Per ciò che concerne lo sviluppo ontogenetico, l’espressione degli antigeni

5. Discussione

I pathway che sono risultati associati al rischio di CRC sono quelli relativi al controllo della proliferazione cellulare, all’ontogenesi, alla cascata dei recettori Tool-like, ai regolatori della trascrizione genica (RNA pol II) e al metabolismo degli xenobiotici.

Il fatto che ii geni che controllano la proliferazione cellulare siano associati al tumore colorettale non sorprende. In effetti una caratteristica delle cellule tumorali è proprio quella di sfuggire ai controlli del ciclo cellulare.

Per ciò che concerne lo sviluppo ontogenetico, l’espressione degli antigeni

carcino-embrionali nel CRC è un esempio di attivazione oncogenica

dell’espressione di geni embrionali. Ipotizzando che l’oncogenesi ricapitoli

l’ontogenesi, un articolo di Kaiser e collaboratori del 2007 ha comparato i

patterns di espressione genica nel CRC umano e nel tumore al colon nel topo

con quelli dello sviluppo embrionale del topo dei giorni 13.5-18.5. In particolare

è stato riportato che 39 tumori provenienti da quattro modelli indipendenti di

topo e 100 CRCs umani comprendenti tutti gli stadi clinici, mostravano una

evidente ricapitolazione dell’espressione genica embrionale. I tumori umani e di

topo, mostrano un’elevata espressione di cluster di geni coinvolti nel controllo

della progressione del ciclo cellulare, proliferazione, migrazione, includendo

anche geni quali MYC, AKT2, PLK1 e SPARC. Tumori di topo e di uomo

differiscono dalla normale espressione genica del colon embrionale per la

perdita di espressione di soppressori tumorali (EDNRB, HSPE, KIT e LSP1). Gli

adenocarcinomi umani perdono inoltre l’espressione di un altro modulo di

soppressione tumorale (IGFBP4, MAP4K1, PDGFRA, STAB1 e WNT4). Molti

tumori invece hanno un guadagno di funzione di un modulo regolato in modo coordinato, associato ad una avanzamento di malignità (ABCC1, FOXO3A, LIF, PIK3R1, PRNP, TNC, TIMP3 e VEGF). La conclusione degli autori è stata che

la comparazione dell’espressione genica tra i tumori di topo, quelli umani e gli stadi di sviluppo embrionale nel topo mostrano un integrato e versatile metodo di definizione dei programmi trascrizionali associati all’oncogenesi che può essere utile al fine di identificare pattern di marcatori specifici ed eventuali target terapeutici (Kaiser et al. 2007).

Il pathway legato ai tool-like receptor (TLR) è collegato a processi infiammatori, pertanto non sorprende che questo pathway sia associato al CRC.

I TLR vengono stimolati da fattori batterici come lipopolisaccaridi, lipoproteine oppure peptidoglicani ed innescano un complesso pathway che è in grado di attivare sostanze quali le citochine (Fig 12).

Fig 12: Tool-like receptor signaling pathway

I polimorfismi per questo pathway trovati associati al tumore al colon retto sono: MAP3K7IP conosciuto anche come TAB1 (rs7949); MAP3K7 conosciuto anche come TAK1 (rs282070); IL6 (rs1800795) e TNF (rs1800629).

Per ciò che concerne i geni MAP3K7IP e MAP3K7 non sono stati effettuati in letteratura degli studi di associazione con il tumore al colon retto, tuttavia per ciò che concerne il gene MAP3K7 in letteratura è riportata un’associazione legata ad una delezione di una regione consensus in 6q15 ed il tumore alla prostata (Liu et al 2007).

Per ciò che concerne la citochina Tumor Necrosis Factor TNF, ed in particolare il polimorfismo -308 G→A, è stato riportato che la forma allelica A è maggiormente presente in individui pediatrici affetti da coliti ulcerative o morbo di Chron (Sykora et al. 2006). Ciò sembra quindi mostrare una maggiore attività infiammatoria ed essere in grado di modificare la progressione dell’infiammazione cronica nel tratto digestivo. Il polimorfismo quindi può essere indirettamente correlato al CRC dal momento che le coliti ulcerative e il morbo di Chron sono dei fattori di rischio piuttosto rilevanti per il tumore. In letteratura uno studio ha mostrato un’associazione tra lo SNP -308 G→A e le coliti ulcerative associate a CRC (Garrity-Park et al. 2008); un secondo (De Jong et al. 2002) ha mostrato associazione tra TNF e tumore colorettale.

