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UNIVERSITÀ DI PISA
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale
Dipartimento di Patologia Chirurgica, Medica, Molecolare e dell'Area
Critica
Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in
Medicina e Chirurgia
Corso di Laurea Magistrale in Medicina e Chirurgia
Tesi di Laurea
NOCARDIOSI: PATOLOGIA MISCONOSCIUTA
ESPERIENZA DELLA U.O. DI MALATTIE
INFETTIVE AOUP
CANDIDATO:
RELATORE:
Manuela Toscano
Prof. Francesco Menichetti
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Sommario
Abstract ... 4 1. Introduzione ... 5 2. Storia ... 7 3. Tassonomia ... 103.1 Nocardia asteroides complex ... 12
3.2 Nocardia abscessus (ex N. asteroides pattern di suscettibilità tipo I) ... 14
3.3 Nocardia brevicatena/paucivorans complex (include pattern di suscettibilità tipo II) ... 15
3.4 Nocardia nova complex (ex N. asteroides pattern tipo III, include N. africana, N.kruczakiae, N.nova, N.veterana e alcune specie senza nome) ... 15
3.5 Nocardia transvalensis complex (include N. asteroides pattern di suscettibilità di tipo IV) ... 18
3.6 Nocardia farcinica (ex N. asteroides tipo V) ... 20
3.7 Nocardia asteroides (Pattern di suscettibilità di tipo VI) ... 21
3.8 Nocardia brasiliensis e pseudobrasiliensis ... 22
3.9 Nocardia otitidiscaviarium complex (ex N.caviae) ... 23
4. Epidemiologia ... 25
5. Fattori di rischio ... 27
6. Caratteristiche microbiologiche e Meccanismi Patogenetici ... 29
7. Manifestazioni Cliniche ... 38
7.1 Significato della presenza di Nocardia spp. in campioni clinici ... 38
7.2 Nocardiosi Cutanea, Sottocutanea, Linfocutanea ... 40
7.3 Micetoma da Nocardia ... 42
7.4 Nocardiosi Polmonare ... 44
7.5 Nocardiosi Cerebrale ... 46
7.6 Nocardiosi Disseminata ... 48
7.7 Batteriemia / Infezioni correlate al catetere- CLABSI ... 50
8. Diagnosi ... 52
8.1 Esame diretto macroscopico e microscopico ... 52
8.2 Identificazione biochimica ... 55 8.3 Identificazione sierologica ... 57 8.4 Identificazione molecolare ... 58 8.5 Diagnosi differenziale ... 59 9. Terapia ... 60 10. Lo studio ... 67 10.1 Scopo ... 67
3 10.2 Materiali e Metodi ... 67 10.3 Risultati ... 70 10.4 Discussione ... 88 11. Conclusioni ... 101 12. Riferimenti Bibliografici ... 103
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Abstract
La nocardiosi è un’infezione causata da microorganismi appartenenti al genere Nocardia, noti per essere agenti patogeni di infezioni opportunistiche in pazienti immunocompromessi, in particolar modo con deficit dell’immunità cellulo-mediata, ma che possono interessare anche ospiti immunocompetenti.
Questi batteri sono responsabili di un ampio spettro di infezioni, localizzate o disseminate, con decorso clinico estremamente vario, cosa che unitamente alla scarsa conoscenza clinica, alle difficoltà di isolamento del microorganismo e alla mancanza di strategie diagnostico-terapeutiche univoche possono condurre a un importante ritardo diagnostico.
Obiettivo del nostro studio è di riuscire a fornire una panoramica sulla nocardiosi, studiandone caratteristiche demografiche, fattori predisponenti, manifestazioni cliniche, accertamenti diagnostici, terapia e outcome mediante l’analisi della Letteratura a nostra disposizione e delle cartelle cliniche dei pazienti ricoverati presso la Clinica di Malattie Infettive AOUP da Gennaio 2000 a Giugno 2017, e confrontando il nostro approccio diagnostico-terapeutico con i dati forniti dalla Letteratura.
La nostra casistica ha compreso un totale di 8 casi, di cui 25% con esclusiva localizzazione cutanea, 25% con esclusivo interessamento polmonare, 12,5% con nocardiosi cerebrale e 37,5% con nocardiosi disseminata.
La variabilità dei quadri clinici di presentazione, l’outcome e la difficoltà di attuare una diagnosi riscontrati nella nostra casistica, seppur così limitata, ha trovato complessivamente una conferma nei dati riportati in Letteratura.
Sebbene, quindi, la nocardiosi resti una patologia rara, che negli ultimi decenni ha subito un aumento dell’incidenza, da correlare sia all’incremento delle condizioni predisponenti che al miglioramento delle tecniche bio-molecolari atte al suo riconoscimento, rimane di difficile riconoscimento e quindi una patologia che il clinico deve imparare a conoscere e riconoscere, e per la quale speriamo che il nostro lavoro abbia dato un contributo.
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1. Introduzione
Il genere Nocardia è costituito da gruppo di actinomiceti aerobi appartenenti all’ordine degli Actinomycetales, noti per essere agenti patogeni di infezioni opportunistiche in pazienti immunocompromessi, ma che possono tuttavia causare malattia anche nell’ospite immunocompetente 7-9.
Per molti anni le Nocardiaceae sono state erroneamente classificate per la caratteristica microscopica di formare filamenti simili alle ife fungine, estensione dei tubuli germinativi e caratteristica peculiare dei miceti 10.
Successivamente, sulla base della composizione della parete cellulare, in particolare dell’envelope lipidico e del peptidoglicano, gli Actinomycetales e quindi anche il genere
Nocardia sono stati indiscutibilmente riconosciuti come batteri 10.
La Nocardia è un microorganismo saprofita e ubiquitario, ampiamente distribuito nell’ambiente, che può essere ritrovato nell’aria, nel terreno, nella vegetazione in decomposizione, nella sabbia, nella polvere, nelle feci animali, così come in tutte le altre forme di materia organica, e persino nell’acqua di mare e delle piscine 5,10-13. È inoltre presente come normale commensale della flora orale e nelle tasche periodontali nei soggetti sani 14,15.
Grazie alla loro capacità di diffondere in qualsiasi distretto del corpo umano, tali batteri si rendono responsabili di un ampio spettro di infezioni, localizzate o disseminate, con decorso clinico estremamente vario, acuto, subacuto o, più frequentemente, cronico e con marcata tendenza alla recidiva 8,15.
Come già osservato, la nocardiosi interessa prevalentemente pazienti immunocompromessi: i soggetti maggiormente a rischio di sviluppo di infezione risultano quelli sottoposti a trapianto di organo solido e midollo osseo, terapie protratte con corticosteroidi, pazienti affetti da neoplasie maligne ematologiche e non, malattie del tessuto connettivo, infezioni da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), malattie croniche (bronco-pneumopatia cronica ostruttiva, diabete mellito, cirrosi epatica, insufficienza renale), vasculiti sistemiche, colite ulcerosa; tuttavia circa un 10% dei soggetti affetti da nocardiosi non presenta alcuna condizione predisponente 5,8,9,11,16-18. La nocardiosi, pur mancando di una sintomatologia specifica, offre un’ampia varietà di manifestazioni cliniche: polmonare, cerebrale e cutanea. La totale aspecificità dei sintomi e dei segni a fronte delle localizzazioni d’organo le ha fatto guadagnare l’appellativo di “grande ingannatrice” 18.
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Il carattere indolente della maggior parte dei casi, unitamente alla sintomatologia aspecifica e confondente e alla difficoltà di identificazione e isolamento rendono ragione della sottostima della vera incidenza e della poca comprensione della reale importanza di tale patologia.
Negli ultimi anni, grazie anche alle tecniche di biologia molecolare e quindi alla maggiore conoscenza di questo batterio, l’attenzione rivolta verso tale patologia sta aumentando con conseguente incremento di casi diagnosticati.
Il contemporaneo aumento delle patologie e delle terapie predisponenti lo stato di immunosoppressione, e quindi facilitanti l’infezione da Nocardia spp., spiega perché ci debba essere una maggiore presa di coscienza da parte del clinico sul reale ruolo patogenetico della nocardiosi.
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2. Storia
Il genere Nocardia fu scoperto e descritto per la prima volta da Edmund Nocard (Provins, 29 gennaio 1850- Saint Maurice, 2 agosto 1903), veterinario e microbiologo francese, stretto collaboratore di Pasteur, che nel 1888 sull’Isola di Guadalupe isolò un microorganismo aerobio filamentoso da un bovino affetto linfadenite 19,20.
Nel 1889, Trevisan chiamò il microorganismo isolato da Nocard, Nocardia farcinica, in onore del suo scopritore 2.
