, e costituiscono la causa più frequente di invalidità.

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- Apnee notturne: le apnee notturne si verificano in più del 10% degli uomini e delle donne con un IMC > 30 e il 65-75% dei soggetti con apnee notturne è affetto da obesità. Le apnee notturne sono più frequenti nelle persone con un eccesso di grasso localizzato a livello dell’addome e del collo. Una minoranza di persone affette da obesità sviluppa una seria condizione medica caratterizzata da frequenti episodi di apnee notturne, che in alcuni casi si possono verificare anche nelle ore diurne. In questa condizione, oltre alle apnee, è presente sonno disturbato con frequenti risvegli determinati dalla ripresa del respiro dopo l’episodio di apnea. Ciò costituisce la manifestazione clinica della “sindrome obesità-ipoventilazione” che aumenta in modo considerevole il rischio di insufficienza respiratoria, ipertensione arteriosa, aritmie cardiache, malattie cardiovascolari e scompenso cardiaco.

- Funzione mestruale, fertilità e gravidanza: l’obesità nelle donne in pre-menopausa è associata a irregolarità mestruali e amenorrea. La condizione più importante associata all’obesità addominale è la sindrome dell’ovaio policistico, caratterizzata da infertilità, disturbi mestruali, irsutismo, iperandrogenismo addominale e anovulazione. La sindrome è associata a iperinsulinemia e a resistenza insulinica. L’obesità durante la gravidanza si associa a un aumento di morbilità sia per la madre sia per il bambino. Nelle donne obese gravide è stato osservato un incremento di ipertensione arteriosa e gestosi gravidica.

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- Problemi psicologici: le principali problematiche psicologiche osservate nei soggetti affetti da obesità, in particolare l’immagine corporea negativa, sembrano essere la conseguenza di un ambiente sociale avverso, che esercita una profonda discriminazione nei confronti di chi ha un corpo di dimensioni superiori alla media. [94]

3.4.2 Comorbidità correlate al diabete

Comorbidità legate al diabete:

• 400.000 sono i diabetici che hanno un infarto nell’arco di un anno • 250.000 i diabetici colpiti da un ictus

• 200.000 i diabetici che manifestano un problema serio a livello renale (nefropatia) o agli occhi (retinopatia o altro)

• 150.000 i diabetici che hanno un problema significativo ai piedi (piede diabetico)

• Ogni 7 minuti una persona con diabete ha un attacco cardiaco

• Ogni 10 minuti una persona con diabete ha un ictus o sviluppa un problema serio alla vista

• Ogni 52 minuti una persona subisce un’amputazione a causa del diabete • Ogni 4 ore una persona con diabete entra in dialisi [95] (Figura 6)

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Figura 6: Comorbidità legate al diabete

Esistono comorbidità diverse tra uomini e donne con diabete o prediabete: gli uomini soffrono più spesso di malattie cardiovascolari come: angina pectoris, infarto del miocardio e la calcinosi della media (o sclerosi calcifica mediale di Mönckeberg, una malattia delle arterie di tipo muscolare caratterizzata da un progressivo accumulo di calcio a livello della tonaca media); mentre le donne mostrano più di frequente aritmia, malattia non coronarica, aumento dei biomarcatori infiammatori sistemici e depressione. Di conseguenza è importante che si tenga conto delle differenze tra sesso e genere nello studio e nel trattamento delle persone che soffrono di queste condizioni.

I danni a lungo termine causati da alti livelli di zucchero nel sangue per lunghi periodi di tempo possono interessare gli occhi (causando problemi alla vista e

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cecità), i nervi (intorpidimento in piedi, gambe e braccia), il cuore (aterosclerosi e malattie correlate), e i reni. Nei reni, gli alti livelli di zucchero nel sangue possono causare danni dei tessuti ed l’organo può perdere la propria funzione. Circa una persona su cinque in dialisi presenta una malattia renale che origina dal diabete, conseguenza della della nefropatia diabetica. [96]

