IL LABORATORIO DI ANALISI NELLA DIAGNOSI E MONITORAGGIO DELLE PATOLOGIE AUTOIMMUNI.

(1)

Il Laboratorio nelle malattie Autoimmuni

Scuola di Specializzazione in Patologia Clinica

Relatore : Prof Alfonso Pompella

Candidato : Lucia

Zagaria

(2)

Malattie Autoimmuni

➢

Organo specifiche

➢

Intermedie

(3)

L'esame EliA è un immunodosaggio d'enzima fluorescente (fluorescence enzyme immunoassay, FEIA) ed è progettato sotto forma di immunodosaggio "sandwich".

Un well viene rivestito con un antigene specificamente riconosciuto dagli anticorpi bersaglio, che rappresentano i marcatori per una determinata malattia autoimmune. Se questi specifici anticorpi sono presenti nel campione ematico del paziente, si legheranno all'antigene. Nella successiva fase di reazione, un anticorpo secondario coniugato all'enzima si lega all'anticorpo bersaglio, legato all'antigene.

L'enzima trasforma un substrato aggiunto in un prodotto fluorescente. Confrontando il segnale della fluorescenza con quello di calibratori di concentrazioni note, può essere determinata la concentrazione anticorpale nel campione dell'esame.

(4)

MALATTIE AUTOIMMUNI SISTEMICHE

•

Lupus Eritematoso Sistemico (ANA, anti-nDna, anti-Sm,

antiribosomi …. )

• Sclerodermia (anti-SCL70, anti-Centromero)

• Artrite Reumatoide ( fattori reumatoidi CCP)

• Connettivite Mista (anti-U1nRNP)

• Dermatomiosite/Polimiosite (anti-Jo1)

• Sindrome di Sjögren (anti-SSA, anti-SSB)

•Vasculiti ( ANCA)

•Sindrome da anticorpi antifosfolipidi (anti-cardiolipina,

β2 glicoproteina 1)

(5)

Serie di patologie eterogenee per modalità di presentazione

e gravità, con quadri clinici che possono riguardare un solo

organo a forme di interessamento sistemico.

Sono dovute ad alterazioni del sistema immunitario che non

è più in grado di riconoscere le proprie strutture

antigeniche producendo anticorpi contro di esse.

(6)

Reazioni del sistema immunitario contro i costituenti self

IgM a basso titolo

Il concetto di autoimmunità fu coniato agli inizi del XX secolo

Dal premio Nobel Paul Ehrlich (1854-1915). Horror autotoxicus

la capacità di reagire contro i costituenti del proprio organismo

(7)

CARATTERI COMUNI A TUTTE LE MALATTIE AUTOIMMUNI

familiarità

maggior frequenza nel sesso femminile

insorgenza apparentemente spontanea

presenza di ipergammaglobulinemia

decorso cronico, caratterizzato da esacerbazioni e remissioni

E' anche possibile che manifestazioni cliniche di una forma si associno a

manifestazioni di un'altra malattia autoimmune (sindromi da sovrapposizione).

(8)

La patologia autoimmune è caratterizzata dalla:

1.Produzione di anticorpi che reagiscono contro i tessuti self 2.La reazione non deve essere conseguenza di una lesione tissutale

ma deve essere la causa primaria della malattia

Il danno ai tessuti è riconducibile a reazioni di ipersensibilità di II e III tipo 3.Produzione di cellule T effettrici reattivi contro i peptidi self

(9)

Organo specifiche

● Lupus eritematoso sistemico ● Slerodermia

● Malattia mista del tessuto

connettivo

● Sindrome di Sjogreen ● Vasculiti

● Sindrome Anti fosfolipidi

➢ Tirotidi Autoimmuni ● Diabete Mellito ● Epatiti Autoimmuni Malattie autoimmuni Sistemiche Organo Specifiche

(10)

Una malattia autoimmune deve soddisfare i seguenti criteri:

-evidenza di una reazione immunitaria verso autoantigeni;

-riproducibilità nell'animale da esperimento mediante inoculazione

dell'antigene specifico.

