Analisi retrospettiva di casi di linfoma nel cane riferiti dal 2010 al 2015 presso l'ospedale dedattico Mario Modenato dell'universita di Pisa

Università di Pisa

Facoltà di Medicina Veterinaria

Specializzazione in Patologia e Clinica degli animali d‘affezione

Anno accademico 2015/2016

Analisi retrospettiva di casi di linfoma nel cane riferiti

presso l’ospedale didattico veterinario Mario Modenato

dell’Università Pisa dal 2010 al 2015

Canditato: Relatore:

Dott.Francesco Pellicanò Prof. George lubas

Correlatore:

Riassunto

Parola chiave: Linfoma, cane, segnalamento, classificazione citologica, immunofenotipo

I tumori ematopoietici, in particolare quelli che originano dai tessuti linfatici, sono tra le neoplasie che più frequentemente interessano la specie canina. L'esame citologico di un campione ottenuto per ago infissione linfonodale rappresenta il metodo più semplice per giungere a una diagnosi di linfoma; il ricorso, inoltre, ad un esteso pannello di analisi di laboratorio (emogramma completo, esame del midollo osseo, profilo biochimico, esame delle urine, profilo coagulativo, siero elettroforesi, radiografie toraciche ed ecografie addominali, sierologia per patologie trasmesse da vettori ed immunofenotipizzazione) consentono al clinico di emettere un corretto giudizio prognostico e impostare un adeguato protocollo terapeutico. Lo studio condotto in questo lavoro si basa su una analisi retrospettiva di 185 casi di linfoma pervenuti presso l‘Ospedale Didattico Veterinario Mario Modenato dell‘Università di Pisa negli anni 2010-2015. Attraverso questo studio è stata valutata l‘incidenza sul totale dei casi di linfoma rispetto al totale dei pazienti osservati. Partendo dal segnalamento, sono stati valutati: età media e mediana, la proporzione dei maschi e delle femmine, il sesso, la condizione sessuale e la razza. Sono state distinte e classificate le forme multicentriche di linfoma da ‗altre forme‘, e infine è stato eseguito uno studio citologico per distinguere il tipo di linfoma (High grade, Low grade) che insieme ai risultati dell‘immunofenotipo, hanno fornito importanti informazioni utili ai fini prognostici e terapeutici.

Indice

PARTE GENERALE Introduzione

1 IL LINFOMA……….…6

1.1 Incidenza . . . ………....6

1.2 Epidemiologia e fattori di rischio . . . ………...6

1.3 Classificazione………..7

1.3.1 Classificazione anatomica………..7

1.3.2 Classificazione WHO………..9

1.3.3 Classificazione istologica WHO……….9

1.3.4 Classificazione di Rappaport 1966………...11

1.3.5 Classificazione di Kiel e Kiel update………11

1.3.6 Classificazione Working Formulation……….14

1.4 Sintomatologia………15 1.5 Sindromi paraneoplastiche………..……..18 1.6 Diagnosi………..…….19 1.6.1 Diagnosi di laboratorio……….…....19 1.6.2 Esame citologico………....20 1.6.3 Immunofenotipo………...21 1.7 Stadio Clinico………..22 1.8 Fattori prognostici………..……23 PARTE SPECIALE Introduzione………..……..……….26 2 MATERIALI E METODI 2.1 Valutazione della casistica………..….26

3 RISULTATI……...………..…..27

3.1 Prevalenza……….…….27

3.3 Sesso e condizione sessuale……….…………27 3.4 Razza………...28 3.5 Linfoma multicentrico………..29 3.6 Altre forme……….…...29 3.7 Diagnosi citologica………..……..30 3.8 Immunofenotipo……….…...31 3.9 Concluzioni……….…….……..31 4 BIBLIOGRAFIA………....32

PARTE GENERALE

INTRODUZIONE

Il linfoma (o linfosarcoma) è la neoplasia maligna più comune del sistema ematopoietico del cane, derivante da una proliferazione clonale di linfociti maligni in tessuti solidi, presenta molte analogie con il gruppo dei NHL (Non Hodgkin's Lymphomas) dell'uomo ed anche per questo è stato ampiamente studiato.

Si tratta di una malattia sistemica a carattere progressivo, caratterizzata da proliferazione maligna e incontrollata di cellule del sistema linfoide arrestatesi in una fase precisa della loro naturale linea di trasformazione e può interessare linfonodi e altri visceri solidi come fegato e milza, oppure siti extranodali (intestino, stomaco, reni, cute, occhio, testicoli, osso, sistema nervoso centrale e periferico).

Si tratta di una malattia molto grave e debilitante, basti tener conto del fatto che i cani con linfoma non sottoposti a trattamento farmacologico hanno una sopravvivenza media di circa 2 mesi.

Questa tesi consiste in uno studio retrospettivo di una popolazione eterogenea di 200 cani, residenti prevalentemente in Toscana, in cui è stato diagnosticato un linfoma negli anni tra il 2010 e il 2015 presso il laboratorio di Ematologia Veterinaria del Dipartimento di Clinica Veterinaria dell'Università di Pisa.

Tutti i soggetti sono stati tipizzati dal punto di vista citologico attraverso l'esame del linfonodo e stadiati dal punto di vista clinico attraverso un'accurata visita clinica e l'esecuzione di un completo panello d'analisi comprendente emogramma, esame del midollo osseo, profilo biochimico, esame delle urine, profilo coagulativo, siero elettroforesi e, dove possibile, immunofenotipizzazione. Tutti questi esami, sono estremamente utili per l'inquadramento del soggetto in termini clinici, per la stadiazione della malattia e per l'emissione di un giudizio in termini prognostici.

IL LINFOMA :

Il termine linfoma indica un gruppo eterogeneo di neoplasie maligne dei linfociti T, B o nè T nè B, caratterizzata da proliferazione incontrollata di cellule del sistema linfoide, che si manifesta con masse tumorali solide che interessano i linfonodi, visceri come (fegato e milza) o ancora siti extranodali (intestino, stomaco, reni, cute, occhio, testicoli, osso, sistema nervoso centrale e periferico

Tra i disordini neoplastici del tessuto emopoietico il linfoma rientra nel gruppo dei disordini linfoproliferativi, insieme alla leucemia linfocitica acuta e a quella cronica. La differenza tra leucemia e linfoma si basa proprio sull'origine dell'emopatia: la prima infatti origina dal midollo osseo ed invade sistematicamente il sangue periferico[1], mentre nel linfoma l'invasione del sangue periferico avviene in conseguenza delle metastasi al midollo osseo da parte delle cellule tumorali. Il linfoma può quindi essere leucemico quando sono presenti in circolo cellule linfomatose, o aleucemico quando non ci sono tracce di tali cellule nel sangue periferico.

Incidenza :

È una delle neoplasie più frequenti nella specie canina. Rappresenta, infatti, circa l‘80% dei tumori ematopoietici ed il 5-7% di tutte le neoplasie del cane[4]. L‘età media dei cani colpiti è di 5,5-9,1 anni [5]. Tale neoplasia può raramente riscontrarsi in cani più giovani di un anno di vita, anche se pochi casi sono stati individuati tra cuccioli di soli quattro mesi.[Jack. E. Moulton, 1990] Non esiste una predisposizione di sesso, anche se alcuni autori riportano un minor rischio per le femmine intere [6]. Sono segnalate delle razze a rischio, quali i Boxer, Golden Retriver, Basset Hound, San Bernardo, Scottisch Terrier, Airedale Terrier e Bull Dog.[2] L‘elevata frequenza in alcune razze piuttosto che in altre, fa sospettare che tra gli agenti eziologici della malattia, possa giocare un ruolo importante la componente genetica. Si è riscontrata, inoltre, una certa prevalenza di malattia in certe linee di sangue. Sono stati anche riportati casi di raggruppamenti di linfomi maligni all‘interno degli stessi gruppi familiari.[3]

Epidemiologia e fattori di rischio:

Il linfoma è una patologia multifattoriale dal momento che non è stato individuato un singolo agente causale.

A differenza del gatto, nel cane non esistono prove certe di un'origine retrovirale del linfoma, tuttavia è stato dimostrato che le cellule linfomatose canine contengono alte quantità di trascrittasi inversa; sono state trovate particelle con proprietà retrovirali in cani affetti da linfoma ed è stata evidenziata un'attività di trascrittasi inversa nel sopranatante di colture cellulari di cani affetti [7] [8].

Il linfoma e tra le neoplasie più frequenti nel cane, rappresentando l‘80 per cento dei tumori ematopoietici e il 5-7 per cento di tutte le neoplasie del cane, l‘incidenza in Europa è di 30 nuovi casi ogni 100.000 anche se questi dati risultano sottostimati.

