Alla fine di ognuno dei due raggruppamenti (foglie e frutti) verrà esposto un breve confronto tra i risultati complessivi del primo e del secondo prelievo.

DISCUSSIONE

Premessa

La discussione dei risultati ottenuti verrà svolta mantenendo separate le analisi eseguite sulle foglie da quelle effettuate sui frutti.

Per maggiore chiarezza si esporranno separatamente anche i risultati riferiti al primo e al secondo prelievo, mettendo in evidenza le eventuali differenze tra controlli e trattati della medesima raccolta.

Alla fine di ognuno dei due raggruppamenti (foglie e frutti) verrà esposto un breve confronto tra i risultati complessivi del primo e del secondo prelievo.

Primo prelievo – foglie (effetto del trattamento)

La presenza eccessiva di un dato elemento (qualunque esso sia) nell’ambiente, sottopone le piante che vi crescono a uno stress. La pianta potrà quindi mostrare sintomi più o meno visibili del disagio a cui è soggetta: ingiallimenti e/o necrosi fogliari, filloptosi, accrescimento stentato e ridotto, etc.

A livello cellulare si avrà la presenza di concentrazioni maggiori di ROS e quindi la pianta reagirà sintetizzando quantità più o meno elevate di molecole “scavenger”

antiossidanti che permettono di eliminare i radicali dannosi, salvaguardando così molecole essenziali dall’ossidazione. Eventualmente se la pianta è naturalmente dotata di una concentrazione sufficiente di alcune di queste molecole può utilizzarne il pool in caso di stress lievi senza sintetizzarne maggiormente, superando comunque lo stress.

In questo lavoro si è preso in considerazione l’eccesso di B, studiandolo di per sè a differenza della maggior parte della letteratura che lo esamina in correlazione alla salinità, dato che in natura tali condizioni si trovano spesso associate.

Il pomodoro, pianta considerata relativamente tollerante a questo stress, non esplica

questa sua tolleranza attraverso l’esclusione totale del B da parte delle radici, ma tramite

un possibile immagazzinamento in comparti dove non risulta così dannoso: si trovano

infatti concentrazioni di B maggiori nei tessuti delle piante trattate rispetto ai controlli

(Gunes et al., 1999; Alpaslan e Gunes, 2001; Cervilla et al., 2007). Per questa ragione è

interessante osservare cosa avviene a livello biochimico nelle cellule. In particolare

l’accumulo di B si ha spesso nei tessuti fogliari. Da cui la scelta di analizzare questi

tessuti, oltre al frutto, prodotto finale del ciclo colturale e parte edule.

Le analisi effettuate sulle foglie sono state rivolte, da un lato, verso la quantificazione del danno provocato dalle ROS, nello specifico l’ossidazione, attraverso la concentrazione di TBARS; dall’altro sono state incentrate sullo studio della difesa attuata dalla pianta, quindi del sistema antiossidante.

Lo stress ossidativo sfocia rapidamente in danni alle membrane. Infatti queste strutture sono formate in gran parte da lipidi, composti particolarmente sensibili all’ossidazione, in virtù della loro conformazione chimica più o meno ricca di doppi legami: maggiore è il grado di insaturazione più le molecole sono soggette all’attacco delle ROS. Le specie attive dell’ossigeno sono comunque in grado di attaccare anche altri tipi di molecole.

Per “misurare” l’ossidazione è stata valutata la concentrazione di TBARS che prendono in considerazione una vasta gamma di molecole, non solo di natura lipidica, che derivano dal processo di ossidazione e reagiscono con l’acido tiobarbiturico (TBA).

Il contenuto di TBARS (fig. 20) dei campioni raccolti a giugno è significativamente aumentato nelle piante sottoposte al trattamento, evidenziando che l’eccesso di B provoca seri danni alla membrana a seguito della destrutturazione della sua architettura lipidica.

Questi risultati rispecchiano ciò che è riportato in letteratura da diversi autori per le foglie di varie specie, anche se in riferimento alla sola malondealdeide (MDA): orzo (Karabal et al., 2003), melo (Molassiotis et al., 2006) e vite (Gunes et al., 2006). Anche su pomodoro ricerche precedenti avevano messo in evidenza un contenuto di MDA significativamente più alto nelle foglie delle piante trattate (Cervilla et al., 2007).

Per quanto riguarda l’influenza del B in eccesso sul sistema antiossidante sono state prese in considerazione le concentrazioni di glutatione e ascorbato e le attività di due enzimi, glutatione riduttasi e ascorbato perossidasi, coinvolti nella loro rigenerazione, attraverso il ciclo Halliwell-Asada.

