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UNIVERSITÀ DI PISA
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aurea Specialistica in Chimica
TESI DI LAUREA
DETERMINAZIONE DEL PROFILO
METABOLICO IN PIANTE DI NICOTIANA
LANGSDORFFII MEDIANTE HPLC-MS/MS
Relatore: Prof. Roger Fuoco
Correlatore: Dott. Andrea Raffaelli
Controrelatore: Prof. Adriano Carpita
Candidato: Gabriele Belli
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Dedica
Questa tesi la voglio dedicare a Selene, la persona più importante della mia vita.
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Ringraziamenti
Numerose sono le persone che negli anni universitari mi hanno aiutato a crescere sia professionalmente sia come uomo.
I miei ringraziamenti vanno a tutti i miei amici e ai professori che hanno fatto di me quello che sono.
Vorrei ringraziare i mie genitori per avermi sempre dato la possibilità di compiere le mie scelte.
Un ringraziamento particolare va ai miei nonni, Piero e Loredana, che mi hanno sempre sostenuto e spronato.
Ringrazio anche i miei zii Oliva, Ezio, Luana e Flavio che, assieme ai miei nonni, hanno facilitato i miei studi regalandomi il tanto ambito MacBook.
Per ultimo, ma non ultimo, vorrei ringraziare il Dottor Alessandro Saba che mi ha consigliato ed aiutato nella risoluzione delle singolari condizioni operative che si sono presentate.
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INDICE
RIASSUNTO...9
INTRODUZIONE E SCOPO DELLA TESI...11
CAPITOLO 1 DESCRIZIONE DEL SISTEMA BIOLOGICO...13
1.1. Introduzione...13 1.1.1 Auxine...14 1.1.2 Citochinine...15 1.1.3 Etilene...17 1.1.4 Acido abscissico ...17 1.1.5 Acido Jasmonico...18 1.1.6 Acido Salicilico...18 CAPITOLO 2 DETERMINAZIONE DEL PROFILO METABOLICO: STATO DELL’ARTE ...21
2.1 Estrazione dei fitormoni dalla pianta...21
2.1.1 Procedura di estrazione...23
2.1.2 Purificazione dell’estratto...23
2.2 Determinazione dei fitormoni mediante GC-MS...24
2.3 Determinazione dei fitormoni mediante HPLC-MS/MS...25
2.4 Determinazione mediante ELISA...27
CAPITOLO 3 PARTE SPERIMENTALE...29
3.1 Spettrometria di massa...29
3.1.1 Sorgenti...29
3.1.1.1. Turbospray Ionization (TIS)...30
3.1.1.2 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)...31
3.1.1.3 Atmosperic Pressure Photo Ionization (APPI)...32
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3.1.3 Strumento utilizzato...34
3.2 Sistema cromatografico...35
3.3. Reagenti ...36
3.3.1 Preparazione degli standard per le rette di calibrazione...37
3.3.2 Preparazione di estratti di campioni reali spiked...39
3.3.3 Preparazione dei bianchi...40
3.3.4 Preparazione dei campioni...40
3.4 Metaboliti studiati...41
CAPITOLO 4 RISULTATI E DISCUSSIONE...45
4.1. Sviluppo del metodo analitico...45
4.1.1 Ottimizzazione dei parametri relativi allo spettrometro di massa45 4.1.1.1 Parametri di composto...45
4.1.1.2 Parametri di sorgente...56
4.1.1.3 Confronto delle sorgenti...57
4.1.2 Scelta dei parametri relativi al sistema cromatografico...65
4.1.3 Rette di calibrazione...70
4.1.4 Limiti di rivelabilità (LOD)...82
4.2 Confronto delle prestazioni dell’API 365 con l’API 4000 e l’Esquire 3000 plus...89
Conclusioni...91
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RIASSUNTO
Nel corso di questo lavoro di tesi è stato sviluppato e messo a punto un metodo analitico ottimizzato per la determinazione di alcuni metaboliti secondari [acido 3-indolo acetico (IAA), zeatina (Z), zeatina riboside (ZR), isopenteniladenina (IP), isopentenil adenosina (IPR), acido jasmonico (JA) e relativo estere metilico (JAME), acido salicilico (SA) e relativo estere metilico (SAME), acido scichimico (SHK), acido abscissico (S-ABA), acido 1-ammino-ciclo propanoico (ACC)] in campioni vegetali utilizzando lo strumento Perkin Elmer API 365. Le prestazioni di questo strumento sono state confrontate, in termini di limite di rivelabilità, con quelle di strumenti di generazione più recente, come l’Applied Biosystems API 4000 e il Bruker Daltonics Esquire 3000 plus.
Nel corso dell’ottimizzazione delle prestazioni del PE API 365, sono state confrontate tre differenti sorgenti di ionizzazione sia in modalità ioni negativi che in modalità ioni positivi. Dal confronto delle intensità del segnale, in modalità ioni positivi, la sorgente APPI è risultata quella migliore per IAA, Z, ZR, IP, IPR e JAME, mentre in modalità ioni negativi la sorgente TIS è risultata la migliore per S-ABA, JA e SA.