Un anno più tardi, nel 1890, Eppinger isolò da un ascesso cerebrale umano un patogeno simile a quello scoperto da Nocard, anch’esso aerobio, gram-positivo, ramificato, filamentoso 19. Questo microorganismo cresceva sul terreno di coltura dando origine a “piccole colonie a forma di stella” e proprio per questo aspetto fu chiamato Cladothrix
asteroides e solo nel 1896 venne rinominato Nocardia asteroides19,21.
Nel 1954, N. farcinica divenne la specie “tipo” del genere Nocardia e il ceppo isolato da Trevisan fu designato quale ceppo di riferimento della specie N. farcinica. Campioni dei ceppi originali, conosciuti come N. farcinica Trevisan, furono conservati in due differenti ceppoteche, ma studi fenotipici successivi dimostrarono che si trattava di due differenti microorganismi; infatti, un ceppo era appartenente alla famiglia delle Micobacteriaceae (NCTC 4524), mentre l’altro era un ceppo di Nocardia (ATCC 3318) 12.
Nel 1962, gli studi tassonomici di Gordon e Mihm mostrarono che non vi era alcuna differenza fenotipica tra il ceppo ATCC 3318 e il ceppo conosciuto come N. asteroides 2.
A causa della incerta classificazione tassonomica di N. farcinica e al crescente numero di isolamenti di N. asteroides, Gordon e Colleghi richiesero alla International Judicial Commission di raggruppare queste due specie: N. asteroides fu scelta al posto di N.
farcinica come specie “tipo” del genere Nocardia e contemporaneamente fu selezionato
un nuovo ceppo di riferimento, N. asteroides ATCC 19247 2,12,21.
Nonostante non sia conosciuto quale dei due ceppi di N. farcinica presenti nelle ceppoteche sia l’originario di Nocard, il ceppo ATCC 3318 possiede tutte le caratteristiche della Nocardia e studi successivi, iniziati nel 1969 con Tzukamura e poi continuati successivamente da altri Autori, dimostrarono che microorganismi che si pensava appartenessero a N. asteroides, contenevano in realtà un sottogruppo di isolati biochimicamente e immunologicamente uguali al ceppo ATCC 3318, ma non al ceppo ATCC 19247 12.
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L’International Commission continuò ad usare la designazione N. farcinica, benché la distinzione tra le specie N. Farcinica e N. Asteroides fosse rimasta controversa, e solo recentemente, grazie a test di suscettibilità e a studi bio-molecolari, N. farcinica è stata definitivamente separata da N. asteroides 12.
I cambiamenti nella tassonomia, per l’identificazione dei vari membri della specie di
Nocardia, iniziarono anni prima della diffusione del sequenziamento genico.
Nel 1988, Wallace et al. studiarono 78 isolati identificati come N. asteroides, valutandone la suscettibilità antibiotica, e ciò permise loro di classificare gli isolati in sette gruppi differenti 22. Tra questi, quello definito “miscellaneous”, corrispondeva solo a un 5% dei campioni testati e mostrava caratteristiche fenotipicamente simili tra loro, ma estremamente varie sotto un profilo di suscettibilità antibiotica, e proprio in questo gruppo fu inserita N. asteroides.
Pur essendo tutti i 78 isolati biochimicamente simili tra loro, Wallace e Colleghi ritenevano che ci fosse una sufficiente diversità tra i pattern di suscettibilità e che ciò stesse ad indicare una significativa eterogeneità degli isolati, e, dato che non avevano possibilità di dimostrare che gli isolati appartenessero a specie differenti, consigliarono di usare il termine “N. asteroides complex” 22,23.
Prima dell’avvento della biologia molecolare, le specie di Nocardia erano identificate, soprattutto nei laboratori clinici, usando batterie di esami biochimici, quale l’idrolisi di alcuni substrati, come, ad esempio, caseina, xantina, tirosina e ipoxantina, che richiedevano tempi molto lunghi di incubazione. Con questo metodo di identificazione, i laboratori classificarono molti degli isolati che non riuscivano a idrolizzare questi substrati come N. asteroides; infatti, in passato, la Letteratura scientifica faceva costantemente riferimento a N. asteroides come la specie di Nocardia di maggior riscontro nelle infezioni umane.
Successivamente, grazie a numerosi lavori pubblicati negli anni ’90, fu scoperto che una gran percentuale degli isolati che erano stati identificati come N. asteroides, erano invece
N. farcinica o N. nova e, proprio per tal motivo, al British Columbia Center for Disease
Control a Vancouver, McNabb e Colleghi decisero di lanciare uno studio su 188 isolati che erano stati precedentemente identificati nei loro laboratori come N. asteroides. Grazie al sequenziamento del rRNA 16s, fu determinato che il 98% degli isolati apparteneva ad altre specie di Nocardia e tra queste le più comuni erano N.
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Tutte queste specie, infatti, non idrolizzano la caseina, la xantina e la tirosina e proprio per tal motivo erano state identificate come N. asteroides.
Soltanto un isolato fu confermato come N. asteroides e pertanto quest’ultima si è rivelata essere una rara causa di infezioni umane, contrariamente a quanto precedentemente pensato 21.
Le specie di Nocardia risultavano difficili da identificare basandosi solamente sulle caratteristiche fenotipiche a causa dell’individuazione di un numero di specie in continuo aumento e della scarsa disponibilità in commercio di test biochimici.
Una valida e utile alternativa ai test fenotipici è stata rappresentata dai saggi con endonucleasi di restrizione (REA), che sfrutta la variabilità all’interno dei geni in specie differenti.
Le endonucleasi di restrizione sono enzimi che riconoscono una specifica sequenza, con lunghezza variabile dalle 4 alle 15 basi, e tagliano il DNA nel punto in cui questo presenta quella determinata sequenza. La sequenza di basi di un particolare gene in gruppi di organismi correlati tra loro può essere costituita da alcune aree conservate, che risultano essere uguali in tutti i membri dello stesso gruppo, e da aree con sequenza variabile. Nel 1995 Steingrube e Colleghi grazie all’utilizzo di una PCR-REA di una heat shock
protein da 65 KDa (HSP65), prima amplificata con PCR e poi tagliata con le endonucleasi Msp1 e BsaH1, riuscirono a identificare 12 specie di Nocardia e, inoltre, misero in
evidenza le differenze molecolari presenti nel gruppo di N. asteroides descritto in precedenza da Wallace 24.
Nel 2000, sempre grazie all’utilizzo di una PCR-REA di una regione di 999 bp di rRNA 16s, prima amplificata con PCR e poi clivata con le endonucleasi HinPII, DnpII, BstEII e SphI, furono descritte 10 specie di Nocardia 25.
Grazie alla metodica della PCR, tutte le specie di Nocardia sono state amplificate, fatta eccezione per N. asteroides del gruppo IV di Wallace che ha mostrato amplificazioni discordanti.
L’analisi delle sequenze di rRNA 16s sono abbastanza variabili da consentire la discriminazione di un certo numero di specie 26.
Grazie alle metodiche di biologia molecolare si è riusciti perciò a identificare numerose specie del genere Nocardia, il cui numero è costantemente in crescita, avendo al giorno d’oggi raggiunto e superato le 100 specie, e di queste più di 30 sono quelle di interesse umano 27,28.
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3. Tassonomia
Filogeneticamente, il genere Nocardia appartiene al sottordine delle Corynebacterineae, insieme ad altre famiglie, tra cui Mycobacteriaceae e Corynebacteriaceae, e tutte queste presentano struttura cellulare simile. La classificazione filogenetica è visibile in figura 1.
La classificazione tassonomica della Nocardia spp. è in continua evoluzione e molto dibattuta.
Nel 1988, quando ancora erano note solo poche specie di Nocardia, Wallace e Colleghi pubblicarono un lavoro, intitolato “Antimicrobial susceptibility patterns of Nocardia
asteroides”, considerato una delle pietre miliari nella storia della Nocardia spp. poiché
poneva nuove basi per l’identificazione delle specie basate sul profilo di suscettibilità antibiotica (la classificazione in pattern è riportata in figura 2) 22,29.
Class Actinobacteria Subclass Actinobacteridae Order Actinomycetales Suborder Corynebacterianeae Famiglia Tsukamurellaceae Genere Tsukamurella Famiglia Nocardiaceae Genere Gordonia Genere Nocardia Genere Rhodococcus Genus Williamsia Famiglia Dietziaceae Genere Dietzia Famiglia Segniliparaceae Genere Segniliparus Famiglia Corynebacteriac eae Genere Corynebacterium Famiglia Mycobacteriaceae Genere Mycobacterium
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Questo lavoro non solo ha apportato nuove conoscenze sulla sensibilità ai farmaci e la conseguente risposta al trattamento, ma ha anche rappresentato il punto di partenza per tutti i successivi studi classificativi.