L’ascorbato è forse l’antiossidante non-enzimatico principale nelle piante, la cui azione si esplica sia direttamente a livello di eliminazione di varie ROS, soprattutto H

O

, ma anche O

, OH

(Sairam et al., 1998; Reddy et al., 2004), a volte con l’ausilio di alcuni enzimi, sia indirettamente nella rigenerazione dell’α-tocoferolo (Sairam et al., 2005), una volta che questo è stato ossidato dalle ROS.

È stato provato che l’esposizione di piante di pomodoro all’eccesso di B (0,50 e 2,00

mM) aumenta la concentrazione delle tre forme di ascorbato (totale, ridotto e ossidato)

all’interno dei tessuti. Lo stress è quindi capace di stimolare sensibilmente la sintesi di

ascorbato, che svolge la sua azione ossidandosi, direttamente o tramite l’azione

dell’APX, perciò anche questa forma aumenta, senza comunque esaurire il pool di ascorbato ridotto, evidenziando così l’elevata efficienza di questo meccanismo protettivo (Cervilla et al., 2007).

Nel presente studio il livello di ascorbato totale (AsA+DHA) nelle foglie trattate si è mantenuto pressochè costante (fig. 21), così come era già stato osservato da Eraslan et al. (2007) in foglie di lattuga. Tuttavia si è verificato un sensibile decremento di AsA e un conseguente aumento di DHA. L’ascorbato viene quindi ossidato a seguito dello stress subito con il trattamento, svolgendo quindi la sua funzione. Il mancato aumento rilevabile nell’AsA può indirizzare verso due differenti ipotesi:

1. la quantità di B qui somministrata non è sufficiente a stimolare la sintesi di ascorbato in questa cultivar;

2. la sintesi di ascorbato è stimolata ma questo composto è repentinamente utilizzato e quindi non si accumula.

In ogni caso, comunque, la pianta riesce a proteggersi dallo stress, almeno entro certi limiti, utilizzando composti antiossidanti, che evitano l’ossidazione di altre molecole essenziali. Ma la condizione di stress provoca ugualmente una certa sofferenza nella pianta che non riesce a equilibrare perfettamente l’azione delle ROS. Forse a lungo andare potrebbe esserci un blocco totale della rigenerazione dell’AsA che potrebbe provocare danni seri. Problema comunque non rilevante per il pomodoro in quanto è una coltura con ciclo relativamente breve.

Come conseguenza dei risultati sopra espressi, sia nel presente studio che in quello condotto da Cervilla et al. (2007) il rapporto AsA/asc. tot diminuisce significativamente nel trattato. Le variazioni delle concentrazioni di AsA e DHA non sono invece sufficienti per far variare il loro rapporto, anzi le due variazioni opposte si compensano tra loro, confermando nuovamente l’efficienza dell’ascorbato nella difesa antiossidativa.

Anche il glutatione è un’importante molecola antiossidante in quanto è capace, oltre che a contrastare direttamente le varie ROS, di interagire con vari enzimi antiossidanti e è implicato nella riduzione del DHA a AsA nel ciclo Halliwell-Asada.

Il glutatione svolge la sua azione protettiva sotto forma di GSH, che viene appunto

ossidato dalle ROS a GSSG, composto che deve poi essere ridotto nuovamente nella

forma precedente affinché possa continuare la sua azione, processo questo catalizzato

dalla GR. Inoltre il B interagisce direttamente con la sintesi del glutatione: è stato visto

infatti che se assorbito in dosi ottimali la stimola, viceversa se in eccesso la inibisce

(Ruiz et al., 2003).

Come mostrato in fig. 22 nel presente studio si è rilevata una presenza maggiore di glutatione (sia ridotto che ossidato) nel controllo rispetto al trattato, probabilmente perché nel trattato, in accordo con quanto sostenuto da Ruiz et al. (2003), si può avere una maggiore difficoltà a sintetizzarlo, ma soprattutto perché anch’esso contribuisce a proteggere la pianta di pomodoro dall’effetto delle ROS. In questo caso la quantità di B somministrata non risulta in grado di stimolare la sintesi di glutatione.

Nonostante tutto il rapporto tra GSH e GSSG tende a aumentare, sebbene in maniera non significativa, nelle foglie trattate, rilevando che il GSH, forma attiva della detossificazione, è relativamente più abbondante dove c’è una presenza più massiccia di ROS.