- Il diabete e il decadimento cognitivo: L’associazione tra diabete mellito, sia tipo 1 sia tipo 2, e demenza è ormai ampiamente dimostrata da numerosi studi presenti in letteratura. I dati finora pubblicati, relativi a pazienti diabetici confrontati con soggetti sani, hanno permesso di stabilire che il rischio a lungo termine di sviluppare declino cognitivo è maggiore del doppio nei soggetti con patologia diabetica rispetto ai soggetti non diabetici. Il 60-70% delle forme di demenza è rappresentato dall’Alzheimer, che riconosce una patogenesi metabolica: l’alterato metabolismo della proteina progenitrice della amiloide (APP), associato allo stress ossidativo e ad alterazioni della proteina Tau, porterebbe a un’aumentata sintesi di ß-amiloide che, accumulandosi nel sistema nervoso centrale sotto forma di placche, determinerebbe un effetto tossico sui neuroni e sulle loro sinapsi. Le demenze di origine vascolare rappresentano la seconda forma più comune, con un tasso che varia dal 10 al 20% delle restanti forme. Nella patologia diabetica i frequenti sbalzi glicemici, con i conseguenti insulti cerebrali legati alla vasculopatia e alla sofferenza neuronale, concorrono a produrre un danno cronico e progressivo alle strutture encefaliche.[97] Il cervello va incontro,

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così, a un progressivo deterioramento, documentato anche alle immagini radiologiche, con una atrofia che si fa sempre più marcata via via che il danno si perpetua nel tempo. Il risultato è una perdita delle funzioni cognitive che si manifesta tipicamente in tre fasi: una prima, precoce, in cui il soggetto dimentica le parole, perde la cognizione temporale e talvolta non riconosce ambienti ad esso familiari; una fase intermedia, in cui oltre all’incapacità di riconoscere persone e ambienti prima familiari, manifesta alterazioni del comportamento e progressiva perdita delle capacità di prendersi cura di sé; una terza, infine, in cui vi è necessità di una totale assistenza domiciliare. Ai disturbi comportamentali gravi si associa anche un’incapacità di svolgere funzioni motorie semplici come la deambulazione. [98] Sono state avanzate diverse supposizioni e sono numerosi gli studi in corso che stanno cercando di spiegare quale influenza l’insulina possa avere sul sistema nervoso centrale. Per quanto ancora le risposte siano poche, vi è una quantità crescente di studi che ha messo in relazione l’insulino-resistenza alla patogenesi della demenza di Alzheimer. Questa patologia sembra infatti essere quasi due volte più frequente nei soggetti diabetici di tipo 2 che nella popolazione non diabetica. Nei pazienti con Alzheimer è stato messo in luce un aumento della risposta insulinica a seguito di un carico di glucosio e una elevata concentrazione di insulina nel liquido cefalorachidiano, riconoscendo di fatto un ruolo importante alla resistenza insulinica nella sua patogenesi [99]. Il meccanismo attraverso cui l’insulina comporta alterazioni delle funzioni cognitive è

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tuttavia ancora sconosciuto. Sono interessanti i risultati ottenuti da alcuni studi in cui soggetti con Alzheimer sono stati sottoposti a trattamento insulinico intra-nasale. Questa formulazione, capace di agire solo a livello centrale e non periferico, ha determinato un miglioramento della memoria verbale. A riprova del possibile effetto dell’insulina sul sistema cognitivo, lo stesso trattamento è stato effettuato su soggetti di controllo per otto settimane e i risultati hanno riportato anche in essi un miglioramento dell’umore, della fiducia in se stessi, dell’attenzione nonché una riduzione del senso di fame [100]. La connessione tra resistenza insulinica e decadimento cognitivo potrebbe essere spiegata con tre possibili teorie: la prima è la condivisione di un medesimo pathway patogenetico, di origine infiammatoria, tra il diabete tipo 2 e la demenza di Alzheimer; una seconda potenziale potrebbe essere ricercata nella disfunzione dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene, causata dalla resistenza insulinica, responsabile del decadimento cognitivo; una terza, infine, potrebbe essere spiegata dalla promozione della formazione di placche senili che si manifesta nei soggetti insulino-resistenti. [101]