Specie Pattern di
sensibilità ai farmaci corrispondente
Principali caratteristiche del pattern
N.abscessus I Sensibile ad ampicillica,
amoxicillina-clavulanato, ceftriaxone, linezolid e amikacina; la maggior parte hanno alte MIC per imipenem; Resistenti a ciprofloxacina e claritromicina
N. brevicatena/paucivorans complex, gruppo senza nome
II Come il pattern I, ma la MIC per la kanamicina e più bassa ed è sensibile a ciprofloxacina; solitamente è resistente a gentamicina; resistente a claritromicina
N. nova complex (N. nova, N. veterana, N. africana, N. kruczackiae)
III Sensibile ad ampicillina, ma resistente ad amoxicillinaclavulanato; sensibile a eritromicina, claritromicina, linezolid e ceftriaxone; presenta MIC molto basse per imipenem e amikacina
N.transvalensis complex IV Resistente a tutti gli aminoglicosidi, inclusa amikacina; Sensibile a ciprofloxacina, ceftriaxone, linezolid e imipenem; resistente a eritromicina e claritromicina
N. asteroides complex V Resistente ad ampicillina, cefalosporine ad ampio spettro e claritromicina; resistente agli aminoglicosidi, eccetto amikacina; sensibile a ciprofloxacina, linezolid e imipenem
N. asteroides tipo VI (specie
senza nome), N.
cyriacigeorgica
VI Resistente ad ampicillina, amoxicillina-clavulanato, claritromicina e ciprofloxacina; sensibile a ceftriaxone, amiacina, linezolid e imipenem
Il ceppo tipo ATCC è sensibile ad ampicillina e le altre sensibilità sono le stesse del pattern VI
N. brasiliensis Non Applicabile Sensibile a minociclina,
amoxicillina-clavulanato, carbenicilina e sulfametossazolo; resistente a kanamicina, cefamandolo, ampicillina, ciprofloxacina, claritromicina
N. pseudobrasiliensis Non Applicabile Sensibile a carbenicilina, ciprofloxacina, claritromicina e sulfametossazolo; resistente a kanamicina, cefamandolo, ampicillina, amoxicillina-clavulanato e minociclina
N. otitidiscaviarum Non Applicabile Sensibile a kanamicina, gentamicina,
amikacina, sulfametossazolo e ciprofloxacina; resistente a ceftriaxone, ampicillina,
amoxicillina-clavulanato, carbenicillina e imipenem (spesso resistente a tutti i β-lattamici)
Figura 2. Pattern di suscettibilità antibiotica delle specie di Nocardia 12
Il successivo utilizzo di metodi molecolari è stato determinante nel migliorare il riconoscimento delle specie: infatti, l’impiego di PCR-REA di hsp65 e dei geni
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dell’rRNA 16s nonché il sequenziamento genico dei geni di hsp65 e secA1 e soprattutto dell’rRNA 16s, hanno permesso il riconoscimento di numerose specie.
3.1 Nocardia asteroides complex
Storicamente, N. asteroides è stata definita come comprendente tutti quegli isolati di
Nocardia che non degradano la xantina, la tirosina e la caseina 30.
Nel 1951 Gordon, Mishra e Colleghi iniziarono a studiare cinque specie all'interno del genere Nocardia, tra cui N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis e altre due specie che sono state successivamente trasferite ad altri generi 12. Questi cinque gruppi furono confrontati con le nove specie di Nocardia conosciute a quel tempo usando le
Figura 3. Albero filogenetico di una regione di 1,382 bp del gene dell'rRNA 16s delle specie di Nocardia 2.
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caratteristiche fenotipiche e fisiologiche come la morfologia delle colonie e le reazioni di idrolisi di differenti sostanze biochimiche.
Successivamente, i ricercatori idearono un metodo per l'identificazione sperimentale delle specie di Nocardia, portando all'identificazione di molti isolati di importanza medica. Nel 1988, Wallace e colleghi suddivisero 78 isolati clinici, precedentemente identificati tutti come N. asteroides, in 7 pattern di suscettibilità agli antibiotici 22.
Questo lavoro ha rappresentato il più grande studio condotto sulle suscettibilità antimicrobiche di N. asteroides, dimostrando la variabilità dei pattern di suscettibilità ai farmaci raggruppando gli isolati in modelli specifici di suscettibilità.
Il problema del ceppo “tipo” è stato da subito evidente in questo studio, poiché nessuno dei sette gruppi di suscettibilità antibiotica corrispondeva al modello del ceppo tipo ATCC 19247. Ciò ha motivato i ricercatori a eseguire ulteriori studi sul profilo di resistenza ai farmaci da parte di N. asteroides (successivamente rinominato N. asteroides
complex) e sul significato tassonomico dei gruppi di Nocardia spp. individuati da Wallace
12,22.
Gli studi successivi sono stati eseguiti utilizzando metodi molecolari più moderni. Studi dettagliati sugli isolati secondo i sette pattern di suscettibilità ai farmaci di N.
asteroides hanno seguito il rapporto iniziale del 1988 e questi nuovi studi hanno descritto
diversi modelli di suscettibilità farmacologica come specie distinte di Nocardia.
Questi gruppi comprendevano isolati che seguivano il modello di suscettibilità di tipo I, che sono risultati identici agli isolati definiti come N. abscessus; gli isolati secondo il modello di suscettibilità di tipo III sono stati successivamente dimostrati fare parte di un complesso di organismi legati a N. nova 12,22,31. Isolati del pattern di tipo V sono stati riconosciuti essere N. farcinica e gli isolati appartenenti al pattern di suscettibilità di tipo VI sono risultati essere identici a N. cyriacigeorgica 12,22,32.
Il pattern di tipo II di Wallace deve ancora avere una denominazione di specie, ma è stato presumibilmente associato con N. brevicatena e N. paucivorans nel N. brevicatena /
paucivorans complex, nonché con alcuni isolati di N. carnea e di altre specie di Nocardia
in diversi cladi filogenetici 12,33,34.
Un altro tipo di pattern di suscettibilità ai farmaci, detto “miscellaneous”, include il ceppo tipo ATCC 19247 di N. asteroides, ma nessun isolato molecolarmente identico a questo ceppo è stato identificato come causa di malattia umana 12,22. Gli isolati appartenenti al pattern di suscettibilità di tipo sono stati poi inclusi nel complesso N. transvalensis insieme ad altri gruppi tassonomici 12.
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3.2 Nocardia abscessus (ex N. asteroides pattern di suscettibilità tipo I)
Nel 1988 Wallace et al. ha riconosciuto per la prima volta N. abscessus come appartenente al pattern di suscettibilità di tipo I di N. asteroides 22.
Questi isolati mostravano un peculiare pattern di suscettibilità ai β-lattamici, essendo suscettibili ad ampicillina, amoxicillina-clavulanato, carbenicillina e cefalosporine ad ampio spettro (cefotaxime e ceftriaxone), ma mostravano elevate MIC (da 8 a 32 μg/ml) per imipenem, rendendola così una delle poche specie, oltre a N. brasiliensis e a N.
otitidiscaviarum complex, resistenti a questo farmaco 22.
Inoltre, questa specie è sensibile a sulfametossazolo, gentamicina e amikacina e resistente a ciprofloxacina e agli altri fluorochinoloni, eritromicina e quindi, presumibilmente, alla claritromicina 22.
Dal punto di vista biochimico, questi isolati sono risultati relativamente asaccarolitici- ossia non in grado di idrolizzare polisaccaridi complessi- e usano il citrato come unica fonte di carbonio.
Nel 2000, Yassin e Colleghi descrissero tre ceppi clinici di Nocardia spp. che contenevano una sequenza di gene dell’rRNA 16s, mai descritta in precedenza, che mostrava il 98,9% di somiglianza con quella del ceppo tipo di N. asteroides, ATCC 19247 12,31. I tre ceppi clinici erano fenotipicamente identici a ATCC 23824, un ex ceppo di N.
asteroides complex, descritto da Wallace et al. come appartenente al pattern di
suscettibilità di tipo I 22.
In passato, mediante lo studio dei pattern di suscettibilità ai farmaci, era già stato dimostrato che questo gruppo rappresentava circa il 20% degli isolati clinici raggruppati all'interno di N. asteroides complex.
Biochimicamente, i tre ceppi clinici nello studio di Yassin et al. erano identici agli altri membri di N. asteroides complex in quanto non erano in grado di idrolizzare i substrati tradizionalmente testati, quali xantina, tirosina, caseina e ipoxantina 31.
L’analisi di una sequenza di 1.236 bp di geni dell’rRNA 16S dei tre ceppi clinici e di ATCC23824 dimostrò che questi erano identici al 100% 12,31.
