Differenze di specie e di genere nella distribuzione delle frazioni di gamma-glutammiltransferasi plasmatica

Testo completo

(1)Università degli Studi di Pisa Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Corso di laurea in Scienze Biologiche Molecolari Laurea Specialistica in Scienze e Tecnologie Biomolecolari. Tesi di laurea:. “Differenze di specie e di genere nella distribuzione delle frazioni di γ-glutamiltransferasi plasmatica”. Candidato. Relatori. Angelo Di caro. Prof. Aldo Paolicchi. Dott.ssa Maria Franzini. Anno Accademico 2007/2008.

(2) Indice. Indice Abbreviazioni.............................................................................................................1 Riassunto....................................................................................................................2. 1. Introduzione ...........................................................................................................5 1.1 Gamma-glutamiltransferasi ..............................................................................5 1.1.1 Generalità, struttura e localizzazione..........................................................5 1.1.2 Biosintesi e processamento della GGT .......................................................7 1.2 Attività catalitica della GGT.............................................................................11 1.3 Funzioni fisiologiche della Ȗ-glutamiltransferasi .............................................12 1.3.1 Il ruolo antiossidante: la sintesi del glutatione............................................12 1.3.2 Il ruolo pro-ossidante della GGT ................................................................15 1.3.3 Escrezione degli acidi biliari.......................................................................17 1.3.4 Formazione di acidi mercapturici ...............................................................17 1.3.5 Il metabolismo del nitrosoglutatione (GSNO)............................................18 1.3.6 Il metabolismo dei leucotrieni e deficit di GGT .........................................19 1.4 Effetti delle reazioni pro-ossidanti GGT dipendenti.........................................20 1.4.1 Perossidazione lipidica delle proteine LDL................................................20 1.4.2 Effetti modulatori........................................................................................22 1.4.3 Modulazione dello stato redox dei gruppi tiolici delle proteine .................22 1.4.4 Bersagli molecolari della GGT: AP1 e TNFR1..........................................24 1.4.5 Effetti sulla proliferazione cellulare e apoptosi ..........................................25 1.5 La GGT sierica..................................................................................................26 1.5.1 Origine e caratteristiche chimico-fisiche ....................................................26 1.5.2 GGT sierica nel contesto delle patologie cardiovascolari ..........................29 1.5.3 GGT e aterosclerosi ....................................................................................34 1.5.4 La GGT nella placca aterosclerotica...........................................................37 1.5.5 Analisi delle frazioni plasmatiche di Ȗ-glutammiltransferasi. ....................40. 2. Scopo della tesi ......................................................................................................43. 3. Materiali e metodi..................................................................................................44 3.1 Reagenti ............................................................................................................44 I.

(3) Indice 3.2 Preparazione dei campioni di plasma ...............................................................44 3.3 HPLC per la determinazione delle frazioni di GGT .........................................45 3.4 Retta di taratura.................................................................................................48 3.5 HPLC per la determinazione delle lipoproteine ...............................................48 4. Risultati..................................................................................................................50 4.1 Retta di taratura.................................................................................................50 4.2 GGT plasmatica totale e sue frazioni in esemplari di ovini..............................50 4.3 GGT plasmatica totale e sue frazioni in esemplari di minipig .........................52 4.4 GGT plasmatica totale e sue frazioni in esemplari di coniglio.........................52 4.5 Determinazione delle lipoproteine in ovini, minipig e conigli. ........................53 5. Discussione e conclusione .....................................................................................64 6. Letteratura citata ....................................................................................................67 7. Ringraziamenti……………………………………………………………………78. II.

(4) Abbreviazioni. ABBREVIAZIONI. AMC. 7-Amino-4-metilcumarina. b-GGT. big-GGT. Cys-Gly. Cisteinilglicina. f-GGT. free-GGT. GGT. Gamma-glutammiltransferasi. GlyGly. Glicilglicina. Ȗ-GluAMC. Ȗ-glutammil-7-amino-4 metilcumarina. HDL. Lipoproteine ad alta densità. HPLC. Cromatografia liquida ad alta prestazione. LDL. Lipoproteine a bassa densità. m-GGT. medium-GGT. s-GGT. small-GGT. VLDL. Lipoproteine a densità molto bassa. 1.

(5) Riassunto. Riassunto La. determinazione. dell’attività. sierica. dell’enzima. gamma-. glutamiltransferasi (GGT) è un normale esame di laboratorio utilizzato per valutare la funzione epatica, giacchè il suo innalzamento è osservato in seguito a steatosi, colestasi, abuso di alcol, ma anche epatopatie virali ed epatocarcinoma. Studi epidemiologici dell’ultimo decennio hanno mostrato che, in aggiunta alla sua connessione con le malattie epatiche, la GGT sierica rappresenta un fattore indipendente di rischio di mortalità per tutte le cause, per l’incidenza di ictus cerebrale, infarto miocardico e morte cardiaca, di sindrome metabolica, di diabete di tipo 2 e di insufficienza renale cronica. La specificità della GGT rimane comunque modesta, giacché diversi fattori sia genetici sia ambientali, come ad esempio genere, età, frequenza cardiaca, ipertensione, colesterolemia, trigliceridemia, glicemia, impiego di contraccettivi orali, abitudine al fumo ed attività fisica ne influenzano i valori. Numerosi studi hanno evidenziato l’eterogeneità della GGT sierica, dovuta alla presenza di diverse forme con caratteristiche chimico-fisiche diverse, ma la struttura e le proprietà chimico-fisiche di tali complessi non sono state ancora studiate a causa della mancanza di tecniche sufficientemente sensibili ed accurate. Lo studio delle caratteristiche biologiche della GGT sierica e delle sue diverse frazioni riveste un interesse notevole sia per la migliore utilizzazione diagnostica e prognostica di questo enzima, sia per migliorare la comprensione della patogenesi delle malattie ad essa connesse (epatiche, cardiovascolari, metaboliche).. 2.

(6) Riassunto. Per approfondire lo studio della natura dei complessi responsabili del trasporto della GGT nel plasma, nel laboratorio in cui è stata condotta la presente tesi è stata ideata una tecnica che permette di separare quattro frazioni di GGT plasmatica tramite cromatografia per esclusione molecolare e di rivelarne selettivamente e sensibilmente l'attività mediante una reazione enzimatica on-line, post-colonna con un reagente fluorescente. Durante questo lavoro di tesi è stata condotta la caratterizzazione della distribuzione di tali frazioni in soggetti sani di sesso maschile e femminile di diverse specie: ovini, coniglio, minipig. Parallelamente allo studio delle frazioni di GGT, in tutte le specie, è stata presa in esame anche la distribuzione delle lipoproteine plasmatiche in quanto possibili trasportatori della GGT circolante. I risultati della presente tesi dimostrano che nel plasma di ovini, minipig e conigli è presente attività di GGT con caratteristiche enzimatiche simili tra le diverse specie, compreso l’uomo. In tutte e tre le specie esaminate la maggior parte dell’attività (80%) è presente nella frazione f-GGT che rappresenta l’enzima non associato ad alcun trasportatore. Negli ovini e nei conigli la restante parte dell’attività di GGT è associata prevalentemente ad s-GGT, mentre nei minipig è più rappresentata b-GGT. E’ interessante notare che il volume di eluizione e pertanto la massa molecolare di tali complessi è uniforme tra le specie, compreso l’uomo. Negli ovini e nei conigli dove è prevalente il colesterolo HDL, il complesso molecolare con attività di GGT più rappresentato è s-GGT, nei minipig invece prevale il colesterolo LDL e il complesso b-GGT, tuttavia i dati. 3.

(7) Riassunto. raccolti non sono sufficienti per stabilire se nelle varie specie ci sia una correlazione diretta tra contenuto in lipoproteine e frazioni di GGT. In conclusione, in questa tesi è stata ottenuta una prima analisi della distribuzione. dell’attività. plasmatica. della. GGT,. fattore. di. rischio. cardiovascolare nell’uomo, permettendo una migliore caratterizzazione di tre specie di animali utilizzati nella ricerca biomedica per lo studio della malattia aterosclerotica.. 4.

(8) Introduzione. 1.INTRODUZIONE. 1.1 Gamma-glutamiltransferasi 1.1.1 Generalità, struttura e localizzazione La Ȗ-glutamil-transferasi (GGT, E.C. 2.3.2.2) è un enzima localizzato sulla membrana plasmatica di molti tipi cellulari. Esso catalizza il primo passaggio del processo di degradazione del glutatione (GSH) extracellulare attraverso la scissione del legame Ȗ-glutammilico (Tate e Meister, 1981). La GGT è una glicoproteina dimerica sintetizzata in un unico propeptide (Curthoys e Hughey, 1979) scisso in 2 subunità, una pesante (55-62 KDa) e una leggera (20-30 KDa), prima di raggiungere la membrana plasmatica (Barouki et al., 1984; Finidori et al.,1984); la subunità leggera è unita mediante interazioni elettrostatiche alla subunità pesante (Tate e Meister, 1981). All’estremità N-terminale della catena pesante è presente un dominio idrofobico che permette l’inserzione dell’enzima sul lato esterno della membrana cellulare, in questo modo entrambe le subunità risultano in contatto con l’ambiente extracellulare (Finidori et al., 1984). Nella subunità leggera è situato il sito catalitico, quindi l’enzima agisce su substrati presenti all’esterno della cellula (Tate e Meister, 1977; Ikeda et al., 1995). 5.