Uno studio precedente su pomodoro (Cervilla et al., 2007) aveva indicato che in una delle cvs prese in esame il glutatione, in tutte le sue forme, non era influenzato dai trattamenti con B (0,50 e 2,00 mM), ma in un’altra cv. il trattamento con 0,50 mM favoriva un aumento significativo sia del GSH che del glutatione totale mentre il GSSG diminuiva. Con il trattamento a 2,00 mM invece l’aumento di GSH e di glutatione totale non è così spiccato, per quanto ancora significativo, e si ha un aumento significativo anche del GSSG. Questo dimostra quanto la risposta ad uno stress possa essere anche specie/cv. dipendente.

Le attività degli enzimi antiossidanti nelle piante sotto stress sono solitamente considerate come un indicatore della tolleranza dei genotipi agli stress, ma pare che non siano coinvolte nei meccanismi di tolleranza alla tossicità da B (Karabal et al., 2003).

A livello enzimatico l’APX è uno degli enzimi più importanti nella regolazione dei

livelli dell’H

O

intracellulare (Noctor e Foyer, 1998): è infatti l’enzima che riduce

l’H

O

a H

O, usando l’ascorbato come donatore di elettroni (Gunes et al., 2006). Come

tutti gli enzimi coinvolti nella rigenerazione dell’ascorbato, anche questo presenta un

comportamento estremamente vario nelle diverse specie sottoposte a eccesso di B. È

stato infatti visto che la sua attività aumenta in foglie di orzo trattate (Karabal et al.,

2003) e in foglie di lattuga trattate (Eraslan et al. 2007), dove è addirittura considerato

l’enzima preponderante nella detossificazione dell’H

O

prodotta in seguito ad alte

concentrazioni di B. Al contrario diminuisce nelle foglie di vite, dove il ruolo maggiore

nella detossificazione dell’H

O

derivante dall’eccesso di B sembrano averlo le CAT

(Gunes et al., 2006), così come avviene in patata (Rahnama e Ebrahimzadeh, 2005).

Per quanto riguarda il pomodoro era stato precedentemente visto che l’attività dell’APX aumentava significativamente (Cervilla et al., 2007) portando a un aumento del DHA, come è già stato accennato sopra.

Le nostre analisi hanno invece mostrato un livello dell’attività dell’APX notevolmente basso nel trattato, quasi 4 volte minore che nel controllo (fig. 23). Dato che nel presente studio, a differenza di Cervilla et al. (2007), la concentrazione di ascorbato ridotto diminuisce nelle foglie trattate, l’enzima non trova sufficiente agente riducente per detossificare la totalità di H

O

formatasi a seguito del trattamento, giustificando la sua minore attività.

Nel presente lavoro l’attività della GR, illustrata in fig. 24, è risultata significativamente minore nelle foglie trattate rispetto al controllo, in accordo con quanto riportato da Keles et al. (2004) su foglie di Citrus, dove le diminuzioni delle attività della GR e della CAT sfociavano in un accumulo di H

O

e quindi in maggiori danni dovuti alla perossidazione. Si può dire che tale effetto sia presente anche in questo caso in quanto la concentrazione di TBARS aumenta significativamente nelle foglie trattate. La diminuzione dell’attività della GR nelle foglie trattate può essere imputabile alla minore presenza di glutatione ridotto, così come avveniva per l’APX in relazione al contenuto di ascorbato ridotto.

Al contrario studi su foglie di pomodoro (cvs Josefina e Kosaco) avevano mostrato un significativo aumento nell’attività della GR, come per gli altri enzimi coinvolti nella rigenerazione dell’AsA, in seguito a trattamenti con il B (Cervilla et al., 2007).

Secondo prelievo – foglie (effetto del trattamento)

Per quanto riguarda il secondo prelievo, avvenuto a circa un mese di distanza dal primo, alla fine di luglio del 2009, i risultati sono lievemente cambiati.

Inaspettatamente la concentrazione di TBARS (fig. 20) si è rilevata praticamente uguale tra controllo e trattato.

Tra tutti i composti antiossidanti presi in esame l’unico che mostra di aver risentito del

trattamento, in questa raccolta, è l’ascorbato. La diminuzione della concentrazione di

AsA (fig. 21) nelle foglie trattate è infatti statisticamente significativa; si può quindi

ritenere che in tal modo il tessuto fogliare venga protetto dal possibile danno indotto

dalle ROS. Il repentino intervento di AsA potrebbe così giustificare il mancato

incremento del contenuto di TBARS nelle foglie trattate. La quantità di B somministrata

non stimola una sintesi maggiore di ascorbato, probabilmente, visti i risultati, perchè

non necessaria, così che la concentrazione di ascorbato totale risulta invariata col trattamento (fig. 21). La stessa costanza era stata riportata in lattuga da Eraslan et al.