Gli esperimenti di ibridazione del DNA hanno mostrato che tutti e quattro ceppi studiati da Yassin et al., cioè i tre ceppi clinici e ATCC3824, appartenevano alla stessa geno-specie 12.
Questi studi hanno stabilito che gli isolati appartenenti al gruppo di suscettibilità di tipo I di N. asteroides erano in realtà una nuova specie, chiamata N. abscessus.
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3.3 Nocardia brevicatena/paucivorans complex (include pattern di suscettibilità tipo II)
Questo complesso è composto da almeno due, ma più probabilmente tre specie, tra cui N.
brevicatena e N. paucivorans e da isolati appartenenti precedentemente pattern di
suscettibilità ai farmaci di tipo N. asteroides di tipo II 12.
N. brevicatena è stata precedentemente classificata come Micropolyspora brevicatena e
successivamente è stata trasferita al genere Nocardia sulla base della composizione della parete cellulare 12.
Gli isolati appartenenti al pattern di suscettibilità di tipo II di N. Asteroides hanno mostrato suscettibilità ad ampicillina, carbenicillina, ciprofloxacina, kanamicina e cefalosporina ad ampio spettro 22. Una caratteristica unica di questo gruppo era la suscettibilità all'amikacina, alla kanamicina e alla tobramicina e la contemporanea resistenza alla gentamicina.
Gli isolati sono relativamente inerti biochimicamente, gli unici carboidrati utilizzati risultano essere il trealosio e / o il L-ramnosio 33.
La N. brevicatena differisce da N. paucivorans solo nella sua utilizzazione di alcool isoamilico e di glicole propilenico 33.
Yassin et al. riportano che N. brevicatena e N. paucivorans mostrano un 99,6% di similitudine nelle sequenze geniche del 16S rRNA; tuttavia, i risultati degli studi di ibridazione del DNA e dei test fenotipici indicano che sono specie distinte 12,33.
3.4 Nocardia nova complex (ex N. asteroides pattern tipo III, include N. africana, N.kruczakiae, N.nova, N.veterana e alcune specie senza nome)
Tsukamura ha descritto per la prima volta N. nova nel 1982 come una specie separata, distinta da N. asteroides e N. farcinica, utilizzando l'analisi dei tratti fenotipici 12. Alcune caratteristiche fenotipiche insolite, quali l’attività arilsulfatasica a 14 giorni in circa il 70% dei ceppi e dell'attività di esterasi in circa il 64% dei ceppi, hanno permesso di distinguere N. nova dagli altri membri appartenenti a N. asteroides complex.
Tsukamura ha presentato due ceppi di riferimento, ATCC 33726 -designato come ceppo tipo- e ATCC 33727 e poiché i tassonomisti erano incerti sulla classificazione di questi ceppi, l'edizione del Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology del 1986 classificò N.
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Nel 1988 Wallace, nel suo studio sui pattern di suscettibilità ai farmaci degli isolati presenti all'interno del N. asteroides complex, ha identificato un gruppo suscettibile a eritromicina e ampicillina e che è stato designato come appartenente al pattern di suscettibilità di tipo III 22.
Questo gruppo includeva il ceppo tipo di N. nova ATCC 33726 presentato da Tsukamura. Nel 1990, gli studi di ibridazione del DNA hanno stabilito la N. nova è una specie valida, distinta dai ceppi tipo di N. asteroides e N. farcinica (rispettivamente ATCC 19247 e ATCC 3318).
Nel 1991, Wallace et al., utilizzando una combinazione di test biochimici e di suscettibilità antibiotica, hanno determinato che circa il 20% degli isolati clinici raccolti in due laboratori di riferimento in Texas e Minnesota precedentemente classificati come
N. asteroides, in realtà corrispondevano al modello di suscettibilità di tipo III e
appartenevano alla specie N. nova 35.
L'unico test biochimico disponibile in commercio per l'identificazione di N. nova era l'attività arilsulfatasica: una produzione positiva di arilsulfatasi dopo 2 settimane, combinata con la suscettibilità ad ampicillina ed eritromicina, e la resistenza ad amoxicillina-clavulanato, sono stati dimostrati essere i migliori metodi per l’identificazione fenotipica di N. nova in laboratorio 35.
Nel 2000 Conville e Colleghi, mediante PCR-REA dell’rRNA 16s, hanno mostrato che un isolato considerato appartenente a N. nova presentava invece geni differenti. L'analisi della sequenza dell’rRNA 16S ha mostrato che tale isolato aveva solo il 98,0% di somiglianza con il ceppo tipo N. nova, suggerendo che alcuni isolati ritenuti appartenenti a N. nova potessero effettivamente appartenere ad altre specie non riconosciute 25. La descrizione di ulteriori specie all'interno di N. nova iniziò nel 2001, quando Gürtler e colleghi descrissero una nuova specie: N. veterana 36.
Mediante l’analisi della sequenza genica dell’rRNA 16S, N. veterana ha mostrato il 98,6% di somiglianza con il ceppo tipo N. vaccinii (noto solo come patogeno vegetale) e 98,1% di somiglianza con N. nova 36.
Gli studi di ibridazione del DNA hanno dimostrato che il ceppo tipo di N. veterana corrisponde solo per il 33% a N. nova 25.
La differenziazione fenotipica delle due specie è complicata poiché N. veterana ha un pattern di suscettibilità antibiotica indistinguibile da quello di N. nova 12,37. Ciò
comprende MIC più elevate verso amoxicillina-clavulanato rispetto all’ampicillina a causa di una β-lattamasi rilevabile solo dopo l'induzione con clavulanato, un fenomeno
17
originariamente descritto da Wallace et al. e presente anche in N. nova 12,35. L’utilizzo delle sole caratteristiche fenotipiche risulta non affidabile per la distinzione degli isolati di N. veterana da quelli di N. nova.
Il secondo ceppo di N. nova presentato da Tsukamura nel 1982 -l’ATCC 33727- dimostrò di avere una somiglianza del 100% con la sequenza genica dell’rRNA 16s di N. veterana 34,38.
Nel 2001, Hamid et al. descrisse una seconda nuova specie, N. africana, la cui sequenza genica dell’rRNA 16s assomigliava a N. vaccinii 39. In tale studio, la N. africana è risultata
fenotipicamente differente dal ceppo tipo di N. nova in quanto N. africana cresce a 45°C e idrolizza solo la caseina. Hamid e colleghi riportarono inoltre che gli isolati di N.
africana sono suscettibili ad amoxicillina, ampicillina, doxiciclina ed eritromicina ma
resistenti a gentamicina, kanamicina e sulfametossazolo.
L’analisi della sequenza dei geni dell’rRNA 16s ha mostrato che N. africana è simile per il 98,4 e il 99,0% ai ceppi tipo rispettivamente di N. nova e di N. veterana 37.
Nel 2004, Conville et al. descrisse una terza specie appartenente al complesso N. nova,
N. kruczakiae 12.
Come N. africana, anche questa specie è risultata indistinguibile da N. nova e N. veterana mediante PCR-REA di hsp65 e test di suscettibilità antimicrobica ed è apparsa identica a
N. africana e N. veterana con la PCR-REA dell’rRNA 16s.
N. kruczakiae mostra una somiglianza molto alta del gene rRNA 16s con N. veterana
(99.8%) ed è simile per il 99.3 e 98.1% rispettivamente a N. africana e N. nova 12. Conville e Colleghi hanno concluso che i test fenotipici ottimali per la differenziazione tra N. africana, N. kruczakiae, N. nova e N. veterana sono la produzione di arilsulfatasi a 14 giorni, l’idrolisi di esculina e caseina e produzione di acido a partire da D-galattosio, glicerolo, raffinato, salicina e trealosio.
Tuttavia, pochi isolati di ciascuna specie, identificati grazie al sequenziamento del gene dell’rRNA 16s, sono stati analizzati utilizzando solo questi criteri fenotipici e, pertanto, l'identificazione di queste specie con metodi fenotipici dovrebbe essere considerata provvisoria; l’'identificazione definitiva delle specie attualmente richiede i test molecolari.
Nel 2004, Wilson e Colleghi hanno analizzato 92, successivamente ampliati a 101, isolati clinici identificati come N. nova sulla base dei risultati di PCR-REA di hsp65 e dei modelli di suscettibilità antibiotica 12. Il 64% erano appartenenti a N. nova e di questi solo
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il 40% lo era effettivamente, mentre il resto degli isolati apparteneva a N. kruczakiae, N.
veterana, o a specie ancora da descrivere.
Questo studio dimostra l'eterogeneità degli isolati clinici considerati appartenenti a N.
nova e anche la necessità di ulteriori studi di ibridazione del DNA per consentire una
migliore caratterizzazione di tutte le specie.