(9) Introduzione. 45000. 22000. M. cellulare. 18 aa. Citoplasma. 6 aa. Fig 1.1 Rappresentazione della GGT. Tutta l’attività catalitica dell’enzima è presente all’esterno della cellula.. Inoltre è stato dimostrato che la catena leggera stessa può avere attività proteasica ed è capace di digerire la catena pesante (Gardell e Tate, 1979). Tale attività in vivo sembra essere mascherata dalla catena pesante. La GGT è preferenzialmente espressa a livello di tessuti epiteliali implicati in attività secretorie e di assorbimento. Elevata attività di GGT è riscontrabile sulla superficie luminale delle cellule del tubulo contorto prossimale del rene, mentre le cellule del tubulo distale e dei glomeruli ne sono praticamente prive, nelle cellule epiteliali delle vie biliari extraepatiche e dei canalicoli epatici e nelle cellule acinose del pancreas. Positive per attività di GGT sono anche le cellule endoteliali dei capillari del cervello (es. del plesso corioideo), del corpo ciliare e del midollo. 6.

(10) Introduzione. spinale, le cellule delle ghiandole sudoripare, delle ghiandole sottomandibolari, dei dotti galattofori, dell’epitelio bronchiale, dell’epididimo, delle vescicole seminali e della prostata (Hanigan e Pitot, 1985; Hanign e Frierson, 1996). La GGT è inoltre presente in quasi tutte le linee cellulari del sangue, in particolare è presente sulla membrana e in granuli intracitoplasmatici delle piastrine (Bolodeoku et al., 1997) e dei leucociti, in particolare nei granulociti e linfociti l’aumento di espressione di GGT sulla membrana plasmatici è considerato un marcatore di differenziazione e trasformazione neoplastica (Khalaf e Hayhoe 1987; Grisk et al., 1993; Sener e Yardimci 2005). Infine attività di GGT è presente anche nel siero, verosimilmente rilasciata dalle membrane cellulari dei parenchimi dei vari organi, di conseguenza le sue variazioni riflettono le modificazioni quantitative della produzione, del rilascio e della rimozione dell’enzima circolante (Huseby e Ingebretsen, 1993).. 1.1.2 Biosintesi e processamento della GGT Nel genoma umano è presente una famiglia multigenica per la GGT che include almeno 7 differenti geni (Courtay et al., 1994) mappati sul cromosoma 22 nella regione 22q11.1-q11.2 vicino ai loci BCR (breakpoint cluster region) e IG-Ȝ (Bulle et al., 1987; Collins et al., 1997). Sequenze correlate, probabilmente pseudogeni, sono state identificate sui cromosomi 18, 19, 20 (Figlewicz et al., 1993). In una genoteca umana, costituita con DNA estratto da una linea cellulare di linfoblasti cariotipicamente normali, sono stati identificati dei cloni rappresentati da tutti i sette geni, ciò esclude che questi sette tipi di cloni genomici siano alleli di un. 7.

(11) Introduzione. singolo gene altamente polimorfico (Courtay et al., 1994). Di questi sette geni è stata analizzata l’espressione e per cinque di essi è stato individuato l’RNA, ma tra questi solo il gene I ha espressione ubiquitaria e dà origine ad una proteina completa e funzionale. Per gli altri quattro geni espressi non è stata ancora identificata la relativa proteina (Courtay et al., 1994). Il gene I si estende su una sequenza di almeno 32Kb e include 20 esoni (Leh et al., 1998). Dodici di essi codificano la sequenza amminoacidica della GGT: i primi sette codificano la subunità pesante, l’esone otto codifica l’estremità carbossilica della subunità pesante e l’estremità amminica di quella leggera, gli ultimi quattro esoni codificano la parte restante della subunità leggera (Chikhi et al., 1999; Leh et al., 1998). La regione non codificante all’estremità 5’ (5’-UTR), di 19Kb, comprende 8 esoni, trascritti in maniera tessuto specifica. Gli esoni del 5’-UTR sono numerati, in direzione 5’-3’come segue (Fig. 1.2): VIII, VII, V, IV, VI, III, IIa, IIb, IIc, I (Chikhi et al., 1999). Gli esoni IIa, IIb, IIc e gli esoni III e VI sono separati solo da potenziali sequenze consenso per il fenomeno di splicing; siti di splicing sono stati anche trovati alle estremità dell’introne tra gli esoni I e IIc, IIa e III. Questi potenziali siti di splicing alternativo possono spiegare i diversi riarrangiamenti a carico di questi esoni. Per quanto riguarda gli esoni VIII, VII e VI è ancora da stabilire se siano trascritti a partire da diversi promotori tessuto specifici (Chikhi et al., 1999; Visvikis et al., 2001).. 8.

(12) Introduzione. 19407 bp. 4616 bp. 951 bp. 229 bp. 214 bp. 92 bp. ATG. 1. VI II. VI I. V. IV. VI. III. II a b c. I. Fig. 1.2: Struttura della regione 5’-UTR del gene I per la GGT. Con i numeri romani sono indicati gli esoni non codificanti, mentre il rettangolo grigio rappresenta il primo esone codificante. I numeri in alto indicano la distanza, in paia di basi, tra gli esoni. (Visvikis et al., 2001). I cDNA (Fig 1.3) corrispondenti ai messaggeri per la GGT sono stati clonati a partire da genoteche di vari tessuti umani: placenta (Rajpert-De Meyts et al., 1988), fegato fetale (Pawlak et al., 1990), HepG2 (Goodspeed et al., 1989), pancreas (Courtay et al., 1992), polmone (Wetmore et al., 1993). Questi cDNA presentano la stessa cornice di lettura aperta (“open reading frame”, ORF) di 1706 nucleotidi, mentre la regione 5’-UTR subisce un riarrangiamento tessuto specifico, probabilmente a causa di una specifica combinazione di eventi di splicing (Chikhi et al., 1999; Visvikis et al., 2001). In particolare la sequenza del cDNA ottenuta dal pancreas è identica a quella ricavata dal cDNA delle cellule HepG2, ma più corta all’estremità 5’: perciò è probabile che queste due sequenze derivino dallo stesso trascritto.. 9.

(13) Introduzione. Fig 1.3: Rappresentazione schematica dei messaggeri derivanti dal gene I per la GGT. In nero è rappresentata la regione codificante e in colore la regione 5’-UTR, che è tessuto specifica. (Chikhi et al., 1999). L’ORF di 1706 nucleotidi dell’mRNA trascritto dal gene I (Fig. 1.3) è l’unica tradotta nell’enzima GGT completo e funzionante. Studi di traduzione in vitro hanno permesso di stabilire che l’mRNA di tipo I completo è tradotto in un unico propeptide senza attività di GGT. La sequenza idrofobica all’estremità amminica permette alla proteina di essere traslocata nel lume del reticolo endoplasmatico. Nel 1995, Brannigan e collaboratori hanno riconosciuto una superfamiglia di proteine chiamate idrolasi nucleofile N-terminali (Nucleofilo N-ter) caratterizzate da una struttura ĮȕȕĮ presente nel dominio catalitico. Tutte le idrolasi nucleofile N-terminali sono trascritte e tradotte in un singolo propeptide processato autocataliticamente ad enzima attivo. Il processo di autocatalisi rende disponibile l’amminoacido nucleofilo N-terminale che catalizza l’idrolisi del legame amminico. La GGT, avendo tutte le caratteristiche appena menzionate, può essere considerata un membro della superfamiglia delle idrolasi nucleofile N-terminali. 10.

(14) Introduzione. (Suzuki and Kumagai, 2002). Tra i membri di questa superfamiglia si ricordano la penicillina. G amilasi, il proteasoma, l’aspartilglucosaminidasi, la glutammica. PRPP aminotrasferasi (GAT) e la L-amminopeptidasi-D-Ala-esterasi/amidasi (Oinonen e Rouvinen, 2000). La GGT non ha isoenzimi intesi come proteine di diversa sequenza aminoacidica ma con la stessa attività catalitica, però esiste una considerevole varietà di isoforme che differiscono nel loro contenuto in carboidrati, infatti ci sono otto potenziali siti di glicosilazione e la proteina è glicosilata in maniera eterogenea e tessuto specifica.. 1.2 Attività catalitica della GGT La GGT catalizza l’idrolisi di Ȗ-glutamil composti attraverso il trasferimento del gruppo Ȗ-glutammilico da un substrato donatore al gruppo amminico di un accettore amminoacidico o dipeptidico (Curthoys e Hughey, 1979) (fig.1.4).. Fig 1.4. Reazione catalizzata dalla GGT (Hanigan, 1998).. 11.