- trasferibilità nell'animale da esperimento mediante iniezione di siero

contenente autoanticorpi o di cellule autoreattive.

Criteri di classificazione delle malattie

autoimmuni

(11)

PRINCIPALI MALATTIE AUTOIMMUNI

Sistemiche Intermedie Organo Specifiche LES AR Sclerodermia Polimiosite Dermatomiosite Connettivite Mista Sindrome di Sjogreen Vasculiti S, Goodpasture Uveiti Sclerosi Multipla Epatiti autoimmuni Miastenia Gravis Colite ulcerosa Addinson Idiopatico Tirotidi Autoimmuni Gastrite Atrofica Anemia Perniciosa Connettiviti

(12)

Selezione negativa: nel timo i linfociti T self-reattivi vanno incontro ad apoptosi

Tolleranza centrale

(13)

A) PREDISPOSIZIONE GENETICA

- Aggregazione familiare; correlazione con aplotipi HLA; M.A.I. spontanee in animali

- Espressione inappropriata di MHC-Classe II

B) LINFOCITI B CD5+ (Aumento nelle MAIS; produzione

di AA in vitro e in vivo)

C) DEFICIT MECCANISMI REGOLATORI

D) INTERVENTO SCATENANTE DI FATTORI ESOGENI - Attivazione policlonale B-linfociti (Virus e batteri)

- Mimetismo molecolare (cross-reattività non-self=self) - Reattività anti-idiotipica

E) ORMONI SESSUALI

- Maggior frequenza di MAIS nel sesso femminile (Estrogeni inibitori dei Ts)

(14)

Anergia

Delezione

Soppressione

Quando il meccanismo centrale non è del tutto

(15)

Tolleranza centrale

lifociti B

Nel midollo I Linf B autoreattivi effettuano la revisione recettoriale (riarrangiamento in Linf B non autoreattivi, 25-50%) Nel midollo

(16)

Tolleranza centrale E periferca

(17)

Treg CD4 CD25 originano nel timo, hanno elevato CTL4A, FOXP3

Tr1, CD4 , producono: IL-10, TGF-β, INF-γ, IL-5 e bassi livelli di IL-2 e IL-4 Th3: TGF-β, IL-4 e IL-10

(18)

Soppressione di cellule T regolatorie:

(19)

Connettiviti

Tra i vari autoanticorpi si sono considerati gli

ANA - anticorpi antinucleo:la loro presenza è

una caratteristica peculiare delle malattie

autoimmuni non organo specifiche

Hep-2 sono i substrati più sensibili pertanto

più indicati nella ricerca degli ANA

(20)

Principali Antigeni cellulari

● Antigeni Cromatinici

DNA,Nucleosoma,Istoni

● Antigeni del Nucleoplasma

Topoisomerasi I Centromero PCNA

Ku

Ribonucleoproteine a basso peso molecolare Ro/SSa Ro/Ssb

● Antigeni del Nucleolo

Complesso PM/Scl esosoma

Sistema antigenico Th/To ribonucleoproteine associate agli RNA

RNA polimerasi I,II,III

SnoRNP ribonucleoproteine nucleolari

● Antigeni dello Spliceosoma

SnRNP ribonucleoproteine nucleari

Antigene Sm , sono 9 polipeptiti associati: B,B1,N,D1,D2,D3,E,F,G.

● Antigeni Citoplasmatici:

varie RNA sintetasi es la istidil RNA sintetasi o Jo-1, PL7,PL12 ecc, antigene P , apparato del Golg, endosomi,Lisosomi

(21)

Autoanticorpi circolanti

Anti Antigeni cromatinici

Anti DNAss ,Anti DNAds, Anti Nucleosoma (responsabile del fenomeno LE), Anti Istoni

Anti Antigeni del nucleoplasma

Anticorpi anti -DNA topoisomerasi I (Scl/70), Anticentromero, (CEMP A,CEMP B,CEMP C. ecc

anti PCNA, anti Ku, anti Ro/SSa Ro/Ssb

Anti antigeni del Nucleolo:

Anti PM/Scl, anti Th/To, Anti RNA Polimerasi, anti fibrillarina.

