RISPOSTE PRECOCI ALLA TOSSICITA’ DA RAME IN RADICI DI COLZA Early response to copper toxicity in roots of Brassica napus
Russo M., Sgherri C., Izzo R., Navari-Izzo F.
Dipartimento di Chimica e Biotecnologie Agrarie, Università di Pisa
Sommario
Radici di piante di colza (Brassica napus cv. Stego) sono state incubate in una soluzione contenente CuSO4 100 μM per differenti periodi di tempo (da 1 min a 6 h).
L’apparato radicale ha presentato un accumulo continuo di rame. L’attivazione delle fosfolipasi C e D si è verificata già dopo 1 minuto di trattamento, con un massimo dopo 10 minuti. La presenza di glutatione è aumentata dopo 15 minuti di incubazione con il metallo, mentre la glutatione riduttasi è stata inibita per tutto il periodo sperimentale. Summary
Seedlings of Brassica napus cv. Stego were incubated in a solution containing 100 μM CuSO4 for different times (from 1 min to 6 h). Copper accumulated into the roots
during the whole experiment. Activation of phospholipase C and D occurred in the roots already after 1 minute of the treatment, reaching a maximum after 10 minutes. Glutathione amounts showed an increase after 15 min of the treatment whereas glutathione reductase was inhibited for the whole experiment.
Introduzione
La contaminazione dei terreni coltivati con metalli pesanti è uno dei fattori che limita maggiormente la produttività. Il rame è un micronutriente essenziale ma quando è presente in eccesso rappresenta una minaccia per la regolare funzionalità delle attività metaboliche. Nella cellula il Cu (II) risulta facilmente ridotto a Cu (I). In questa forma risulta fortemente instabile e tende ad essere ossidato dando luogo a reazioni tipo Fenton che generano specie reattive dell’ossigeno (ROS) causando stress di tipo ossidativo (Sgherri et al. 2003). ROS quali il radicale superossido (O2.-) ed il perossido
d’idrogeno (H2O2) sono composti responsabili dei processi di perossidazione dei lipidi
di membrana, dell’alterazione dell’omeostasi degli ioni calcio e dell’ossidazione dei gruppi sulfidrilici delle proteine di membrana (Navari-Izzo et al. 1998). In primo luogo il rame agisce a livello radicale ma, quando presente a concentrazioni tossiche, può interferire con numerosi processi fisiologici anche a livello fogliare tra cui quello fotosintetico (Ciscato et al., 1997; Lidon et al., 1993).
Sono molte le molecole che si ritiene abbiano un ruolo nella trasduzione dei segnali durante lo stress ossidativo tra cui le ROS, l’acido ascorbico, il glutatione (GSH) ed i messaggeri lipidici. Il GSH, determina l’induzione di geni che intervengono nella difesa contro gli stress; infatti, il GSH opera con un meccanismo che genera segnali intracellulari per l’induzione della replicazione del DNA. Il GSH può così essere coinvolto nel trasporto dei segnali fuori dalla cellula. Inoltre, poiché il GSH può essere trasportato attraverso l’intera pianta, esiste anche la possibilità che sia coinvolto nel trasporto dei segnali a lunga distanza (Foyer et al. 1997).
Anche l’attivazione di fosfolipasi è stata posta in relazione al processo di trasduzione del segnale in seguito a stress essendo l’idrolisi dei lipidi la prima tappa della generazione dei messaggeri lipidici. In particolare, l’acido fosfatidico (PA), prodotto dall’azione delle fosfolipasi C e D, rappresenta un importante secondo messaggero coinvolto nel burst ossidativo che si genera in risposta a vari stress biotici ed abiotici compreso l’eccesso di rame (Navari-Izzo et al., 2006).