(15) Introduzione. I principali accettori del gruppo Ȗ-glutammilico sono: cistina, L-cisteina, L-glutammato, L-alanilglicina, glicilglicina, L-serilglicina (Griffith et al., 1979; Tate e Meister, 1981). Il glutatione è il principale substrato fisiologico dell’enzima, ma tutti i Ȗ-glutammil composti sono substrati della GGT (Magnan et al., 1982). Diverse sostanze sono in grado di inibire l’attività catalitica della GGT (Meister, 1983), tra queste l’acivicina [acido L-(ĮS,5S)-Į-ammino-3-cloro-4,5diidro-5-isossazolo-acetico], un potente inibitore irreversibile della GGT che si lega stabilmente alla serina in posizione 406 sulla catena leggera dell’enzima (Smith et al., 1995) e il complesso serina-borato, che agisce con un meccanismo di inibizione competitiva in quanto la serina mima la struttura Į-carbossilica del gruppo Ȗ-glutammilico del substrato (Tate e Meister, 1978).. 1.3 Funzioni fisiologiche della Ȗ-glutamiltransferasi 1.3.1 Il ruolo antiossidante: la sintesi del glutatione Le funzioni fisiologiche della GGT sono in parte oscure; le conoscenze a proposito del suo ruolo riguardano le funzioni che essa svolge a livello della membrana plasmatica. La GGT catalizza il primo passo della degradazione extracellulare del glutatione. (GSH,. Ȗ-glutammilico. Ȗ-glutammilcisteinilglicina),. presente. tra. acido. cioè. glutammico. e. l’idrolisi cisteina.. del La. legame porzione. Ȗ-glutammilica è trasferita su accettori amminoacidici i quali, trasportati all’interno della cellula, sono substrato dell’enzima Ȗ-glutamil-ciclotransferasi che li scinde nei 12.

(16) Introduzione. corrispettivi amminoacidi (Griffith et al, 1979; Tate e Meister, 1981) e in 5-oxoprolina, la quale può essere nuovamente convertita in acido glutammico dall’enzima 5-oxoprolinasi e usata quindi per la resintesi del GSH intracellulare (Meister e Anderson, 1983). Il dipeptide cisteinil-glicina è idrolizzato dalle dipeptidasi di membrana in cisteina e glicina, che, riassorbite dalla cellula, possono essere riutilizzate nella sintesi de novo del GSH (Allison e Meister, 1981; Hanigan e Ricketts, 1993). La GGT inoltre favorisce il recupero del GSH uscito dalla cellula secondo gradiente di concentrazione. L’insieme delle reazioni collegate all’attività di GGT e quelle che portano alla sintesi ed all’efflusso del GSH costituiscono quello che viene definito il “ciclo del Ȗ-glutammile” o “ciclo di Meister” (Orlowski e Meister, 1970) (Fig 1.5). Poiché la GGT dà inizio alla degradazione del GSH extracellulare rendendo possibile la successiva captazione degli amminoacidi che lo compongono da parte della cellula (ciclo del Ȗ-glutammile), viene considerata un enzima ancillare dei sistemi antiossidanti basati sul GSH; da questo punto di vista l’enzima avrebbe un ruolo protettivo contro il danno ossidativo intracellulare (Hanigan e Pitot, 1985; Hanigan et al.,1998).. 13.

(17) Introduzione. Fig 1.5 Ciclo del Ȗ-glutammile (Lieberman et al., 1995). Attraverso il ciclo del Ȗ-glutammile la GGT gioca un ruolo importante per il trasporto transmembrana degli amminoacidi che compongono il glutatione fra cui la cys, fondamentale per la sintesi proteica; in casi di deficit enzimatico, tuttavia, non sono stati riscontrati particolari problemi di trasporto di tali amminoacidi. Un’ulteriore conferma del legame molto stretto fra glutatione e GGT si è avuta osservando che, se veniva inibita la produzione di glutatione nei topi attraverso dietilmaleato, la concentrazione di GGT-mRNA aumentava significativamente negli epatociti e così pure la concentrazione sierica dell’enzima (Moriya et al., 1994).. 14.

(18) Introduzione. 1.3.2 Il ruolo pro-ossidante della GGT Se da un lato la GGT permette la sintesi di un importante antiossidante intracellulare, d’altra parte negli ultimi anni si è sempre più indagato circa le possibili implicazioni pro-ossidanti che la GGT può assumere in particolari condizioni. Le prime evidenze sperimentali di una possibile funzione pro-ossidante della GGT risalgono ad esperimenti condotti in vitro in cui viene descritta la capacità della GGT di determinare la produzione di radicali liberi e specie reattive dell’ossigeno (ROS), con conseguenze che portano all’ossidazione delle proteine ed alla perossidazione dei lipidi poliinsaturi della membrana plasmatica. (Stark et al., 1993) Gli effetti pro-ossidanti della GGT dipendono dall’alta reattività del gruppo tiolico (-SH) della CysGly, prodotto dell’idrolisi del GSH ad opera della GGT, che a pH fisiologico è presente in forma di anione tiolato (S–). Quest’ultimo riduce il Fe(III) a Fe(II), generando il radicale tiile (S•) della CysGly. Il Fe(II), a sua volta, riduce l’ossigeno molecolare a ione superossido (O2•–) convertito in perossido di idrogeno (H2O2) dall’enzima superossido dismutasi. L’anione superossido e l’acqua ossigenata, in presenza di Fe(III) libero (reazione di Fenton) o chelato dall’ADP (reazione di Haber Weiss), possono generare radicali ossidrili (Fig. 6). Questi ultimi possono dare inizio alle reazioni a catena della perossidazione lipidica (Zalit et al., 1996). (Fig. 1.6). 15.

(19) Introduzione. OH° + OH-. LPO. O2 Fe. GSH H. GGT. +. 2+. -A D P. (H a b e r W e is s r e a c tio n ). 2H +. H 2O 2. O2 -. O2 ° CG. CG. -. Fe. 3+. -. O2 °. T h io la te a n io n. LPO. CG°. H 2O 2 S u p e r o x id e d is m u ta s e. Fe2+. O2. T h iy l r a d ic a l. Fig. 1.6 Reazioni proossidanti conseguenti all’attività della GGT. E’ importante sottolineare come questi fenomeni avvengono, almeno inizialmente, sul lato esterno della membrana e quindi all’esterno della cellula, e perciò non sottoposti ai meccanismi di difesa in essa contenuti (Maellaro et al., 2000). L’azione proossidante della GGT è legata alla presenza di metalli redox attivi nell’ambiente extracellulare, evenienza che in vivo è fortemente prevenuta grazie alla formazione di complessi quali ferritina, transferrina e ceruloplasmina che non permettono ai metalli di catalizzare reazioni con radicali liberi. A tal proposito è interessante osservare che l’attività di GGT è in grado di ridurre e promuovere il rilascio di ioni ferro legati alla transferrina (Drozdz et al., 1998; Dominici et al., 2003a) e che l’azione pro-ossidante è stata osservata anche in presenza di ceruloplasmina (Glass e Stark, 1997), ovvero due sorgenti fisiologiche di ioni metallici. Inoltre il rilascio di ioni ferro dalle loro forme di immagazzinamento è stato osservato in molte condizioni fisiopatologiche, un processo questo che 16.

(20) Introduzione. potrebbe rendere i metalli disponibili per promuovere l’azione pro-ossidante della GGT (Paolicchi et al., 2002a).. 1.3.3 Escrezione degli acidi biliari Nel fegato l’attività di GGT è regolata dagli acidi biliari liberi e coniugati. Gli acidi biliari liberi (colato, chenodesossicolato, desossicolato) stimolano l’attività enzimatica della GGT con conseguente incremento delle reazioni di idrolisi e di transpeptidazione del GSH fondamentali per il rifornimento di amminoacidi utilizzati nei processi di coniugazione. Gli acidi biliari coniugati con glicina e taurina stimolano la reazione di idrolisi a livello di dotti biliari, ma inibiscono quella di transpeptidazione con un meccanismo di feed-back negativo, riducendo così la disponibilità degli amminoacidi necessari per la formazione dei coniugati (Abbott e Meister, 1983).. 1.3.4 Formazione di acidi mercapturici La GGT interviene anche in processi di detossificazione essendo un componente della via metabolica per la sintesi di acidi mercapturici a partire da coniugati del GSH. L’enzima citosolico glutatione-S-transferasi coniuga gli xenobiotici elettrofili con il gruppo sufidrilico del GSH, i coniugati sono escreti dalla cellula attraverso trasportatori specifici. Nell’ambiente extracellulare il coniugato glutationico perde l’acido glutammico per l’azione della GGT ed è indirizzato nella via di formazione degli acidi mercapturici. Questi ultimi sono escreti dal sistema tubulare del rene e dal sistema duttale del fegato, caratterizzati. 17.

(21) Introduzione. entrambi da un’elevata attività di GGT, ed eliminati come tali rispettivamente nell’urina e nella bile durante i normali processi digestivi (Hinchman et al., 1998; Kearns et al., 1998).. 1.3.5 Il metabolismo del nitrosoglutatione (GSNO) Il monossido di azoto (NO) è un importante mediatore di molte funzioni biologiche, le più importanti sono: la regolazione del tono vascolare con funzione vasodilatatrice, l’inibizione dell’aggregazione piastrinica, è un neurotrasmettitore, in quanto radicale può agire come proossidante (azione citotossica) o antiossidante. Gli effetti diretti dell’NO si esplicano nel sito di produzione della molecola stessa in quanto la sua emivita è di pochi millisecondi. L’NO può reagire anche con i gruppi tiolici di proteine (albumina, emoglobina) o con tioli a basso peso molecolare (GSH, CysGly, Cys, omocisteina) formando nell’insieme i nitrosotioli (RSNO) che rappresentano una forma di stabilizzazione e di trasporto dell’NO (Giustarini et al., 2003). In particolare il nitrosoglutatione (GSNO) ha numerose attività farmacologiche sovrapponibili a quelle dell’NO libero (Zeng et al., 2001; Rassaf et al., 2002). Il GSNO è un anche substrato per l’enzima GGT, infatti è stato dimostrato che in vitro la GGT, in presenza di GlyGly come accettore della reazione di transpeptidazione, catalizza la conversione di GSNO in nitroso-cistenil-glicina (CGSNO), questa in presenza di ioni metallici di transizione si dissocia spontaneamente in Cys-Gly e NO (Hogg et al., 1997).Quindi, se il GSNO consente il trasporto dell’NO, l’attività di GGT potrebbe consentirne l’utilizzo promuovendo la. 18.