(2007).

Questi risultati sono però in contrasto con quelli di altri lavori condotti su piante di Citrus (Keles et al., 2004) e su pomodoro (cvs Josefina e Kosaco) (Cervilla et al., 2007), dove anche l’ascorbato totale aumenta, quindi tali conclusioni non sono generalizzabili. Probabilmente la predominanza di un dato composto antiossidante rispetto a un altro è strettamente legata sia alle quantità di B somministrate che a fattori genetici e quindi di conseguenza la risposta antiossidativa al medesimo stress risulta molto varia, come già detto, a seconda delle specie considerate.

Anche la concentrazione totale dell’altra molecola antiossidante presa in esame, il glutatione, non mostra variazioni significative (fig. 22), per cui potrebbe darsi che la difficoltà di sintesi del glutatione proposta da Ruiz et al. (2003) in piante sottoposte ad alte concentrazioni di B si annulli dopo un certo periodo di tempo di esposizione allo stress. In queste condizioni sfavorevoli la forma ridotta nuovamente prodotta potrebbe aiutare la pianta a superare lo stress. La costanza nella concentrazione di glutatione totale era stata già osservata da Cervilla et al. (2007) nella cv. di pomodoro “Josefina”.

È inoltre interessante notare che la concentrazione di GSSG diminuisce nelle foglie trattate, ciò potrebbe confermare l’ipotesi avanzata precedentemente dell’efficienza dell’ascorbato, in queste condizioni, per cui oltre a proteggere i vari componenti cellulari, non fa consumare gli altri composti antiossidanti, lasciando intatto il loro pool per le funzioni per cui sono preposti in condizioni ottimali.

Da un altro punto di vista, prendendo cioè, in esame l’altra funzione del GSH legata al ciclo Halliwell-Asada, potrebbe darsi che la DHAR abbia un’attività minore e quindi non utilizzi il GSH per ridurre il DHA, formando meno GSSG.

Per quanto riguarda gli enzimi, sia l’attività dell’APX che quella della GR diminuiscono sensibilmente nel trattato (rispettivamente fig. 23 e 24). Per entrambi la spiegazione potrebbe risiedere nella diminuzione dei rispettivi substrati (AsA e GSSG). Per quanto riguarda la GR la sua minore attività potrebbe essere dovuta anche a una minore presenza di NADPH, necessario donatore di elettroni nella riduzione del GSSG a GSH in quanto l’eccesso di B provoca fra l’altro anche una riduzione dell’attività fotosintetica (Lovatt e Bates, 1984; Keles et al., 2004) della pianta dovuta a una minor produzione di NADPH, con conseguente riduzione della crescita (Cervilla et al., 2007;

Alpaslan e Gunes, 2001).

Confronto tra primo e secondo prelievo – foglie (effetto dell’età della pianta) Confrontando i risultati relativi al primo e al secondo prelievo si notano alcune differenze rilevanti.

La concentrazione delle TBARS, per esempio, è significativamente maggiore nei campioni di giugno (fig. 20) e ciò rispecchia un danno da ossidazione maggiore, rispetto a quello presente nei campioni raccolti a luglio. Ciò potrebbe essere dovuto a una capacità della pianta sottoposta a uno stress continuo di “riconoscerlo” e quindi di mettere in atto nel tempo meccanismi metabolici di difesa in modo da arginare i danni e metterla nelle condizioni di continuare il ciclo biologico.

L’AsA non mostra alcuna variazione significativa (fig. 21) nel tempo né tra i controlli né tra i trattati. Ciò indica che il tempo di esposizione allo stress è scarsamente influente su tale composto: la pianta non attiva maggiormente questa difesa a seguito di una prolungata esposizione ma allo stesso tempo non subisce nemmeno un inasprimento dei danni, come già accennato precedentemente questo potrebbe essere legato a una quantità di base di ascorbato totale sufficiente a contrastare questo stress.

Per quanto riguarda il glutatione (fig. 22) si notano invece alcune variazioni. Il GSH, al contrario del G tot che rimane invariato, infatti, diminuisce significativamente tra il controllo della prima raccolta e quello della seconda. Una diminuzione analoga era stata già monitorata in studi precedenti (Hatton et al., 1996) che avevano portato alla conclusione che la concentrazione di GSH diminuisce con l’età della pianta, forse perchè normalmente usato per contrastare il danno ossidativo legato all’invecchiamento naturale dei tessuti.

