Corso di Analisi chimico-farmaceutiche e tossicologiche 2: introduzione

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DIPARTIMENTO FARMACIA-SCIENZE DEL FARMACO UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI BARI “A. MORO”

Prof. Fulvio Loiodice

fulvio.loiodice@uniba.it

Analisi Chimico-Farmaceutiche

e Tossicologiche II

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Testi consigliati

Fondamenti di Chimica Analitica Autori: Skoog, West, Holler, Crouch

EdiSES

Chimica Analitica Quantitativa Autori: Harris

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MISURA DELLA QUANTITÀ OVVERO DELLA CONCENTRAZIONE DI UNA O PIÙ SOSTANZE PRESENTI IN UN CAMPIONE.

STUDIO QUANTITATIVO DELL’INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE.

ANALISI VOLUMETRICHE Titolazioni •di neutralizzazione •di precipitazione •di complessazione •di ossido-riduzione ANALISI STRUMENTALI Metodi •Potenziometrici •Amperometrici •Conduttimetrici •Spettrofotometrici •Fluorimetrici

Analisi Quantitativa

•Affinità recettoriale

•Saggi di binding con radioligandi e con traccianti fluorescenti •Valutazione dell’attività di agonisti ed antagonisti

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1. Esercitazioni di pesata con la bilancia analitica e uso della vetreria

2. Preparazione e standardizzazione di soluzioni di HCl 0.1 M e di NaOH 0.1 M

3. Titolazione di una soluzione di acido borico (*)

4. Preparazione e standardizzazione di una soluzione di AgNO3 0.1 M

5. Titolazione di una soluzione di cloruro di sodio con metodo di Mohr (*)

6. Preparazione e standardizzazione di una soluzione di EDTA 0.01 M 7. Titolazione di una soluzione di solfato di magnesio (*)

8. Preparazione di una soluzione standard di cerio ammonio nitrato e dosaggio del solfato ferroso in una compressa di Ferrograd® (*)

9. Dosaggio dell’acido ascorbico contenuto nel Cebion® (*)

10. Titolazione potenziometrica e conduttimetrica dell’acido acetilsalicilico contenuto nell’Aspirina® (*)

11. Dosaggio spettrofotometrico della furosemide (*)

ESERCITAZIONI DI LABORATORIO

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(6)

Rispetto ad un’analisi qualitativa, una indagine quantitativa sfrutta un minor numero di reazioni chimiche che però sono:

veloci

complete ripetibili

Analisi qualitativa

Analisi quantitativa

Determinazione della “quantità esatta” di un certo composto nel

campione in esame Identificazione chimica dei

componenti presenti nel campione

Sfruttando le proprietà chimiche, chimico-fisiche e biologiche di un determinato campione è possibile:

Si basa sulla separazione, identificazione e determinazione dei componenti del campione in analisi.

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} Analisi quali-quantitativa dei cibi

◦ _{Es. Determinazione di elettroliti nelle acque minerali}

} Analisi cliniche

◦ _{Es. Determinazione della concentrazione di Na}+ _{e K}+ _{nei liquidi} biologici

} Determinazione di inquinanti

◦ _{Es. Determinazione di idrocarburi, NO, CO nei gas di scarico}

} Analisi nella ricerca scientifica

◦ _{Es. Determinazione della velocità di reazioni chimiche o} enzimatiche per la comprensione dei meccanismi di reazione

} Analisi in processi industriali

◦ _{Es. Determinazione di carbonio, nichel e cromo durante la} produzione dell’acciaio

◦ _{Es. Determinazione del mercaptano nelle forniture di gas} domestico

Il controllo di qualità è parte integrante dei

moderni processi industriali, cui non fa eccezione l’industria farmaceutica

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MEDICAMENTO:

} “

Ogni sostanza avente proprietà curative o profilattiche delle

malattie umane o animali che viene somministrata allo scopo

di stabilire una diagnosi o ripristinare, correggere o

modificare funzioni organiche dell’uomo o dell’animale”

“Everything is a poison, nothing is a poison. It’s the dose that makes the poison”

THEOPHRASTUS BOMBASTUS VON HOHENHEIM (PARACELSO)

SVIZZERA (1493 - 1541)

VELENO

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(10)

(11)

L’analisi farmaceutica risponde alle seguenti domande:

ü Il principio attivo presente nella specialità medicinale è

effettivamente quello riportato?

ü Qual è la sua percentuale in questa formulazione?

ü Nella formulazione è presente solo il principio attivo o sono

presenti impurezze?

ü Qual è la concentrazione delle impurezze specificate nel

principio attivo?

ü A che velocità viene rilasciato il principio attivo in questa

formulazione in maniera che possa essere assorbito dall'organismo?

ü Qual è la concentrazione del farmaco in un campione di tessuto

o nei fluidi biologici?

ü Quali sono i valori di pKa, dei coefficienti di partizione, della solubilità e della stabilità di un determinato farmaco?