Ne deriva che per l'identificazione ottimale di queste specie sono richieste sia la determinazione delle proprietà fenotipiche che i metodi molecolari; pertanto, i laboratori con la sola possibilità di studio delle caratteristiche fenotipiche dovrebbero considerare una designazione preliminare di "N. nova complex", che include N. africana, N.
kruczakiae, N. nova e N. veterana nonché probabilmente diverse altre specie cui deve
essere ancora dato un nome 12,26,34,37,40.
3.5 Nocardia transvalensis complex (include N. asteroides pattern di suscettibilità di tipo IV)
La prima descrizione di N. transvalensis risale al 1927, quando questa specie è stata riportata come causa di micetoma in un paziente africano 12.
Fino alla fine degli anni '90, tuttavia, solo pochi isolati di questa specie erano stati descritti in dettaglio.
Nel 1978 Gordon e Colleghi dimostrarono che cinque isolati di N. transvalensis avevano caratteristiche fenotipiche distinte tra loro. Tutti e cinque gli isolati degradavano ipoxantina, tirosina e urea, mentre non decomponevano la caseina. Solo due degli isolati degradavano xantina e adenina. Quattro dei cinque isolati hanno prodotto acido a partire dal mannitolo, dal sorbitolo e dal trealosio. Infine, tutti gli isolati idrolizzavano esculina e amido, producevano acido a partire da adonitolo, eritritolo, glucosio e glicerolo e utilizzavano il citrato 30.
Nel 1992, McNeil et al. misero in evidenza 15 isolati clinici che mostravano una grande variabilità circa le loro caratteristiche fenotipiche rispetto al ceppo di riferimento di N.
transvalensis, ma queste risultavano accomunate da un elevato grado di resistenza agli
antibiotici 41.
Nel 1997, Wilson et al. descrissero 56 isolati clinici di Nocardia spp. che classificarono come appartenenti ad un "N. transvalensis complex" basato sulle analogie dei pattern di suscettibilità antibiotica e sulle caratteristiche biochimiche 42.
19
Questi isolati sono risultati appartenere a quattro gruppi separati all'interno del N.
transvalensis complex.
Il primo gruppo assomigliava maggiormente al ceppo “tipo” di N. transvalensis 42. Il secondo gruppo di isolati comprendeva microrganismi appartenenti al N. asteroides
complex con pattern di suscettibilità antibiotica di tipo IV, originariamente osservato nella
descrizione del 1988 di Wallace dei pattern di suscettibilità antibiotica di N. asteroides e rappresenta la forma più comunemente isolata nel N. transvalensis complex 22.
Gli isolati classificati come tipo IV di N. asteroides e N. transvalensis erano generalmente resistenti a tutti gli aminoglicosidi, tra cui l'amikacina, una caratteristica unica all’interno di Nocardia spp 42.
I 31 isolati di N. asteroides di tipo IV sono stati distinti da N. transvalensis grazie ad alcune caratteristiche fenotipiche: i primi due taxa di tipo N. transvalensis e N. asteroides tipo IV presentano diverse caratteristiche biochimiche comuni, tra cui l'utilizzo di citrato, D-galattosio e D-trealosio, idrolisi di ipoxantina e un’uguale composizione in esteri dell’acido micolico evidenziata con la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) 12,42.
Gli ultimi gruppi all'interno del complesso N. transvalensis sono stati identificati e designati N. Transvalensis "New Taxon 1" e "New Taxon 2."
L'87% di questi isolati non utilizza il mio-inositolo ed è risultato suscettibile all'amoxicillina-clavulanato. I due taxa sono stati separati l'uno dall'altro sulla base delle differenze nell'utilizzo di D-glucitolo e D-mannitolo e inoltre mostravano un variabile grado di idrolisi di tirosina 42.
Con l'analisi enzimatica mediante PCR con enzimi di restrizione del frammento 441 bp del gene hsp65 e con l’analisi dei profili degli acidi grassi di 13 isolati di N. transvalensis è risultato che nessuno degli isolati clinici corrispondeva a ATCC 6865 e, con solo due eccezioni, erano così dissimili tra loro che non potevano essere raggruppati. Grazie all'analisi sequenziale dei 500 bp iniziali dell’rRNA 16s, Patel e Colleghi hanno dimostrato che i quattro gruppi all'interno del complesso N. transvalensis hanno omologie dal 98,0% al 99,2% con N. transvalensis ATCC 6865. L'unico gruppo con identità di sequenza al 100% era rappresentato da N. asteroides pattern di suscettibilità tipo IV 34. Sulla base di tali risultati, la designazione proposta per questi quattro taxa combinati è “N. transvalensis complex” e, anche se non tutti gli isolati possono soddisfare i criteri di resistenza in vitro all'amikacina, una definizione operativa dovrebbe includere la resistenza a tale aminoglicoside, caratteristica unica a questo gruppo 12,34,42.
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Esempi del pattern di suscettibilità di N. asteroides tipo IV (ATCC 49872 e ATCC 49873) e del New Taxon 1 (ATCC 700034 e ATCC 700035) sono stati depositati nella ceppoteca della American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va 12.
3.6 Nocardia farcinica (ex N. asteroides tipo V)
Durante lo studio dei modelli di suscettibilità antibiotica degli isolati appartenenti al complesso N. asteroides, Wallace e colleghi descrissero un gruppo di isolati con un profilo di suscettibilità unico che classificarono come pattern tipo V 22.
Successivamente dimostrarono che il ceppo tipo di N. farcinica apparteneva a questo pattern e che il ceppo Preceptrol ATCC, commercializzato come ceppo di riferimento di
N. asteroides (ATCC 3308), apparteneva infatti alla specie N. farcinica 43. Mediante l’utilizzo di una batteria di test biochimici, inclusa la crescita alla temperatura di 45 ° C, l'utilizzo di acetamide come fonte di azoto e di carbonio, la produzione di acido da ramnosio e la resistenza alla tobramicina e al cefamandolo, questo ceppo si è dimostrato tipico di N. farcinica come successivamente confermato da vari studi molecolari 43. L'analisi chemiotassonomica dei lipidi, il sequenziamento dei geni dell’ rRNA 16S e gli studi di ibridazione del DNA hanno stabilito N. farcinica come una specie distinta.44 Con il sequenziamento del gene dell’rRNA 16s, la maggior parte degli isolati clinici mostra l'omologia del 100% con il ceppo tipo ATCC 12,34.
Steingrube e colleghi hanno dimostrato che N. farcinica potrebbe essere differenziata da altre specie di Nocardia utilizzando PCR con enzimi di restrizione del gene hsp65 24. Gli isolati di N. farcinica hanno un pattern di suscettibilità ai farmaci specifico, caratterizzato dalla resistenza alla maggior parte degli antibiotici β-lattamici, tra cui cefamandolo (100%), cefotaxime (100%) e ceftriaxone (80%). Gli isolati sono anche resistenti agli aminoglicosidi, tra cui tobramicina (90%), kanamicina (100%) e gentamicina (100%), ma sono suscettibili ad amikacina (100%) 43.
Secondo gli studi di Wallace e Colleghi, il 100% era anche suscettibile a sulfametossazolo, all'82% all'imipenem, all'88% alla ciprofloxacina, e in bassa percentuale ad ampicillina ed eritromicina (5% e 3% rispettivamente) 43.
Nel 2004, Ishikawa et al. hanno determinato la sequenza genomica di un ceppo clinico di
N. farcinica 45. Il cromosoma circolare è risultato essere composto da oltre 6 milioni di coppie di base e inoltre sono stati identificati anche due plasmidi e svariati geni responsabili di virulenza e resistenza intrinseca ai farmaci.45
21
3.7 Nocardia asteroides (pattern di suscettibilità di tipo VI)
Questo rappresenta il pattern più comunemente isolato nel Sud degli USA.
Tale organismo è difficile da identificare utilizzando i test biochimici disponibili in commercio, mentre è più facilmente riconoscibile per la sua suscettibilità a cefamandolo, cefotaxime, ceftriaxone, amikacina, e imipenem e per la resistenza ad ampicillina, amoxicillina-clavulanato, ciprofloxacina, eritromicina e presumibilmente a claritromicina 12,22,26,43,46.
Numerose tecniche di biologia molecolare, tra cui la PCR con enzimi di restrizione del gene di hsp65 e del gene dell’rRNA 16s nonché il sequenziamento del gene dell’rRNA 16s, hanno consentito l'assegnazione più precisa di isolati clinici a questo gruppo. Nel 2001, Yassin et al. descrisse N. cyriacigeorgica isolata da secrezioni bronchiali di un paziente affetto da bronchite cronica 32. L’analisi della sequenza genica dell’rRNA 16s mostrò che questo organismo ha un elevato grado di somiglianza genomica con altre specie di Nocardia, ma è necessaria l’ibridazione del DNA per distinguerla da N.
asteroides, N. abscessus e N. paucivorans 12.