Per ciò che concerne il polimorfismo -174 G>C del gene IL6 presente a livello

del promotore è stata riscontrata un’associazione con CRC con un OR di 1.53

(95% CI 1.12-2.09) (Landi et al. 2003). Un altro studio ha mostrato che l’allele C

per il polimorfismo rs1800796 ed il genotipo GG per il polimorfismo rs1800795

sono associati con una riduzione del tumore al colon con un OR: 0.76 (95% CI

0.57-1) ma non di quello rettale con un OR: 1.49 (95% CI: 1.02-2.16) (Slattery

et al. 2007). Sembra che lo SNP sia in grado di alterare i livelli di espressione dell’interleuchina-6 (Fishman et al. 1998; Terry et al. 2000). In particolare, l’allele C è associato a gravi condizioni infiammatorie, che includono aumenti nel plasma dei livelli della proteina C reattiva (Vickers et al. 2002). L’allele C può causare un aumento dell’infiammazione per le cellule colorettali in risposta ai neutrofili attivati (Nusrat et al.2001); l’allele C inoltre è associato con un ridotto rilascio di IL6. E’ stato inoltre riscontrato che l’allele C è associato al tumore al colon retto in individui che non prendono abitualmente NSAIDs. Ciò potrebbe supportare l’ipotesi che i genotipi G-174 siano associati con un aumento del livello basale di infiammazione che può essere ridotto tramite l’utilizzo appunto di NSAIDs. IL6 può anche alterare la capacità di sviluppare tumori tramite la formazione di nuovi vasi sanguigni; tuttavia il suo ruolo nell’angiogenesi non è ancora chiarito (Motro et al. 1990; Hatzi et al. 2002).

Per il pathway della regolazione della trascrizione genica (promotori per la RNA polimerasi II) è difficile fornire una spiegazione supportata dalla letteratura. E’

noto che cambiamenti nell’espressione genica causati da alterazioni nei normali eventi epigenetici possano essere alla base dei processi di tumorigenesi. Per esempio nelle forme neoplastiche sia benigne che maligne si assiste al fenomeno di ipometilazione del DNA (Feinberg et al. 2004). L’ipometilazione avviene a livello delle sequenze ripetitive presenti nei microsatelliti o nelle regioni pericentromeriche; ciò può condurre ad instabilità genomica a causa di una maggiore suscettibilità alle rotture dei cromosomi (Ji W et al. 1997; Qu GZ et al. 1999). Inoltre è stata anche evidenziata un’ipermetilazione a carico di promotori di soppressori tumorali, attuandone un silenziamento come avviene per esempio per i geni p16INK4A, VHL, APC, CDH1 e MLH1 (Feinberg et al.

2004). Infine è stata evidenziata anche una deregolazione della modificazione

degli istoni che è capace di alterare l’espressione genica. Per esempio l’

acetilazione della lisina sul residuo 9 dell’istone H3 è correlato con espressione genica mentre invece una metilazione del residuo è associato con silenziamento genico (Peters et al. 2002).

Infine, in letteratura troviamo molte associazioni tra polimorfismi in geni che codificano per enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici e varie forme di cancro, incluso il tumore al colon retto. Gli xenobiotici possono essere attivati e detossificati grazie a degli enzimi di fase I e fase II Fig 13 (Le blanc et al. 1989;

Powis et al.1987).

Fig 13 : metabolismo degli xenobiotici

Per ciò che concerne il tumore al colon retto, gli xenobiotici derivano

principalmente dall’alimentazione ed in particolare un’alimentazione ricca di

carne rossa ben cotta veicola l’ingestione di mutageni e carcinogeni quali per

esempio le amine eterocicliche e gli idrocarburi policiclici aromatici (Eisenbrand

et al 1993). L’impatto di questi contaminanti, specialmente delle amine

eterocicliche, è stato in tempi passati considerato avere un basso potenziale

canceroso (Layton et al. 1995). Tuttavia sono classificate come IARC -

cancerogeni di categoria II e quindi ci si aspetta che contribuiscano al rischio (Sugimura et al. 2000). Le amine eterocicliche genotossiche devono essere attivate per espletare i loro effetti genotossici. Diversi studi hanno mostrato che i citocromi p450 sono enzimi chiave coinvolti nell’attivazione metabolica e la deattivazione del maggiore componente delle amine eterocicliche aromatiche che è il 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-b]piridina (PhIP) (Langouet et al.