(22) Introduzione. dissociazione del GSNO, un possibile bersaglio potrebbero essere proprio i vasi sanguigni, in quanto la GGT è espressa dalle cellule endoteliali.. 1.3.6 Il metabolismo dei leucotrieni e deficit di GGT I leucotrieni (LTs) sono una classe di mediatori lipidici sintetizzati e rilasciati dai leucociti e dalle cellule di tessuti sottoposti a stimolo infiammatorio. I LTs derivano dall’acido arachidonico convertito in acido 5-idrossiperossieicosatreinoico (5-HPETE) per azione dell’enzima 5-lipossigenasi (5-LO). 5-HPETE è a sua volta convertito in LTA4 che rappresenta il precursore sia del LTB4 che dei cisteinil-LTs (LTC4, LTD4 e LTE4). Il LTC4 deriva dal LTA4 in seguito a reazione con una molecola di GSH, a sua volta è convertito in LTD4 (glicilcisteinil-LT) dall’attività enzimatica della GGT, la successiva idrolisi del residuo di Gly porta alla formazione del LTE4 (cisteinil-LT) (Lewis et al., 1990). I cisteinil-LTs, legandosi a specifici recettori sulle cellule muscolari lisce, possono indurre una prolungata broncocostrizione (Anderson et al., 1982; Bernstrom et al., 1982), e possono esercitare una potente azione vasocostrittrice sulle arterie coronarie. Alcuni autori ipotizzano che i cisteinil-LTs svolgano un ruolo attivo nella patogenesi e nelle manifestazioni cliniche dell’aterosclerosi (Allen et al., 1998).In modelli animali di ischemia è stato dimostrato che inibitori dell’enzima 5-LO e antagonisti dei recettori per i cisteinil-LTs sono efficaci nel ridurre l’estensione dell’infarto e dell’aritmia indotta dalla riperfusione. Inoltre sembra che le lesioni aterosclerotiche si associno a una maggior espressione dei recettori per i cisteinil-LTs (Allen et al., 1998). Tuttavia non è ancora chiaro se i tre. 19.

(23) Introduzione. cisteinl-LTs condividano la stessa attività biologica, così anche il ruolo della GGT nel processo infiammatorio è tuttora poco definito.. 1.4 Effetti delle reazioni pro-ossidanti GGT dipendenti 1.4.1 Perossidazione lipidica delle proteine LDL E’ stato discusso che in presenza di Fe3+ l’attività catalitica della GGT promuove la formazione di ROS i quali a loro volta possono innescare il processo di perossidazione lipidica (Minotti, 1993). In studi successivi è stato verificato che le lipoproteine a bassa densità (LDL) sono ossidate in un sistema nel quale fossero presenti GGT, GSH, ADP-Fe3+ e GlyGly come accettori della reazione di transpeptidazione (Paolicchi et al., 1999). In presenza di ADP-Fe3+ anche il GSH promuove l’ossidazione delle LDL, ma la velocità di tale reazione aumenta significativamente in presenza di GGT e di GlyGly (Fig. 1.7). Questo effetto è stato osservato per valori fisiologici di attività di GGT (0-100 mU/ml) e di di GSH (0-2 mM, Paolicchi et al. 1999). L’ossidazione delle LDL è ritenuto un processo fondamentale nella formazione della placca aterosclerotica e del danno vascolare (Berliner e Heinecke, 1996; Paolicchi et al., 1999).. 20.

(24) Introduzione. Fig 1.7 Ossidazione delle LDL dipendente dal GSH e dalla GGT Incubazioni (1ml di volume finale) contenti LDL (0.1 mg prot/ml), Gly-Gly (20 mM) e ADP-Fe(III) (150 µM ADP-15 µM FeCl3) in PBS pH 7.4, 37°C. A)Le reazioni sono state iniziate mediante l’aggiunta di GSH (2mM), in più aumentando le concentrazioni di GGT. (B) GGT era mantenuta costante (50 mU/ml) e le reazioni sono state iniziate aggiungendo concentrazioni crescent di GSH. (Paolicchi et al., 1999). Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che l’ossidazione GSH-dipendente delle LDL poteva essere promossa sia da GGT in presenza di trasferrina come sorgente di ioni ferro, sia da cellule esprimenti un elevato livello di attività di GGT sulla membrana, come ad esempio le cellule di epatoblastoma (HepG2) o le cellule monoblastoidi (U937) (Paolicchi et al., 1999). Le cellule in questo caso possono essere considerate come sorgente sia di GGT che di GSH, quest’ultimo infatti è normalmente rilasciato dalle cellule (Meister et al., 1995). Queste ultime due osservazioni sono una prima indicazione che l’ossidazione delle LDL mediata dal sistema GSH/GGT possa avvenire in condizioni fisiologiche.. 21.

(25) Introduzione. 1.4.2 Effetti modulatori Le specie reattive dell’ossigeno giocano un ruolo fondamentale nella modulazione di molte funzioni cellulari. In questo contesto la GGT e le reazioni proossidanti, conseguenti alla sua attività enzimatica, possono partecipare alla regolazione del metabolismo cellulare.. 1.4.3 Modulazione dello stato redox dei gruppi tiolici delle proteine Il primo bersaglio primario delle ROS generate nell’ambiente extracellulare dall’azione della GGT sono i gruppi tiolici delle proteine di membrana. L’ossidazione dei gruppi sulfidrilici delle proteine è infatti aumentata in seguito alla stimolazione dell’attività di GGT mentre il processo è prevenuto dalla sua inibizione (Dominici et al. 2003). Il coinvolgimento dell’H2O2 nel processo è indicato dal fatto che l’ossidazione dei gruppi sulfidrilici delle proteine è significativamente prevenuta dalla catalasi mentre un decremento della riduzione dei gruppi sulfidrilici delle proteine è dovuto all’inibizione della GGT con acivicina. L’ossidazione dei tioli proteici della superficie cellulare non dipende solo dalla produzione di H2O2 (Radi, 1991; Quesada, 1996), ma è anche legata a processi di S-tiolazione che consistono nella formazione di un ponte disolfuro tra un gruppo –SH proteico e un tiolo a basso peso molecolare (GSH, CysGly, Cys, Omocys). La S-tiolazione ha la duplice funzione di proteggere i gruppi sulfidrili critici delle proteine da un’ossidazione irreversibile e di modulare, in modo reversibile, la loro. 22.

(26) Introduzione. funzione (Coan et al., 1992; Schuppe-Koistinem et al., 1994; Sahaf et al., 2005). Infatti la “detiolazione”, processo attraverso cui si ha la riduzione dei disolfuri misti, ne ripristina la funzione (Del Corso et al., 1993; Ravichandran et al., 1994, Cabiscol e Levine, 1996). Un numero sempre maggiore di molecole sembra essere modulato tramite S-tiolazione, sia proteine di membrana che proteine citosoliche (Sen e Parker, 2002; Sies e Parker, 2002) come ad esempio H-ras (Mallis et al., 2001), la chinasi p59 delle cellule T (Hehner et al., 2000), la fosfatasi PTP1B (Barrett et al., 1999), c-jun (Klatt et al., 1999) NF-kB/p50 (Pineda-Molina et al., 2001) e la caspasi 3, implicata in processi apoptotici (Davis et al., 1997). Anche la cisteinil-glicina originatasi dal catabolismo del GSH ad opera della GGT può concorrere alla formazione di ponti disolfuro con le proteine (Pompella et al., 2003; Corti et al., 2005). La S-cisteinilglicilazione così come la S-tiolazione può assumere due significati. In primo luogo, può essere interpretata come una difesa nei confronti dei danni ossidativi irreversibili (Coan et al., 1992; Thomas et al., 1995; Seres et al., 1996). In quest’ottica, essendo la GGT espressa ad alti livelli sia nei tumori che nelle metastasi (Tew et al., 1996) potrebbe contribuire alla resistenza delle cellule cancerogene nei confronti degli effetti citotossici dello stress ossidativo come nel caso di molti farmaci antitumorali ad attività proossidante (Daufeub et al., 2002; Paolicchi et al., 2002b; Paolicchi et al., 2003). In secondo luogo la S-cisteinilglicilazione può avere una funzione regolatoria. E’ stato osservato che l’aumento della S-cisteinil-glicilazione comporta una diminuzione della S-glutatiolazione, ciò potrebbe essere considerato un meccanismo mediante il quale le cellule esprimenti attività di GGT, come le cellule tumorali (Tew et. al, 1996), riescono a modulare lo. 23.