Due anni più tardi, nel 2003, Roth ha dimostrato che la sequenza del gene dell’rRNA 16s del ceppo di N. cyriacigeorgica è identica a quella del ceppo ATCC 14759, che fu selezionato da Wallace come ceppo di riferimento di N. asteroides pattern di suscettibilità agli antibiotici di tipo VI 46 .
Nel 2004, in seguito all’analisi di cinque isolati appartenenti al pattern di suscettibilità di tipo VI, Patel ha riscontrato pattern di suscettibilità simili, così come ha ottenuto gli stessi risultati utilizzando la metodica di PCR con enzimi di restrizione di hsp65 ed anche gli esiti dei test biochimici si sono rivelati simili, tranne che per i risultati variabili ottenuti con citrato, ramnosio e l'utilizzo di acetamide 34.
Tutti e cinque gli isolati sono cresciuti alla temperatura di 45°C in un tempo di 3 giorni. Per di più, i cinque isolati hanno mostrato sequenze parziali (500 bp) identiche dell’rRNA 16s. Questa sequenza ha mostrato una similitudine di sequenza del 100% con N.
cyriacigeorgica.
Studi successivi condotti sul profilo biochimico, con analisi PCR con enzimi di restrizione di hsp65, e sul pattern di sensibilità antibiotica di N. cyriacigeorgica hanno rivelato che questa è identica agli isolati di N. asteroides con pattern di suscettibilità di tipo VI.
22
3.8 Nocardia brasiliensis e pseudobrasiliensis
La specie conosciuta come N. brasiliensis è stata originariamente descritta da Lindenberg nel 1909 come Discomyces brasiliensis 12.
Altri sinonimi usati in Letteratura comprendono Streptothrix brasiliensis, Oospora
brasiliensis, Actinomyces brasiliensis e Actinomyces violaceus subsp. brasiliensis.12
N. brasiliensis differisce da tutte le altre specie riconosciute di Nocardia in quanto è più
frequentemente associata ad infezioni cutanee solitamente in soggetti immunocompetenti.
In clinica, gli isolati di N. brasiliensis sono tradizionalmente identificati utilizzando test biochimici e studiandone la composizione delle pareti cellulari 47.
N. brasiliensis degrada tipicamente la caseina e la tirosina, mentre dà risultati variabili
per quanto attiene il metabolismo di ipoxantina.
Nel 1995, Wallace et al. hanno dimostrato che alcuni isolati inizialmente identificati come
N. Brasiliensis erano in realtà fenotipicamente differenti da questa per caratteristiche
biochimiche e per l’appartenenza a pattern di suscettibilità distinti 47.
Inoltre, questi erano più spesso associati a malattie invasive in pazienti immunocompromessi.
La successiva analisi di sequenza dell’rRNA 16s e l'ibridazione del DNA hanno dimostrato che questi isolati appartengono a una specie distinta, la Nocardia
pseudobrasiliensis 12,47 .
Differenze significative nei modelli di suscettibilità sono stati osservati anche quando si confrontano isolati di N. brasiliensis e di N. pseudobrasiliensis: i primi sono tipicamente resistenti a ciprofloxacina e a claritromicina, a differenza dei secondi, e proprio sulla base di tale differenza è stato suggerito di effettuare il test di suscettibilità a questi due farmaci come metodo di screening per la differenziazione degli isolati. Inoltre, a differenza dei risultati ottenuti per N. pseudobrasiliensis, la maggior parte degli isolati di N. brasiliensis sono suscettibili ad amoxicillina-clavulanato, trimetoprim-sulfametossazolo e minociclina 47.
I due taxa sono distinguibili anche grazie all’attività della β-lattamasi; La maggior parte degli isolati di N. brasiliensis possiede tale enzima che conferisce resistenza verso svariati farmaci β-lattamici, tra cui cefalosporine, benzilpenicillina, cefoxitina e imipenem 12,47,48.
23
Due ceppi di N. pseudobrasiliensis, ATCC 51511 e ATCC 51512T, sono stati depositati nella ceppoteca dell’American Type Culture Collection 12.
3.9 Nocardia otitidiscaviarium complex (ex N.caviae)
N. otitidiscaviarium è stato riconosciuto per la prima volta da Snijders nel 1924 in una
cavia di Sumatra, un porcellino d'India affetto da una patologia dell'orecchio. "Caviarum", infatti, si riferisce al nome generico della cavia e "otitis" all'infiammazione dell'orecchio 12.
Nel 1935, Erikson la rinominò Actinomyces caviae e solo nel 1962 Gordon e Mihm la inserirono nel genere Nocardia proponendo il nome "Nocardia caviae" 12. Questi Autori affermarono che il termine N. otitidiscaviarium non era appropriato in base al Codice internazionale di nomenclatura dei batteri e dei virus del 1958; purtuttavia questa definizione è ormai abitualmente utilizzata per identificare i membri di questo genere.
N. otitidiscaviarium è stata ritrovato nel suolo ed è stata descritta anche come patogeno
opportunistico per umani e animali 12,49.
Nell’uomo, N. otitidiscaviarium è nota per essere causa di infezioni cutanee, linfocutanee e polmonari in pazienti immunocompetenti e immunocompromessi 12,50-52. Tuttavia, le infezioni sostenute da N. otitidiscaviarium sembrano essere rare rispetto a quelle causate da altre specie di Nocardia e non sono stati pubblicati resoconti di infezione umana fino alla metà degli anni Sessanta.52
Biochimicamente, N. otitidiscaviarium è distinto da altre specie di Nocardia per la sua capacità di idrolizzare sia l'ipoxantina che la xantina. L’analisi molecolare, compreso il sequenziamento dell’rRNA 16s, può essere necessaria per la conferma dell'identificazione delle specie 12.
Nel 2004, Patel e Colleghi studiarono 10 isolati clinici di N. otitidiscaviarium: nonostante i profili biochimici e i pattern di suscettibilità antibiotica fossero simili, l’analisi genetica di hsp65 effettuata mediante PCR con tre enzimi di restrizione (BstEII, MspI e HinfI) e il sequenziamento parziale dell’rRNA 16s, evidenziarono che tre isolati clinici avevano una sequenza identica a quella del ceppo di tipo ATCC 14629,mentre i restanti sei isolati avevano sequenze simili tra loro ma diverse da quelle del tipo N. otitidiscaviarium tipo
ATCC 14629, suggerendo che N. otitidiscaviarium possa rappresentare un complesso
24
Il grado di eterogeneità tra isolati identificati è stato sottolineato anche nello studio dei profili degli acidi grassi tra 20 ceppi differenti. I ceppi sono stati separati in tre gruppi, con i ceppi di riferimento ATCC 14629, ATCC 14630 e ATCC 27941 rappresentativi dei tre gruppi che gli Autori hanno designato rispettivamente A, B e C 53.
A causa della varietà chemiotassonomica e molecolare, Patel et al. hanno proposto di riferirsi a tali microorganismi con il termine “N. Otitidiscaviarium complex”, proprio per sottolinearne l’eterogeneità 34.
Gli isolati del N. otitidiscaviarium complex sono solitamente resistenti ai β-lattamici, tra cui la maggior parte delle cefalosporine a largo spettro, ad ampicillina, amoxicillina-clavulanato e imipenem, ma sono solitamente sensibili ad amikacina, ai fluorochinoloni e ai sulfamidici 12.
25
4. Epidemiologia
I dati circa la reale prevalenza e incidenza della nocardiosi sono tutt’oggi molto scarsi poiché questa patologia non presenta obbligo di notifica; nonostante ciò, la sua incidenza sembra essere in aumento, a causa del numero crescente di pazienti immunocompromessi e del miglioramento delle tecniche diagnostiche dei laboratori di microbiologia.
L’incidenza della nocardiosi varia marcatamente in base alla geografia in accordo con numerosi fattori, come la prevalenza delle infezioni da HIV, dei trapianti e delle neoplasie maligne ed anche condizioni climatiche, stato socio-economico e alla capacità del Laboratorio di rilevare e identificare le specie di Nocardia 54.
Negli ultimi anni, grazie all’interessamento crescente rivolto verso quest’infezione, sono stati condotti alcuni grossi studi in cui è stata valutata anche l’incidenza annuale della nocardiosi: in Australia del Nord è stata stimata un’incidenza di 2,02/100000 individui, che è risultata estremamente più alta rispetto a quella riscontrata in Canada, Spagna e Australia meridionale, in cui variava tra 0,47-0,87/100000 persone 17,55,56.
Tuttavia, in molti paesi in via di sviluppo dove sono diffuse altre malattie infettive croniche, come ad esempio la TBC, spesso la Nocardia spp. non viene rilevata o è erroneamente identificata 54.