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Procura un campione rappresentativo

Valuta l'attendibilità dei risultati Solubilizza i campioni

Elimina le interferenze

Misura le proprietà dell’analita

Calcola i risultati Seleziona il metodo

FASI DI UN’ANALISI QUANTITATIVA

Definisci i campioni replicati

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Prepara un campione da laboratorio Procura un campione rappresentativo

Valuta l'attendibilità dei risultati Definisci i campioni replicati

Solubilizza i campioni Elimina le interferenze

Misura le proprietà dell’analita Calcola i risultati

Seleziona il metodo

FASI DI UN’ANALISI QUANTITATIVA

üvolumetrico ügravimetrico üelettroanalitico üspettroscopico

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(15)

SELEZIONA IL METODO

Accuratezza

Sensibilità

Limite di

rivelabilità

concentrazione

Intervallo di

Selettività

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METODI

CHIMICI

FISICI E CHIMICO-FISICI

METODI

Si basano su una reazione chimica alla quale partecipa l’analita

Con poche eccezioni sono metodi strumentali (quando non implicano alcuna reazione chimica sono puramente fisici)

CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI

METODI

ANALITICI

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Metodi gravimetrici

Si determina la massa dell'analita o di qualche composto in relazione chimica con esso.

Può essere diretto o indiretto

METODI CHIMICI

Metodi volumetrici

Si misura il volume di una soluzione contenente un reagente (titolante) a concentrazione nota che reagisce completamente con l'analita.

Si possono anche basare sulla quantità di gas prodotto o consumato (gas-volumetria)

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METODI FISICI E CHIMICO-FISICI

Metodi elettroanalitici

Implicano la misura di proprietà elettriche (Potenziale, Corrente, Resistenza, ecc)

Metodi spettroscopici

Si basano sulla misura dell’interazione tra una radiazione elettromagnetica e gli atomi o le molecole di analita; oppure sulla produzione di tali radiazioni da parte degli analiti

Metodi misti

Si basano sulla misura di proprietà quali il rapporto massa/carica (spettrometria di massa), la velocità del decadimento radioattivo, il calore di reazione, la velocità di reazione, l'attività ottica e l'indice di rifrazione

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METODI FISICI E CHIMICO-FISICI

VANTAGGI

üMaggiore velocità di esecuzione

üRISPARMIO

üElevata sensibilità e specificità üAmpia applicabilità

SVANTAGGI

üElevato costo d’acquisto e manutenzione dello strumento üTrattamento preliminare del

campione con metodi chimici üNecessità di standard puri

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FASI DI UN’ANALISI QUANTITATIVA

Seleziona il metodo

ümacinazione üfrantumazione üessiccamento CAMPIONAMENTO

(21)

CAMPIONAMENTO

In una analisi chimica si utilizza solo una piccola frazione del materiale in esame. Pertanto l’analisi viene effettuata su un

CAMPIONE che rappresenti FEDELMENTE la composizione della

matrice da cui deriva

Per CAMPIONAMENTO si intende il processo attraverso cui una popolazione del campione è ridotta di dimensioni fino ad una quantità di materiale omogeneo che possa essere facilmente trattata in laboratorio e la cui composizione sia rappresentativa della popolazione stessa

raccogliere un campione grossolano identificare una popolazione

ridurre il campione

ü fango di un tratto di fiume ü cervello di ratto ü cartone di tavolette di vitamine ü frantumazione ü miscelamento ü essiccamento

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POCHI CAMPIONI REALI SONO OMOGENEI!

Il risultato dell’analisi dipenderà dal modo in cui verrà scelta la parte di campione da analizzare

Ne risulta che sarà influenzata l’accuratezza della analisi

CAMPIONAMENTO

Gli errori dovuti ad un cattivo campionamento

non possono essere corretti

i

_t

= i

_m

+ i

_c

it = incertezza totale

im = incertezza del procedimento analitico

i_c= incertezza del procedimento di campionamento Se

i

_c

>i

_m

Þ _non ha alcun senso tentare di migliorare la misura

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CAMPIONAMENTO CASUALE

Il materiale di partenza è diviso in tanti settori reali o

immaginari ed i campioni vengono scelti casualmente tra i

suddetti settori preferibilmente con una tabella di numeri

casuali

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I campioni vengono prelevati da ogni zona caratteristica del

materiale e poi riuniti e mescolati (omogeneità)

mt 20

mt 40

mt 60

mt 80

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Frantumazione

Miscelamento

Viene in genere effettuate tramite un mortaio a diamante o un mulino a palle. Si deve inoltre tener conto della differente durezza dei materiali. Spesso è conveniente procedere con una setacciatura e successiva rimacinazione

Per piccole quantità è sufficiente utilizzare un foglio di carta lucida. Alternativamente si utilizza un miscelatore a V

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Essiccamento

I campioni da laboratorio spesso contengono acqua che è in equilibrio con l’atmosfera

La composizione del campione dipende dall’umidità relativa e dalla temperatura dell’ambiente nel momento in cui viene fatta l’analisi