Numerosi studi hanno rivelato una potenziale associazione fra autoimmunità e/o sistema immunitario e neoplasia emopoietica nel cane.

E' riportato, ad esempio, che cani con trombocitopenia immunomediata presentavano una maggior occorrenza di linfoma rispetto a quelli non colpiti da tale disordine [13]. Nell'uomo è stato visto che la probabilità di manifestare un linfoma aumenta nei soggetti immunodepressi ed anche nel cane è

rilevabile una soppressione della risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata in corso di linfoma [12] Infine è stato ampiamente studiato il ruolo dei fattori ambientali sull'insorgenza della malattia, sebbene sia ancora sconosciuto il meccanismo d'azione e non sia chiaro se questi agiscano da soli o in concomitanza ad altri fattori predisponenti.

In particolare è stata riferita un'associazione tra il rischio di linfoma maligno nel cane e l'esposizione agli erbicidi a base di acido 2,4-diclorofenossiacetico; l'effetto di tale sostanza sarebbe dose-dipendente e massimo in quei casi che vivono in ambienti trattati 4 o più volte l'anno [9] [10] Altro fattore di rischio ambientale è l'esposizione a campi elettromagnetici a bassa frequenza (50-60 Hz): il rischio aumenta in quegli animali che passano più del 25% della loro giornata fuori casa [11] In merito a quanto detto fin'ora è interessante sottolineare come uno studio condotto presso il dipartimento di Clinica Veterinaria dell'Università di Pisa su 88 cani con linfoma ha dimostrato la presenza di una correlazione tra l'emopatia degli animali e l'uso da parte dei padroni di sostanze tossiche quali erbicidi, solventi, benzine e la residenza in zone a particolare inquinamento ambientale [9] [10].

Classificazione

La classificazione del linfoma maligno nel cane si basa su localizzazione anatomica, criteri citologici, classificazione istologica e caratteristiche immunofenotipiche [14].

La continua e rapida evoluzione classificativa dei linfomi riflette non solo maggiori conoscenze in campo biologico, ma anche la necessità di correlare tipo morfologico e riscontro clinico, ma soprattutto a terapia e prognosi.

L‘esperienza ci ha insegnato, in linea con quanto accade in medicina umana che esistono entità differenti da un punto di vista clinico e biologico e che richiedono pertanto trattamenti diversificati [4]

La volontà, quindi, di creare una correlazione tra il tipo morfologico e le evidenze cliniche, si è resa nel tempo più necessaria.

Esistono diversi modi per classificare il linfoma in veterinaria, e nessuno, da solo, risulta del tutto in grado di soddisfare l‘esigenza di ottenere una definizione esaustiva.

Classificazione anatomica

Linfoma multicentrico: è la forma più comune nel cane e si presenta nell‘ 84% dei casi. Si rileva linfoadenomegalia generalizzata non dolente, che interessa i linfonodi sottomandibolari, prescapolari, ascellari, inguinali e poplitei. Anche i linfonodi non esplorabili fisicamente possono essere aumentati di volume (sottolombari, sacrali e meseraici). È anche frequente il reperto di epatosplenomegalia.

Linfoma alimentare: costituisce il 5-7% dei casi e consiste in un interessamento gastroenterico isolato o diffuso con o senza interessamento linfonodale, splenico ed epatico. I linfomi intestinali possono essere di due tipi: a cellule T ( definiti eptelioropi, generalmente a medie e grandi cellule) oppure MALT type (a piccole cellule con fenotipo B, che insorgono generalmente nella sottomucosa e formano grandi aggregati nodulari intraparietali) [15] [16] [4]

Linfoma cutaneo: si riscontra nel 3-8% dei pazienti affetti da linfoma, colpisce soprattutto animali anziani e si manifesta sotto forma di lesioni solitarie o multiple dall‘aspetto molto variabile.

Questo può essere primitivo, oppure rappresentare localizzazione secondaria di forma multicentrica. Si riconoscono due forme di linfoma cutaneo: non epiteliotropo ed epiteliotropo (CELT), quest‘ultimo è caratterizzato da una infiltrazione di linfociti T neoplastici con tropismo specifico

per epidermide e strutture annesse; esso comprende uno spettro di malattie cutanee che comprendono micosi fungoide, sindrome di Sezary e reticulosi pagetoide.[22] [23] L‘eziologia rimane sconosciuta ma da alcuni studi si pensa che dermatiti atopiche possano predisporre allo sviluppo di CELT: i linfociti T infatti possono proliferare ed espandersi in senso clonale se stimolati da segnali antigenici persistenti o anormalità funzionali delle cellule di Langherans.

Linfoma mediastinico: rappresenta il 2-5% casi, rappresentando la terza forma di linfoma nel cane e generalmente interessa i linfonodi mediastinici craniali, il timo o entrambi e può coinvolgere anche l‘esofago. L‘ipercalcemia associata a linfoma mediastinico è riportata nel 10-40 per cento dei cani: in uno studio condotto su 37 cani affetti da linfoma con ipercalcemia concomitante il 43% di questi aveva sviluppato una forma mediastinica. E‘ stato visto inoltre che il linfoma mediastinico è spesso associato ad un fenotipo T e ad una prognosi sfavorevole. [17] [18] [19] [20] [21].

Linfoma extranodale: questa forma colpisce il 4% circa degli animali. La patologia può essere dislocata in qualsiasi distretto. Ne esiste una forma renale, oculare, nervosa, intravascolare, nasale, muscolare, polmonare, uretrale e vascicale. [12]

Il linfoma oculare è caratterizzato da lesioni variabili come fotofobia, blefarospasmo, epifora, ifema, uveite anteriore, coinvolgimento corioretinico e infiltrazione del nervo ottico fino a cecità improvvisa; in alcuni casi si tratta di una forma multicentrica che colpisce secondariamente gli occhi. [24]

La forma nervosa è caratterizzata da una varietà di sintomi neurologici in base al tratto coinvolto, si possono riscontrare crisi epilettiche o paralisi: se ne distinguono tre forme, epidurale, neuroepidurale e dei nervi periferici. [24] [12]

Il linfoma intravascolare o angioendoteliomatosi è una rara malattia sistemica caratterizzata da proliferazione di linfociti neoplastici nel lume dei vasi sanguigni, la progressiva invasione neoplastica ne determina occlusione con formazione di trombi, emorragie e infarti. In questa forma non si ha coinvolgimento del midollo osseo e non si osservano cellule neoplastiche nello striscio ematico.

Altre forme descritte sono il linfoma osseo, molto raro e riportato in letteratura in pochissimi casi e quello renale, più frequente nel gatto che nel cane. Rare sono anche le forme di linfoma vescicale [27] e delle cavità nasali. [26]

Classificazione secondo la World Health Organization

.

Tale classificazione si bassa sullo stadio clinico della malattia. Prevede la presenza di cinque stadi e di due sottostadi.

Classificazione secondo la WHO

Sottostadio a: Assenza di segni clinici di malattia Sottostadio b: Presenza di segni clinici di malattia

Classificazione istologica WHO:

Le classificazioni più recenti in medicina umana (WHO e REAL, Revised European American

Lymphoma) tengono conto delle caratteristiche epidemiologiche, cliniche, morfologiche ed

immunofenotipiche e genetiche, distinguendo precise entità cliniche provviste di proprio schema prognostico e terapeutico.

La classificazione WHO umana è stata applicata con successo al linfoma canino da Valli e collaboratori (2002) [28] Questo tipo di classificazione istopatologica permette di confrontare i dati (clinici, prognostici e terapeutici) proponendo l‘architettura e l‘immunofenotipo della malattia. Questa classificazione appare utile per riconoscere entità patologiche distinte e inquadrarle da un punto di vista biologico e prognostico: tale classificazione non prevede raggruppamenti in base al grado di malignità ma fornisce un elenco di entità morbose indipendenti.[29] [4] [30] Secondo studi recenti effettuati per valutare l‘applicabilità di questo sistema di classificazione, gli istotipi più frequenti sono il linfoma a grandi cellule B [31] [32] e il linfoma follicolare [30], mentre nel lavoro di Flood-Knapik (2013) su 75 cani emergeva una netta prevalenza del linfoma della zona T. [33] Il linfoma ad architettura follicolare include: linfoma follicolare (immunofenotipo B ed interessa i linfonodi), il linfoma della zona mantellare (immunofenotipo B, ed interessa soprattutto la milza), linfoma della zona T (immunofenotipo T, e interessa soprattutto i linfonodi).[33]

Si tratta di forme biologicamente indolenti, a decorso lento e che tendono ad essere preceduti da periodi più o meno lunghi di iperplasia benigna, mentre in fase avanzata si comportano come neoplasie ad elevato grado di malignità. [32] [33] Il comportamento biologico del linfoma della zona marginale (citologicamente corrisponde a linfoma a medie cellule macronucleolate) [34]