Anti Spliceosoma: Anti Sm, anti SnRNP (U1-RNP ,U2RNP) Anticorpi anti Citoplasmatici: Anti-Jo-1 anti-PL7,PL-12 ecc

Anti proteine Ribosomiali: Anti P,Anticorpi anti Golgi (AGA),Anti endosomi ( EEA1,CLIP-170, GASP-1), Anti mitocondri.

(22)

(23)

■

ENA :Antigeni nucleari estraibili

:Sm,

U1RNP, Ro(SSA), La (SSB), Jo1 (istidil

tRNA sintasi), SCL70 (topoisomerasi)

■

Antigeni nucleari non estraibili

:DNAss,

DNAds o DNAn, istoni, centromero

■

Antigeni citoplasmatici

:Jo-1, mitocondri,

ribosomi

(24)

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO

DELLE MAS

 _{INDICI IMMUNOLOGICI: Autoanticorpi circolanti, protidogramma, esami}_{INDICI IMMUNOLOGICI: Autoanticorpi circolanti, protidogramma, esami}

genetici

 _{INDICI DI FLOGOSI : ves, CRP,Sideremia Esame emocromocitometrico}_{INDICI DI FLOGOSI : ves, CRP,Sideremia Esame emocromocitometrico}  la ves risulta aumentata, Emoglobina e Sideremia ridotte, Piastrinopenia, _{la ves risulta aumentata, Emoglobina e Sideremia ridotte, Piastrinopenia,}

frazioni del complemento.

(25)

FREQUENZA DI ASSOCIAZIONE CON LE

MALATTIE AUTIMMUNI SISTEMICHE

ANA

LES LES > 90 % > 90 % CM 100 % CM 100 % SS 80 % SS 80 % SSJ 60 % SSJ 60 % P - DM 30 % P - DM 30 % AR 30 % AR 30 % LES LES > 90 % > 90 % CM 100 % CM 100 % SS 80 % SS 80 % SSJ 60 % SSJ 60 % P - DM 30 % P - DM 30 % AR 30 % AR 30 %

(26)

Gli anticorpi antinucleo (ANA) sono anticorpi diretti contro

macromolecole nucleari naturali native e/o denaturate

comunemente presenti nel siero dei pazienti con malattie

(27)

Immunofluorescenza indiretta (IFI) Immunoprecipitazione, Immunodiffusione Controimmunoelettroforesi Emagglutinazione RIA / IRMA Western Blot

Dot Blot, ImmunoBlot ELISA

ELIA 

(28)

S

Si presta alla ricerca di auto-anticorpi per individuare la presenza di malattie autoimmuni._{i presta alla ricerca di auto-anticorpi per individuare la presenza di malattie autoimmuni.}

Vantaggi:

Sensibilità e specificità di reazione.

Semplicità e rapidità d’esecuzione.

Facile riproducibilità.

Permette di ottimizzare l’iter diagnostico.

Costo contenuto

..

Indaga sulla presenza di auto-anticorpi e evidenzia pattern non ancora

descritti.

Limiti: Limiti:

Tecnica soggettiva.

Solubilità di alcuni antigeni nucleari.

Non consente l’identificazione delle specificità anticorpali.

Necessita di un sistema ottico efficiente.

(29)

Nucleari

Citoplasmatici

omogeneo (DNA, Istoni) punteggiato (Jo1)

granulare (RNP, Sm, SSA, SSB) mitocondriale (PiruvatoDH)

nucleolare (Scl-70) ribosomiale (RNP)

centromerico ( CENP A.B.C) citoscheletro(actina,vimentina)

Mitotici

fibre del fuso mitotico (tubulina)

poli del fuso mitotico (NuMa)

centrioli (enolasi)

(30)

Pattern fluorescente omogeneo Hep-2

Alcuni Esempi di Pattern

Fluorescenza che interessa

la periferia

del nucleo

(31)

(32)

Centromerico Ribosomi

Citoplasmatico

(33)

(34)