Per quanto riguarda la parte cromatografica, sono state comparate diverse colonne (Waters Symmetry C18, Phenomenex Curosil PFP, Phenomenex Luna HILIC e Phenomenex Synergi Hydro),e la Synergi Hydro è risultata la migliore in termini di risoluzione dei vari segnali.
Sulla base dei risultati ottenuti, dei dodici metaboliti inizialmente scelti per la messa a punto del metodo analitico, il metil salicilato (SAME) e l’acido scichimico (SHK) sono stati esclusi a causa del cattivo fattore di risposta dello strumento; mentre l’acido 1-ammino-1-ciclopropanoico (ACC) è stato escluso perché non ritenuto da nessuna delle colonne utilizzate.
Infine, le prestazioni dell’API 365 sono state confrontate con quelle di due spettrometri di massa di generazione più recente: l’AB API 4000 e il Bruker Daltonics Esquire 3000 plus. Dal confronto è risultato che l’API 365, operando
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con la sorgente APPI in modalità ioni positivi, ha in generale limiti di rivelabilità simili a quelli dell’API 4000 ed in alcuni casi (ZR; IP e IPR) addirittura migliori da uno a due ordini di grandezza. Mentre, rispetto all’Esquire 3000 plus i limiti sono risultati sistematicamente più alti, sino a quattro ordini di grandezza.
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INTRODUZIONE E SCOPO DELLA TESI
Lo studio degli effetti degli stress abiotici sugli esseri viventi, assume particolare rilevanza in questo periodo storico in connessione con i grandi cambiamenti climatici in corso e con la conseguente necessità di acquisire un maggiore controllo degli impatti umani sugli ecosistemi. E' importante a questo riguardo lo sviluppo di sistemi modello che permettano di analizzare le interazioni dinamiche fra i vari tipi di stress ed organismi biologici con caratteristiche fisiologiche diverse, in grado di rispondere in modo differenziato e controllabile a cambiamenti drastici del contesto ambientale.
Le piante sono potenzialmente uno strumento molto utile per questo tipo di studi in quanto sono sottoposte per interi cicli vitali a stress biotici ed abiotici a cui devono fare fronte modificando la loro interazione con l’ambiente non potendo spostarsi, come gli animali, alla ricerca di nicchie più confacenti alla loro sopravvivenza. Per questo durante l’evoluzione si sono dotate di sofisticati meccanismi di risposta agli stress , che vengono attivati al momento del bisogno, basati sulla ricezione di segnali e sulla espressione da questi indotta, dei geni che controllano una serie di strumenti difesa. Anche se alcuni di questi sono specifici di un certo tipo di stress, ve ne sono altri che vengono comunque attivati sia in caso di attacco da patogeni che in presenza di condizioni ambientali sfavorevoli. All’inizio di molte vie metaboliche attivate da stress vi sono senza dubbio una serie di composti ad azione ormonale che fungono da “chiavi” per l’induzione della risposta generale di difesa. Figurano fra questi tutte le maggiori classi di fitormoni, fra cui le auxine e le citochinine, il cui rapporto è alla base di gran parte dei processi di sviluppo e di difesa delle piante, ed altri , ancora più specifici delle riposta a stress come l’acido salicilico (SA), l’acido jasmonico (JA), l’etilene (ET) e l’acido abscissico (ABA).
Dal punto di vista analitico, le concentrazioni di questi metaboliti in una pianta possono essere estremamente basse, e quindi per poter effettuare l’analisi quantitativa si fa ricorso alla spettrometria di massa accoppiata a varie tecniche
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cromatografiche. In particolare, l’ abbinamento tra HPLC e spettrometria di massa tandem risulta particolarmente vantaggioso. Infatti, l'HPLC permette di separare i vari metaboliti dal resto delle sostanze organiche presenti nella pianta e lo spettrometro di massa tandem, essendo altamente sensibile e selettivo, ne permette l’identificazione e la determinazione quantitativa.
Gli spettrometri di massa accoppiati con l'HPLC sono strumenti molto costosi e questo ne limita di fatto l'utilizzo solo a relativamente pochi laboratori, che per altro possono avere serie difficoltà a sostituire i vecchi strumenti con quelli di generazione successiva. In commercio è quindi possibile reperire strumenti di generazione precedente, a prezzi anche molto vantaggiosi, le cui prestazioni vanno però attentamente valutate al fine di verificare la reale applicabilità al problema specifico. Un esempio è rappresentato dallo spettrometro Perkin Elmer API 365 di generazione precedente e dagli strumenti Bruker Daltonics Esquire 3000 plus e Applied Biosystems API 4000, di più recente produzione. Infatti, lo strumento API 365, nonostante sia stato commercializzato circa dodici anni fa, possiede ancora performance abbastanza elevante in termini di sensibilità e selettività.
L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato pertanto quello di mettere a punto un metodo analitico per la determinazione dei metaboliti secondari in campioni vegetali utilizzando lo strumento Perkin Elmer API 365 di generazione precedente, e di confrontare le sue prestazioni con quelle di strumenti di ultima generazione, come il Bruker Daltonics Esquire 3000 plus e l’ Applied Biosystems API 4000.