I

II

III

IV

(con o senza stadio III)

V

Coinvolgimento di midollo e sangue e/o di organo non linfoide (con o senza stadio da I a IV

dipende dalla sede anatomica di insorgenza, quello splenico richiede splenectomia ed eventualmente chemioterapia adiuvante [34] mentre la forma linfonodale è biologicamente aggressiva e richiede da subito trattamento chemioterapico. [4] [35]

Classificazione istologia del linfoma nel cane secondo WHO (2002)

Cellule B

 Linfoma linfoblastico  Linfoma linfocitico  Linfoma linfocitico di tipo

intermedio

 Linfoma linfoplasmocitico  Linfoma follicolare (della

zona mantellare, del centro follicolare I,II,III, nodale marginale, splenico marginale)

 Linfoma marginale associato al tessuto linfoide della mucosa (MALT)  Linfoma a grandi cellule (a

cellule B, immunoblastico, diffuso clivato, diffuso non clivato, timico, intravascolare)  Linfoma di Burkitt Cellule T  Linfoma linfoblastico  Linfoma cutaneo (epiteliotropo e non epiteliotropo  Linfoma extranodale periferico  Linfoma angioimmunoblastico  Linfoma angiotropo (angiocentrico e angioinvasivo)  Linfoma intestinale  Linfoma anaplastico a grandi cellule

Nel tentativo di correlare il tipo cellulare alla prognosi, inoltre, si sono applicati al linfoma canino svariati schemi di classificazione istologica, la maggior parte dei quali usati per il linfoma non-Hodgkin nell‘uomo. Tra questi sistemi, i più frequentemente usati sono la classificazione di Rappaport, quella di Kiel e quella della National Cancer Institute Working Formulation.

La classificazione di Rappaport 1966

La prima classificazione istologica risale al 1966 ed è quella di Rappaport che distingue la malattia in cinque gruppi in base alle caratteristiche morfologiche della popolazione cellulare predominante. Questa classificazione è caduta in disuso in quanto troppo limitata e semplicistica, inoltre non è in grado di fornire indicazioni utili per stabilire una prognosi e una terapia. [36] [37]

Classificazione istologica di Rappaport (1966) Tipo 1 Linfoma indifferenziato

Tipo 2 Linfoblastico poco differenziato

Tipo 3 Linfoblastico ben differenziato

Tipo 4 Misto linfocitico-istiocitico Tipo 5 Linfoma istiocitico

A ognuna di queste cinque classi possono appartenere forme ―nodulari‖ o ―diffuse‖. La nodularità si accompagna, in genere, ad una prognosi migliore.

La classificazione di Kiel e Kiel update:

E‘ il metodo classificativo senza dubbio più usato, distingue i linfomi in basso e alto grado di malignità. Questa classificazione citopatologica unisce ad aspetti morfologici anche caratteristiche immunofenotipiche

Al primo gruppo appartengono i linfomi linfocitici B e T, le micosi fungoidi, la sindrome di Sèzary, i linfoplasmocitici, il plasmocitico, il centrocitico, il centroblastico-centrocitico (follicolare, follicolare-diffuso, diffuso). Al secondo gruppo appartengono i linfomi centroblastici (puri e misti), i linfoblastici (B, tipo Burkitt, T a cellule convolute, non classificabili), gli immunoblastici (con differenziazione plasmocitica, B) e gli anaplastici. In seguito la classificazione di Kiel è stata aggiornata (Update Kiel), questa suddivide i linfomi in base al fenotipo e al grado di malignità.

Classificazione di Kiel update Linfomi B A basso grado  Linfocitico  Linfoplasmocitico  Prolinfocitico  Centrocitico  Centroblastico-centrocitico  Cellule medie macronucleolate Ad alto grado  Centroblastico monomorfo  Centroblastico polimorfo  Immunoblastico  Tipo Burkitt  Plasmocitoide  Linfoblastico  Linfomi T

Linfoma linfocitico: Si presenta come un tappeto di cellule omogenee, composto da linfociti molto simili a quelli normali, il citoplasma è scarso, nucleo rotondo e cromatina addensata. I nucleoli sono visibili e rare sono le mitosi: questo spiega la crescita lenta di questo tipo di linfomi.

Linfoma linfoplasmocitico: chiamato anche ―immunocitoma‖ la popolazione cellulare è eterogenea con cellule piccole e nucleo eccentrico rotondo, citoplasma basofilo e presenza di un area chiara perinucleare, non sono presenti mitosi e macrofagi in attività fagocitaria.

Linfoma prolinfocitico: può avere sia immunofenotipo T che B. E‘ costituito da cellule in predominanza piccole, nuclei con cromatina densa e nettamente nucleolata, citoplasma abbondante e rare mitosi. Sono linfomi a crescita lenta.

Linfoma centrocitico: è un linfoma molto raro, si identifica per la presenza di una popolazione cellulare, di numero variabile, caratterizzata da un nucleo indentato di taglia leggermente superiore a quella dei linfociti normali, la cromatina è a zolle ma meno addensata rispetto ai linfociti normali. Linfoma centroblastico-centrocitico: raro nel cane, è caratterizzato dalla presenza di cellule di dimensioni variabili, piccole e medie, le cellule più piccole presentano caratteristiche dei centrociti, le cellule di medie dimensioni invece sono rappresentate da centroblasti che si presentano con cromatina fine, numerosi nucleoli addossati alla membrana nucleare, nucleo irregolare e citoplasma basofilo. La presenza di centrociti e centroblasti può far pensare ad una iperplasia follicolare, ma, il carattere disperso dei centroblasti l‘assenza di plasmocitosi, macrofagi fagocitanti e il ridotto indice mitotico ne confermano il carattere tumorale.

Linfoma a cellule medie macronucleolate: è caratterizzato da cellule tumorali omogenee di taglia variabile, piccola-media (1.5 volte il volume di un globulo rosso). Il nucleo presenta cromatina decondensata ed un voluminoso nucleolo centrale, citoplasma poco esteso e moderatamente basofilo. L‘ndice mitotico è ridotto, ne consegue che queste cellule rispondono negativamente al

A basso grado

 Piccole cellule chiare  Prolinfocitico

 Pleomorfo a piccole cellule  Micosi fungoide

Ad alto

grado  Pleomorfo misto

 Pleomorfo a grandi cellule  Immunoblastico

 Plasmocitoide  Linfoblastico

marker di proliferazione Ki-67. Le cellule tumorali di questo linfoma sembra derivino dalla zona marginale del follicolo secondario del linfonodo. Questa forma può evolvere in linfoma centroblastico biologicamente aggressivo.

Linfoma centroblastico monomorfo: E‘ poco frequente, è caratterizzato da una popolazione omogenea di cellule voluminose, le cellule presentano un nucleo rotondo centrale, cromatina fine e numerosi nucleoli in posizione juxta-nucleare, il citoplasma e scarso e moderatamente basofilo, frequenti sono anche le mitosi. Si tratta di una forma particolarmente aggressiva ad elevato grado di malignità.

Linfoma centroblastico polimorfo: E‘ un linfoma molto frequente nel cane, può essere esclusivamente a fenotipo B. Si presenta con cellule di taglia media rappresentate dai centroblasti (in percentuale elevata), piccole cellule blastiche con nucleo rotondo, cromatina decondensata e irregolare, nucleoli multipli e prominenti e con citoplasma stretto e iperbasofilo: cellule di taglia grande di tipo immunoblastico (mai superiori al 20%) e cellule medie macronucleolate della zona marginale (presenti in percentuale minore).

Sono frequenti i macrofagi fagocitanti, che per la loro distribuzione in mezzo alle cellule linfomatose assumono il cosiddetto aspetto a cielo stellato. L‘indice mitotico è variabile, da livello medio ad alto. Questo tipo di linfoma proprio per il suo carattere eterogeneo può essere suddiviso in due sottogruppi: uno in cui predominano le piccole cellule e uno in cui predominano le cellule più grandi.

Linfoma immunoblastico: E‘ poco frequente e difficile da distinguere dal linfoma centroblastico polimorfo. E‘ caratterizzato da una percentuale dell‘80% di cellule di tipo immunoblastico che si presentano come cellule di taglia molto grande, nucleo irregolare, volume nucleolare elevato, ampio citoplasma basofilo e alto indice mitotico. Può avere fenotipo sia B che T.

Linfoma tipo Burkitt: è molto aggressivo, caratterizzato da una proliferazione omogenea di cellule di taglia piccola e con nucleo rotondo, cromatina irregolare, nucleoli multipli o singoli prominenti, citoplasma ridotto e iperbasofilo. L‘indice mitotico è elevato.

