I
INDICE
Riassunto………...………….III Glossario………..…....….VII
Capitolo 1……….1
1.1 Cenni storici sui pesticidi………..1
1.2 Classificazione dei pesticidi e controlli sanitari………3
1.3 Metodi analitici in uso……….13
1.3.1 Metodi multiresiduo………...……14
1.4 Scopo della tesi………...….…20
Capitolo 2………...…………23 2.1 Materiali e strumentazione………..………23 2.1.1 Reagenti e soluzioni………..………….23 2.1.2 Materiali e vetreria………...………..……23 2.1.3 Condizionamento vetreria………..………24 2.1.4 Strumentazione………..………24
2.2 Prove di ottimizzazione del metodo………...….27
2.2.1 Prove di linearità in funzione del volume iniettato nel TDS…….…37
2.3 Prove di validazione del metodo……….…38
2.3.1 Determinazione del range di lavoro e valutazione del range di linearità………...…38
2.3.2 Rette di calibrazione ……….……….……40
2.3.3 Valutazione del recupero………...………49
2.3.3.1 Considerazioni sul recupero………...……53
2.3.4 Valutazione della precisione metodo………..……...…………54
2.3.4.1 Considerazioni sulla precisione……….……56
2.3.5 Limite di rivelabilità e limite di quantificazione………56
2.3.5.1 Considerazioni sul LDR e LDQ……….………59
2.3.6 Valutazione dell’accuratezza………….………...…….59
2.3.6.1 Considerazioni sull’accuratezza relativa al circuito europeo………..……….63
2.3.7 Selettività………..……….…………64
2.3.7.1 Considerazioni sulla selettività………..………66
II
2.3.8.1 Considerazioni sui risultati di validazione…………...……..77
2.3.9 Controllo di qualità………78
Capitolo 3 ………..…………83
Campo applicativo dei risultati……….………83
Conclusioni……….…………88
Bibliografia ………91
III
RIASSUNTO
Il presente lavoro di tesi è stato svolto presso il Dipartimento di La Spezia dell’Agenzia Regionale per la Protezione dell’Ambiente della Liguria (A.R.P.A.L.), struttura qualificata a livello nazionale e comunitario per l’esecuzione dei controlli sull’impiego di pesticidi nel settore agro-alimentare. Nell’attività sperimentale è stata investigata, in maniera positiva, la possibilità di utilizzare una nuova strumentazione automatica ed in linea (TDS-GC-MSD) per la determinazione di residui di pesticidi in matrici vegetali.
Per lo studio sono state utilizzate n. 5 matrici vegetali (insalata, mela, limone, oliva, riso) rappresentative delle tipologie dei prodotti agro-alimentari alle quali si applicano i protocolli di indagine per la ricerca dei residui di pesticidi.
Alle suddette matrici, esenti da residui di antiparassitari, sono state aggiunte quantità note di una soluzione standard di 42 pesticidi certificati.
I pesticidi usati come standard di riferimento sono quelli più frequentemente incontrati nell’ambito dei controlli nel settore agro-alimentare e presentano caratteristiche in termini di struttura chimica, stabilità, volatilità, rivelabilità da poter essere considerati rappresentativi della più ampia e numerosa famiglia degli oltre 700 fitofarmaci rilevati con le tecniche gascromatografiche.
Le matrici artificialmente contaminate sono state utilizzate come campioni di partenza per sviluppare, mettere a punto e validare il metodo analitico multiresiduo. L’uso di differenti matrici vegetali (contenuto di clorofilla, di zuccheri, di acidità, di grassi) è stato ritenuto indispensabile al fine di individuare condizioni analitiche in grado di fornire risposte accettabili pur in presenza di interferenze dovute all’ “effetto matrice” e che possono influire in maniera diversa sulla rivelabilità dei pesticidi.
La messa a punto della procedura analitica ha richiesto la necessità di ottimizzare l’insieme dei parametri operativi e strumentali relativi alle seguenti operazioni:
− estrazione della matrice con acetonitrile;
IV − prelievo di una aliquota del surnatante organico e trasferimento mediante siringa
al sistema TDS (Thermal Desorption System);
− desorbimento termico automatico delle componenti volatili (pesticidi + altro) effettuato in corrente di Elio, accumulo dei vari analiti e loro trasferimento in colonna mediante un sistema di iniezione PTV – CIS (Programmed Temperatura Vaporizer + Cooled Injection System);
− eluizione gascromatografica e rilevazione mediante rivelatore a spettrometria di massa, associata al sistema RTL (Retention Time Lock), capace di garantire la costanza dei tempi di ritenzione;
− identificazione dei singoli componenti mediante il tempo di ritenzione e la presenza nello spettro di massa dei segnali relativi a quattro frammenti ionici caratteristici e relativi rapporti di abbondanza;
− quantificazione mediante l’utilizzo di curve di calibrazione costruite con il metodo delle aggiunte standard attraverso l’impiego di miscele di riferimento a composizione nota. Il metodo delle aggiunte permette così di eliminare le problematiche legate all’effetto matrice.