Quindi si può dire che oltre ad avere un comportamento diverso in cvs diverse, in accordo con quanto riportato da Cervilla et al. (2007) le forme del glutatione hanno andamenti diversi anche all’interno della stessa cv., a seconda dell’età della pianta.

Si è riscontrata una diminuzione significativa anche a livello del rapporto GSH/GSSG sia tra i controlli che tra i trattati, dovuto probabilmente alla diminuzione significativa di GSH.

Diversa, invece, è la situazione delle attività dei due enzimi, APX e GR, infatti

entrambe aumentano sensibilmente con l’età (fig. 23 e 24) sia nelle piante controllo che

in quelle trattate. Per quanto riguarda l’APX è probabile che le foglie trattate del

secondo prelievo, essendo state sottoposte per un tempo più lungo allo stress, abbiano

accumulato più H

O

rispetto a quelle del primo prelievo: l’accumulo di uno dei

reagenti, in virtù della “inibizione retroattiva” provoca un aumento dell’attività enzimatica per riportare la reazione all’equilibrio. Di conseguenza, all’interno del ciclo Halliwell-Asada, per equilibrarlo, anche l’attività della GR aumenta.

Nelle piante trattate si ha, poi, un notevole consumo di AsA - per contrastare le ROS formatesi - e quindi l’APX trova una minore concentrazione di agente riducente, così da mostrare una diminuzione di attività rispetto a quella del controllo, dove l’attività di questi enzimi aumenta con l’età per un probabile accumulo di ROS, dovuto al naturale invecchiamento dei tessuti.

Primo prelievo – frutti (effetto del trattamento)

Le analisi condotte sui frutti sono state indirizzate al monitoraggio delle proprietà nutrizionali delle bacche, quindi l’attenzione è stata rivolta soprattutto a quelle molecole ritenute importanti per la protezione del frutto e a livello di salvaguardia della salute nell’uomo, nella prevenzione dello stress ossidativo che sembra causa o concausa di numerose malattie degenerative (La Vecchia, 1997).

Per questo motivo sono stati analizzati composti differenti da quelli esaminati nelle foglie, dove erano state semplicemente prese in esame alcune delle molecole (enzimatiche e non) coinvolte nella difesa dello stress ossidativo, senza logicamente interessarsi al loro potenziale valore nutraceutico, dato che le foglie di pomodoro non sono oggetto di consumo alimentare nè da parte dell’uomo nè da parte del bestiame.

I composti analizzati nei frutti hanno caratteristiche chimiche ben diverse gli uni dall’altri per cui è stato necessario fare due tipi distinti di estratti in modo da poter ottenere di volta in volta le varie molecole, a seconda della loro affinità con l’acqua.

Per prima cosa è stata fatta un’analisi del potere antiossidante dei due estratti, idrofilico e lipofilico, il primo contenente principalmente ascorbato e fenoli, il secondo licopene e tocoferoli, per avere un’idea generale del contenuto nei frutti di tutte le molecole capaci di contrastare lo stress derivante dall’eccesso di B a cui erano sottoposte le piante.

Il potere antiossidante dell’estratto idrofilico (fig. 25) non sembra essere stimolato dal trattamento, visto che la piccola differenza quantitativa (tra l’altro negativa per il trattato) non risulta essere statisticamente significativa. Lo stesso avviene per l’estratto lipofilico (fig. 26). Si può dire quindi che il trattamento qui effettuato non incide in modo rilevante sul potere antiossidante totale dei frutti.

Risultati di studi condotti precedentemente su campioni di pomodoro raccolti, invece, a

diversi stadi di maturazione avevano messo in evidenza che il potere antiossidante

dell’estratto idrofilico rimaneva costante, come nel presente lavoro, mentre quello dell’estratto lipofilico aumentava con il raggiungimento della maturazione, con una buona correlazione con il valore della concentrazione del licopene (Cano et al., 2003), a significare, invece, che il livello di alcuni composti antiossidanti varia naturalmente nei diversi stadi fenologici della pianta.

L’unica analisi qui condotta sia sulle foglie che sui frutti è quella dell’acido ascorbico, in quanto oltre ad avere numerose funzioni vitali nei tessuti vegetali, dove probabilmente è il principale composto antiossidante, svolge questa funzione ed altre anche nei tessuti animali, che sono incapaci di sintetizzarlo autonomamente e quindi lo devono acquisire tramite l’alimentazione.