(27) Introduzione. stato redox e la funzione di proteine importanti presenti nella matrice extracellulare e sulla superficie di altri tipi cellulari, quali per esempio le cellule del sistema immunitario o endoteliali (Corti et al., 2005).. 1.4.4 Bersagli molecolari della GGT: AP1 e TNFR1 NF-kB è un fattore di trascrizione ubiquitario implicato nella regolazione di un ampio numero di geni che controllano vari aspetti delle risposte immunitarie ed infiammatorie (Baeuerle e Henkel, 1994). Diverse sono le evidenze sperimentali a favore di una modulazione cellulo-specifica dell’attività di questo fattore di trascrizione in relazione all’attività di GGT. Utilizzando cellule di criceto V79-GGT che esprimono un transgene per GGT, è stato visto che la produzione di specie reattive dell’ossigeno GGT-dipendente promuoveva sia il legame di NF-kB al DNA sia l’attivazione del gene (Accaoui et al., 2000). Un altro studio su cellule di melanoma umano Me665/2/60 ha dimostrato che la stimolazione dell’attività dell’enzima o la sua inibizione determinavano rispettivamente la stimolazione o l’inibizione della traslocazione nucleare di NF-kB (Maellaro et al., 2000). Tuttavia in concomitanza ad un’aumentata attività dell’enzima è stato osservato un diminuito legame di NF-kB al DNA come se questo fosse un meccanismo di autoregolazione per prevenire un’eccessiva attivazione di questo gene in condizioni di persistente stress ossidativo (Dominici et al., 2003b). Analogamente, l’attività di GGT sembra essere in grado di promuovere il legame di AP-1 al DNA; l’acivicina ma anche altri inibitori della attività di GGT. 24.

(28) Introduzione. sopprimono questo effetto a conferma del coinvolgimento dell’enzima (Paolicchi et al., 2002a). Il tumor necrosis factor receptor I (TNFR1) è un recettore che presenta nel dominio extracellulare alcuni motivi ricchi in cisteine direttamente coinvolti nel legame con il tumor necrosis factor-Į (TNF-Į, Chen et al., 1995). Ciò suggerisce che la GGT modificando lo stato redox delle cisteine presenti sul TNFR-I possa influenzare l’affinità di legame del TNF-Į al recettore e di conseguenza modulare le risposte cellulari a questa citochina (Dominici et al., 2004). La possibile modulazione del TNFR-I da parte dell’attività di GGT è stata studiata in due cloni della linea cellulari di melanoma Me665/2 caratterizzati da diversi livelli di attività enzimatica. In queste cellule sono state identificate cinque forme di TNFR-I distinte per il grado di ossidazione dei residui di cisteina. La forma più ossidata è costitutivamente presente nel clone cellulare 2/60, caratterizzato da un’elevata espressione di GGT, ed è possibile osservarla nel clone 2/21 in seguito all’induzione dell’espressione dell’enzima. La modulazione del recettore TNFR-I in seguito all’attività di GGT potrebbe modificare l’affinità di legame del TNFĮ, e quindi modulare la risposta cellulare (Dominici et al., 2004).. 1.4.5 Effetti sulla proliferazione cellulare e apoptosi L’apoptosi ha un importante ruolo biologico di regolazione nella maggior parte dei processi fisiologici come il differenziamento, l’omeostasi e la rimozione di cellule anormali in tutti i tessuti (Granville et al., 1998). Il controllo del meccanismo di morte cellulare programmata è modificato se non addirittura eliminato in cellule. 25.

(29) Introduzione. tumorali. E’ nota da tempo l’interconnessione tra proliferazione cellulare, regolazione del ciclo e apoptosi, tanto che una alterazione del ciclo cellulare, peraltro inevitabilmente presente nelle cellule cancerose, può influenzare in maniera diretta la sensibilità della cellula agli stimoli apoptotici (Rudin e Thompson, 1997). I dati raccolti nel corso di ricerche sulla linea cellulare di carcinoma ovarico umano A2780 hanno messo in evidenza come l’H2O2 e l’ossidazione dei tioli prodotti dall’attività di GGT durante il catabolismo del GSH svolgessero un’azione anti-proliferativa (Perego et al., 1997). Mentre, nella linea cellulare U937 di istiocitoma umano, Del Bello e collaboratori (1999) hanno osservato che la produzione di ROS mediata dalla GGT costituiva uno stimolo anti-apoptotico per le cellule e di conseguenza l’inibizione dell’enzima determinava l’arresto della crescita e la frammentazione del DNA caratteristica dell’apoptosi.. 1.5 La GGT sierica Dal 1961 la determinazione della GGT sierica è utilizzata come marcatore diagnostico di disfunzione epatica (Szczeklik et al., 1961), neoplasie incluse e di consumo eccessivo di alcool (Whitfield et al., 2001). La misurazione dell’attività sierica della GGT è un semplice test di laboratorio, ma, nonostante la sensibilità del test, la bassa specificità limita il suo valore diagnostico.. 1.5.1 Origine e caratteristiche chimico-fisiche Come già detto precedentemente nel genoma esiste una famiglia di geni per la GGT, ma solo il gene I è trascritto e tradotto nella proteina completa e 26.

(30) Introduzione. cataliticamente attiva (Courtay et al., 1994). Per cui non esistono isoforme enzimatiche dal punto di vista della struttura proteica, mentre la glicosilazione è tessuto specifica e contribuisce all’eterogeneità di peso molecolare e di carica osservate nelle proteine estratte da vari tessuti. La GGT sierica sembra essere di origine epatica come suggerito da studi condotti da Huseby e collaboratori (1981), dai quali risulta che la GGT presente nel siero ha le stesse caratteristiche di quella estratta dal fegato per quanto riguarda il PM, il contenuto di residui di acido sialico e il grado di glicosilazione. Questi parametri erano invece distinti rispetto a quelli della GGT ritrovata nelle urine, rene e pancreas (Huseby et al., 1981). Studi successivi hanno dimostrato la presenza di due frazioni diverse di GGT nel siero, una idrofilica e una idrofobica che differiscono per carica, dimensione e densità. La forma idrofilica, apparentemente identica a quella ottenuta dopo il trattamento proteolitico utilizzato per la purificazione della GGT da tessuto, era presente in piccola quantità e sembrava circolare nel sangue come enzima libero (Huseby et al.,1982a; Huseby et al., 1982b; Huseby et al., 1982c). Per quanto riguarda la frazione idrofobica, è stato proposto che sia costituita da GGT trasportata dalle lipoproteine sieriche VLDL, LDL, HDL e chilomicroni. Si suppone che l’associazione della GGT con le lipoproteine avvenga tramite il dominio lipofilico localizzato all’estremità N-terminale responsabile della normale inserzione dell’enzima nella membrana plasmatica. Infatti, l’enzima associato alle LDL consiste in una catena pesante intera, ciò indica che è coinvolta la forma anfipatica dell’enzima. (Paolicchi et al., 2003a).. 27.

(31) Introduzione. L’associazione dell’enzima GGT con le lipoproteine è stata studiata da Huseby e collaboratori (1982) nel siero di pazienti con patologie epatobiliari. E’ stato osservato che il 60-80% dell’attività totale della GGT era legata in complessi con le lipoproteine. Questi ultimi potevano essere separati in due principali frazioni mediante cromatografia per gel filtrazione o elettroforesi in gel di agarosio. Una frazione era caratterizzata da un alto peso molecolare (PM > 600000) e ȕ-mobilità ed era stata ritrovata nel siero di molti pazienti con colestasi. L’altra frazione contenente GGT eluiva in corrispondenza dell’intervallo di PM da 250000 a 450000 e migrava con Į1Į2-mobilità. Tali PM erano compatibili con complessi tra lipoproteine e questa associazione sembrava essere confermata dalla presenza di attività di GGT nelle frazioni di lipoproteine plasmatiche separate mediante ultracentrifugazione per gradiente di densità. La maggior parte dell’attività della prima frazione (PM > 600000) sembrava associata con le lipoproteine VLDL e LDL, mentre la GGT presente nella seconda frazione (PM: 250000 – 450000) sembrava essere associata con le lipoproteine HDL come osservato nel 70% del siero di pazienti non itterici. Infine entrambe le frazioni erano eterogenee per quanto riguarda le dimensioni, la carica e la densità (Huseby et al., 1982a). In uno studio condotto successivamente da Wenham e collaboratori (1984) la GGT del siero è stata separata, tramite cromatografia per esclusione molecolare, in tre frazioni con PM relativo di 1000000, 250000-500000 e circa 120000. In questo studio l’attenzione è stata focalizzata principalmente sulla frazione di GGT con PM intermedio (250000-500000) isolata da pazienti con malattie epatiche. Anche in questo studio è stato dimostrato che tale frazione consisteva in un complesso tra. 28.

(32) Introduzione. GGT e lipoproteine ad alta densità (HDL). Inoltre le proprietà fisiche di questa frazione, sia la carica che la massa, potevano essere alterate in seguito all’incubazione del siero con la bile (Wenham et al.,1984).. 1.5.2 GGT sierica nel contesto delle patologie cardiovascolari L’attività di GGT nel sangue fornisce indicazioni di alterazioni patologiche a livello epatico ed è il parametro di scelta utilizzato nel monitoraggio dell’abuso di alcol. La sua associazione con il rischio di morbilità e mortalità era inizialmente riportata in questa prospettiva (Kristenson et al., 1980; Peterson et al., 1983). Conigrave e collaboratori (1993) per primi hanno osservato che la GGT potesse avere un valore prognostico indipendentemente dalle malattie epatiche e dal consumo di alcol; infatti studi successivi hanno confermato il ruolo della GGT come predittore indipendente di mortalità per tutte le cause (Brenner et al., 1995; Arndt et al., 1998; Karlson et al., 2000). In particolare per quanto riguarda le malattie cardiovascolari, è stato osservato che i livelli di GGT sierica erano correlati con un aumentato rischio di infarto del miocardio (Betro et al., 1973; Hood et al., 1990; Wannamethee et al., 1995). Questa associazione potrebbe essere spiegata in parte dalla già conosciuta correlazione positiva tra la GGT ed i noti fattori di rischio coinvolti nella patogenesi dei disordini cardiovascolari, come ad esempio il cambiamento della composizione dei lipidi nel sangue (Van Barneveld et al., 1989; Jousilahti et al., 2000), l’indice di massa corporea (Nilssen et al., 1990; Daeppen et al., 1998), l’ipertensione (Miura et al., 1994; Yamada et al., 1995), l’intolleranza al glucosio (Umeki et al., 1989), l’insulino resistenza (Rantala et al., 2000) e il diabete. 29.