Quest’infezione può interessare individui appartenenti a qualsiasi gruppo etnico e in qualsiasi fascia d’età, anche se sembra essere più frequente nei soggetti giovani e negli adulti, soprattutto tra i 20 e i 60 anni 15,57.
È molto rara nella popolazione pediatrica e si osserva principalmente in bambini con patologie polmonari gravi o con immunocompromissione significativa 18,58.
Risulta 2-3 volte più frequente nei maschi rispetto alle femmine e questo rapporto sembra variare anche in funzione della fascia d’età, arrivando ad essere addirittura 4:1 verso i 40 anni d’età 15,18,19,59.
Tali batteri sono ubiquitari e possono essere trovati in terreno, sabbia, polvere, materiale organico in decomposizione, feci animali e acqua, sia di mare che di piscina 11,57,60. I microorganismi vengono poi inalati con la polvere, specialmente nei luoghi con clima secco, determinando coinvolgimento polmonare in più del 70% dei casi 14,15.
Altra via di infezione è quella per inoculo diretto, che determina infezioni cutanee e sottocutanee che possono poi diffondere ai tessuti profondi.
26
Nella figura seguente è riportato un breve schema delle specie di Nocardia che causano infezione umana in ordine di frequenza.
Nonostante la nocardiosi interessi molti animali, come gatti, cani, cavie e bovini, non vi è alcuna evidenza di diffusione respiratoria dagli animali infetti agli esseri umani ed inoltre non vi è alcuna prova di trasmissione interumana 10.
La nocardiosi è solitamente un'infezione acquisita in comunità, sporadica, anche se sono stati descritti alcuni casi nosocomiali, di cui alcuni sotto forma di piccole epidemie 60,61. Un esempio lo ritroviamo nel caso di un focolaio epidemico in una unità di trapianto di rene in cui il microorganismo è stato trovato in campioni polvere e nell'aria dell'unità operativa, suscitando preoccupazioni e facendo ipotizzare che l'isolamento respiratorio potesse essere appropriato per alcuni tipi di pazienti immunocompromessi; comunque, ad oggi non vi è nessuna indicazione all’isolamento, sia respiratorio che da contatto, dei pazienti con nocardiosi 10,15,62,63.
Figura 4. Classificazione delle specie di Nocardia causa di infezione umana.
- N. asteroides sensu stricto tipo VI - N. brasiliensis
- N. farcinica - N. nova
Specie più frequenti:
- N. otitidiscaviarium - N. pseudobrasiliensis
Specie meno frequenti:
- N. abscessus - N. africana - N. brevicatena complex - N. carnea - N. paucivorans - N. transvalensis - N. veterana Specie rare:
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5. Fattori di rischio
La nocardiosi umana interessa individui sani in un terzo dei casi, ma più frequentemente i pazienti immunocompromessi, in particolar modo quelli con deficit dell’immunità cellulo-mediata 5. Le condizioni più frequentemente associate a nocardiosi sono riportate in figura 5.
Figura 5. Principali condizioni predisponenti.
• Indotti da terapie farmacologiche: • Farmaci steroidei a lungo termine • Antiproliferativi
• Anti-TNFα
• Inibitori della Calcineurina • Trapianti • Malattie autoimmuni • Connettiviti Stati immunodepressivi • DM • Epatopatie croniche • Insufficienza renale • Malattie granulomatose: • Sarcoidosi • Granulomatosi di Wegener Patologie croniche • Bronchiectasie • BPCO • Asma
• Proteinosi alveolare polmonare
Patologie polmonari croniche e/o anomalie polmonari strutturali • HIV/AIDS • TBC • CMV • Toxoplasmosi • Aspergillosi Infezioni concomitanti • Alcolismo
• Abuso di sostanze stupefacenti da inoculo
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Nell'ambito delle condizioni che determinano immunocompromissione, la nocardiosi sembra interessare principalmente i pazienti sottoposti a trapianti di organi solidi e di midollo osseo, i soggetti diabetici, i pazienti in terapia cronica con corticosteroidi sistemici, con farmaci immunosoppressori o in trattamento con anticorpi monoclonali, quelli con patologie polmonari croniche quali BPCO, proteinosi alveolare polmonare, bronchiectasie o con anomalie polmonari strutturali o funzionali, gli individui affetti da infezioni concomitanti quali HIV, TBC, CMV, Toxoplasma spp. e aspergillosi, i pazienti con malattie croniche granulomatose, LES, Sarcoidosi, Linfopenia Idiopatica, o affetti da neoplasie maligne solide o ematologiche, infine risultano a rischio anche i soggetti che abusano di alcool o di droghe per via endovenosa 5,15,19,55,59.
In particolar modo, i pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche hanno un rischio molto maggiore di nocardiosi rispetto a quelli sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe.
Lo sviluppo della malattia acuta da rigetto di trapianto - Graft-vs-Host Disease (GVHD)- e successivi trattamenti immunosoppressivi aggiuntivi possono rappresentare, almeno in parte, la causa dell’aumentato rischio di infezione nei pazienti che hanno subito il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeniche. In questi, la nocardiosi si può sviluppare con una latenza di tempo molto variabile, che va da 2- 3 mesi a 1- 2 anni dopo l'infusione delle cellule staminali 5.
Tra i riceventi del trapianto di organi solidi, la nocardiosi ha una frequenza da 0,6% a 3%: i riceventi di trapianto di polmone hanno la più alta incidenza di infezione da Nocardia spp., seguiti dai riceventi di cuore, piccolo intestino, reni e fegato 5,64.
29
6. Caratteristiche microbiologiche e Meccanismi patogenetici
La conoscenza delle caratteristiche microbiologiche e dell’aspetto microscopico della
Nocardia spp. risulta fondamentale per l’identificazione e la differenziazione di questi
batteri da altri microorganismi. Infatti, nonostante il continuo sviluppo di nuove metodiche diagnostiche, l’analisi microscopica diretta continua ad essere importante nel processo identificativo.
La Nocardia è un batterio intracellulare facoltativo, aerobio obbligato, immobile acapsulato, Gram positivo, negativo alla colorazione di Ziehl-Neelsen e debolmente positivo alla colorazione di Kinyoun, catalasi positivo e a lenta crescita; Agar Sabourad rappresenta il terreno selettivo per questi batteri 5,11,14,16,19,65,66.
Questi formano cellule filamentose ramificate che si frammentano in elementi pleomorfi, bastoncellari o coccoidi, come visibile in figura 6 19. L'estensione dei filamenti, la ramificazione laterale e l'uniformità del processo di frammentazione sono variabili e spesso dipendono dalle condizioni della coltura 19.
L'esame microscopico delle colonie di Nocardia coltivate su supporti solidi mostra che le cellule filamentose sporgono lontano dalla superficie di crescita sotto forma di ife aeree 19,65. Le colonie con abbondante crescita aerea hanno un aspetto cotonoso, caratteristica che può ricordare molti Streptomyces spp. o alcuni funghi 19.
I cambiamenti nella morfologia delle colonie sono direttamente correlati con l’età della colonia stessa: le colonie giovani presentano lunghi filamenti ramificati, mentre quelle più vecchie hanno elementi coccoidi o bacillari che derivano dalla frammentazione dei
Figura 6. Nocardia colorata con colorazione di Gram: sono visibili elementi bastoncellari ramificati. Courtesy of Stanley W Chapman, MD.
30
filamenti, caratteristica che, all’occhio inesperto, le può far apparire simili ai Micobatteri 65.
La maggior parte delle Nocardia spp. producono pigmenti carotenoidi che colorano le colonie con varie tonalità di giallo, arancione, rosa o rosso; mentre alcuni ceppi producono un pigmento idrosolubile, simile alla melanina, che colora in marrone il terreno di coltura. L'intensità dei pigmenti dipende dalle condizioni in cui è cresciuta la colonia.
La parete cellulare della Nocardia spp. è una struttura formata da più strati, complessa e in continua evoluzione. Questa infatti, durante la crescita, va incontro a numerose modificazioni chimiche e ultrastrutturali durante la crescita, che determinano cambiamenti nella superficie cellulare, nell’interazione tra cellule batteriche ed hanno anche importanti ripercussioni sulla virulenza dei batteri e sull’interazione ospite-patogeno. Lo studio di vari ceppi di Nocardia spp. in differenti momenti della loro crescita ha permesso di correlare la composizione cellulare e la morfologia del batterio con il grado di virulenza: infatti, la forma coccoide, tipica della fase stazionaria, risulta poco virulenta, a differenza delle cellule in fase di crescita logaritmica, durante la quale i batteri si presentano con ramificazioni filamentose e sono altamente virulenti; alcuni ceppi poi sono significativamente meno virulenti durante tutte le fasi della loro crescita. Tutte queste considerazioni hanno portato ad uno studio più attento dei singoli componenti della parete cellulare.