La vitamina C, infatti, ha numerose importanti funzioni nell’uomo: è indispensabile per la corretta sintesi del collagene e dei tessuti connettivi e per la formazione delle cellule ossee, aumenta l’assorbimento intestinale del Fe, migliora la resistenza alle infezioni e potenzia il sistema immunitario. Inoltre la sua carenza, oggigiorno inusuale, provoca lo scorbuto (Moruzzi et al., 1966).

Il contenuto di ascorbato totale (fig. 27) non risulta sensibile all’eccesso di B, così come avveniva nelle foglie di lattuga (Eraslan et al., 2007) e nelle foglie di pomodoro del presente esperimento. La concentrazione di AsA mostra un andamento simile a quello dell’ascorbato totale.

Diversa invece è la situazione del rapporto AsA/DHA che, invece, subisce un notevole incremento nel trattato, dove risulta essere quasi il quadruplo rispetto al controllo.

Sono state poi prese in esame le concentrazioni di alcuni composti che presentano importanti attività antiossidanti e possono svolgere allo stesso tempo anche altre funzioni all’interno del corpo umano, quali fenoli (fig. 28), tocoferoli (fig. 29) e licopene (fig. 30). Nessuna di queste sostanze mostra comunque di essere particolarmente suscettibile al trattamento con eccesso di B.

Nel particolare, i fenoli sono un gruppo di prodotti secondari estremamente eterogeneo

e svolgono una vasta gamma di funzioni nel regno vegetale. Sono infatti implicati nel

sostegno meccanico della pianta (lignina), nella difesa contro erbivori e patogeni

(isoflavonoidi e tannini), nell’attrazione degli impollinatori e nella dispersione dei frutti

(antocianine) (Taiz e Zeiger, 2001) oltre che nella decolorazione di foglie e frutti

(Çakmak et al., 1995; Ritenour e Saltveit, 1996). Sono inoltre capaci di interagire con

regolatori di crescita, con le perossidasi e con le IAA ossidasi (Pressey, 1990).

È stato dimostrato che i fenoli nell’uomo inibiscono l’ossidazione delle lipoproteine a bassa densità, considerate le più aterogeniche (Visioli e Galli, 1998). Inoltre sono importanti nella difesa contro il cancro (La Vecchia, 1997).

Sulla risposta dei fenoli all’eccesso di B studi precedenti avevano messo in evidenza che la concentrazione di fenoli totali subiva significativi aumenti sia in condizioni di eccesso che di carenza di B (Ruiz et al., 1997; Öncel et al., 2000; Dordas e Brown, 2004). Ciò potrebbe essere dovuto a un’azione diretta del B sull’attività della fenilalanina ammonio liasi (PAL) che si riflette sulla sintesi dei fenoli, in quanto quest’enzima trasforma il precursore iniziale (la fenilalanina) in acido cinnamico, primo passaggio della via biosintetica dei fenoli (Taiz e Zeiger, 2001). In condizioni di eccesso di B il rapido aumento della concentrazione di fenoli solubili in condizioni di stress potrebbe essere dovuto all’inibizione della sintesi di lignina (Keles et al., 2004).

Nel presente lavoro però i fenoli (fig. 28) sono rimasti invariati e questa discordanza può essere riportabile al fatto che nessuno dei lavori precedentemente citati ha condotto le analisi sui frutti, ma su foglie o su colture cellulari in vitro. Tessuti diversi possono infatti facilmente reagire in modi differenti al medesimo stress. Per esempio per quanto riguarda l’ipotesi dell’accumulo di fenoli dovuto in parte all’inibizione della sintesi di lignina (Keles et al., 2004), si può dire che quest’ultimo composto è relativamente presente nelle foglie ma lo è molto meno nel frutto (logicamente escludendo i semi), perciò i fenoli contenuti nei frutti potrebbero svolgere altre funzioni che non sono pregiudicate dall’eccesso di B e che perciò possono essere utilizzati normalmente senza accumularsi. Per quanto riguarda invece la stimolazione diretta del B sull’attività della PAL, potrebbe darsi che la quantità di B che raggiunge il frutto non sia sufficiente a oltrepassare la soglia limite oltre la quale è capace di interagire significativamente con tale enzima.

I tocoferoli rappresentano la vitamina E, anche se spesso con questa denominazione si tende a considerare solo l’α-tocoferolo, in quanto questa risulto essere, in effetti, la forma biologicamente più potente e attiva (Brigelius-Flohé e Traber, 1999), come si nota anche dalle maggiori concentrazioni di questa forma anche nel presente esperimento.

