I
Indice generale:
Riassunto ... 1 Abstract ... 2 1. INTRODUZIONE... 3 1.1 La terapia genica ... 31.2 Il virus adeno-associato (AAV) ... 5
1.3 Organizzazione e replicazione del genoma di AAV ... 7
1.4 Produzione di vettori basati sull’AAV da impiegare nella terapia genica .. 10
1.5 Potenziali applicazioni dell’AAV nella terapia genica: vantaggi e limiti... 13
1.6 Il lievito S. cerevisiae nella ricerca in campo virologico ... 16
2. SCOPO DELLA TESI ... 19
3. MATERIALI E METODI... 20
3.1 Ceppi di lievito utilizzati... 20
3.2 Preparazione dei terreni di coltura ... 20
3.3 Plasmidi utilizzati... 23
3.4 Trasformazione delle cellule batteriche ... 27
3.5 Trasformazione delle cellule di lievito... 28
3.6 Southern Blot ... 31
3.7 Costruzione di un vettore d’espressione per Cap in lievito... 39
3.8 Western Blotting ... 45
4. RISULTATI ... 53
4.1 Replicazione del genoma del virus adeno-associato in S. cerevisiae: ... effetto delle ITRs e delle proteine Rep ... 53
4.2 Stabilità del fenotipo URA+ nelle cellule di S. cerevisiae URA3+LEU2+ trasformate... 58
4.3 Studio sulla ricombinazione dei plasmidi pSubURA3 e pGRep68 ... 59
4.4 Identificazione degli intermedi di replicazione del genoma di AAV nellecellule di lievito trasformate... 60
4.5 Effetto di Rad50 e rad52 nella replicazione del genoma di AAV in lievito... 65
II 4.6 Costruzione di un vettore d’espressione per Cap in lievito e
caratterizzazione delle proteine virali mediante Western blot ... 67
5. DISCUSSIONE... 76
6. CONCLUSIONI... 80