3.4.3 Comorbidità correlate al Diabete gestazionale

Le donne con GDM hanno una maggiore incidenza di disturbi ipertensivi durante la gravidanza, tra cui ipertensione gestazionale, preeclampsia ed eclampsia. Esiste un aumento del rischio di polidramnios (eccesso di liquido amniotico) che può aumentare il rischio di parto pretermine. L'eccessiva crescita

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fetale rimane un'importante preoccupazione perinatale nella GDM. Le conseguenze di un'eccessiva crescita fetale includono traumi alla nascita, morbilità materna da parto cesareo, distocia di spalla e ipoglicemia neonatale [80] Altre morbilità neonatali che potenzialmente si verificano più frequentemente nei neonati di donne con GDM includono iperbilirubinemia, ipocalcemia, eritema e sindrome da distress respiratorio. Le complicanze a lungo termine del GDM includono il diabete e le malattie cardiovascolari nelle madri, [102] e l'obesità e il diabete nella prole. [103] Le anomalie congenite non si verificano con un tasso maggiore nei pazienti con diabete gestazionale, poiché il GDM di solito si verifica alla fine del secondo trimestre quando l'embriogenesi è completata.

GDM complicanze a distanza nella prole: - Obesità (>50%) in età preadolescenziale

- IGT (intolleranza al glucosio) e insulino-resistenza in età adolescenziale - IGT e insulino-resistenza in età adolescenziale

- IGT e Diabete tipo 2 in età adulta GDM complicanze a distanza nella madre:

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- Nei primi 10 anni il 50% delle donne con GDM svilupperà un diabete tipo 2 con tasso di progressione nei primi 5 anni del 10% e nei successivi 5 del 5.5% annuo

Retinopatia e nefropatia: Occorre offrire alle donne con diabete preesistente, una valutazione della retina al loro primo appuntamento clinico prenatale (a meno che abbiano effettuato una visita negli ultimi 3 mesi) e di nuovo a 28 settimane. Se la retinopatia diabetica è presente al momento dell’appuntamento, è necessario eseguire un’ulteriore valutazione della retina a 16 -20 settimane [104]. Se la diagnosi è stata formulata durante la gravidanza occorre suggerire un follow up oftalmologico almeno 6 mesi dopo la nascita [105]. La retinopatia diabetica non dovrebbe essere considerata una controindicazione al parto vaginale.

Inoltre, se una valutazione renale non è stata effettuata nei 3 precedenti mesi nella donna con diabete preesistente, è necessario organizzarla al primo appuntamento in gravidanza. Se la creatinina sierica è anormale il riferimento ad un nefrologo dovrebbe essere considerato. È importante tener conto della tromboprofilassi nelle donne con un range di proteinuria sopra 5 g/day (ACR superiore 220 mg/mmol) [106]. Anche l’insorgenza della preeclampsia dovrebbe essere considerata, come dimostrato dalle linee guida NICE Hypertension in pregnancy.

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Capitolo 4 : Effetti di composti di origine naturale nei disordini

metabolici e comorbidità correlate

Il coinvolgimento dell'inflammasoma nella fisiopatologia nei disordini metabolici sta promuovendo la ricerca sui potenziali benefici terapeutici derivanti dal blocco farmacologico dell'inflammasoma NLRP3. In questo contesto, la comunità scientifica, oltre ai farmaci di sintesi, sta compiendo sforzi intensi per caratterizzare gli effetti dei composti naturali.

4.1 Elenco dei composti di origine naturale che inibisco l’inflammosoma

- Tenuigenina: composto steroideo, presente in Polygala tenuifolia, utilizzato

nella medicina cinese come agente antiossidante e antinfiammatorio.

- Crocina: carotenoide presente nei fiori del genere crocus. È la sostanza

responsabile del colore giallo intenso dello zafferano.

- Acido-2-carba ciclico fosfatidico: ciclicomediatore fosfolipidico naturale con

una struttura ad anello fosfato ciclico. Fosfolipide derivante dal glicerolo, possiamo ritrovarlo sia in alimenti vegetali che animali.

- Apigenina: flavonoide naturale, presente in varie specie di frutta e verdura,

come il prezzemolo, la cipolla, il sedano, il tè e il pompelmo. Una delle fonti più comuni di consumo dell’apigenina è la camomilla. È nota per essere un

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flavonoide bioattivo, con proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, antiangiogeniche, antiallergiche, antigenotossiche e anticancerose.