Tale vitamina è importante per la salute umana in quanto è indispensabile per il corretto funzionamento del tessuto muscolare e del tessuto nervoso; un tempo era considerata la

“vitamina della fecondità” in quanto la sua carenza (peraltro mai riscontrata, perchè la

maggior parte degli alimenti ne contiene a sufficienza) provocava sterilità in ratti di

entrambi i sessi (Moruzzi et al., 1966). La sua funzione principale rimane comunque quella di antiossidante: è considerato infatti l’antiossidante principale della fase lipidica ed è capace di contrastare la perossidazione lipidica (Navari-Izzo et al.,1997; Gao et al., 2002), causa scatenante di malattie degenerative.

A livello biochimico, nelle cellule vegetali l’α-tocoferolo è capace di ridurre alcuni radicali liberi, quali per esempio i radicali idroperossilici, derivati dai lipidi durante la degenerazione delle membrane. Questi ossidano il tocoferolo a radicale tocoferossile, molecola relativamente stabile, che poi è ridotto nuovamente a tocoferolo dall’AsA per completare il ciclo (Njus e Kelley, 1991).

Secondo Çakmak e Röhmeld (1997) alte concentrazioni di B interferiscono nella sintesi dell’α-tocoferolo, inibendola; i radicali liberi si trovano quindi ad avere via libera per danneggiare le membrane.

Il fatto che nel presente esperimento (fig. 29) non si abbia una diminuzione significativa può far pensare che la concentrazione di B nei frutti non raggiunge (con questo trattamento) valori così elevati da essere capace di inibire la sintesi dei tocoferoli.

Ipotesi che può essere avvalorata dal fatto che il B nel pomodoro non è capace di ritraslocare (floema-immobile), per cui si avrà una concentrazione di B minore nei frutti che nelle foglie. Tale caratteristica di floema-immobilità non è esclusiva del pomodoro, infatti, è stata riscontrata anche nel genere Citrus, nelle cui foglie si è appunto osservata una diminuzione significativa dell’α-tocoferolo a seguito di apporti anche eccessivi di B (Keles et al., 2004).

Le concentrazioni di δ- e γ-tocoferolo non hanno mostrato variazioni significative ma i loro valori, come già indirettamente accennato, erano molto più bassi rispetto all’α- tocoferolo. Addirittura il δ-tocoferolo era presente in quantità inferiori a 1 µg/g s.s., indipendentemente dal trattamento, per cui si può dire che nel pomodoro questa forma di tocoferolo non svolge un’azione rilevante. Concentrazioni così basse di questa forma erano state trovate anche in studi precedenti condotti su basilico (Sgherri et al., 2010).

Infine è stato analizzato il licopene, un carotenoide, che ultimamente ha ricevuto una notevole attenzione in quanto è ritenuto importante per la prevenzione contro vari tipi di cancro, in particolare quelli alla prostata e al pancreas, e contro certe malattie dello stomaco (Gerster, 1997).

I carotenoidi, in generale, sono importanti composti antiossidanti coinvolti nella

salvaguardia dell’apparato fotosintetico dalle ROS (Hirschberg, 2001), inoltre sono i

precursori dell’acido abscissico, un fitormone, sintetizzato appunto a partire da una

xantofilla (carotenoide ossigento), che regola numerose e molto varie funzioni (Taiz e Zeiger, 2001). Questi composti sono importanti anche per migliorare l’aspetto degli ortaggi da foglia, sia quelli destinati alla prima che alla quarta gamma (Biswall, 1995).

Per l’essere umano, infine, sono importanti in quanto sono, oltre che antiossidanti, anche i precursori della vitamina A, che protegge contro la degenerazione degli epiteli e la cui carenza provoca secchezza dell’epitelio corneale e cecità notturna (Moruzzi et al., 1966).

Inoltre è stato visto che i carotenoidi prevengono malattie cardiache, compresi anche alcuni tipi di tumore, malattie cardiovascolari, incluso l’infarto (Block e Longester, 1994) e la degenerazione maculare legata all’età (Seddon et al., 1994).

Il licopene è il carotenoide più abbondante nelle bacche di pomodoro e sembra anche essere quello più efficiente come “singlet oxygen quencher”, con una costante di “tasso di quenching” pari a K

=31x10

M

s

(Di Mascio et al., 1989).

Anche la concentrazione del licopene non varia in relazione all’eccesso di B (fig. 30), in accordo con quanto riportato anche da Keles et al. (2004) su foglie di Citrus in riferimento alla concentrazione di β-carotene e a quella delle xantofille, tutti composti di cui il licopene è il precursore comune. Probabilmente le ROS derivate dall’eccesso di B non sono in grado di stimolare in modo significativo la sintesi di questi antiossidanti, almeno nelle piante prese in esame. Ciò può essere motivato dal fatto che la sintesi di altre molecole con la stessa funzione protettiva, per esempio l’ascorbato, è meno dispendiosa per il metabolismo della pianta e quindi viene preferita, lasciando svolgere ai carotenoidi solo le loro funzioni normali.