Linfoma plasmocitoide: E‘ costituito da una popolazione cellulare eterogenea con cellule piccole o medie, nucleo eccentrico con piccoli nucleoli, elevato indice mitotico. Può essere di fenotipo sia B che T. Si tratta di una forma molto aggressiva e chemioresistente.

Linfoma linfoblastico: può avere entrambi i fenotipi. E‘ caratterizzato dalla proliferazione di cellule piccole-medie con nucleo irregolare, convoluto, cromatine fine condensata e nucleoli discreti e poco evidenti; il citoplasma è moderatamente esteso e basofilo, e indice mitotico elevato con numerose mitosi raggruppate.

Linfoma a piccole cellule chiare: appartiene al gruppo T, ed ha un basso grado di malignità. Si caratterizza nell‘avere piccole cellule con nucleo irregolare unipolare, ampio citoplasma pallido ed esteso, e talvolta può contenere piccole granulazione azzurrofile.

Linfoma pleomorfo: può essere suddiviso in tre gruppi: il primo costituito da cellule di piccole dimensioni e con basso indice mitotico; il secondo si caratterizza per la presenza di cellule di taglia piccola-media e fa parte dei linfomi ad alto grado di malignità; il terzo è costituito da cellule di grandi dimensioni ad elevato grado di malignità. Presentano tutti un fenotipo T e sono caratterizzate nell‘avere un nucleo irregolare, cromatina fine e citoplasma chiaro scarsamente basofilo.

Micosi fungoide: si tratta di un linfoma cutaneo epidermotropo, che secondariamente può invadere i linfonodi locoregionali. La morfologia di questo linfoma è variabile; si possono riscontrare cellule con nucleo cerebriforme, cellule con aspetto monocitoide, entrambe presentano cromatina fine e citoplasma abbondante e chiaro, ed infine grandi cellule granulose con citoplasma pallido contenente delle grosse granulazioni azzurrofile. Fanno parte dei linfomi T a basso grado di malignità.

Linfoma anaplastico: Si caratterizza per la presenza di cellule di grandi dimensioni, nucleo molto irregolare, talvolta binucleato, citoplasma esteso ed intensamente basofilo.

Classificazione Working Formulation:

La Working Formulation è una classificazione proposta dal National Cancer Institute (1982), questo sistema classifica i linfomi in base al pattern, (nodulare o diffuso), al tipo di cellule, (piccole/grandi cellule clivate /non clivate, immunoblastiche o linfoblastiche) e al grado di malignità (basso, intermedio o elevato ma non fornisce informazioni sull‘immuniofenotipo del tumore. [38] [21] L a classificazione di Kiel e la Working Formulation sono due metodi classificativi molto usati, in quanto in grado di fornire delle informazioni prognostiche: per essere utili questi sistemi devono fornire informazioni circa la risposta alla terapia, il mantenimento della remissione e la sopravvivenza.

Numerosi studi negli ultimi anni si sono serviti di questi due schemi classificativi: Teske e collaboratori (1994) ha stabilito che su 116 cani con linfoma il 16,4% erano a basso grado di malignità, il 75% di grado intermedio, il 6% di grado elevato e il 2,6% al gruppo miscellanea. D questo studio inoltre è stato possibile constatare una prevalenza dell‘immunofenotipo B (58,9%) rispetto all‘immunofenotipo T (37,9%); infine la maggior parte di questi linfomi risultava essere a grandi cellule e centroblastici.[39] Da altri studi inoltre è emerso che i linfomi ad alto grado rispondono molto bene al trattamento chemioterapico rispetto a quelli a basso grado, tuttavia i cani con linfoma a basso grado possono sopravvivere più a lungo senza chemioterapia. [40] [30]

National Cancer Institute Working Fomulation, 1982

(ripreso da 66 e modificato)

Basso grado di malignità  Diffuso a piccoli linfociti

(linfocitico-plasmocitoide)

 Follicolare a piccole cellule clivate

 Follicolare misto

Medio grado di malignità  Follicolare a grandi cellule non clivate  Diffuso a grandi cellule

non clivate

 Diffuso a piccole cellule clivate

 Diffuso misto

Alto grado di malignità  Immunoblastico

 Linfoblastico (convoluto o meno)

 Diffuso a piccole cellule non clivate (Burkitt o meno)

Sintomatologia:

Così come dal punto di vista citologico e anatomico esistono differenze consistenti tra i vari tipi di linfoma, allo stesso modo, per questa neoplasia, non esiste una sintomatologia specifica o generica. Ogni forma presenta un‘ampia gamma di sintomi che dipendono, ovviamente, dagli organi interessati e dal grado di avanzamento della malattia.[14]

Forma multicentrica: è la più frequente nel cane (80-85% dei casi), solo il 10-20% ha manifestazioni cliniche di malattia e, il quadro clinico più frequentemente riscontrato è quello di cani sani con linfoadenomegalia generalizzata non dolente [37], da un coinvolgimento epatico, splenico, del midollo osseo o da una combinazione di essi. [5] I linfonodi sono enormemente ingrossati e duri ( da 5 a 15 volte le normali dimensioni), e in genere sono indolenti alla palpazione [41].

La linfoadenomegalia spesso appare bilaterale e simmetrica ed è conseguente alla sostituzione parziale o completa della normale architettura del linfonodo da parte dei linfociti maligni [42]. La sintomatologia, dove manifesta, è piuttosto vaga e, infatti, spesso il motivo della visita è il reperimento casuale, da parte del proprietario, di un ingrossamento localizzato ed evidente delle masse linfonodali.[5] A volte i motivi della visita sono riconducibili a segni aspecifici presenti nel (20-40% dei casi) quali dimagrimento, mancanza di appetito, letargia, astenia, febbre e debolezza muscolare.

Il dimagrimento può essere conseguente alla disfagia, indotta dai linfonodi megalici, con o senza coinvolgimento delle tonsille, che premono sulle pareti esofagee e, allo stesso tempo, costituiscono un limite meccanico ai normali movimenti mandibolari. Se l‘ingrossamento dei linfonodi causa una stasi nel deflusso della linfa, si potranno osservare edemi più o meno diffusi; se questi stessi linfonodi premono su un parte dell‘albero respiratorio si avrà tosse.[17] [45] [12] Segni clinici più comuni sono l‘epato-splenomegalia, inoltre si può riscontrare poliuria e polidipsia secondarie all‘ipercalcemia paraneoplastica.[46] [47]

La diagnosi differenziale deve essere posta con infezioni sistemiche (batteriche, virali, parassitarie e fungine), disordini immunomediati (lupus, poliartriti, vasculiti e dermatopatie), e altre neoplasie ematopoietiche (leucemia, mieloma multiplo, istiocitosi sistemica o sarcoma istiocitico diffuso).[4]

Forma alimentare:. questa forma rappresenta il 5-7% dei casi, con coinvolgimento di piccolo intestino, fegato, linfonodi mesenterici, stomaco e colon.[2] In alcuni pazienti il tratto gastroenterico è coinvolto secondariamente in corso di neoplasia multicentrica, ma la sintomatologia gastroenterica in questi soggetti non è quella prevalente.

La proliferazione linfomatosa può avvenire in forma di noduli murali che coinvolgono la mucosa e la sottomucosa, o come infiltrazione diffusa.[16] Il linfoma intestinale in genere colpisce soggetti di età tra i 6,7 e 7,7 anni [15] [43] mentre le razze maggiormente colpite sono il Boxer, Shar Pei, Golden Retriver e in alcuni studi viene evidenziatala maggiore prevalenza di cani maschi.[15] [16] [43] [44].

Di solito, i pazienti affetti da questa forma, a differenza di quelli che presentano la forma multicentrica, hanno una sintomatologia conclamata. La comparsa dei sintomi, però, rispetto all‘insorgenza della patologia è piuttosto variabile. Gli animali possono manifestare vomito, diarrea, anoressia, malassorbimento, perdita di peso, ittero e tenesmo, e occasionalmente, peritonite secondaria [16] ad ostruzione completa e perforazione dell‘intestino.[41]. In questi pazienti la visita clinica evidenzia la presenza di una o più masse in cavità addominale, (si può trattare di linfonodi mesenterici ingrossati o di altre masse a localizzazione intestinale) e da ispessimento delle anse intestinali. [1].