Gli aspetti esaminati nel percorso di ottimizzazione hanno permesso di formulare le migliori scelte di compromesso per ognuna delle fasi operative suddette.
Di particolare rilievo ed utilità è risultato l’uso di NaCl per indurre la separazione di fase tra l’acetonitrile e l’acqua contenuta nell’estratto della matrice vegetale; senza questo accorgimento la risposta analitica risulta fortemente alterata.
Attraverso questa linea analitica è stato quindi possibile condurre in maniera automatica gli stadi di purificazione, separazione, identificazione e quantificazione dei vari analiti.
La validazione della procedura si è articolata attraverso una serie di misure e verifiche che hanno permesso di valutare:
− l’intervallo di linearità della risposta analitica (che risulta ottima per pesticidi presenti nelle matrici campione fino a concentrazioni di 5 mg/kg, e oltre, laddove
V il campo di interesse sotto il profilo del controllo è tipicamente intorno a 1 mg/kg);
− l’effetto matrice indotto dal composto vegetale in esame, sul quale i diversi pesticidi dimostrano di condensare nel CIS in maniera differente a seconda della loro struttura chimica;
− il recupero percentuale a seguito di estrazione, che dipende sia dalla matrice, che dal singolo pesticida (i fattori di recupero misurati per il metodo proposto risultano conformi ai criteri in uso nel settore e confrontabili con quelli di altre metodologie di estrazione e purificazione assai più complesse ed onerose);
− la precisione (o ripetibilità) del metodo analitico, che è risultata decisamente elevata anche per le basse concentrazioni (nell’intorno di 0,02 mg/kg di pesticida su matrice è risultata mediamente del 10%) e presenta valori fuori dei limiti per qualche pesticida a 1 mg/kg;
− il limite di rivelabilità e di quantificazione: sono risultati del tutto adeguati agli scopi del metodo e risultano essere in genere, per quanto riguarda i LDR, al di sotto di 0,01 mg/kg; i LDQ sono idonei alla verifica dei limiti di legge fissati; − l’accuratezza: è risultata decisamente buona con valori prossimi al 100% nella
maggior parte dei casi.
Utilizzando la procedura analitica messa a punto nel presente lavoro, il laboratorio ha partecipato ad un circuito di validazione a carattere europeo con altri 121 laboratori specializzati nel settore (European Commission’s Proficiency Test 5 on Pesticide Residues in Iceberg Lettuce, 2003). Per otto dei quattordici pesticidi presenti erano già disponibili le condizioni analitiche messe a punto con il metodo TDS-GC-MSD; inoltre sei nuovi pesticidi sono stati determinati applicando lo stesso metodo.
La valutazione dei risultati da parte della Commissione Europea è ancora in corso; comunque il valore medio delle misure del nostro laboratorio è in buon accordo con quello ottenuto dagli altri 121 laboratori.
Questo risultato è tanto più apprezzabile e positivo quando si consideri che la metodologia analitica proposta offre il notevole vantaggio di una significativa riduzione dei tempi di analisi rispetto ai metodi convenzionali, oltre a garantire una maggior durata dell’apparato strumentale, dal momento che le componenti
VI meno volatili vengono integralmente separate prima dell’ingresso nella linea gascromatografica e in colonna vengono iniettate solo sostanze completamente gascromatografabili.
VII
GLOSSARIO
CIS Cooled Injection System ECD Electron Capture Detector FID Flame Ionization Detector
GC-FTIR Gas Chromatograph-Fourier Transform Infrared detector GC-MS Gas Chromatograph-Mass Spectrometer
GPC Gel Permeation Cromatography HC Hydrocarbon
HPLC High Pressure Liquid Chromatography IR Infrared
MSD Mass Selective Detection NPD Nitrogen Phosforous Detector OC Organochlorine
ON Organoazotate OP Organophosforate
RTL Retection Time Lock SIM Selected Ion Monitoring
SPE Solid Phase Extraction TDS Thermo Desorption System TLC Thin Layer Chromatography