(33) Introduzione. di tipo 2 (Perry et al., 1998; Lee et al., 2003); i livelli di GGT correlavano positivamente anche con nuovi fattori di rischio cardiovacolari come la proteina C-reattiva, il fibrinogeno e gli F2-isoprostani (Lee et al., 2003). Una correlazione negativa invece è stata osservata con l’attività fisica e i valori di HDL (Ruttmann 2005). Nel 1995 Wannamethee e collaboratori hanno focalizzato la loro attenzione sulle malattie ischemiche del cuore (ischemic heart disease, IHD). In uno studio prospettico su larga scala (7613 uomini di mezza età e 11 anni di follow-up) i livelli di GGT nell’intervallo fisiologico risultavano associati con il rischio di mortalità per tutte le cause e questa osservazione era in gran parte dovuta all’incremento delle morti per IHD nel quintile superiore della distribuzione della GGT. Dopo aver corretto l’analisi statistica per gli altri fattori di rischio, elevati livelli di GGT (quintile superiore, GGT > 24 U/L) erano ancora associati con un significativo aumento di mortalità per tutte le cause e per IHD. L’aumentato rischio di mortalità per IHD risultava più marcato nei pazienti con una manifesta malattia ischemica del cuore e particolarmente in quelli con un precedente infarto del miocardio al momento del reclutamento nello studio. Queste osservazioni hanno suggerito l’esistenza di un collegamento tra la GGT sierica e l’evoluzione dell’aterosclerosi (Wannamethee et al. 1995). La presunta connessione della GGT con la patologia aterosclerotica ha ricevuto un ulteriore conferma in studi prospettici condotti da Emdin e collaboratori (2001). Lo studio prevedeva un follow-up di sei anni su 469 pazienti con sindrome ischemica e malattia coronarica (CAD) documentata angiograficamente. Dopo correzione per altri fattori di rischio cardiovascolari (età,. 30.

(34) Introduzione. fumo di sigaretta, colesterolo, frazione di eiezione del ventricolo sinistro, indice di massa. corporea,. diabete. mellito). e. per. fattori. confondenti. (alanina. amminotransferasi sierica, consumo di alcol) il valore prognostico dell’attività della GGT sierica per morte cardiaca e infarto non fatale è stato confermato. In particolare, il significato prognostico della GGT sierica era più evidente in un sottogruppo di pazienti con aterosclerosi diffusa (malattia multivasale) e un precedente infarto del miocardio. Il rischio risultava aumentato usando due differenti valori soglia di GGT (25 o 40 U/l) e la maggior parte degli eventi cardiaci erano concentrati nei primi tre anni dopo il primo infarto. Il significato prognostico della GGT sierica risultava così correlato con la diffusione delle lesioni aterosclerotiche nelle arterie coronariche. Ancora più interessante è il fatto che il valore. prognostico. della. GGT. scompariva. nei. soggetti. sottoposti. a. rivascolarizzazione mediante angioplastica o by-pass, procedure che comportano la stabilizzazione della placca (Amoroso et al., 2001). Quindi la prognosi sfavorevole segnalata dall’elevata GGT sierica sembrava essere applicabile su pazienti con placche vulnerabili, suggerendo che esista una connessione tra la GGT e i processi coinvolti nella destabilizzazione della placca (Fig 1.8).. 31.

(35) Introduzione. Fig 1.8 Correlazione tra la sopravvivenza e il livello di sGGT (A) Sopravvivenza a 6 anni di 168 pazienti con CAD, precedenti infarti al miocardio e multiple malattie vasali (119 con GGT sierica >40 U/L; 49>40 U/L) (B) Sopravvivenza a 6 anni di un sottogruppo della stessa popolazione sottopostosi a rivascolarizzazione tramite angioplastica. (Emdin et al., 2001; Pompella et al., 2004).. Un recente studio prospettico di Ruttmann e collaboratori (2005), condotto su 163,944 soggetti adulti austriaci ha definitivamente confermato che i livelli di GGT nel siero sono un fattore prognostico indipendente per eventi fatali di forme croniche di CAD (coronary artery disease) e per eventi cardiaci acuti. Questa conclusione risultava vera per entrambi i sessi con una chiara relazione dose-risposta e una maggiore importanza nei soggetti giovani (età < 60 anni). Ruttmann e collaboratori hanno stabilito che i valori sierici di GGT che assumono significato prognostico per gli eventi cardiovascolari erano all’interno dell’intervallo fisiologico. Inoltre, sono stati individuati i valori limite sia per i maschi che per le femmine (maschi, 15,5 U/l corrispondenti a 27,6 U/l a 37 °C; femmine, 10,5 U/l corrispondenti a 18,7 U/l a 37 °C). Simili risultati sono stati. 32.

(36) Introduzione. trovati anche da Lee e collaboratori (2006) in uno studio su una popolazione di 28,388 finlandesi nel quale è stata evidenziata un’associazione indipendente tra la GGT sierica e la malattia coronarica nella popolazione generale. Tale associazione era più forte nei soggetti con meno di 60 anni e tra i consumatori di alcool; in particolare la misura della GGT sierica nei soggetti con diebete di tipo 2 era di aiuto per valutare il rischio futuro di CAD. Che la GGT sierica fosse un forte predittore di eventi coronarici acuti in uomini apparentemente sani (1878 soggetti) e indipendentemente dagli altri fattori di rischio per malattie cardiovascolari è stato confermato anche dallo studio MONICA (Meisinger et al., 2006). Sebbene le cause più note di elevazione della GGT siano l’abuso di alcool e le malattie epato-biliari, il rischio cardiovascolare associato all’elevazione della GGT risultava essere del tutto indipendente da questi suoi determinanti, e ciò non è strano se si considera che in tutti gli studi, compresi i più recenti, il rischio cardiovascolare cresceva progressivamente con il crescere dei valori di GGT all’interno dell’intervallo di riferimento, ma non al di sopra di esso, mentre i valori di GGT associati all’abuso di alcool ed alle epatopatie si trovavano in un intervallo assai più alto, all’interno del quale il rischio non cresce più (Fig.1.9). 33.

(37) Rischio relativo (95% IC). Introduzione. Tutte. Cause non neoplastiche. Neoplasie. Cause vascolari. Cardiopatia ischemica. Cause di mortalità. Malattie cerebrovascolari. Figura 1.9 Livelli di attività serica di GGT e mortalità. Le categorie di GGT serica corrispondono ai seguenti intervalli di attività: (1) < 9 U/L per le donne e < 14 U/L per gli uomini; (2) 9-17 U/L e 14-27 U/L; (3) 18-26 U/L e 28-41 U/L; (4) 27-35 U/L e 42-55 U/L; (5) >35 U/L e > 56 U/L. La categoria 1 è utilizzata come riferimento.(Kazemi-Shirazi et al.,2007). 1.5.3 GGT e aterosclerosi L’aterorosclerosi è caratterizzata dall’accumulo di depositi di colesterolo nell’intima delle arterie di grande e medio calibro. Questa deposizione porta anche alla proliferazione degli elementi cellulari dell’intima che gradualmente si ispessisce portando a una riduzione del lume vascolare e di conseguenza del flusso sanguigno. Si ritiene che lo sviluppo della placca ateromatosa inizi con il danno dell’endotelio associato con una varietà di fattori di rischio quali l’età, il sesso, fattori genetici, l’ipertensione, iperlipidemia, il diabete mellito e il fumo di sigaretta.. 34.

(38) Introduzione. Sotto l’influenza di vari stimoli l’endotelio può essere attivato, acquisisce così nuove proprietà funzionali e antigeniche e aumenta la permeabilità a vari costituenti del plasma. Questo processo determina la deposizione di lipidi nella parete vascolare, trasportati dalle lipoproteine LDL, l’adesione dei monociti ematici all’endotelio, seguita dalla loro migrazione nell’intima e dall’attivazione in macrofagi: si forma così una prima lesione non ostruttiva chiamata stria lipidica. Con il progredire del processo infiammatorio, un elevato numero di macrofagi e linfociti viene attratto nella lesione da citochine chemiotattiche ed indotto a moltiplicarsi. L’attivazione di tali cellule determina la liberazione di enzimi idrolitici, citochine, chemochine e fattori di crescita che instaurano un ciclo di accumulo di monociti-macrofagi che internalizzano colesterolo e si trasformano in cellule schiumose. Le cellule muscolari lisce, indotte a migrare e proliferare nell’intima da diversi stimoli, assumuno le caratteristiche di miofibroblasti secernenti collagene portando alla formazione di tessuto fibroso che contribuisce al progressivo ingrandimento della lesione, così la placca comincia a divenire fibrotica. Negli stadi avanzati, la placca aterosclerotica è una struttura fibro-lipidica, ricoperta da un cappuccio fibroso di tessuto connettivo di spessore variabile, sotto il quale è presente un core ricco di lipidi (in particolare colesterolo e i suoi esteri) e macrofagi che assumono il caratteristico aspetto di cellule schiumose dopo aver fagocitato i lipidi (koyama et al., 1996). La placca appare di colore bianco-giallastro e tende a protrudere nel lume dell’arteria determinando un alterazione del flusso ematico.. 35.