RISULTATI

ANA PATTERN nDNA ENA ANCA

1:160 Omo/cito N N 1:2500 Speckled Ssa> 240 SSb209 1:1280 Granulare Ssa > 240 SSb>240 1:640 Speckled Ssa > 240 SSb>240 1:128 Numa 1 1:640 Diffuse grainy 17 1:160 Nucleolare 1:1280 Fine SSa > 240 SSb 17 1:80 Omogeneo N N N 1:40 Nucleolare N N 1:640 Omogeneo 17.7 N 6.7 1:320 Speckled N SSa> 240 SSb 37 1:2500 Centrometro ACA 132 N N N N N 1:320 Omogeneo N SSa>240 1:1280 Omogeneo N N

1:5000 Centromero SSa20 ACA> 320

N N SSa>240 1:80 Granulare N N N 1:10000 Granulare Ssa > 240 1:320 Omogeneo N N N 1:1280 Omogeneo 420 N 1:320 Omogeneo 39 1:10000 Nucleare Ssa > 240

(35)

•In condizioni normali non esistono livelli di autoanticorpi rilevabili, se rilevati, sono generalmente a basso titolo(non clinicamente significativo) e non rivestono molta importanza.

•non sempre il risultato positivo per ANA corrisponde ad un successivo risultato positivo per dsDNA o ENA •verificare sempre il quadro generale del soggetto: età, possibili reazioni crociate, prelievo in gravidanza, malattie virali, trattamenti

farmacologici in corso, alta concentrazione di IgM. •In tutti questi casi la positività per ANA risulta solo come epifenomeno e non va considerata clinicamente

significativa

ANA TITOLO PREVALENA% 1:80 20-30 1:160 10-12 1:320 5

(36)

ANA < 1:80 NON è NECESSARIO ULTERIORE ACCERTAMETO

ANA =O > 1:80 EFFETTUARE NUOVI CONTROLLI DOPO 3-6 MESI

ANA > 1:160 SONO NECESSARI ULTERIORI ACCERTAMENTI PROBABILE PRESENZA DI UNA MALATTIA AUTOIMMUNE

(37)

(38)

Esami di Secondo Livello ANA IFI POSITIVO

Ab Anti ENA Anti ds DNA

ANTI ds DNA:

Crithidia luciliae, alla diluizione iniziale del siero 1:10 ( elevata specificità )

(39)

IFI

-

ELIA

elevata sensibilita’e riproducibilita’ standardizzazione

facilita’di esecuzione automatizzazione

difficile standardizzazione oggettività

soggettivita’ limitato numero di

costo ridotto antigeni nel coating

CONFRONTO TRA METODICHE

(40)

conclusioni

Questa tabella rappresenta un campione di 25 pazienti dei tantissimi che affluiscono all'Ospedale Unico della Versilia, i pattern e i titoli come si può osservare possono essere diversi anche se associati allo stesso tipo di autoanticorpo, tutta via nel laboratorio di Sierologia le richieste giungono solitamente come ;ANA e ENA screenig, c'è comunque da considerare anche se al paziente è già stata diagnosticata una patologia autoimmune e si reca per valutare nel tempo il titolo

Se si tratta invece di un paziente in cui c'è il sospetto forte della presenza di una patologia autoimmune si procede con test a cascata, a parte gli esami ematochimici generali, gli ANA rappresentano il primo livello di esami di screenig, che in base alla valutazione dei risultati si procederà poi a test di secondo livello più specifici per diagnosticare la patologia, e ovviamente il clinico dovrà comunque considerare se gli aspetti sintomatologici siano congruenti con i risultati del referto.

In base alle considerazioni le due metodiche prese in esame non sono intercambiabili considerando che le tecniche come l'ELIA siano molto sensibili possono aumentare i falsi positivi, generando preoccupazioni inutili, allora è importante modulare la potenza di questi nuovi test rispetto alla metodiche più “antiche” organizzando un algoritmo diagnostico che possa utilizzarli come test di secondo livello, posso concludere che le metodiche prese in considerazione sono Complementari e si prestano perfettamente alla esigenza di procedere con esami di primo livello ed esami di secondo livello se necessario.

(41)