La prognosi nel cane è infausta: diversi studi clinici infatti hanno rivelato una scarsa risposta alla chemioterapia e un tempo di sopravvivenza medio molto basso.[15] [48]

La diagnosi differenziale deve essere posta con enteriti linfoplasmocitiche, (che rappresenterebbe una lesione precancerosa), tumori intestinali non linfomatosi, enteriti granulomatose e corpi estranei.[4]

Forma cutanea: i segni clinici legati a questa forma sono estremamente variabili e possono ricordare patologie cutanee primarie e secondarie. Le lesioni possono essere solitarie o multiple e variano nell‘aspetto da placche eritematose a noduli, fino ad apparentemente innocue lesioni dermatologiche d‘ordine infiammatorio.[2] Spesso tali lesioni risultano pruriginose. Tale localizzazione cutanea può essere primaria o secondaria e, quindi, associata ad un‘altra forma di linfoma localizzata prevalentemente in un‘altra sede anatomica. Il linfoma cutaneo primario comprende tre forme, entrambe di origine cellulare T. Esiste un linfoma epiteliotropo rappresentato dalla micosi fungoide (manifestazione più comune), sindrome di Sezary e reticulosi pagetoide. Per micosi fungoide si intende una forma di linfoma cutaneo non leucemico e più frequentemente riscontrata nel cane (soggetti anziani di 9-11 anni); i cani possono presentare eritroderma pruriginoso esfoliativo, placche o noduli cutanei multipli con tendenza ad ulcerarsi, depigmentazione muco cutanea, o lesioni infiltrative ed ulcerative localizzate esclusivamente nel cavo orale. [41]

Una lesione caratteristica del cane è una neoformazione dermoepiteliale, circolare, in rilievo a (forma di ciambella) eritematosa e priva di peli che delimita un‘area di cute normale.[5] [22] [4] [24]

La sindrome di Sezary è molto rara è rappresenta la fase leucemica della micosi fungoide. E‘ caratterizzata da eritroderma esfoliativo, prurito e linfoadenomegalia generalizzata, con presenza di cellule di Sezary (linfociti neoplastici) nell‘infiltrato cutaneo e nel sangue.

La reticulosi pagetoide è una forma benigna a decorso cronico che si presenta sotto due aspetti clinici: localizzata (Woringer-Kolopp) e generalizzata (Ketron-Goodman); quest‘ultima è più frequente nel cane e si presenta sotto forma di papule e placche eritematose, e ulcere a livello delle giunzioni muco-cutanee, cavo orale, cuscinetto plantare e addome.[22] [4]

L‘altra forma di linfoma cutaneo conosciuta è quella non-epiteliotropa, è meno comune nel cane rispetto al gatto ed è caratterizzata da un immunofenotipo B, e presente localizzazione al derma profondo e medio senza coinvolgimento dell‘epidermide. A volte è presente anche linfoadenomegalia e nell‘80% si realizza un coinvolgimento sistemico.[2]

Si presenta sotto forma di lesioni multifocali che appaiono come noduli duri, a volte alopecicche e di colore rosso porpora. [4]

Linfoma epiteliotropo; presenza di papule eritematose e noduli multipli sull’addome di un cane.

Forma mediastinica: E‘ una forma molto rara verificandosi nel 2-5% dei casi, colpisce prevalentemente i linfonodi mediastinici craniali e raramente il timo. Anche in questo caso, come nella forma alimentare, gli animali vengono [17] portati alla visita per l‘improvvisa comparsa di dispnea, tosse, rigurgito e poliuria-polidipsia e quando è presente ipercalcemia paraneoplastica (40% dei casi) [5] [18]

La causa di questi sintomi è sicuramente dovuta all‘ingrossamento del linfonodo mediastinico craniale che effettua con il suo volume una compressione delle strutture circostanti, ma anche nel versamento pleurico, il quale può contribuire ad all‘aggravamento di questi sintomi. Alcuni animali possono sviluppare inoltre una sindrome della vena cava anteriore, presentando un‘imponente edema della testa, collo e arti toracici.[37] [4]

All‘esame fisico le anomalie sono in genere confinate alla cavità toracica con diminuzione del normale murmure vescicolare, spostamento della normale sonorità polmonare nelle aree dorso-caudali e suono ottuso nelle porzioni più ventrali.[12] [4]

La diagnosi differenziale deve essere posta con timoma, chemodectoma, neoplasie di tiroide ectopica, blastomicosi, granulomatosi linfoide polmonare, insufficienza cardiaca congestizia, piotorace, chilotorace ed emotorace. [4]

Radiografia latero-laterale di un cane con aumento del linfonodo sternale e del tracheobronchiale mediano.

Forma extranodale: Con questo termine, ―extranodale‖, si indicano genericamente tutte le altre localizzazioni escluse dalle categorie precedenti. In molti casi, tale localizzazione può essere seguita da una diffusione della malattia.

La forma nervosa, questa può essere multifocale o solitaria è può essere causa di crisi epilettiche, deficit neurologici e paresi e paralisi [49] se la neoplasia linfomatosa è extradurale o intramidollare. Nel caso di interessamento cerebrale è possibile, in soggetti sottoposti a chemioterapia, una incapacità di azione da parte dei chemioterapici per via della barriera ematoencefalica.

La forma oculare risulta essere caratterizzata da uveite, cheratite, ifema, ipopion, sinechie posteriori, glaucoma, emorragie retiniche, distacco retinico ed infiltrazione del nervo ottico fino alla cecità improvvisa.[1]

Infine esistono molte altre localizzazioni. come quella nasale[1], ossea[1], surrenalica[1],vescicale[3], tracheale[1].

Il linfoma osseo primitivo è molto raro, e in letteratura veterinaria sono riportati pochi casi nella specie canina e per lo più vertebrali. Il coinvolgimento osseo può essere monostotico o poliostotico; radiograficamente è tipico l‘aspetto radiolucente della lesione.[4]

La forma intravascolare è conosciuta anche con il termine di angioendoteliomatosi maligna o linfoma angiotropo a grandi cellule, si tratta di una forma molto rara, caratterizzata da proliferazione di linfociti T neoplastici nel lume e nella parete dei vasi. La progressiva occlusione vascolare ad opera di cellule neoplastiche comporta trombosi, fenomeni emorragici e infarti. Sono tipici l‘assenza di cellule neoplastiche nello striscio ematico periferico e l‘assenza di coinvolgimento midollare.[4]

L‘angioendoteliomatosi maligna può interessare qualsiasi letto vascolare, ma principalmente i vasi del sistema nervoso centrale, per cui nei soggetti colpiti è possibile riscontrare deficit neurologici centrali e periferici, ipossiemia secondaria a trombosi polmonari, vasi retinici tortuosi e dilatati e sindrome vestibolare. La diagnosi in questo caso risulta particolarmente difficile considerata la rarità di questa forma.[4]

1.5 Sindromi paraneoplastiche

Il linfoma è accompagnato da queste sindromi, che consistono in disordini metabolici e sistemici che si sviluppano in zone anche lontane dalla neoformazione. Tra queste, oltre a generici stati di anoressia e cachessia, di particolare rilevanza prognostica è l‘ipercalcemia. Questa condizione, accompagnata da poliuria e polidipsia, è spesso associata alla presenza di un linfoma T e si manifesta più frequentemente in corso di forma mediastinica.[5] [18] La causa sembra imputabile al rilascio, da parte delle cellule tumorali di una sostanza PTH-simile con attività osteoclastica (PTRrp:PTH related protein), che determina la mobilitazione e il riversamento in circolo del calcio osseo[50] [41]. Si manifesta, inoltre, frequentemente, uno stato anemico dovuto a diversi meccanismi (emolisi immunomediata, infiltrazione del midollo osseo, sindrome da eritropoiesi inefficacie conseguentemente alla terapia) e che, in ragione di questi meccanismi eziopatogenetici, può avere carattere di rigeneratività o meno. La leucocitosi neutrofilica, con o senza deviazione a sinistra e modesta monocitosi, è un altro reperto assai frequente (77-69% dei casi) e può essere la diretta conseguenza di un danno tissutale o di processi necrotici dovuti all‘infiltrazione delle cellule linfomatose nei tessuti e organi. La leucopenia è stata osservata solo nel 9-12% dei cani con NHL [41]. Le proteine del sangue, analizzate attraverso l‘elettroforesi, possono mostrare ipergammaglobulinemia. Si riscontrano soprattutto gammopatie monoclonali, raramente policlonali.

Conseguenze di quest‘alterazione possono essere fenomeni di iperviscosità ematica e proteinuria di Bence- Jones. [51] [39]

1.6 La diagnosi

La diagnosi di linfoma si basa innanzitutto su un‘accurata visita clinica che permetta di palpare tutti i linfonodi esplorabili in modo da poterne rilevare l‘eventuale megalia.