2002; Malfatti et al. 2001), mentre uno dei meno abbondanti metaboliti, l’N- acetossi-PhIP, è detossificato dale Glutatione s-transferasi (GSTs) (Coles et al.

2001). Dati provenienti da studi effettuati sia in vivo che in vitro suggeriscono

che l’esposizione agli idrocarburi policiclici aromatici (PAHs), quali il

benzo(a)pirene, possa essere importante per l’insorgenza del tumore al colon

retto (Langouet et al. 2002; Sachse et al. 2003). I PAHs derivano

principalmente dai grassi animali (Lijinsky et al.1964; Lijinsky 1991) e sono

anche presenti in modo significativo nel fumo di tabacco (IARC 1996). I PAHs

sono metabolizzati da una varietà di enzimi di fase I e fase II già citati in

precedenza. Per ciò che concerne in particolare il benzo(a)pirene, il metabolita

reattivo è chiamato benzo(a)pirene-7,8- diidrodiolo-9,10-epossido (Fig 14) che

è un substrato della classe α delle GSTs (Hayes et al. 2005).

Fig 14: metabolismo del benzo(a)pirene

I polimorfismi per questo pathway trovati associati al tumore al colon retto sono: GSTA3 (polimorfismi rs494334, rs3818234, rs523605); GSTZ1 (polimorfismo rs2270423); UGT1A7 (polimorfismi N129K R131K, W208R);

CYP2D6 (polimorfismo rs28371705); NAT2 (polimorfismo I114T)

Enzimi di fase I

I citocromi p450 si riferiscono ad una classe di proteine contenenti l’eme,

presenti in tutti i mammiferi, in tutti i tipi di cellule, fatta eccezione per gli

eritrociti e le cellule del muscolo scheletrico. I substrati di questi enzimi di fase I

possono essere sia sostanze esogene oppure sostanze endogene quali per

esempio il colesterolo e gli ormoni steroidei. Per ciò che concerne gli

xenobiotici, il ruolo del citocromo sarebbe quello di rendere idrosolubili e quindi

facilmente eliminabili le sostanze esogene, tuttavia come già detto per altri

enzimi può capitare invece che alcuni potenti cancerogeni vengano convertiti

nella loro forma attiva. La reazione che viene catalizzata dal citocromo P450 che ha attività monoossigenasica è la seguente:

RH + O

+ NADPH+ H

→ ROH + H

O + NADP

Il sistema del citocromo P450 si può trovare sia a livello del reticolo endoplasmatico sia a livello dei mitocondri; per ciò che concerne il citocromo presente nei mitocondri questo è costituito da un NADPH-adrenodossina reduttasi che contiene come gruppo prostetico il FAD; il quale riceve per primo i due elettroni provenienti dal NADPH. Successivamente un elettrone alla volta passa ad una piccola proteina ferro-non eme chiamata adrenodossina la quale passa gli elettroni sempre uno alla volta al citocromo P450. Il sito catalitico del citocromo P450 contenente un gruppo ferro eme che funziona secondo il meccanismo riportato in Fig 15 (Lubert Stryer).

Fig 15: ciclo catalitico proposto per il citocromo P450

Per ciò che concerne il gene CYP2D6 e le sue varianti alleliche in associazione allo svilupparsi di tumore colorettale in letteratura non è stata riscontrata un’associzione rilevante (Butler et al. 2001; Sachse et al. 2002; Landi et al.

2005) mentre è stata valutata un’associazione tra gli omozigoti per l’allele 48G di CYP1B1 e il tumore al colon retto: la variante allelica in questione si associava con un aumento di attività, mentre sempre un aumento di attività derivante da un polimorfismo quale 461N è associato con un ridotto rischio di CRC (Landi et al. 2005) .