- Idrossitirosolo: composto appartenente alla classe dei polifenoli e insieme al

tirosolo è il fenolo più abbondante nell’olio d’oliva. L’idrossitirosolo è caratterizzato da un forte potere antiossidante e da numerose altre proprietà benefiche.

- Isoliquiritigenina: è un composto chimico fenolico, appartenente alla classe

dei Calconi, si trova in una varietà di piante tra cui è presente anche la Liquirizia.

- Allicina: composto solforganico che può essere facilmente ottenuto dall'aglio,

una pianta della famiglia delle Amaryllidaceae, si trova sotto forma liquida con odore pungente tipico di aglio e affini.

- Quercetina: composto appartenente al gruppo dei flavonoli, è isolabile da

numerose specie vegetali tra cui: ippocastano, calendula, biancospino, camomilla, iperico e Ginkgo biloba.

- Lactucina: composto appartenente al gruppo dei lattoni sesquiterpenici. Si

tratta di un composto organico presente in molte varietà di lattuga, soprattutto nel lactucarium, chiamato anche oppio di lattuga, il quale viene estratto dalla Lactuca Virosa (o anche dalla cicoria—> Cichorium intybus).

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- Baicalina: composto polifenolico appartenente alla famiglia dei flavoni.

Questa sostanza, isolata da diverse specie vegetali di scutellaria, è meglio conosciuta e utilizzata nella medicina tradizionale cinese con il nome di Huang qin (Scutellaria baicalensis).

- Formononetina: Composto facente parte della categoria degli isoflavoni. È

uno dei principi attivi contenuti nel Trifoglio rosso.

- Acido Salvianolico B: acido fenolico, è uno dei principali componenti attivi

della Salvia Miltiorrhiza Bge, che è impiegata nel trattamento delle malattie infiammatorie croniche e della malattia neoplastica in Cina.

- Il colorante viola della patata dolce (PSPC): è un colorante alimentare

naturale di antociani ottenuto dalla patata dolce ( Ipomoea batatas ).

- Resveratrolo: fenolo non flavonoide. È una sostanza che viene naturalmente

prodotta da varie piante, come per esempio vite, more e cacao, a scopo protettivo nei confronti di agenti patogeni come batteri o funghi.

- Ecklonia cava: polifenolo. È un’alga bruna perenne e si trova principalmente

al largo della costa del Giappone e della Corea.

- Acido asiatico: saponina triterpenicha di cui sono ricche le foglie di Centella

Asiatica (Hydrocotyle asiatica).

- Alpinetina: derivato flavonoide. Fitochimico isolato da una varietà di piante

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- Frassinellone: lattone. Principio attivo della Frassinella, detta anche Dittamo.

Pianta perenne spontanea e aromatica appartenente alla famiglia delle Rutaceae. chiamata frassinella perché la forma delle sue foglie ricorda da vicino quella del frassino.

- Wogonoside: è uno dei principali flavonoidi (glucuronide del Wogonin) attivi

in Radix Scutellariae (RS), una delle erbe medicinali più famose in Cina.

- Bergenina: C- glicoside dell'acido 4-O-metil gallico. Può essere isolato da

specie di Bergenia come Bergenia ciliata e Bergenia ligulata.

- L'acido ferulico: è un acido carbossilico, derivato sostituito dell'acido

trans-cinnamico. Prende il nome da Ferula, un genere di piante erbacee perenni. In natura è abbondantemente presente nelle granaglie (avena, grano, riso), nei carciofi, nel caffè ed in alcuni tipi di frutta come le mele, le arance e l’ananas.

- Le procianidine: sono membri della classe dei flavonoidi delle

proantocianidine (o tannini condensati ). Possono essere trovati in molte piante, in particolare mele , corteccia di pino marittimo , cannella , fave di cacao , semi d'uva , buccia d'uva e vini rossi di Vitis vinifera

- Epigallocatechina gallato: noto anche con la sigla EGCG, è un importante

polifenolo presente nel tè.

