I RIASSUNTO
II Le cellule delle creste neurali (NCC) originano dalla parte dorsale del tubo neurale e vanno incontro a migrazione, proliferazione e differenziamento, processi che sono determinati dall’interazione di queste cellule con i diversi fattori ambientali. Il sistema nervoso enterico (ENS) prende origine dalle cellule delle creste neurali vagali e sacrali, e si organizza in una complessa rete di gangli e neuroni a livello della parete dell’intestino, così da controllarne la motilità. Durante il suo sviluppo, possono però insorgere diversi problemi, un esempio caratteristico è riscontrabile nella malattia di Hirschsprung (HSCR) o aganglia congenita dell’intestino, dovuta all’incapacità da parte delle cellule delle creste neurali (NCC) di formare gangli enterici. Questa malattia ha una frequenza di 1/5000 nati-vivi e consiste in un’ostruzione intestinale potenzialmente letale che è rimossa chirurgicamente. Penetranza incompleta, espressività variabile e dipendenza dal tipo di sesso sono le caratteristiche identificate nelle famiglie di pazienti HSCR, suggerendo che ci sia un’interazione genica e ambientale di base nella determinazione di questo fenotipo.
Sono stati identificati ben nove geni che correlano con la malattia: il protoncogene RET ed il suo ligando più importante, il fattore neurotrofico che deriva dalla linea delle cellule gliali GDNF, l’endotelina-3 (ET-3) ed il suo recettore B (EDNR-B), l’enzima che converte l’endotelina (ECE1), neurturina (NTN), SOX10, SIP1 e phox2B. Inoltre si osserva che i pathways maggiormente coinvolti nella determinazione della malattia di HSCR sono quelli di RET e ET3, infatti gli altri geni trovati associati all’HSCR sono coinvolti in queste due vie metaboliche. Mutazioni in RET e EDNRB sono le cause più comuni dell’HSCR: alterazioni in RET sono state riscontrate nel 50% dei casi familiari e nel 15-20% di quelli
III sporadici, mentre in meno del 5% dei pazienti sono state identificate alterazioni nel recettore B dell’endotelina 3.
Recenti studi hanno messo in luce il ruolo di ET3 e GDNF nello sviluppo del sistema nervoso enterico, infatti, i pathways attivati da queste molecole sono indispensabili per la corretta migrazione e differenziamento delle cellule delle creste neurali vagali e sacrali. Utilizzando estratti di cellule dell’intestino d’embrioni di topo di 10/11 giorni è stato osservato che GDNF stimola la proliferazione cellulare e ha inoltre un potere chemiotattico per queste cellule, mentre ET3 è in grado di inibire il differenziamento neuronale e di ridurre l’azione chemioattrattiva di GDNF.
Per approfondire l’analisi sugli effetti biologici di GDNF ed ET3 abbiamo allestito colture cellulari di una linea di neuroblastoma di topo (Neuro 2A) utilizzata come modello cellulare rappresentativo delle cellule delle creste neurali. L’espressione di RET, EDNRB e GFRA1 è stata verificata nelle cellule neuro2A mediante RT-PCR in esperimenti preliminari, inoltre è stata evidenziata la presenza a livello proteico di RET mediante esperimenti d’immunocitochimica.
L’espressione dei tre recettori nelle mouse neuro2A, ha confermato l’idoneità di questa linea cellulare a rappresentare le NCC. Forti di questo dato le mouse neuro2A sono state utilizzate per ottenere i primi dati sperimentali sugli effetti di GDNF ed ET3.
Combinazioni di trattamenti con GDNF, ET3 e dei loro rispettivi inibitori, caratterizzano gli esperimenti su questa linea cellulare. Dopo un certo periodo di trattamento che è variato da 4 a 5 giorni, le cellule sono state fissate ed analizzate allo scopo di valutare, proliferazione e differenziamento. In particolare, per la valutazione della proliferazione cellulare si è proceduto con il conteggio delle
IV cellule ed è stato messo appunto il protocollo per la rivelazione delle cellule positive al BrdU. Per valutare gli effetti dei trattamenti sul differenziamento, le cellule sono state suddivise in 5 classi morfologiche e contate per campi casuali, utilizzando un microscopio a contrasto di fase, quindi si è proceduto ad un’analisi delle percentuali di cellule differenziate sul totale delle cellule lette e si è inoltre valutato l’effetto dei trattamenti sulle singole classi calcolando la percentuale di una classe sul totale delle cellule.
I risultati che sono stati ottenuti in condizioni di crescita ad alte densità cellulari indicano la tendenza di GDNF a stimolare la proliferazione cellulare e la tendenza di ET3 ad inibirla, provocando anche un’inibizione dell’effetto di GDNF nei pozzetti in cui la stimolazione cellulare è stata effettuata con entrambi.
Il dato che è emerso dai nostri esperimenti riconferma i dati della letteratura. In un terreno base, sintetico, privo di siero con semina effettuata ad alta ed a bassa densità GDNF sembra aumentare la proliferazione ed il differenziamento. La proliferazione è dovuta alle cellule con fenotipo tondeggiante. Questo dato è in accordo con il risultato di immunocitochimica dove le cellule tondeggianti erano maggiormente marcate per RET. Quindi sembra che queste cellule rappresentino una sottopopolazione ancora staminale che risponde positivamente allo stimolo di GDNF.
