Capitolo 3

Risultati e discussione

3.1 Cinetica di rilascio dei metalli dai sedimenti

L’elutriato, o fase acquosa estraibile, è una matrice ambientale in grado di replicare i fenomeni di mobilizzazione del sedimento e di predire il rilascio dei contaminanti dal sedimento verso la colonna d’acqua. Generalmente, la metodica di preparazione degli elutriati prevede un rapporto sedimenti:acqua di mare 1:4 (w:v) (Miniero et al., 2005), mentre per quanto riguarda i tempi di elutriazione non vi è una procedura standardizzata; alcuni autori riportano 30 minuti, altri 1 ora, altri ancora 8 o 24 ore (Arizzi Novelli et al., 2006). L’effetto del tempo di elutriazione sul rilascio dei metalli da parte del sedimento è stato quindi valutato nell’arco di 30 ore utilizzando un sedimento prelevato alla Foce dello Scolmatore. I risultati, mostrati in figura 3.1, indicano che il rilascio di Cd e Pb si mantiene sempre a livelli piuttosto bassi nell’arco di tutto l’esperimento, mentre il Cu viene rilasciato piuttosto velocemente nel corso delle prime ore, poi la velocità di rilascio rallenta fino a raggiungere un plateau dopo la ventesima ora. Questo andamento del rilascio del Cu indica che per raggiungere un equilibrio fra fase solida e fase acquosa è necessario un tempo di agitazione

superiore alle 20 ore. Per questo motivo sono state scelte le 24 ore come tempo di elutriazione per i nostri esperimenti.

tempo (h) 0 5 10 15 20 25 30 C u , C d , P b (n M ) 0 20 40 60 80 _Cu Cd Pb

Figura 3.1: Cinetica di rilascio dei metalli nell’elutriato ottenuto dal sedimento prelevato dalla Foce dello Scolmatore.

3.2 Misure dei metalli negli elutriati

Prima di condurre gli esperimenti di esposizione delle microalghe agli elutriati dei sedimenti sono state effettuate le misure chimiche della concentrazione dei metalli presenti negli elutriati tramite “Anodic Stripping Voltammetry” (ASV). Gli elutriati sono stati preparati utilizzando due sedimenti prelevati da aree costiere a forte impatto antropico, la Foce dello Scolmatore e Marina di Pisa (vedi figura 2.1), che hanno rappresentato due aree campione per la messa a punto del biosaggio sugli elutriati.

Tabella 3.1: Concentrazioni totali di Cd, Cu e Pb (nM), pH e Total Organic Carbon (TOC) negli elutriati ottenuti dai sedimenti prelevati alla Foce dello Scolmatore e a Marina di Pisa, oltre che nell’acqua di mare naturale usata per l’elutriazione.

* Le concentrazioni di metalli sono valori medi ± S.D. di 3 misure effettuate a pH 2 tramite ASV.

I risultati, ottenuti sulla misura della concentrazione dei metalli, hanno evidenziato che il sedimento prelevato alla Foce dello Scolmatore è contaminato principalmente da Cu mentre quello prelevato a Marina di Pisa è contaminato maggiormente da Cd (tabella 3.1). I risultati riportati in tabella mostrano anche, in entrambe i casi, una elevata concentrazioni di TOC che indica un forte rilascio di sostanza organica, più accentuato per il sedimento prelevato alla Foce dello Scolmatore. L’elevata quantità di sostanza organica, rilasciata dai sedimenti, ha impedito di misurare la frazione elettrochimicamente labile dei metalli (misura che viene effettuata a pH 8) interferendo con l’elettrodo di mercurio, per questo sono state effettuate le misure delle concentrazioni totali dei singoli metalli misurate a pH 2. L’elutriazione dei sedimenti è stata condotta utilizzando acqua di mare naturale, prelevata in una zona incontaminata (al largo dell’isola di Capraia): le basse concentrazioni di metalli misurate (tabella 3.1) hanno permesso di utilizzare quest’acqua di mare sia per l’elutriazione dei sedimenti che come controllo sperimentale.

Campione [Cd], nM [Pb], nM [Cu], nM pH TOC (µg l-1) Foce Scolmatore 3.5±1.2 1.2±0.2 41.0±2.9 7.8 527 Marina di Pisa 16.1±1.1 0.4±0.1 11.0±3.4 8.2 267

Gli elutriati di questi due sedimenti sono stati utilizzati per lo sviluppo di biosaggi algali basati sull’uso del pool intracellulare di fitochelatine come indicatore biologico di esposizione ai metalli.