E’ conveniente allontanare l’umidità dai campioni solidi PRIMA DELLA PESATA o, se questo non è possibile, portare il contenuto di acqua ad un livello riproducibile

Si utilizzano forni convenzionali, microonde, lampade ai raggi infrarossi, essiccatori sottovuoto

Una alternativa è rappresentata dalla determinazione del contenuto di acqua nel momento dell’analisi

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FORME DI ACQUA NEI SOLIDI

1. Acqua essenziale: è l’acqua che rappresenta una parte integrante della struttura molecolare o cristallina di un composto nel suo stato solido

Dipende dalla temperatura e dall’umidità relativa

ü

Acqua di cristallizzazione

: BaCl₂.2H₂O

ü

Acqua di costituzione

: si trova in composti che quando riscaldati

danno origine a quantità stechiometriche di acqua

2KHSO

_4(s)

D

K

₂

S

₂

O

_7(s)

+ H

₂

O

_(g)

Ca(OH)

_2(s)

D

CaO

_(s)

+ H

₂

O

_(g)

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2. Acqua non essenziale: è l’acqua che è fisicamente trattenuta da un solido

ü

Acqua adsorbita

: è trattenuta sulla superficie dei solidi

La quantità di acqua adsorbita su un solido diminuisce all’aumentare della temperatura, generalmente si avvicina a zero quando il solido viene scaldato a 100°C

ü

Acqua assorbita

: è trattenuta come fase condensata negli

interstizi o nella struttura molecolare di un solido colloidale

La quantità di acqua contenuta dipende in maniera marcata dalla temperatura e dall’umidità

ü

Acqua occlusa

:

acqua liquida trattenuta in microscopiche sacche

disposte in modo irregolare all’interno dei cristalli solidi E’ insensibile a variazioni di umidità

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DEFINISCI I CAMPIONI REPLICATI

Campioni replicati

:

Sono porzioni di materiale che hanno più o meno la stessa grandezza e che vengono sottoposte al processo analitico contemporaneamente ed allo stesso modo

Le masse o i volumi dei campioni replicati sono determinati da misure accurate (i.e. buretta, matraccio graduato, bilancia analitica)

La replicazione accresce la qualità dei risultati e fornisce una

misura della loro attendibilità

(30)

Prepara un campione da laboratorio Procurati un campione rappresentativo

Seleziona il metodo

FASI DI UN’ANALISI QUANTITATIVA

üScelta del solvente üFiltrazione

(31)

Le tecniche o le reazioni che

vanno bene per un analita

soltanto vengono dette

SPECIFICHE

Le tecniche o le reazioni che

vanno bene solo per pochi

analiti vengono dette

SELETTIVE

L'INTERFERENZA è una specie diversa dall’analita che provoca un errore accrescendo o diminuendo la quantità che si sta misurando in un'analisi

MASCHERAMENTO

PRECIPITAZIONE

ESTRAZIONE

SCAMBIO IONICO

ELIMINA LE INTERFERENZE

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MASCHERAMENTO

Un agente mascherante è un reagente che lega chimicamente una interferenza ed evita che essa provochi errori nella analisi

Non deve interferire con il comportamento chimico dell’analita

üEs. Miscela Mg2+/Al3+

Al3+ _{+ 6F}- _D _AlF_6(3-)

Al3+ _{mascherato da F}-_{; Mg}2+ _{titolato con EDTA}

Alternativamente si può trasformare l’interferenza in una fase distinta e separabile meccanicamente

(33)

Calcola i risultati Seleziona il metodo üvolume ümassa üpotenziale üassorbanza

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ü Usare una bilancia tarata ü Pesare 20 compresse

ü Ridurre in polvere le 20 compresse di

paracetamolo e pesare una quantità della polvere ottenuta equivalente a 125±10 mg di paracetamolo

ü Agitare il campione di polvere pesato con circa

150 mL di acido acetico 0.05 M per 10 minuti in un pallone tarato da 500 mL e poi portare a volume di 500 mL con altro acido acetico

ü Filtrare circa 100 mL della soluzione ottenuta

in una beuta, poi trasferire 5 porzioni separate di filtrato da 5 mL ciascuno in palloni tarati da 100 mL con acido acetico 0.05 M

ü Effettuare due letture di ciascuna diluizione

con uno spettrofotometro UV

PROCEDURA OPERATIVA STANDARD (SOP) PER IL SAGGIO DI COMPRESSE DI

PARACETAMOLO

Solubilizza i campioni Elimina le interferenze Misura le proprietà dell’analita

Calcola i risultati Seleziona il metodo

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Prepara un campione da laboratorio Procurati un campione rappresentativo

Valuta l'attendibilità dei risultati

Definisci i campioni replicati Solubilizza i campioni Elimina le interferenze

Calcola i risultati

Seleziona il metodo

FASI DI UN’ANALISI QUANTITATIVA

üDeterminazione della quantità relativa nel campione üApplicazione di metodi statistici

(36)

}

Determinazione della quantità relativa dei

diversi componenti del campione

}