- Sulforafano: composto del gruppo degli Isotiocianati appartenente alla

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specie vegetali, come nelle piante alla famiglia delle crucifere quali ad esempio broccoli, cavoli e cavolini di Bruxelles. (Figura 7)

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Figura 7: Strutture chimiche di diversi fitochimici che agiscono sulle vie dell'inflammasoma NLRP3 e relativi meccanismi molecolari con cui questi

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4.2 Evidenze Sperimentali

4.2.1 Obesità e diabete di tipo 2

Nell'ambito dell'obesità, solo uno studio ha riportato che il trattamento con

Isoliquiritigenina (ILG), un flavonoide con struttura calcarea ottenuta dalla

Glycyrrhiza Uralensis, inibisce l'attivazione di NF-κB indotta da LPS. In questo studio viene mostrato che ILG inibisce potentemente l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e l'effetto è indipendente dalla sua potenza inibitoria su TLR4. [144] L'effetto inibitorio dell'ILG era più forte di quello del partenolide, un noto inibitore dell'inflammasoma NLRP3. GL, un triterpenoide di G. uralensis, aveva effetti inibitori simili sull'attività NLRP3, ma erano richieste alte concentrazioni di GL. Inoltre, GL inibiva l'oligomerizzazione ASC attivata da NLRP3, mentre ILG ha inibito l'oligomerizzazione ASC attivata da NLRP3. Basse concentrazioni di ILG sono risultate altamente efficaci nella produzione di IL-1β indotta da IAPP rispetto al farmaco sulfonilurea gliburide. Le analisi in vivo hanno rivelato che ILG attenua potentemente l'obesità, l'ipercolesterolemia e l'insulino-resistenza indotte da HFD. Inoltre, il trattamento ILG ha migliorato la steatosi macrovescicolare indotta da HFD nel fegato. Infine, ILG ha notevolmente inibito l'infiammazione del tessuto adiposo indotta dalla dieta e la produzione di IL-1β e caspasi-1 nel tessuto adiposo bianco in coltura ex vivo. Questi risultati suggeriscono che ILG è un potenziale bersaglio

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farmacologico per il trattamento delle malattie infiammatorie associate all'inflammasoma NLRP3 [145].

Cichorium intybus Linn. (C. intybus, Chicory) della famiglia delle Asteraceae

fornisce una varietà di prodotti commestibili ed è ampiamente utilizzata come importante erba medicinale per trattare vari disturbi, incluso il diabete [146]. C. intybus ha anche proprietà di promozione del sistema immunitario ed è considerato uno dei migliori sostituti del caffè. [147] Dal punto di vista farmacologico, è stato riportato che le radici di cicoria possiedono attività antidiabetiche [148] e antiipertrigliceridemiche [149]. Tuttavia l'attività antidiabetica attenuata dall'inflammasoma e dall'inflammasoma di C. intybus non è stata ancora riportata. Nel presente studio, sono stati evidenziati gli effetti protettivi delle parti aeree dell'estratto di C. intybus contro il T2D indotto da HFD. Inoltre, sono stati eseguiti studi sperimentali in vitro per chiarire i meccanismi coinvolti nell'efficacia in vivo dell'estratto di C. intybus nel T2D.

Il resveratrolo è un fenolo non flavonoide e una fitoalessina prodotta

naturalmente da numerose piante in risposta agli attacchi da agenti patogeni quali batteri o funghi. Le principali fonti alimentari di resveratrolo sono la buccia dell'uva, i mirtilli, i lamponi, il gelso e le arachidi. Questo composto polifenolico, ha dimostrato di esercitare potenti azioni antidiabetiche, antiossidanti e antinfiammatorie [150]. Sia la metformina che il resveratrolo migliorano la disfunzione adiposa inibendo l'infiammazione ed esercitano

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un'azione simile nella regolazione dell'AMPK [151], e quindi si è tentati di sapere se l'attivazione farmacologica di AMPK (proteina che regolamenta il metabolismo dei lipidi) contribuisce a prevenire l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in tessuto adiposo in condizioni di stress ER (reticolo endoplasmatico). Il resveratrolo impedisce l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 riducendo la scissione mitocondriale mediata da Drp1 (enzima coinvolto nella scissione dei mitocondri) attraverso la regolazione di AMPK. Questi risultati hanno suggerito un nuovo intervento terapeutico per l’attivazione dell’AMPK farmacologico nel miglioramento della disfunzione adiposa in condizioni di stress ER.

