Progettazione e studio delle caratteristiche di autoorganizzazione di corti oligopeptidi

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SOMMARIO

1 Introduzione...1

1.1 L’Auto–Organizzazione Molecolare... 1

1.1.1 Principi Termodinamici dell’Auto–Organizzazione ... 1

1.1.1.1 Equazioni termodinamiche fondamentali dell’auto–organizzazione ... 1

1.1.1.2 Condizioni necessarie per la formazione di aggregati... 2

1.1.1.3 Variazione di

µ

_N0_con

_N

_{per strutture semplici di diverse geometrie ... 2}

1.1.1.4 La concentrazione di aggregazione critica (CAC) ... 3

1.1.1.5 Aggregati infiniti e aggregati di dimensione finita... 4

1.1.1.6 Distribuzione dimensionale di strutture auto–organizzate ... 5

1.1.2 Auto–Organizzazione di Polipeptidi in Sistemi Biologici ... 7

1.1.2.1 Amiloide associato al morbo di Alzheimer ... 7

1.1.3 Sistemi Oligopeptidici Auto–Organizzati ... 8

1.1.3.1 Oligopeptidi a complementarità di carica... 8

1.1.3.2 Oligopeptidi per modifiche superficiali... 10

1.1.3.3 Oligopeptidi tensioattivi ... 11

1.2 Materiali Biocompatibili per Ingegneria Tissutale ... 12

1.2.1 Biocompatibilità ... 12

1.2.2 Idrogeli ... 13

1.2.2.1 Idrogeli polimerici ... 13

1.2.2.2 Idrogeli da soluzioni colloidali di molecole a basso peso molecolare ... 13

1.2.3 Ingegneria Tissutale ... 14

1.2.3.1 Idrogeli per ingegneria tissutale ... 15

1.3 Scopo della tesi... 16

2 Materiali e Metodi ...17

2.1 Materiali ... 17

2.1.1 Prodotti Chimici ... 17

2.1.1.1 Oligopeptidi ... 17 2.1.1.2 Antibiotici... 17 2.1.1.3 Glutammina ... 17

2.1.2 Prodotti singolo uso... 17

2.1.2.1 Filtri ... 17

2.1.2.2 Plastiche sterili per colture cellulari ... 17

2.1.3 Tamponi e Soluzioni Saline ... 17

2.1.3.1 Tamponi fosfato... 17

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2.1.3.3 Soluzione di idrossido di sodio... 18

2.1.4 Soluzioni degli Oligopeptidi ... 18

2.1.4.1 Per misure di diffusione della luce ... 18

2.1.4.2 Per misure di viscosità ... 18

2.1.4.3 Per misure AFM ... 18

2.1.5 Substrati per Misure AFM ... 18

2.1.5.1 Mica muscovitica... 18

2.1.5.2 Grafite pirolitica (HOPG) ... 19

2.1.6 Reagenti per Prove Biologiche e Terreni di Coltura... 19

2.1.6.1 Neutral Red ... 19

2.1.6.2 Reagente di Proliferazione Cellulare WST-1 ... 19

2.1.6.3 Siero bovino fetale (FBS) ... 19

2.1.6.4 Tampone fosfato salito senza Ca2+_{e Mg}2+_{... 19}

2.1.6.5 Terreno di coltura cellulare DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium) ... 19

2.1.6.6 Terreno di coltura cellulare completo (DMEM)-10% di siero ... 19

2.1.6.7 Terreno di coltura cellulare EMEM (Earle's Minimum Essential Medium) ... 19

2.1.6.8 Terreno di coltura cellulare completo (EMEM)-10% di siero... 19

2.1.6.9 Tripsina-EDTA ... 20

2.1.7 Linee Cellulari ... 20

2.1.7.1 Fibroblasti embrionali murini balb/3T3 clone A31 ... 20

2.1.7.2 Cellule di epatoblastoma umano (HepG2)... 20

2.2 Metodi ... 21

2.2.1 Misure di Diffusione della Luce ... 21

2.2.2 Misure di Assorbimento UV-Visibile... 21

2.2.3 Misure di Microviscosimetria ... 21

2.2.3.1 Misura della viscosità nel tempo ... 22

2.2.3.2 Determinazione della CAC... 22

2.2.4 Misure di Microscopia a Forza Atomica ... 22

2.2.4.1 Microscopio a forza atomica... 22

2.2.4.2 Sonde AFM... 22

2.2.4.3 Scansioni AFM in aria ... 23

2.2.4.4 Scansioni AFM in liquido... 23

2.2.5 Valutazioni Biologiche ... 23

2.2.5.1 Misure di microscopia ottica... 23

2.2.5.2 Lettore per micropiastre... 24

2.2.5.3 Congelamento e scongelamento delle cellule... 24

2.2.5.4 Subcolture di linee cellulari immortalizzate ... 24

2.2.5.5 Analisi di citotossicità mediante saggio WST-1... 24

2.2.5.6 Saggio di vitalità cellulare con il colorante Neutral Red ... 25

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3 Risultati e Discussione...27

3.1 Selezione di Corti Oligopeptidi a Alternanza di Carica ... 27

3.2 Tossicità di Oligopeptidi ... 31

3.3 Concentrazione di Aggregazione Critica di Oligopeptidi... 35

3.3.1 Misure di Diffusione della Luce... 35

3.3.1.1 La diffusione statica della luce ... 35

3.3.1.2 Diffusione della luce in soluzioni acide di oligopeptidi ... 37

3.3.2 Microviscosimetria di soluzioni peptidiche ... 39

3.4 Morfologia degli Aggregati degli Oligopeptidi ... 45

3.4.1 La Microscopia a Forza Atomica ... 45

3.4.1.1 La sonda... 46

3.4.1.2 Il rivelatore di deflessione ... 47

3.4.1.3 Il trasduttore piezoelettrico... 48

3.4.1.4 Sistema di feedback ... 49

3.4.1.5 La curva forza–distanza... 49

3.4.1.6 Forze di van der Waals ... 50

3.4.1.7 Jump to contact e forze di adesione... 51

3.4.1.8 Forze di repulsione ... 52

3.4.1.9 Deformazione elasto–plastica del campione ... 52

3.4.1.10 Forze in un mezzo acquoso ... 52

3.4.1.11 Modalità operativa statica ... 54

3.4.1.12 Modalità operative dinamiche ... 55

3.4.2 Misure AFM su Oligopeptidi Depositati su Mica ... 58

3.4.2.1 RWDW ... 59

3.4.2.2 RVDV... 60

3.4.2.3 RADA e RDAA... 60

3.4.2.4 RDVV, RADAR, EAKA, RADARAD, RDRDAAA, RGDG, RGDA... 62

3.4.3 Misure AFM al Variare delle Condizioni di Auto–Organizzazione ... 64

3.4.3.1 AFM di oligopeptidi depositati su grafite pirolitica ... 64

3.4.3.2 Influenza del tempo di esposizione al substrato ... 67

3.4.3.3 AFM in liquido ... 68

3.5 Idrogeli dell’Oligopeptide RWDW ... 71

3.5.1 Condizioni di Formazione ... 71

3.5.2 Crescita Cellulare negli Idrogeli di RWDW ... 72

4 Conclusioni...79

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