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di studiare in radici di piante di Brassica napus trattate con eccesso di rame la produzione di segnali lipidici ed antiossidativi. Materiali e Metodi
Piante di colza (Brassica napus. cv. Stego) sono state cresciute per 21 giorni in coltura idroponica utilizzando la soluzione nutritiva riportata da Salt et al. (1995), rinnovata ogni 3 giorni. Le piante sono state fatte crescere in condizioni controllate con densità di flusso fotonico: 400 µmol m-2 s-1, fotoperiodo luce/buio: 16/8 h (giorno/notte), temperatura giorno/notte: 21/16°C, umidità relativa: 75%. Al momento del prelievo, le radici delle piante intere sono state lavate con acqua distillata ed immerse in una soluzione di MOPS/NaOH 5 mM (pH 6) contenente CuSO4 100 μM per
periodi di tempo crescenti (da 1 minuto a 6 ore). Terminato il periodo di incubazione, le piante sono state tagliate al colletto, le radici desorbite con Pb(NO3)2 5 mM ed è stato
determinato il contenuto di rame secondo quanto riportato da Izzo et al. (1991). Per la determinazione del fosfatidilbutanolo (PtBut), alla miscela di incubazione contenente rame è stato addizionato n-butanolo allo 0,2% (Navari-Izzo et al., 2006). Per l’analisi dei lipidi, le radici sono state immerse per 5 minuti in alcol isopropilico bollente per inattivare le fosfolipasi ed immediatamente poste in azoto liquido. I lipidi sono stati estratti con una miscela di cloroformio/metanolo (2:1, v/v) contenente butilidrossitoluolo (BHT) come antiossidante. La separazione e l’analisi dei lipidi sono state eseguite utilizzando tecniche cromatografiche (estrazione in fase solida, cromatografia su strato sottile) in accordo a Quartacci et al. (2002). La separazione cromatografia del PtBut è stata ottenuta utilizzando come eluente la fase organica superiore della miscela composta da etil acetato/isottano/acido acetico/acqua (13:2:3:10, v/v/v/v), previa eluizione della lastra con acetone per allontanare composti interferenti con i glicolipidi (de Vrije e Munnik, 1997). L’ attività della fosfolipasi C (PLC) è stata ottenuta dopo cromatografia su strato sottile (TLC) analizzando l’intensità della banda relativa al diacilglicerolo (DAG) secondo il programma Total Lab v. 1.10. Il contenuto di glutatione totale (GSH + GSSG) e quello della forma ossidata (GSSG) così come l’attività della glutatione riduttasi (GR) sono stati determinati secondo Sgherri e Navari-Izzo (1995).
Risultati e Discussione
Il contenuto di rame nelle radici delle piante di colza ha mostrato un rapido incremento già dopo 1 min di trattamento raggiungendo alla fine della sperimentazione un valore 80 volte più elevato rispetto al controllo (Russo et al., 2005).
Il PA, prodotto diretto della fosfolipasi D o indiretto della fosfolipasi C, da 3,95 moli% dei PL totali nelle piante controllo è aumentato linearmente nel tempo fino a
controllo. A tempi superiori ai 10 minuti si è osservata una diminuzione del livello di PA, che è ritornato vicino ai livelli del controllo (Fig. 1).
1 10 100 1000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min P A
Fig. 1. Variazioni del contenuto di PA nelle radici di Brassica napus cv. Stego incubate con 100 μM CuSO4 per periodi di tempo crescenti (da 1 a 360 minuti). Il PA è espresso come incremento rispetto al
controllo (linea orizzontale, 3,95 ± 0,08 moli% dei PL totali).
La fosfolipasi D (PLD), determinata misurando la produzione del fosfatidilbutanolo (PtBut), ha mostrato una rapida attivazione già dopo 1 min di trattamento, raggiungendo la massima attivazione dopo 10 min con un valore 11 volte circa piú elevato rispetto al controllo (Fig. 2). La rapida e transitoria produzione di PtBut, e quindi del PA, è una tipica risposta dei messaggeri lipidici responsabili della trasduzione del segnale.
La fosfolipasi C (PLC), determinata tramite la produzione di diacilglicerolo (DAG), ha mostrato analogo andamento temporale del PA e del PtBut (Figure 1-2). La massima attivazione è stata riscontrata dopo 10 min, con un incremento di circa 3,5 volte rispetto al controllo (Fig. 3).