La quercetina è uno dei flavonoidi più comuni in quanto è isolabile da

numerose specie vegetali tra cui: ippocastano, calendula, biancospino, camomilla, iperico e Ginkgo biloba. Si ritiene che promuova la salute, in parte grazie alla sua capacità di agire come antiossidante contro i ROS [152] e di inibire la xantina ossidasi [153]. Questo composto riduce lo stress ossidativo, migliora lo stato antiossidante e inibisce l'apoptosi delle cellule epatiche. Inoltre allevia l'accumulo di grasso epatico, regola l'espressione genica infiammatoria epatica, riduce i livelli di colesterolo totale e trigliceridi e sopprime l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 renale.

Wang et al. [115] hanno riferito che il colore viola della patata dolce (PSPC), contenente antociani, ha migliorato il danno istopatologico epatico associato al diabete indotto da HFD, attraverso l'inibizione dell'inflammasoma NLRP3. È

(51)

stato proposto che i meccanismi molecolari dipendano dalla capacità degli antociani della PSPC di inibire la segnalazione dell'enzima 1 (IRE1). Questa richiede l'inositolo indotto dallo stress da ER e dalla proteina 1/2 (NOD1 / 2) contenente il dominio di oligomerizzazione legante i nucleotidi di trascrizione NF-kB, suggerendo così che questa classe di flavonoidi può agire su entrambi i passaggi necessari per l'attivazione di NLRP3.

(Figura 8)

Composto

fitochimico Categoria

Meccanismi

molecolari Dose e tempo di

trattamento Modelli sperimentali Isoliquiritigenina Calcone Inibizione della trascrizione di TLR4-IkB- NF-kB Inibizione dell’oligomerizzazi one di ASC 0,5% peso/peso per 20 settimane Obesità indotta da HFD Lactucina e Lactopicrina Sesquiterpeni Inibizione della traslocazione di NLRP3 nei mitocondi, associata alle membrane ER 50 mg/kg due volte a settimana, per os, per 6 settimane Diabete di tipo 2 indotto da HFD Resveratrolo Stilbenoide Stimolazione di AMPK Blocco di Drp1 Inibizione della fissione mitocondriale indotta dai ROS

50 mg/kg per os, per 7 giorni

Diabete indotto da Streptozocina

Quercetina Flavonoide Inibizione dell’interazione TXNIP/NLRP3

25 mg/Kg/die per os, per 7 giorni

Infiammazione epatica indotta da Streptozocina (Causa diabete di tipo 1 nei ratti) Colore viola della patata dolce Antocianina Soppressione dello stress ER indotto dai meccanismi di attivazione di IRE1 Inibizione della traslocazione di NF-kB Inibizione del segnale di NOD1/2 700 mg/Kg/die per os, per 20 settimane

Diabete indotto dall’infiammazi one epatica causata da HFD

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Figura 8: Fitochimici che inibiscono l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 in modelli animali di disordini metabolici e relative comorbidità.

Nell'ambito dell'obesità, solo uno studio ha riportato che il trattamento con

isoliquiritigenina, un flavonoide con struttura calcarea ottenuta dalla

Glycyrrhiza Uralensis, ha esercitato effetti benefici nei topi con obesità indotta da HFD. L'isoliquiritigenina ha attenuato l'aumento di peso corporeo, la resistenza all'insulina, l'iperglicemia, l'ipercolesterolemia e l'infiammazione dei tessuti adiposi, tramite l'inibizione di entrambi i passaggi dell'attivazione di NLRP3. Infatti, l'isoliquiritigenina ha inibito sia la trascrizione di NF-kB tramite il blocco del segnale TLR4 / IkB sia l'oligomerizzazione di ASC [107].