Secondo prelievo – frutti (effetto del trattamento)

Anche per quanto riguarda il secondo prelievo non si è riscontrata alcuna differenza significativa per nessuna delle molecole prese in esame.

Il trattamento con eccesso di B sembra perciò non influenzare le qualità organolettiche e nutrizionali del frutto, risultato assolutamente accettabile in quanto in linea con la caratteristica, più volte citata, della pianta di pomodoro che non essendo una delle specie ricche di polioli non è capace di distribuire in modo equilibrato il B che si accumula maggiormente sui margini delle foglie più vecchie (vedi fig. 6).

Il fatto che nello specifico il potere antiossidante dell’estratto idrofilico (fig. 25) e

dell’estratto lipofilico (fig. 26) non subisca variazioni statisticamente significative

conferma la scarsa incidenza sui frutti del trattamento effettuato.

Per quanto riguarda l’acido ascorbico (fig. 27) non si ha alcuna variazione significativa;

anche il rapporto AsA/DHA, parametro che mostrava una notevole variazione nei campioni della prima raccolta, rimane invariato, indicando così che assumono importanza anche le quantità relative delle due forme, indipendentemente dalle loro concentrazioni assolute.

Il contenuto in fenoli (fig. 28) non varia col trattamento, forse perchè la quantità di B che raggiunge i frutti rientra tuttavia nel range ottimale per questa via metabolica, senza oltrepassare i limiti oltre i quali questa via si stimolerebbe, dato che in condizioni di B- carenza o di eccesso più del 90% del contenuto fogliare di B si legherebbe a pectine e fenoli, rispettivamente nella parete cellulare e nella membrana plasmatica (Hu e Brown, 1994; Hu et al., 1996). Per cui diminuendo la concetrazione di fenoli liberi si stimolerebbe la loro sintesi.

La concentrazione dei tocoferoli (fig. 29) non mostra cambiamenti significativi. Anche in questo caso comunque si ha una presenza notevolmente maggiore di α-tocoferolo, seguita dal γ-tocoferolo e solo tracce del δ-tocoferolo, a conferma della minore importanza di quest’ultima forma nel metabolismo del pomodoro e della netta predominanza della forma α.

I frutti delle piante trattate non mostrano ingiallimenti o necrosi: questo può essere spiegato anche in virtù del mantenimento dei livelli della concentrazione dell’α- tocoferolo, che proteggono le membrane dall’azione delle ROS.

Anche nel secondo prelievo non si hanno variazioni significative nella concentrazione di licopene (fig. 30), così come avveniva nel primo prelievo e come è riportato in letteratura in foglie di Citrus per la concentrazione di β-carotene e delle xantofille (Keles et al., 2004), probabilmente ancora una volta in dipendenza della caratteristica di scarsa ritraslocabilità del B, anche a seguito di un’esposizione prolungata allo stress.

Confronto tra il primo e il secondo prelievo – frutti (effetto dell’età della pianta)

L’unica variazione statisticamente significativa tra primo e secondo prelievo è risultata

essere la diminuzione, nei frutti trattati della seconda raccolta, del rapporto AsA/DHA

(fig. 28). Nei campioni della seconda raccolta, infatti, si nota una tendenza all’aumento,

anche se non significativa, dell’ascorbato totale e un livello mediamente costante

dell’AsA. Si ha perciò un leggero aumento del DHA, probabilmente dovuto alla somma

degli effetti del trattamento, comunque poco rilevanti nei frutti, e del naturale

invecchiamento della pianta.

Per il resto non si è registrata alcuna variazione degna di nota tra i risultati relativi al primo e quelli relativi al secondo prelievo. Per cui sembrerebbe che un prolungamento (di circa un mese) del periodo di esposizione della pianta allo stress non influisca molto sui frutti cresciuti e maturati in tale periodo.

Tutto ciò è facilmente spiegato considerando che il B nel pomodoro non viene

accumulato nei frutti. Il pomodoro infatti, come già detto più volte, non fa parte del

gruppo di specie ricche di polioli e, tramite questi, capaci di ritraslocare il B anche nel

floema. Tale elemento finisce quindi per accumularsi principalmente ai margini delle

foglie mature (fig. 6), con relative necrosi peraltro non tali da arestare il ciclo biologico.