Enzimi di fase II

Le principali reazioni di fase II del metabolismo di molte sostanze sono reazioni di coniugazione in cui intervengono le glutatione-S-trasferasi (GSTs). Le glutatione-S-trasferasi nell’uomo viene codificata da otto distinte famiglie

geniche: la famiglia alfa è codificata a partire dal cromosoma 6, la mu dal cromosoma 1, la theta sul 22, la pi sul cromosoma 11, la zeta sul 14, la sigma sul 4, per la kappa (mitocondriale) non è stata individuata la posizione sul cromosoma e la chi (conosciuta anche come omega) è codificata a partire dal cromosoma 10 (Fig 16) ( Strange et Al. 2001).

Fig 16: La famiglia della Glutatione-S-transferasi

La funzione delle GSTs è di coniugare le sostanze elettrofile con il glutatione (GSH), generando prodotti che vengono facilmente rilasciati dalle cellule per trasporto attivo ed escreti. In generale la coniugazione di composti quali gli xenobiotici con il glutatione porta alla formazione di prodotti meno reattivi di quelli di partenza; tuttavia in alcuni casi si possono ottenere dei prodotti maggiormente reattivi; un esempio può essere la coniugazione del glutatione con il solvente diclorometano che porta alla formazione di un composto altamente instabile quale l’S-clorometilglutatione, il quale contiene un centro elettrofilo capace di modificare il DNA (Wheeler et al. 2001; Guengerich et al.

2003). La mancanza di attività di questi enzimi può essere associata a tumore al colon retto. Un esempio possono essere le associazioni per gli alleli GSTM1- null e GSTT1-null (Saadat et al. 2001; Ates et al.2005).

Per ciò che concerne i polimorfismi del gene GSTA3 analizzati nella tesi, in letteratura non vi sono studi in proposito per ciò che concerne il tumore al colonretto. Anche per il gene GSTZ1 non si rilevano studi di tipo caso-controllo in letteratura.

Gli enzimi di fase II UDP-glucuronosiltransferasi (UGTs) catalizzano la

coniugazione di sostanza idrofobiche ad acidi β-D-glucopiranosidoronici

(glucuronidi) che sono solubili in acqua e che quindi possono essere eliminati

tramite via biliare o renale dal corpo (Tukey et al. 2000; Dutton 1980 e Shipkova

et al. 2001). La caratteristica di questi enzimi è quella di glucuronidare non solo

i composti endogeni ma anche composti esogeni quali gli idrocarburi eterociclici

e policiclici e le amine eterocicliche (Tukey et al. 2000). Il locus genetico per le

UGT1 è localizzato sul cromosoma 2q37 e codifica 9 prodotti genici, il locus

inoltre contiene quattro pseudogeni (Gong et al. 2001).

Per ciò che concerne in particolare il gene UGT1A7 viene espresso in modo specifico a livello del tratto gastrointestinale e nel tessuto polmonare, ma non nel tessuto epatico poiché l’espressione di UGT è tessuto specifica (Tukey et al.

2000; Strassburg et al.1998 e Strassburg et al. 1997).

I polimorfismi del gene UGT1A7; N129K R131K, W208R; riscontrabili nelle forme alleliche UGT1A7*2 e UGT1A7*3 sono state associate al tumore al colon retto in alcuni studi in letteratura e sembrano mostrare ridotta attività catalitica.

Le varianti genotipiche del gene UGT1A7 sono state trovate associate al tumore al colon retto con un OR di 2.4 (95% CI 1.3-4.6) (Van der Logt et al.

2004). La variante genotipica *3 è stata trovata associata al tumore al colon retto in uno studio con un OR di 2.75 (95% CI 1.6- 4.71) (Strassburg et al.

2002). Le varianti genotipiche *2/*2 e *3/*3 hanno mostrato un significativo livello di associazione con il rischio di sviluppare tumore al colon retto (OR:7.80, 95% CI: 2.66- 22.87; OR: 3.47, 95%CI: 1.51-7.97) ed in particolare nello stesso studio le analisi mostrano che in individui che hanno fumato, che fumano, che bevevano alcool e che attualmente bevono alcool il rischio aumenta rispettivamente: OR: 7.80 95%CI: 0.97-8.11; OR: 3.39 95%CI: 1.19- 9.67; OR: 2.89 95%CI: 2.89 95%CI: 0.99-8.46 ed infine OR: 3.14 95%CI: 1.09- 9.09 (Chen et al. 2006). Inoltre uno studio si è concentrato sugli effetti delle varianti genotipiche e l’esposizione ad agenti cancerogeni provenienti dalla dieta; lo studio ha categorizzato i genotipi del gene UGT1A7 in gruppi in relazione all’attività dell’enzima: alta (*1 /*1, *1/*2, *2/*2); intermedia (*1/*3,