L'effetto d'ET3 in letteratura non è molto chiaro e non c’è nessuno studio al riguardo per le mouse neuro2A. Sembra che a basse densità cellulari esso abbia un’interazione sinergica con GDNF portando ad un aumento della popolazione di cellule differenziate, mentre ad alte densità tende a inibire l'effetto proliferativo. Questo dato sembra suggerire che l’azione di ET3 sia complessa. Dalla letteratura emerge a sostegno di tale ipotesi, che ET3 in presenza di siero induce la
V proliferazione delle cellule delle creste neurali enteriche, mentre in terreno base, questo effetto è poco rilevante.
Tenuto presente che sia la via di RET che di EDNRB sono attive e stimolabili nelle neuro2A, come emerge dai nostri studi, queste cellule possono essere un buon strumento per arrivare a conoscere le interazioni fra i due pathways coinvolti e determinare le relazioni molecolari per lo sviluppo normale del sistema nervoso enterico e patologico, come nel caso dell’Hirschsprung.
VI ABSTRACT
VII Neural crest cells (NCC) originates form the dorsal part of the neural tube, where they start to migrate, to proliferate and differentiate, all processes which are important and determined by the interaction of these cells with different environmental factors.
The enteric nervous system (ENS) originate from the cells of the vague and sacred nerves that subsequently will give rise to a complex network of ganglia and neurons in the intestinal walls, able to control the motility.
During the development some problems could arise and a good example is the Hirschsprung disease (HSCR) named also congenital aganglia, where the NCC cells are unable to form the enteric ganglia. This syndrome has a frequency of 1/5000 live-birth and consist in a intestinal obstruction potentially lethal, lethality that could be avoided only by surgical intervention. Characteristical features of the HSCR disease that can be linked with family history like: incomplete penetrance, variable expression, and age related phenotype. All this suggest that the phenotypic expression of this disease could be linked to an interaction between genetic and environmental factors.
Nine genes have been nowadays correlated to this pathology: the protoncogene RET and his prinicipal ligand, the neuro-trophic factor GDNF, which derives from the glial cells lineage, the neurturin (NTN), another RET ligand, endothelin-3 (ET-3) and his receptor B (EDNR-B), the endothelin converting enzyme (ECE1), SOX10, SIP1, and finally phox2B. Moreover it could be observed the intracellular pathways that are HSCR related are mainly those activated by RET and EDNRB, in fact all the other genes citied and related to HSCR are part of these metabolic pathways (e.g. GDNF is the RET ligand, and ET3 is the one for EDNRB).
RET or EDNRB mutations are the main causes of Hirschsrung disease: alteration in RET are identified in almost 50% of the familial and in 15-20% of the sporadic cases, whereas the alteration in the endothelin 3-receptor B in no more then 5% of cases.
Recent studies has emerged on the role of ET3 and GDNF on the development of the enteric nervous system, in fact, the ET3 and GDNF activated pathways are absolutely important for the migration and differentiation of the neural crest cells. By using mouse gut cells derived from 10/11 days embryo has been observed that GDNF is able to stimulate the cellular proliferation with a chemoattractive property for this cell type, whereas ET3 is able to both inhibit the neuronal differentiation
VIII and the chemoattractive property of GDNF. To better understand the biological effects of GDNF and ET3 we have cultured and used the Neuro 2A cell line, derived form mouse neuroblastoma, has a cell model for neural crest cells. The RET, EDNRB and the GDNF receptor α1 (GFRα1) expression was analyzed in Neuro2A by RT-PCR in preliminary experiments. Together with the RNA expression level also the protein level has been analyzed by immunoistochemistry. The expression of the three receptors confirmed the goodness of the Neuro 2A cell model to represent the NCC. Considering this theoretical background Neuro2A has been used to assess our hypothesis and to obtain experimental data on the effect of GDNF and ET3.
Combination of GDNF, ET3 together with their inhibitors has been analyzed. After an incubation periods of 3 and 4 days the cells were fixed and analyzed in order to evaluate proliferation and differentiation. In particular the cellular proliferation has been analyzed by BrdU incorporation, which protocol was optimize for this model, and by cell counting. Instead regarding the differentiation process, the cells has been subdivided in 5 different morphological classes and counted in random optical fields by an inverted microscope. After these, we have proceeded to evaluate the effect on the differentiation by the treatment. Results were obtained by analyzing the number of cells, in percentage, compared to the total number of cells counted. The results were analyzed also by subdividing the differentiated cells in the 5 different morphological features (phenotypic sub-classes).
The results obtained with cells in a high density situation indicate that GDNF alone has a tendency to stimulate the cellular proliferation, in contrast with an inhibitory effect of ET3 both alone or in the cells batch where also DGNF was added.
The results that we where able to obtain are in complete agreement with literature data. In a basal, synthetic media, without serum, in both culture performed at high and low density, GDNF seems to increase the proliferation and differentiation. Mainly the proliferation involves cells with round shape morphology. This result is in agreement with the immunocytochemical data obtained where the cells stained with RET where effectively those with round shaped morphology. For these seems like that this cell type, represent a subpopulation still in a stem cell state positively responding to GDNF.
The ET3 effect in literature in still controversy and unclarified, and no study are available on neuro2A. In looks like that a low cellular density ET3 can
IX sinergically interact with GDNF bringing to a more differentiated number of cells, whereas at high density tends to have an inhibitory action on the proliferation process. These observation brings us to think to a complex ET3 cellular action. Form literature some data seems to confirm the observation that ET3 in presence of serum could induce proliferation of the NCC, instead in a minimal media this effect is less relevant.
Taking into account that both RET and EDNRB pathways in neuro2A are active and induceable, like is emerging from our data, this cell type could be used as a good model for the understanding of the interaction between the two related pathways and to determine the molecular relationships for the normal and pathologic development of the enteric nervous system, like the case of Hirschsprung.