Il peptidoglicano delle cellule di Nocardia spp. è strutturalmente simile a quello del
Mycobacterium e di Rhodococcus spp.: l’unità basale è rappresentata dall’Acido
β-N-acetilglucosamil-1,4-N-glicolilmuramico con una L-Alanina legata al gruppo carbossilico dell’acido N-glicolilmuramico.
La catena laterale di aminoacidi è costituita da tripeptidi di L-Alanina-D-α-glutammina-meso-DAP e da tetrapeptidi di L-Alanina-D-α-glutammina-L-Alanina-D-α-glutammina-meso-DAP-D-Alanina. I tetrapeptidi si formano con legami crociati tra la D-Alanina di un polimero e l’Acido Meso-DiAminoPimelico di un altro, oppure fra residui di DAP su polimeri adiacenti. Nella maggior parte dei ceppi di N. asteroides, il peptidoglicano rappresenta solo il 20-25% della parete cellulare, anche se in alcuni momenti della crescita, come nella fase stazionaria, può arrivare a costituirne fino al 45%.
Il peptidoglicano, così come avviene nella parete cellulare dei micobatteri, è legato mediante legami fosfodiesterici ad un polimero di arabinogalattano e alcuni dei suoi residui di arabinosio vengono esterificati a molecole di acido micolico, formando un
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grosso complesso costituito da peptidoglicano, arabinogalattano e micolati. Alcune porzioni di questa struttura sono immunogene e posseggono epitopi che sono in comune con Micobacterium, Rhodococcus e Corynebacterium spp.
L’envelope di Nocardia spp. non contiene acidi teicoici, ma un grande numero di altre sostanze che sono legate con interazioni deboli o covalenti al complesso di peptidoglicano, arabinogalattano e acidi micolici.
Circa il 15-25% della parete cellulare è formato da peptidi e proteine talora complessati a formare lipopropteine, peptidolipidi o glicolipoproteine.
Un gran numero di specie di Nocardia contengono nella parete cellulare anche glucosio, mannosio e inositolo e il trealosio legato a due molecole di acido micolico in posizione 6,6’.
L’insieme Trealosio-6,6’-DiMicolato – TDM- viene detto “Fattore Cordale” e possiede numerose attività biologiche: è tossico, inibisce la fusione delle membrane con meccanismo calcio-dipendente, inibisce la fusione dei fagosomi-lisosomi all’interno dei macrofagi e sembra essere responsabile della virulenza di Nocardia.
Inoltre, alla parete cellulare sono saldamente legati anche specifici acidi grassi e acidi micolici e tra questi si ritrova una grande quantità di acido tubercolostearico, caratteristicamente presente nell’envelope di Mycobacterium, Rhodococcus e Nocardia spp., nonché in poche altre specie di actinomiceti a essi strettamente correlate. All’interno di una stessa cellula, in qualsiasi momento del ciclo cellulare, si trovano una grande varietà di acidi micolici di differente lunghezza: il grado di insaturazione e la lunghezza degli acidi micolici sono condizionati dallo stadio del ciclo cellulare in cui si trova il batterio in tale momento e dalla temperatura di crescita; i loro cambiamenti corrispondono a differenze nella tossicità e virulenza del batterio. Inoltre, proprio queste differenze nella grandezza e nel grado di non saturazione sono state utilizzate per suddividere il genere
Nocardia nei vari gruppi tassonomici.
I meccanismi patogenetici di tale microorganismo sono molteplici e risultano complessi e non del tutto conosciuti. Un loro schema riassuntivo è proposto in figura 7.
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La virulenza di N. asteroides risulta strettamente associata allo stadio di crescita in cui si trova il batterio e alla sua capacità di: inibire la fusione dei fagosomi-lisosomi, neutralizzare l’acidificazione fagosomiale, resistere ai meccanismi di killing ossidativo dei fagociti, alterare la produzione di enzimi lisosomiali nei fagosomi e infine di invadere e riprodursi all’interno delle cellule nervose nell’animale da esperimento.
• I ceppi virulenti di Nocardia spp. resistono allo "scoppio ossidativo" dei ROS grazie agli alti livelli di SOD e di catalasi
Resistenza al killing ossidativo
• Caratteristica esclusiva dei ceppi virulenti; il meccanismo non è del tutto noto, ma sembra che sia dovuta alla presenza del Fattore Cordale
Inibizione della fusione di fagosomi-lisosomi
• Alcuni componenti cellulari sembra bloccare l'acidificazione dei fagosomi nei macrofagi, permettendo la sopravvivenza della Nocardia spp. al loro interno
Blocco dell'acidificazione dei fagosomi
• I ceppi virulenti resistono al killing macrofagico riducendo i livelli di fosfatasi alcalina poichè quest'ultima è utilizzata come unica fonte di carbonio. Inoltre, la fosfatasi alcalina e il glutammato aumentano la crescita di Nocardia spp.
Alterazione della funzione fagosomiale e del contenuto lisosomiale
• Negli anni, sono state studiate varie molecole che, pur mostrando una potente attività tossica in vitro, in vivo hanno attività ridotta o non sembrano direttamente correlate al processo patogenetico
Tossine
• In vitro micro quantità di fattore cordale emulsionato in oli minerali sono letali per la cavia, inoltre compromette la migrazione
leucocitaria, ha attività antitumorale, immuno-modulatoria, è tossico per i mitocondri, induce reazioni granulomatose da corpo estraneo e sembra interferire con il sistema della coagulazione. Il TDM di N.
asteroides sembra in grado di alterare le proprietà biofisiche delle
vescicole liposomiali e di inibire la fusione delle membrane Ca⁺⁺-dipendente, nonché di inibire la fusione dei fago-lisosomi
Acidi micolici
• La Nocardia spp. perde la parete cellulare e dà la forma L, diventando Gram negativa. Il loro ruolo non è del tutto conosciuto, ma sembrano coinvolte nella patogenesi e nella latenza di sviluppo della malattia, nonché nella recidiva delle infezioni dopo una antibioticoterapia apparentemente riuscita
Forma L
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Anche alcuni componenti cellulari sembrano essere coinvolti in questo processo: alti livelli di catalasi, le SOD, il fattore cordale e le emolisine sono stati chiamati in causa.
- SOD e Catalasi:
La SuperOssido Dismutasi o SOD è un enzima antiossidante che neutralizza il radicale superossido (O₂ˉ ֹֹ) e quindi esercita un ruolo protettivo verso i metaboliti tossici dell’ossigeno degli organismi aerobi; la SOD è prodotta anche da alcuni batteri, infatti i ceppi virulenti di M. tuberculosis e N. asteroides la secernono nel terreno di coltura. L'interazione dei fagociti con la maggior parte dei microrganismi provoca uno “scoppio ossidativo” come dimostrato dal rilascio di metaboliti dell'ossigeno, quali il superossido e il perossido di idrogeno; tuttavia, i ceppi virulenti di Nocardia sono capaci di resistere al killing da parte dei PMN grazie agli alti livelli di catalasi: la SOD, sia quella secreta che quella adesa alla superficie, catalizza la dismutazione del superossido prodotto dall’interazione con fagociti. Il perossido di idrogeno che deriva da tale reazione viene poi metabolizzato dagli alti livelli di catalasi intracellulari.
- Inibizione della fusione di fagosomi-lisosomi:
Questa caratteristica è di esclusiva pertinenza dei ceppi virulenti. La capacità di inibire la fusione di fagosomi-lisosomi sembra essere in parte dovuta alla presenza di Trealosio-6,6’-DiMicolato (TDM) nella parete cellulare. Tuttavia, i precisi meccanismi responsabili dell'inibizione indotta dalle specie di Nocardia non sono completamente chiari.
- Blocco dell’acidificazione dei fagosomi:
Dopo l'ingestione di gran parte dei batteri e di altre particelle estranee, il pH delle cellule fagocitiche viene rapidamente abbassato intorno a 5, condizione che non permette la sopravvivenza dei microorganismi ingeriti. Sembra probabile che alcuni componenti cellulari di Nocardia spp. blocchino o neutralizzino l'acidificazione dei fagosomi all’interno dei macrofagi. Tuttavia, non è chiaro se queste sostanze siano le stesse che inibiscono la fusione dei fagosomi-lisosoma, perché l'acidificazione può avvenire sia in maniera indipendente dalla fusione di fago-lisosoma che come conseguenza della fusione stessa 19,67.
- Alterazione della funzione fagosomiale e del contenuto lisosomiale:
La crescita di ceppi virulenti di Nocardia spp. all'interno di macrofagi influenza i livelli dell’attività enzimatica lisosomiale. È stato infatti osservato che questi