*1/*4, *2/*3); bassa (*3/*3; *3/*4; *4/*4). Non è stata riscontrata associazione

con UGT1A7 a bassa attività contro l’intermedio-alta OR: 1.1(95% CI: 0.7-1.8), senza distinzioni di razza. Tuttavia è stato riscontrato che un apporto di composti HCA quale per esempio il 2-amino-3,4,8-trimetilimidazo[4,5- f]quinoxalina medio o superiore alla media e la presenza del genotipo a bassa attività, porta ad un’associazione positiva con il tumore (OR: 2.4, 95%CI: 1.2- 4.8) comparato ad un apporto inferiore alla media (Butler et al. 2005).

Altri enzimi di fase II coinvolti nel metabolismo degli Xenobiotici sono le N- acetiltransferasi. Questi enzimi catalizzano il metabolismo di vari composti quali le amine aromatiche che dopo lo step della N-idrossilazione effettuata dai citocromi P450 formano N-idrossi HCA che possono quindi essere substrato per le N-acetiltransferasi tramite una O-acetilazione che porta alla formazione di composti reattivi quali gli N-acetossi esteri altamente reattivi (Hein et al. 2002).

Questi composti spontaneamente idrolizzano e formano ioni arilnitrosi (Buonarati et al.1990; Hein et al. 2000) (Fig 17).

Fig 17: Metabolismo in cui sono coinvolti gli enzimi N-acetiltransferasi

Per ciò che concerne in particolare il gene NAT2 ed il polimorfismo I114T è stato riscontrato che possa portare ad una ridotta attività catalitica e per questo motivo gli aplotipi portanti questo polimorfismi sono definiti lenti acetilatori (Fretland et al. 2001). Studi effettuati sull’associazione di polimorfismi di NAT2 e tumore al colon retto tendenzialmente mostrano un’associazione con la patologia per gli alleli a rapida acetilazione (Lang et al. 1986 OR: 2.48 CI 95%

1.0-6.0, Roberts-Thomson et al. 1996 OR: 1.9 CI 95% 1.0-3.3). Uno studio

recente ha mostrato per i Caucasici un’associazione positiva per il genotipo

NAT2 “rapido intermedio” in confronto a quello “lento” OR: 1.4 CI 95%1.0-1.81

(Butler et al. 2008).

6. Conclusioni

Sulla base del lavoro effettuato per la presente tesi di laurea possiamo affermare che l’analisi dei pathway biologici permette di superare alcune delle limitazioni che si presentano quando si analizzano statisticamente i singoli geni e/o polimorfismi.

Infatti, applicando la correzione per i test multipli di Bonferroni nessuno dei geni da noi studiati avrebbe prodotto una significatività statistica. Al contrario, l’analisi di gruppi di geni permette di stabilire se un dato pathway ha un numero di segnali superiore a quello dovuto al solo effetto del caso. Inoltre, il raggruppamento dei geni entro pathway biologici permette di evidenziare direttamente quali possano essere i processi cellulari più importanti per l’eziologia del CRC.

Indubbiamente siamo consapevoli che questo tipo di approccio analitico deve essere perfezionato. Un possibile bias viene introdotto con la selezione degli SNPs: alcuni sono di tipo funzionale mentre altri sono biologicamente neutrali.

La disomogeneità degli SNPs può alterare i risultati dei pathways associati. Per

esempio, l’associazione statisticamente significativa riguardante il metabolismo

degli xenobiotici, per quanto assolutamente plausibile, potrebbe essere il

risultato del fatto che la maggior parte dei polimorfismi presenti in questo

pathway sono in grado di alterare la funzionalità proteica. Un’altro aspetto da

tener presente è il fatto che in questo studio non è stata tenuta di conto della

forza di associazione dei vari SNPs, i quali sono stati analizzati sulla base di

una semplice categorizzazione associato/non associato. In futuro questi aspetti

dovranno necessariamente essere perfezionati al fine di ridurre i possibili bias

introdotti.