La diagnosi differenziale di linfoadenomegaia deve essere posta nei confronti di malattie infettive batteriche, virali, parassitarie (soprattutto Leishmaniosi e Babesiosi), fingine o rickettzie (Ehrlichia Canis); sono da prendere in considerazione anche i disordini immunomediati (Lupus eritematoso sistemico, poliartriti, vasculiti e dermatopatie) o altre neoplasie ematopoietiche (leucemia linfoide. mieloma multiplo e itiocitosi sistemica maligna). [4] Bisogna, inoltre, procedere con l‘osservazione delle mucose, il cui eventuale pallore è indicativo di anemia. L‘anemia, se presente, è normocitica, normocromica e non rigenerativa, tipica delle malattie croniche.[37] Il reperto di piccole emorragie petecchiali a livello delle mucose sta ad indicare che è in corso uno stato di trombocitopenia secondaria a mieloftisi. La trombocitopenia è frequente, manifestandosi nel 70 % dei casi.[1]

Molto importante è la palpazione dell‘addome al fine di rilevare un ingrandimento dei visceri addominali, l‘ispessimento delle anse intestinali o la linfoadenomegalia meseraica.

Un dato inoltre che deve essere valutato con attenzione è l‘anamnesi; nei pazienti affetti da linfoma alimentare l‘anamnesi remota non riporta segni clinici gastro enterici, oppure ne riporta di saltuari e poco rlevanti. La diagnsi differenziale deve essere posta nei confronti della IBD (infiammatory bowel desease), il proprietario riferisce in questo caso segni clinici altalenanti e responsivi, anche per lunghi periodi, alla terapia sintomatica.[4]

Viceversa nei pazienti affetti da linfoma alimentare l‘insorgenza dei segni clinici risale al massimo a 6-8 settimane precedenti alla visita e il proprietario riferisce sintomi progressivi, poco responsivi alla terapia sintomatica. Altre possibili diagnosi differenziali sono neoplasie intestinali non linfomatose o corpi estranei.[4]

Un esame oftalmoscopico, infine, che includa la visualizzazione del fundus, può rivelare anomalie (per esempio, uveite, emorragia retinica, infiltrazione oculare) in circa il 70% dei cani con linfoma[37]. I reperti appena citati, se riscontrati, comunque, possono solo fornire un‘indicazione, e talvolta un forte sospetto di malattia, ma non possono essere sufficienti per formulare una diagnosi certa e precisa, mentre sono utili, per indirizzare il veterinario nell‘effettuazione di ulteriori accertamenti.

Diagnosi di laboratorio:

Gli esami laboratoristici di routine includono emogramma, profilo biochimico ed esame delle urine, questi comunque raramente forniscono indicazioni specifiche per la diagnosi ma possono far sospettare un linfoma o essere d‘aiuto nell‘interpretazione dell‘esame citologico[12].

Nella maggior parte dei casi l‘esame emocromocitometrico mette in evidenza nel 40 % dei casi una anemia lieve, normocitica e normocromica, e non rigenerativa [45] [52]; l‘anemia può essere la conseguenza di un processo immunomediato, di una infiltrazione midollare o della cronicità della malattia (a causa di un processo infiammatorio cronico, anomalie del metabolismo del ferro o per mancata risposta del midollo osseo all‘eritropoietina) [53].

La trombocitopenia è frequente, verificandosi nel 30-50% dei casi e può avere anche questa un origine immunomediata o essere secondaria a mielottisi [53] [54]

Insieme all‘anemia e alla trombocitopenia un altro riscontro frequente è la linfocitosi (20% dei casi), la neutrofilia (25-45% dei casi, diretta conseguenza di un danno tissutale o di processi necrotici dovuti all‘infiltrazione di cellule linfomatose in organi o tessuti), meno frequente è invece la linfopenia (7-12% dei casi) [45] [52] [53]. Infine un riscontro poco frequente può essere la

monocitosi e la presenza di blasti in circolo, in questo caso in presenza di coinvolgimento midollare e blasti circolanti risulta difficile la distinzione tra linfoma (stadio V) e leucemia linfoblastica acuta, in questo caso ci si affida alla determinazione citofluorimetrica di CD34, che risulta positivo nelle leucemie acute e negativo nei linfomi di stadio V (bibliografia libro onco).

Lipercalcemia ( >12 mg/dl spesso associata a linfomi T) rappresenta una sindrome paraneoplastica di particolare rilevanza prognostica nei cani affetti da linfoma, questa si manifesta nel 20-40% dei pazienti, l‘aumento del calcio in circolo è imputabile al rilascio da parte delle cellule tumorali, di fattori umorali PTH-simili (PTH-related protein, PTHrp)con conseguente attività osteoclastica e aumentato assorbimento di calcio a livello renale [5] [55]. Diversi sono i segni clinici ascrivibili a questa alterazione biochimica: possiamo infatti riscontrare nei soggetti: debolezza muscolare, anoressia, perdita di peso, letargia, vomito e soprattutto poliuria-polidpsia (il calcio ionico antagonizza infatti gli effetti dell‘ormone antidiuretico sul tubulo distale e sul dotto collettore, alterando il meccanismo di concentrazione delle urine) [54]

L‘iperproteinemia è una alterazione paraneoplastica di raro riscontro in cani e gatti con linfoma, questa può essere conseguente a produzione di immunoglobuline da parte delle cellule neoplastiche di immunofenotipo B (circa il 6 % dei cani con linfoma mostrano gammopatia monoclonale) [5] [4] Altre alterazioni osservabili possono essere: aumento della bilirubina, enzimi epatici (compreso LDH, che può fungere da marker di recidiva [56] si è visto infatti che se i livelli di LDH sono aumentati al termine della chemioterapia e 30 giorni dopo, tendenzialmente i cani tendono a recidivare entro 45 giorni [4] Un aumento di urea e creatinina è conseguente a danno renale da infiltrazione neoplastica o da ipercalcemia [21]. L‘ipoalbuminemia invece è uno dei riscontri più frequenti in corso di linfoma gastrointestinale [48].

Esame citologico

In caso di linfoadenomegalia, localizzata o sistemica, si deve sempre eseguire un ago aspirato [2], questo rappresenta una tappa fondamentale del procedimento diagnostico, soprattutto nel caso di linfoma multicentrico; si tratta di una tecnica facile e veloce da eseguire, esente da effetti collaterali e diagnostica nella maggior parte dei casi [4]. L‘efficacia diagnostica di questo semplice esame può risultare, però, diminuita in quelle forme a particolare localizzazione viscerale, in cui un coinvolgimento dei linfonodi esplorabili sia scarso o assente. Se possibile si dovrebbe evitare di eseguire aspirazione dei linfonodi retro mandibolari che sono frequentemente reattivi, e difficilmente distinguibili dalle ghiandole salivari [2]. Si preferisce infatti effettuare il puntato a carico dei linfonodi prescapolari, poplitei e inguinali [4] I campioni citologici indicativi di linfoma evidenziano una popolazione di cellule linfoidi immature, in genere predominano le forme ad intermedio-alto grado di malignità e i tipi cellulari più comuni sono il linfoma centroblastico (monomorfo e polimorfo) [57] e il linfoma immunoblastico [58] [45] [38].

Nell‘analisi citologica del linfonodo si devono valutare le dimensioni cellulari, la forma del nucleo, aspetto della cromatina, forma e numero di nucleoli, quantità e basofilia del citoplasma, eventuale presenza di vacuoli, granuli e indice mitotico [4].

La dimensione cellulare si stabilisce paragonando la grandezza del nucleo a quella di un eritrocita. Le cellule sono considerate piccole quando il loro nucleo è di dimensioni < a due emazie, medie se è uguale, grande se è >. Quindi si valuta il nucleo, osservandone la forma che può essere rotonda, ovale, a fagiolo, irregolare con incisure ecc; l‘aspetto della cromatina (fine, decondensata, addensata in maniera irregolare a livello della membrana o dei nucleoli), infine vengono valutati i nucleoli (numero, dimensioni e localizzazione).

Si osserva poi il citoplasma valutandone l‘ampiezza, la basofilia e gli eventuali contenuti (granuli, vacuoli, elementi cellulari fagocitati). In presenza di numerosi macrofagi in fagocitosi, il campione

citologico assume l‘aspetto a ―cielo stellato‖(starry sky) facilmente riscontrabile in linfomi linfoblastici, immunoblastici e di Burkitt. La presenza di ―starry sky‖ è indice di maggiore aggressività del linfoma; i macrofagi infatti, hanno il compito di fagocitare le cellule che muoiono e nei linfomi aggressivi il turnover cellulare è notevolmente aumentato.

Si valuta l‘indice mitotico contando 10 campi con obbiettivo a 40x e se si ha un numero < a 2 mitosi, l‘indice mitotico è basso, se compreso tra 3 e 5 è medio, se è > di 6 è alto.

Diversi studi citomorfologici hanno dimostrato che, nel cane, sono più comuni i linfomi ad alto grado di malignità (74% circa) e, tra questi, il più frequente è il tipo centroblastico B, rappresentando metà dei casi, mentre il linfoma T è meno comune e si accompagna a prognosi sfavorevole [4] [57].