Le cinetiche temporali di produzione dei DAG, del PtBut e del PA (Figure 1-3) indicano che sia la PLC che la PLD sono state prontamente attivate a seguito dell’incubazione delle radici in eccesso di rame, a differenza di quanto ritrovato nell’apparato fogliare, dove le fosfolipasi non sono state attivate dal metallo (Russo et al., 2005).
1 10 100 1000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 min P tB u t
Fig. 2. Variazioni del contenuto di PtBut nelle radici di Brassica napus cv. Stego incubate con 100 μM CuSO4 per periodi di tempo crescenti (da 1 a 360 minuti).Il PtBut è espresso come incremento rispetto al
controllo (linea orizzontale, 0,62 ± 0,11 moli% dei PL totali).
1 10 100 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 min D A G
Fig. 3. Variazioni del contenuto di DAG nelle radici di Brassica napus cv. Stego incubate con 100 μM CuSO4 per periodi di tempo crescenti (da 1 a 360 minuti).Il DAG è espresso come incremento rispetto al
controllo (linea orizzontale, 2,96 ± 0,07 moli% dei lipidi totali).
Il decremento del glutatione totale (GSH + GSSG) e del GSH osservato nei primi 10 minuti di trattamento, può rappresentare un meccanismo di risposta precoce della pianta allo stress, avendo il glutatione funzione antiossidativa. Il rapido decremento potrebbe essere giustificato anche dalla sua traslocazione nella parte aerea, osservata nella precedente sperimentazione (Russo et al., 2005). Infatti, a differenza dei messaggeri lipidici, il GSH potendo traslocare attraverso l’intera pianta, risulta essere coinvolto nel trasporto dei segnali a lunga distanza (Foyer et al., 1997). L’incremento percentuale del GSSG, già dopo 1 minuto di incubazione con il rame, è un indice della capacità
GR ha subíto un rapido decremento della sua attività già dopo 1 minuto di trattamento, mantenendosi per tutto il periodo sperimentale a un valore piú basso rispetto al controllo (Fig. 4). Questa inattivazione potrebbe essere dovuta ad un più intenso stress ossidativo subíto dall’apparato radicale rispetto a quanto ritrovato nell’apparato fogliare (Russo et al., 2005). 1 5 10 15 30 60 120 360 0 1 2 3 4 5 6 7 8 min G S H + G S S G ( m o l/ g s .s .) 1 5 10 15 30 60 120 360 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min G S H ( m o li /g s .s .) 1 5 10 15 30 60 120 360 0 10 20 30 40 50 min G S S G ( % ) 1 5 10 15 30 60 120 360 0 1 2 3 4 5 6 min G R ( U /m g p ro te in a )
Fig. 4. Contenuti di glutatione totale (GSH + GSSG), ridotto (GSH), ossidato (GSSG) ed attività specifica della glutatione riduttasi (GR) nelle radici di Brassica napus cv. Stego incubate con 100 μM CuSO4 per
periodi di tempo crescenti (da 1 a 360 minuti).
Conclusioni
A livello radicale, la risposta della pianta allo stress ossidativo si è sviluppata con la produzione di segnali lipidici ed antiossidativi. Le cinetiche temporali di produzione dei DAG, del PtBut e del PA (Figure 1-3) indicano che sia la PLC che la PLD sono state prontamente attivate a seguito dell’incubazione delle radici in eccesso di rame. Come è caratteristico dei segnali intracellulari, la formazione dei messaggeri è risultata limitata in uno stretto arco di tempo in modo tale che il segnale, una volta diminuito di intensità, possa aumentare nuovamente in risposta ad un altro stimolo.
In corrispondenza di tutti i punti sperimentali, il glutatione ha avuto un’azione antiossidativa mostrando decrementi rispetto al controllo; infatti la percentuale del GSSG è incrementata già dopo 1 minuto di incubazione e per tutto il periodo di sperimentazione. L’incremento a 15 minuti di trattamento, potrebbe indicare il suo funzionamento da messaggero del burst ossidativo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato svolto con un finanziamento dell’Università di Pisa (Fondi di Ateneo 2004, 2005).
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