(39) Introduzione. L’ossidazione delle LDL rappresenta un evento cruciale nella patogenesi dell’aterosclerosi, principalmente nell’iniziazione delle lesioni (Stocker e Keaney, 2004). Le LDL ossidate sono implicate in numerosi processi fondamentali nel processo aterosclerotico: inducono la trasformazione di monociti e macrofagi in cellule schiumose descritta in precedenza, sono capaci di stimolare le cellule endoteliali e le cellule muscolari lisce a secernere la proteina-1 chemiotattica dei monociti e favorire così la loro migrazione all’interno della parete cellulare; possono favorire l’attivazione endoteliale ed essere chemiotattiche per i linfociti T e i macrofagi. E’ stato dimostrato che i processi ossidativi, che generano specie reattive dell’ossigeno (ROS), sono coinvolti in molti eventi responsabili della progressione della placca aterosclerotica. I ROS, infatti, possono stimolare la proliferazione delle cellule muscolari lisce, contribuendo allo sviluppo e all’espansione della lesione, nonchè. alla. sua. destabilizzazione,. in. quanto. stimolano. l’attività. delle. metalloproteasi e inibiscono quella dei loro inibitori. Inoltre, anche apoptosi e vie di trasduzione del segnale sono modificate dall’azione dei prodotti dello stress ossidativo. Molti studi sperimentali hanno indicato che i processi redox possono essere frequentemente coinvolti nella produzione di cambiamenti capaci di destabilizzare una lesione aterosclerotica rendendola una lesione fatale. Diversi enzimi, espressi da elementi cellulari presenti nella placca (cellule endoteliali, fagociti, cellule muscolari lisce, fibroblasti) sono stati proposti come possibile fonte di agenti ossidanti coinvolti nello sviluppo della placca, come ad. 36.

(40) Introduzione. esempio,. NADPH-ossidasi,. NO-sintasi,. xantina. ossidasi,. mieloperossidasi,. lipoossigenasi, enzimi mitocondriali. Fin dal 1995, è stata dedicata una crescente attenzione alla GGT i cui livelli nel siero sono stati recentemente considerati come un nuovo marker per la prognosi di malattie cardiovascolari collegate con l’aterosclerosi. Il potenziale ruolo della GGT nella patogenesi dell’aterosclerosi è suggerito dalle prove biochimiche che indicano l’azione proossidante della GGT come produttore di agenti ossidanti.. 1.5.4 La GGT nella placca aterosclerotica Studi biochimici hanno dimostrato che la GGT produceva specie reattive dell’ossigeno in vitro (Paolicchi et al., 1999), pertanto si è ipotizzato che potesse avere un ruolo nella patogenesi della placca. Il ruolo patogenetico della GGT nella progressione dell’aterosclerosi e nelle sue complicanze è suggerito da studi istochimici che hanno rivelato un’intensa attività di GGT nel core lipidico di lesioni aterosclerotiche umane, dove erano localizzate anche le cellule schiumose derivate dai macrofagi CD 68+ ( Paolicchi et al., 1999; Paolicchi et al., 2004 ). L’attività di GGT co-localizzava anche con le LDL ossidate (Fig. 1.10; Emdin et al., 2002), ed è stata riscontrata anche in microtrombi aderenti alla superficie dell’ateroma. (Fig. 1.11; Dominici et al., 2003a).. 37.

(41) Introduzione. Fig. 1.10 Colocalizzazione dell’attività di GGT con le LDL ossidate. Placca di un’arteria cerebrale umana. A) Dimostrazione istochimica dell’attività di GGT B) Immunofluorescenza indiretta per le LDL ossidate (Emdin et al., 2002). Fig. 1.11 GGT cataliticamente attività in microtrombi presenti sulla superficie di una placca aterosclerotica umana. A) Ematossilina / Eosina; B) Dimostrazione istochimica dell’attività di GGT (Dominici et al., 2003a). Nella placca aterosclerotica è presente glutatione (Franzini et al., 2008), substrato dell’enzima GGT, inoltre sono stati individuati depositi di ferro co-localizzati con i ceroidi, complessi insolubili di proteine e lipidi ossidati presenti sia all’interno che all’esterno delle cellule schiumose (Lee et al., 1998), ed anche ferro redox attivo (Lapenna et al., 2007); nelle placche aterosclerotiche è descritto anche un accumulo di ferritina (Pang et al., 1996), ulteriore possibile fonte di. 38.

(42) Introduzione. Fe(III) per la GGT (Stark et al., 1993; Corti et al., 2004). In questo contesto potrebbero essere favorite le reazioni pro-ossidanti conseguenti all’attività di GGT. Come già descritto nel paragrafo “GGT e produzione di specie reattive dell’ossigeno nell’ambiente extracellulare”, la CysGly, prodotto della reazione catalizzata. dalla. GGT,. riduce. il. Fe(III). generando. simultaneamente. il. corrispondente radicale tiile, che può formare ponti disolfuro con le proteine presenti (Corti et al., 2005), e Fe(II) che porta alla successiva formazione di anione superossido e idrossido di idrogeno. L’analisi dei tioli a basso peso molecolare in estratti acidi di placca ha messo in evidenza la presenza, oltre al glutatione, di CysGly libera che indica l’effettiva presenza di GGT attiva nella placca e di CysGly legata alle proteine, che è considerata un marcatore biochimico delle avvenute reazioni pro-ossidanti dipendenti dall’attività di GGT (Corti et al., 2005; Franzini et al., 2008). Lo stress ossidativo indotto dalla GGT potrebbe contribuire alla progressione. e. destabilizzazione. della. placca. aterosclerotica. favorendo. l’ossidazione delle LDL (Paolicchi et al., 1999); ma anche modulando l’attività delle metalloproteinasi, la proliferazione ed apoptosi degli elementi cellulari, l’aggregazione piastrinica e la trombosi (Dominici et al., 2003; Libby 2005). Riguardo l’origine della GGT nella placca possono essere prese in considerazione due sorgenti: una endogena a carico degli elementi cellulari della placca (cellule infiammatorie e muscolari lisce), ipotesi supportata dalla presenza di mRNA per la GGT (Franzini et al., 2008). una esogena, ipotesi supportata, a sua volta, dalla constatazione che la GGT sierica sembra essere trasportata da lipoproteine, incluse le LDL (Huseby, 1982; Watanabe et al., 1984; Wenham et al.,. 39.

(43) Introduzione. 1984). Uno studio preliminare di caratterizzazione della GGT estratta da placche aterosclerotiche ha dimostrato la presenza in queste ultime di due forme enzimatiche distinte per dimensione, carica superficiale e precipitabilità con acido fosfotungstico; la forma a maggior peso molecolare (simile a quello dei complessi sierici tra GGT e LDL), a maggiore carica negativa (più acido sialico presente) e precipitabile con polianioni (nelle condizioni delle LDL sieriche) potrebbe avere origine sierica (Franzini et al., 2008).. 1.5.5 Analisi delle frazioni plasmatiche di Ȗ-glutammiltransferasi. Recentemente è stato proposto un nuovo metodo di separazione e determinazione delle frazioni di GGT (Franzini et al.,2008). La determinazione dell’attività delle frazioni di GGT è eseguita con un sistema FPLC utilizzando una colonna per cromatografia ad esclusione molecolare (Superose 6HR 10/300 GL, GE Healthcare) che consente di separare le componenti plasmatiche esclusivamente in base alla loro massa molecolare in un intervallo compreso tra 5000 e 5 kDa, perciò è possibile separare anche le lipoproteine dalle VLDL dalle LDL. Per poter determinare in continuo l’attività di GGT, attraverso una connessione a T, all’eluato è continuamente aggiunto una soluzione contenente ƣ-glutammil-7-amido-4metilcumarina (ȖGluAMC), substrato fluorescente specifico per la GGT. Le condizioni di reazione sono tali per cui limite di rivelazione dell’attività è pari a 0.5 U/L e l’area sottesa ai picchi è proporzionale all’attività di GGT.. 40.

(44) Introduzione. Con questo metodo è stata caratterizzata la distribuzione delle frazioni di GGT in 200 soggetti sani, donatori di sangue (100 uomini e 100 donne) (Fig.1.12 e tabella 1.) (Franzini et al., 2008).In tutti i soggetti esaminati sono state identificate quattro frazioni di GGT denominate big-GGT (b-GGT, 2000 kDa), medium-GGT (m-GGT, 940 kDa), small-GGT (s-GGT, 140 kDa) e free-GGT (f-GGT, 70 kDa). I pesi molecolari delle frazioni b-GGT, m-GGT e s-GGT sono compatibili con quelli di complessi con le lipoproteine VLDL, LDL, HDL rispettivamente, mentre quello di f-GGT è indicativo di una forma enzimatica libera. Il peso molecolare delle singole frazioni è indipendente dai livelli di GGT associati ad esse, ciò suggerisce l’esistenza di un’interazione specifica tra l’enzima e il trasportatore piuttosto che ad un assorbimento casuale in circolo, perciò è possibile che la secrezione e rimozione delle singole frazioni siano indipendenti l’una dall’altra. Analizzando l’andamento dell’attività delle quattro frazioni in funzione dell’attività totale di GGT, è emerso che in entrambi i generi f-GGT è la frazione più rappresentata ai bassi valori di GGT totale (< 20 U/L), mentre l’aumento di questi ultimi dipende principalmente dalle frazioni s- e b-GGT (1.12). Un altro aspetto che distingue f-GGT dalle frazioni ad alto peso molecolare è la forma della distribuzione di frequenza nella popolazione, gaussiana per f-GGT e asimmetrica a destra, come per la GGT totale, per le altre tre (Franzini et al., 2008). Lo studio delle frazioni della GGT si prospetta di notevole interesse sia per una migliore utilizzazione diagnostica e prognostica di quest’enzima, sia per una migliore comprensione della patogenesi delle malattie ad esso connesse.. 41.