Se i risultati ottenuti con l‘esame citologico del puntato linfonodale non sono sufficienti alla tipizzazione del linfoma è necessario ricorrere all‘esame istologico tramite una exeresi chirurgica dell‘intero linfonodo [24].

Esempio di linfoma centroblastico polimorfo (esame citologico eseguito presso l’ospedale didattico Mario Modenato)

Immunofenotipo:

La determinazione dell‘imunofenotipo sta acquisendo notevole importanza, perché distingue i linfomi B da quelli T, diversi dal punto di vista prognostico e terapeutico. L‘immunofenotipizzazione distingue popolazioni linfocitiche secondo le proteine di superficie (cluster di differenziazione, CD), questa può essere fatta mediante citometria a flusso (tecnica che consente di evidenziare diverse sottopopolazioni linfocitiche eseguibile anche su aspirati linfonodali, immunoistochimica su sezioni istologiche, immunocitochimica su preparati citologici e analisi clonale mediante PCR.

Trattamenti precedenti con glucocorticoidi mascherano l‘assetto antigenico di superficie e rendono difficoltoso il riconoscimento dell‘immunofenotipo.

La metodica prevede l‘utilizzo di anticorpi monoclonali, grazie ai quali è possibile determinare alcune molecole di membrana specifiche, la cui espressione è riconosciuta in differenti tipi cellulari o in specifici stadi di differenziazione e attivazione.

Per definire l‘origine come B le cellule devono immunoesprimere CD21 e CD79a, mentre devono immunoesprimere CD3 CD4, CD5 e CD8 per essere identificate come linfociti T [4].

Se le prove risultano sempre negative, i linfomi vengono classificati come non-B/non-T. [59] [2] [60]. E‘ possibile inoltre individuare la velocità di proliferazione tumorale (per esempio, tramite

Ki-67, antigene nucleare di cellula proliferante) [37]. Le informazioni così ottenute, sono indispensabili alla formulazione della prognosi e pongono le basi per la scelta del protocollo chemioterapico più idoneo.

Le tecniche di citofluorimetria permettono non soltanto di valutare il fenotipo di cellule neoplastiche, ma valutare anche importanti aspetti, come presenza di pattern aberranti (legati ad aspetti prognostici caratteristici), e rintracciare la presenza di cellule neoplastiche in differenti organi, quali sangue e midollo (utili per la stadiazione), e valutare eventuale malattia residua dopo la chemioterapia [4].

Infine l‘evidenziazione di pattern quali- quantitativi aberranti, identificabili grazie alla citofluorimetria, consente di accertare con assoluta certezza l‘origine neoplastica delle cellule, consentendo di risolvere alcune complesse diagnosi differenziali con forme di linfoadenopatia reattiva.

Un‘altra tecnica che consente di risolvere gran parte delle diagnosi differenziali più complesse è l‘utilizzo della PCR che, amplificando le sequenze di DNA codificanti per TCR E BCR nella popolazione linfocitica, consente di valutare lo stato di riarrangiamento di questi recettori (PCR for Antigen Receptor Rearrangement. PARR). Se la popolazione linfocitica è policlonale (iperplasia linfoide) l‘amplificazione mediante PCR produrrà ampliconi di varie dimensioni; al contrario, in caso di linfoma, l‘amplificazione produce ampliconi tutti della medesima dimensione, indicando la presenza di una popolazione clonale. Questa tecnica comunque viene riservata a forme difficili da identificare e soprattutto nel gatto [4].

In immunoistochimica, per identificare pattern di positività ad un determinato antigene è stato stabilito di porre il valore di cut-off >del 60%, quindi un linfoma ha immunofenotipo B se un numero >60% esprime marker per cellule B, mentre ha immunofenotipo T se il valore >60% esprime marker per cellule T [4].

Stadio clinico:

Una volta raggiunta una diagnosi certa di linfoma, è necessario effettuare una valutazione complessiva del paziente, procedendo a quella che è definita ―stadiazione‖ della malattia.

La stadiazione rappresenta la valutazione dell‘estensione anatomica di una neoplasia e consente di definire quanto essa sia voluminosa e diffusa al momento della diagnosi, e inoltre, fornisce informazioni utili per definire una probabile prognosi e impostare così un protocollo terapeutico adeguato [61]

Come già citato, esiste un sistema di classificazione messo a punto dall‘organizzazione mondiale della sanità, che suddivide il linfoma in cinque stadi e due sottostadi. Questo sistema (che deriva dal metodo TNM per la valutazione delle neoplasie umane) si avvale delle informazioni cliniche e clinico-patologiche raccolte per determinare l‘estensione della malattia e quindi correlarla alla prognosi [5].

La stadiazione si ottiene attraverso l‘effettuazione, di un esame emocromocitometrico, del profilo biochimico (in particolare di azotemia, calcemia, glicemia, enzimi epatici e protidemia), dell‘analisi dell‘urine e di ecografie addominali e radiografie toraciche [62].

L‘esame radiografico del torace consente di andare alla ricerca di linfoadenopatia sternale e/o tracheobronchiale, o evidenziare radiopacità allungata nel mediastino craniale ventralmente alla trachea (linfonodi mediastinici craniali), e infiltrati polmonari di tipo interstiziale diffuso e versamento pleurico.

Da importanti studi è stato visto che il 60-75% di cani con linfoma multicentrico presentava coinvolgimento polmonare al momento della diagnosi, in questo caso il lavaggio bronco alveolare permette, proprio per la spiccata tendenza del linfoma all‘esfoliazione, di identificare con accuratezza eventuale coinvolgimento polmonare, anche in assenza di lesioni radiograficamente evidenziabili.

I rilievi radiografici addominali in corso di linfoma multicentrico includono: epato-splenomegalia, linfoadenomegalia (sottolombare e meseraica) e versamento addominale [4] [63] [64].

L‘esame ecografico consente al clinico di esplorare accuratamente alcune stazioni linfonodali addominali e retroperitoneali non altrimenti evidenziabili, queste stazioni linfonodali infatti difficilmente sono visibili in condizioni normali, tra questi ricordiamo i linfonodi: gastrici, splenici, portali, pancreatico-duodenali, aortici e renali; viceversa, in presenza di linfoma multicentrico, sono facilmente identificabili poichè notevolmente aumentati di volume ed ipoecogeni.

L‘ecografia consente consente inoltre di studiare ed evidenziale eventuali alterazioni in organo come: fegato, reni, vescica e milza. Il fegato oltre ad essere notevolmente aumentato di volume ―epatomegalia‖, può presentare quattro patter ecografici in associazione al linfoma, può essere iso-, ipo-o iperecogeno e presentare lesioni nodulari ipoecogene. Per quanto riguarda la milza l‘organo appare aumentato di volume (splenomegalia) con parenchima ipoecogeno; in numerosi casi si visualizzano piccole aree ipoecogene diffuse in tutto il parenchima, la milza quindi assume un caratteristico aspetto a ―nido d‘ape‖ (honeycomb) [65] [62].

I reni, se coinvolti all‘esame ecografico appaiono megalici, la corticale si presenta ispessita con alterata ecogenicità e spesso sono presenti lesioni nodulari ipoecogene [4].

Questo esame inoltre consente, in corso di linfoma alimentare, di mettere in evidenza un aumento dello spessore della parete intestinale, di evidenziare la presenza di masse o ispessimenti localizzati e perdita della normale stratigrafia d‘organo. Nel caso in cui siano presenti queste alterazioni l‘iter diagnostico prevede l‘esecuzione di un prelievo bioptico a tutto spessore nei siti interessati mediante laparoscopia o laparotomia [16].

L‘esame del midollo osseo permette di completare il processo di stadiazione, questo risulta particolarmente indicato nei soggetti in cui sono state rilevate alterazioni ematologiche come per esempio: anemie, linfocitosi e citopenie periferiche [14], e quindi per comprendere se c‘è stata colonizzazione metastatica da parte dei linfociti maligni. In caso di malattia avanzata, infatti, si può avere coinvolgimento del sangue, ed è possibile osservare la presenza allo striscio ematico di linfoblasti, prolinfociti e linfociti immaturi [32] [66]. In questi casi distinguere il linfoma dalla leucemia linfoide può risultare difficile. La distinzione si effettua attraverso l‘individuazione della proteina di membrana CD74, che risulta essere espressa dalle cellule neoplastiche in corso di leucemie acute e non di linfoma.[4] Si possono, inoltre, effettuare, per una maggiore completezza, esami citopatologici del parenchima epatico e splenico.

1.7 Fattori prognostici:

La prognosi varia molto in base alla forma di linfoma e alle caratteristiche individuali del soggetto colpito, comunque la guarigione è molto rara (<10% dei casi) [21].Comunque bisogna sempre tenere presente che questa neoplasia è una delle più chemoresponsive, e l‘obbiettivo del medico veterinario è quello di indurre una remissione della malattia e quindi prolungare e migliorare la qualità di vita del paziente.