Resveratrolo Stilbenoide Induzione di SIRT1 e SIRT6 8 mg/Kg/die per os, per 4 settimane Diabete indotto dall’infiammazi one epatica causata da HFD Estratto di Ecklonia Cava Polifenolo Inibizione dell’attivazione di NLRP3 Attivazione dei meccanismi AMPK/Sirt1/ PGC-1α 100 e 500 mg/Kg/ die per os, per 12 settimane Nefropatia diabetica indotta con HFD Diidroquercetina Diidroflavonoide Soppressione dei ROS Diretta inibizione dell’assemblament o di NLRP3 25,50 e 100 mg/ Kg/die per os, per 12 settimane Nefropatia diabetica indotta da Streptozocina e HFD Formononetina Isoflavonoide Inibizione del segnale di trascrizione TRL-MyD88- NF-kB 25,50 mg/Kg/die per os, per 6 settimane Disfunzioni cognitive diabetiche indotte da streptozocina Composto fitochimico Categoria Meccanismi

molecolari Dose e tempo di

trattamento

Modelli sperimentali

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Due studi recenti hanno valutato gli effetti dei composti naturali che agiscono sulla cascata intracellulare NLRP3 in modelli animali di DMT2. Nel primo studio, Shim et al. [108] hanno osservato che il trattamento con estratti di foglie di Cichorium intybus, contenenti una varietà di sostanze fitochimiche, come lattucina e lattoni sesquiterpenici di lattucopicrina, ha attenuato l'aumento di peso corporeo, il metabolismo del glucosio, la resistenza all'insulina, nonché l'infiammazione del tessuto adiposo e sistemico nei topi con HFD (diabete di tipo 2 indotto), tramite l'inibizione dell'attivazione di NLRP3.

Inoltre, gli estratti di foglie di Cichorium Intybus hanno promosso lo spostamento dei macrofagi pro-infiammatori M1 nei tessuti adiposi verso il fenotipo antinfiammatorio M2, riducendo i marker inducibili di ossido nitrico sintasi (iNOS) e TNF M1 e aumentando l'espressione di Arg-1 e indicatori IL-10 M2. È stato proposto che il meccanismo molecolare dipenda dalla capacità della lattucina e della lattucopicrina di inibire la traslocazione dei componenti molecolari NLRP3 nelle membrane del reticolo endoplasmatico (ER) associate ai mitocondri, un passaggio fondamentale nel processo di attivazione di NLRP3 [109,110].

Nel secondo studio, Li et al. [111] hanno riferito che il trattamento con

resveratrolo ha contrastato lo stress ossidativo del tessuto adiposo e

l'infiammazione nel diabete indotto da streptozocina attraverso il blocco dell'attivazione di NLRP3. In particolare, gli effetti inibitori del resveratrolo sono

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stati attribuiti alla sua capacità di attivare il sistema antinfiammatorio AMPK attraverso il blocco della proteina 1 correlata alla dinamina (Drp1) e alla fissione mitocondriale indotta da ROS e la conseguente inibizione dell’interazione proteina legante la tioredossina (TXNIP)-NLRP3. Questi risultati, sebbene generati in diversi modelli animali di disordini metabolici, mostrano che i composti naturali che prendono di mira le fasi di attivazione dell'NLRP3 potrebbero rappresentare opzioni terapeutiche adeguate per la gestione dell'obesità e del diabete.

Di interesse, nel contesto delle sindromi metaboliche, la maggior parte delle ricerche disponibili ha studiato gli effetti dei fitochimici che mirano a NLRP3 nelle complicanze associate all'obesità e al diabete, tra cui infiammazione epatica, steatosi epatica non alcolica (NAFLD), nefropatia diabetica e deterioramento cognitivo [112, 113, 114]. Wang et al. [113] hanno osservato che il flavonoide Quercetina dietetico alleviava lo stress ossidativo epatico, l'infiammazione e la steatosi nei ratti con diabete indotto da streptozocina, attraverso il blocco dell'interazione TXNIP / NLRP3 [113].

In un articolo successivo, Yang et al. [116] hanno dimostrato che il resveratrolo ha contrastato l'infiammazione epatica nei topi HFD, attraverso l'inibizione dell'assemblaggio NLRP3, inducendo l'espressione delle proteine anti-infiammatorie Sirt1 e Sirt6. In particolare, il trattamento con resveratrolo ha ridotto i livelli di trigliceridi epatici insieme alle citochine pro-infiammatorie

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