(45) Fluorescenza (unità arbitrarie). Introduzione. 100. 100. A, uomini. 80. 80. 60. 60. 40. 40. 20. 20. 0 10. 15. 20. 25. B, donne. 0 10. 15. 20. 25. Volume di eluizione (ml). Fig.1.12 Profili di eluizione delle frazioni plasmatiche di GGT nella popolazione di riferimento analizzata: A) uomini (n = 100), B) donne (n = 100). I cromatogrammi rappresentano l’andamento del 25° (linea tratteggiata), 50° (linea continua), 75° (linea punteggiata) percentile del segnale fluorescente registrato ad ogni volume di eluizione. Tabella 1. Attività totale e delle frazioni di GGT plasmatica in soggetti sani. Uomini (n = 100). Donne (n = 100). Median a. 5°–95° percentile. Median. 5°–95° percentile. GGT* totale. 25.3. 12.3 – 60.5. 14.4. 8.4 – 30.9. < 0.001. b-GGT*. 2.4. 0.7 – 10.7. 1.1. 0.4 – 5.2. < 0.0001. m-GGT*. 1.0. 0.2 – 3.3. 0.5. 0.2 – 1.2. < 0.0001. s-GGT*. 9.2. 2.8 – 33.7. 3.9. 1.5 – 11.6. < 0.0001. f-GGT. 13.2. 8.3 – 19.6. 8.9. 5.9 – 12.5. < 0.0001. P. I dati presentati sono valori di attività esperssi in U/L. *il test t di Student è applicato su dati trasformati con la funzione ln. N.S: non significativo.. 42.

(46) Scopo della tesi. 2. SCOPO DELLA TESI L’aumento dell’attività di GGT è un indice di disfunzione epatobiliare e un marcatore non specifico di abuso di alcol. Gli studi epidemiologici pubblicati negli ultimi quindici anni dimostrano che livelli di GGT nel siero fin’ora non considerati patologici si accompagnano ad un aumentato rischio di mortalita’ per eventi cardiovascolari legati ad aterosclerosi. In diversi studi istologici e biochimici è stato dimostrato che all’interno della placca aterosclerotica è presente attività di GGT che sembra contribuire agli eventi ossidativi che promuovono la progressione e destabilizzazione della lesione stessa. Inoltre è stato dimostrato che nella placca aterosclerotica c’è una frazione di GGT con caratteristiche simili a quella presente nel siero, ciò suggerisce che la GGT sierica sia implicata direttamente nell’evoluzione della patologia, quindi lo studio delle frazioni può essere d’aiuto nel capire i meccanismi implicati nella patologia cardiovascolare. Per studiare i meccanismi patogenetici della malattia aterosclerotica, si ricorre a diversi modelli animali, quali il coniglio, il maiale e la pecora, tre specie nelle quali si studiano gli effetti dell’ipercolesterolemia sulla formazione di placche aterosclerotiche. Il maiale è anche un modello di studio per lo scompenso cardiaco, mentre le pecore sono utilizzate per l’impianto del cuore artificiale. Lo scopo di questa tesi è quello di descrivere qualitativamente e quantitativamente la distribuzione delle frazioni circolanti di GGT per meglio caratterizzare questo fattore di rischio cardiovascolare nelle tre specie suddette. Inoltre poiché l’espressione della GGT cambia durante l’ontogenesi, nella pecora è stata analizzata la distribuzione della GGT a diversi stadi di sviluppo.. 43.

(47) Materiali e metodi. 3. MATERIALI E METODI 3.1 Reagenti. Il substrato Ȗ-Glutammil-7-amido-4-metilcumarina (ȖGluAMC,G7261), la Glicilglicina (GlyGly, G1002) e tutti i reagenti sono stati acquistati dalla SigmaAldrich (Italia).. 3.2 Preparazione dei campioni di plasma I campioni di sangue sono ottenuti da soggetti sani di sesso maschile e femminile di diverse specie: ovino (n=5), coniglio (n=2) e minipig (n=4). Il plasma è stato ottenuto centrifugando ciascun campione di sangue per 15 minuti a 1500xg a temperatura ambiente per rimuovere la parte corpuscolata; il campione di plasma così ottenuto è suddiviso in aliquote e conservato a -20°C fino al momento dell’uso. I 5 campioni di ovini sono stati ottenuti da un maschio di 2 mesi ancora lattante, da un maschio adulto di 4 anni, da due femmine adulte di 4 e 1 anno e da una femmina di 6 mesi. Quest’ultima è completamente indipendente dalla madre, ma non ha ancora raggiunto l’età riproduttiva corrispondente a 10 mesi di vita. I 4 campioni di minipi sono stati ottenuti da una coppia maschio, femmina di 6 mesi e da una di 8 mesi. Tutti gli individui hanno raggiunto l’età riproduttiva (4 mesi per i maschi e 5 mesi per le femmine). Entrambi i conigli campionati, un maschio e una femmina, hanno 1 anno di vita e sono considerati adulti (età riproduttiva 10 mesi per i maschi, 8 mesi femmine).. 44.

(48) Materiali e metodi. 3.3 HPLC per la determinazione delle frazioni di GGT Il campione di plasma da analizzare (25µl), preventivamente filtrato con un filtro da siringa in PVDF da 0.45 ȝm (Millipore), è iniettato in una colonna cromatografica per esclusione molecolare (Superose 6 HR 10/300 GL,GE Healthcare ) e sospinto alla velocità costante di 0,5ml/min da una fase mobile costituita da tampone sodio fosfato 0,1mM a pH 7,4 contenente NaCl 0,2 M, EDTA 0,1 mM, glicilglicina (Gly-gly) 4,5 mM. La colonna cromatografica è calibrata con proteine a peso molecolare noto per stabilire la relazione tra peso molecolare e volume di eluizione. Per poter determinare in continuo l’attività di GGT, attraverso una connessione a T, all’eluato della cromatografia è stata continuamente aggiunta una soluzione contenente il substrato fluorescente per la GGT, Ȗ-Glutammil-7-amido-4metilcumarina (ȖGluAMC), rilasciata al flusso di 0,1 mL/min. La reazione enzimatica avviene per circa 4.5 minuti a pH 8.2 in una spira di reazione del volume 2.6 mL mantenuta a temperatura costante di 37°C in un bagnetto termostatico (Fig. 3.1). Poichè l’accettore della reazione catalizzata dalla GGT è incluso nella fase mobile, la presenza dell’enzima è visualizzata attraverso la liberazione del composto fluorescente amminometilcumarina (AMC) secondo la reazione:. Ȗ-Glu-AMC + GlyGly ĺ Ȗ-Glu-GlyGly + AMC. Il segnale derivante dalla reazione è rilevato tramite un fluorimetro operante a una lunghezza d’onda di eccitazione di 380 nm e di emissione di 440 nm. 45.

(49) Materiali e metodi. Parte A Pompa HPLC Flusso 0.5 mL/min. Colonna separativa cromatografica. Parte B Perfusore Riserva. Flusso 0.1 ml/min. Iniettore Campione iniettato 25 µLµL Vinj = 100 Mixing coil. Rivelatore (spettrofotometro, fluorimetro, elettrochimico). Bagnetto termostatico 37°C. Fig 3.1. Schema dell’apparato per la separazione e quantificazione delle frazioni plasmatiche di GGT.. 46.

(50) Materiali e metodi. Con questo metodo, nel plasma umano, si distinguono quattro frazioni con attività di GGT che eluiscono ai seguenti volumi: b-GGT 11,4 mL; m-GGT 15,0 mL; 18,5 mL; f-GGT 21,2 mL. Le condizioni di reazione sono tali per cui l’area sottesa a tutto il cromatogramma, tra 10 e 25 mL di volume di eluizione, è proporzionale all’attività totale di GGT determinata dal laboratorio di analisi chimico-cliniche dell’Istituto di Fisiologia Clinica (CNR Pisa) e l’area sottesa ai picchi cromatografici è proporzionale all’attività di GGT associata ad ogni frazione. L’attività di queste ultime è calcolata secondo la proporzione:. area tot : GGT totale = area picco : GGT frazione. La soluzione madre di ȖGluAMC è preparata settimanalmente alla concentrazione di 4,5 mmol/L in etanolo 30% w/w contenente NaOH 0.005 N. Tale soluzione è conservata a -20°C, protetta dalla luce. La soluzione di Ȗ-Glu-AMC 4,5 mM è diluita in tampone TRIS 0,25M pH 8,5 per ottenere la concentrazione di Ȗ-Glu-AMC 180 µM. L’intensità di fluorescenza del segnale è espresso in unità arbitrarie di fluorescenza (f.u.) e l’area sotto i picchi è proporzionale all’attività di GGT (Franzini et al., 2008).. 47.