I fattori prognostici coinvolti maggiormente sono: lo stadio clinico, la morfologia cellulare, il grado istologico e l‘immunofenotipo. Grazie a recenti studi, l‘inquadramento istopatologico ha consentito di delineare il comportamento biologico della malattia, il sottotipo istologico sembra quindi avere un importante valore prognostico ai fini della remissione completa, della durata della prima remissione e della sopravvivenza totale [4] [21].

Secondo studi recenti il linfoma T linfoblastico, e il linfoma della zona mantellare sono molto aggressivi e associati ad una prognosi infausta con tempi brevi di sopravvivenza rispetto ai B, e secondo Teske i linfomi T sono tutti di alto grado di malignità [50], mentre in uno studio di Fournel (1997) è emersa una prevalenza di linfomi T a basso grado di malignità [34]

Il linfoma T è caratterizzato da evoluzione rapida, interessa cani tendenzialmente giovani, mostra spesso coinvolgimento mediastinico e leucemico, si accompagna ad ipercalcemia paraneoplastica. Inoltre, è meno responsivo alla chemioterapia. Eccezione a questa regola è il linfoma di Burkitt che, pur essendo di tipo B, presenta spiccata aggressività.

La maggior parte degli studi non è stato in grado di mettere in evidenza un rapporto tra stadio clinico WHO e prognosi nel cane. Molti studi concordano che cani con linfoma ai primi stadi (I-III) hanno una prognosi migliore rispetto a quelli al IV e V stadio. Inoltre i tempi di sopravvivenza sono ridotti in quei soggetti che mostrano segni clinici come: febbre, depressione, sintomi gastroenterici, coinvolgimento del midollo osseo e citopenie periferiche [67][68][1][37].L‘anemia e infiammazione cronica sono associate ad una diminuita sopravvivenza a lungo termine.[24][69][45][70][71]. Di fatto, la manifestazione della malattia e quindi l‘appartenenza al sottostadio b di questa classificazione è associato ad una prognosi significativamente più infausta. Secondo uno studio recente, la presenza alla diagnosi di alcune variabili (stadio clinico I-IV, assenza di ipercalcemia, nessun pretrattamento con corticosteroidi, ematocrito maggiore del 35%, peso corporeo maggiore di 10 kg, linfoma centroblastico, immunofenotipo B, assenza di infiltrazione midollare) ha permesso di identificare cani con linfoma che avrebbero vissuto oltre due anni [72][

Per quanto riguarda la localizzazione anatomica, fattori prognostici sfavorevoli sono rappresentati da coinvolgimento cutaneo, mediastinico e gastrointestinale diffuso, rispetto alla forma multicentrica.

Il linfoma gastrointestinale nel cane ha una prognosi decisamente infausta: in due studi la sopravvivenza media era rispettivamente di 13 e 77 giorni[48][73].

Nel lavoro di Rassnick.[73], fattori prognostici negativi erano la presenza di diarrea e mancata remissione dei sintomi in seguito a terapia.

Da studi recenti si è visto inoltre che il linfoma intestinale a sede colica o rettale ha una pognosi decisamente migliore[15][48]

In diverse neoplasie animali tra cui il linfoma, la resistenza ai farmaci antitumorali è associata ad una sovraespressione della glicoproteina P (P-gp) che determina una MDR (chemioresistenza multipla, Multi Drug Resistance). La P-gp è una glicoproteina di membrane fisiologicamente deputata al metabolismo dei farmaci, essa agisce come pompa in grado di espelleredalla cellula farmaci antitumorali e quindi indurre sviluppo di chemioresistenza[74].

I glucocorticoidi in particolare sono potenti induttori di P-gp e quindi in grado di indurre chemioresistenza in cani con linfoma, e quindi se somministrati prima della chemioterapia possono essere causa di minor tempo di sopravvivenza[45][75]

Per quanto riguarda i fattori epidemiologici sono da considerare l‘età e il sesso dell‘animale, attualmente comunque sembra non esserci una relazione significativa tra l‘età e la risposta alla terapia, alla durata di prima remissione e alla sopravvivenza totale[24][

In alcuni studi invece il sesso sembra essere un fattore prognostico rilevante, e le femmine sterilizzate sembra abbiano una prognosi migliore[76][77], ciò si pensa sia dovuto all‘incidenza degli ormoni sessuali sulle cellule in crescita e differenziazione, tuttavia non è stata dimostrata la presenza di recettori per gli estrogeni e testosterone nè sui linfociti normali né sulle cellule normali dei cani colpiti da linfoma[8][78]

Altri marker prognostici importanti sono l‘ipocobalaminemia[79], l‘ipercalcemia(presente nei linfomi T) [80][18], la concentrazione ematica di glutatione S –transferasi [81] evidenziata in cani con linfoma al momento della diagnosi e poco prima della recidiva, la metalloproteinasi della matrice, enzima zinco-dipendente responsabile di degradazione della matrice, il cui dosaggio è valutabile a livello plasmatico e tissutale[4] In particolare è stato evidenziato in uno studio, che il dosaggio delle metalloproteinasi diminuiva dopo l‘inizio della chemioterapia e aumentava 6-12 settimane prima che fosse evidente la recidiva[4] Tra gli altri marker prognostici ricordiamo la proteina C reattiva [82], la timidinchinasi, enzima cellulare attivo durante le fasi G1 e S del ciclo cellulare e implicato nella fase prolife,rativa delle cellule neoplastiche, si è visto in particolare che

in cani con linfoma le concentrazioni sieriche di timidinchinasi aumentavano, riflettendo lo stadio clinico della malattia, questo dunque rappresenta un valido marker per monitorare recidive precoci in cani con linfoma sottoposti a chemioterapia, prima che queste siano evidenziabili clinicamente [4] Infine un altro marker da considerare è la latticodeidrogenasi (LDH), in particolare uno studio prospettico ha evidenziato come il dosaggio seriale di LDH in siero di cani con linfoma possa predire una recidiva; in particolare se la latticodeidrogenasi è elevata al termine e 30 giorni dopo la chemioterapia è probabile che il linfoma recidivi entro 45 giorni, viceversa livelli elevati alla diagnosi non si correlavano con la prognosi.[56][83]

Parte speciale:

Introduzione:

Questo lavoro si basa su una analisi retrospettiva di 185 casi di linfoma pervenuti presso l‘Ospedale Didattico Veterinario Mario Modenato dell‘Università di Pisa negli anni 2010-2015. . Attraverso questo studio è stata valutata l‘incidenza sul totale dei casi di linfoma rispetto al totale dei pazienti osservati. Partendo dal segnalamento, sono stati valutati: età media e mediana, la proporzione dei maschi e delle femmine, il sesso, la condizione sessuale e la razza. Sono state distinte e classificate le forme multicentriche di linfoma da ―altre forme‖, e infine è stato eseguito uno studio citologico per distinguere il tipo di linfoma (High grade, Low grade), che, insieme ai risultati dell‘immunofenotipo, hanno fornito importanti informazioni utili ai fini prognostici e terapeutici.

Materiali e metodi:

Valutazione della casistica:

I cani con linfoma analizzati in questo studio sono 185, di entrambi i sessi e di età compresa tra 1 e 16 anni, visitati nel quinquennio 2010-2015. In alcuni casi mancavano delle informazioni riguardo l‘età (4 soggetti), il sesso (2 soggetti), e sulla razza (3 soggetti). Dei 185 pazienti; 145 presentavano un forma muticentrica, e agli altri 40 avevano altre forme di linfoma; (intestinale, mediastinico, cutaneo, renale, nasale, osseo, polmonare e oculare). Tutti i pazienti sono stati sottoposti ad un accurato esame clinico, unitamente ad ecografia addominale, radiografia toracica, prelievo del midollo osseo, emogramma completo e profilo biochimico. La valutazione di questi dati ha permesso la stadiazione clinica del soggetto. La diagnosi di linfoma è stata raggiunta attraverso l‘esame citologico di agoaspirati di linfonodi esplorabili e lesioni cutanee, e agoaspirati ecoguidati di masse, liquidi cavitari, linfonodi non esplorabili. Non in tutti i casi comunque si è potuta raggiungere una valutazione del citotipo coinvolto, in quanto alcuni campioni erano danneggiati e non diagnostici. I campioni, ove possibile, sono stati sottoposti ad immunofenotipizzazione con citometria a flusso; ma non in tutti i casi si è potuta raggiungere una valutazione di questo parametro, in quanto molti campioni sono risultati danneggiati e non idonei. Su tutti i casi raccolti è stata applicata una statistica descrittiva.