3.3 Esperimenti di esposizione a breve termine

3.3.1 Incubazioni in acqua di mare arricchita di metalli

Allo scopo di individuare le specie di alghe fitoplanctoniche più adatte per essere utilizzate in biosaggi sulla sintesi di fitochelatine, colture unialgali di 5 specie di microalghe marine, P. tricornutum, T. weissflogii, S. costatum, D. tertiolecta e E. huxleyi, sono state incubate per 5 ore in acqua di mare naturale a cui sono stati aggiunti Cd, Pb o Cu in concentrazioni note e poi saggiate per la presenza di fitochelatine. Essendo le diverse specie molto diverse in volume l’una rispetto all’altra, i risultati sono stati normalizzati per unità di biovolume (tabella 3.2).

Microalga Ceppo Forma Volume (µm3) S.D.

Thalassiosira weissflogii CCAP 1085/1 cylinder 1247 ± 616

Phaeodactylum tricornutum CCAP 1052/1A double cone 168 ± 31

Skeletonema costatum CCAP 1077/5 cylinder 323 ± 120

Dunaliella tertiolecta CCAP 19/27 prolate spheroid 208 ± 82

Emiliania huxleyi CCAP 920/3 sphere 101 ± 31

Tabella 3.2: Specie, il ceppo, la forma ed il volume delle 5 microalghe utilizzate per i biosaggi.

Prima di risospendere le cellule algali nel mezzo di esposizione, e 1 ora dopo l’aggiunta di metallo, è stata misurata la frazione elettrochimicamente labile del metallo a pH naturale tramite ASV ed abbiamo assunto che questa sia uguale alla frazione inorganica dei metalli (Me') (Achterberg and Braungardt, 1999). Questa misura tiene conto del

fatto che l’acqua di mare naturale contiene una certa quantità di sostanza organica che potrebbe complessarsi con il metallo presente in soluzione e quindi non renderlo più totalmente disponibile.

I risultati ottenuti sulla produzione di fitochelatine in funzione della concentrazione della frazione inorganica dei metalli sono riportati in figura 3.2. Risulta evidente dai grafici che tutte le specie algali testate producono fitochelatine in risposta all’esposizione ai metalli ma con risposte che sono ampiamente differenziate a seconda della specie; inoltre si può apprezzare che la produzione di fitochelatine è una funzione della concentrazione di metallo in soluzione. In figura non sono state riportate le quantità prodotte dei diversi polimeri di fitochelatine ma solo il totale di fitochelatine; i cromatogrammi ottenuti dall’analisi all’HPLC degli estratti cellulari hanno comunque evidenziato che le fitochelatine maggiormente prodotte sono le PC2indipendentemente

dalle specie metalliche presenti in soluzione e dalle specie di microalghe, dato che queste sono le prime ad essere prodotte.

Analizzando la risposta in produzione di fitochelatine delle cinque specie microalgali all’esposizione ai singoli metalli si può notare che, per quanto riguarda il Cd, P. tricornutum, T. weissflogii e S. costatum producono quantità misurabili di fitochelatine anche alla prima aggiunta di metallo ([Cd'] = 5 nM), dopo di che la quantità di fitochelatine prodotta aumentava in modo proporzionale al Cd fino a raggiungere valori di concentrazione intracellulare attorno a 600M alla [Cd'] = 100 nM. Al contrario D. tertiolecta e E. huxleyi rispondevano con basse quantità di fitochelatine all’esposizione al Cd.

P. tricornutum e T. weissflogii sono risultate essere le più sensibili al Cu sintetizzando fitochelatine fino a 100 M alle più alte concentrazioni di Cu in soluzione, mentre S.

costatum, D. tertiolecta e E. huxleyi rispondevano con basse quantità di fitochelatine alle aggiunte di Cu.

S. costatum rispondeva più delle altre alghe all’esposizione al Pb, con concentrazioni anche doppie rispetto a P. tricornutum e T. weissflogii. In modo simile al Cd ed al Cu, il Pb induceva solo scarse quantità di fitochelatine in D. tertiolecta e E. huxleyi.

In generale, i risultati ottenuti hanno evidenziato che le tre diatomee sono le specie più sensibili all’esposizione ai metalli e che il Cd risulta essere il maggiore induttore, in accordo con i dati della letteratura (Kawakami et al. 2006; Ahner et al., 2002; Ahner e Morel, 1995) .

Dai dati riportati in figura 3.2 si nota che le risposte in produzione di fitochelatine risultano essere specie-specifiche. Ciò può dipendere dalle diverse tipologie di uptake e di accumulo dei metalli utilizzate dalle diverse specie di microalghe. Per quanto riguarda D. tertiolecta e E. huxleyi, benché abbiano la capacità di produrre fitochelatine, probabilmente queste non costituiscono il principale meccanismo di difesa messo in atto contro la tossicità dei metalli. Ciò è in accordo con i risultati ottenuti da altri autori, i quali hanno osservato che, in D. tertiolecta (Gonzalez-Davila et al, 1995) e in E. huxleyi (Leal et al, 1999) esposte al Cu la detossificazione del metallo avviene principalmente mediante la produzione di essudati.

Figura 3.2: Confronto della produzione di fitochelatine tra le 5 specie microalgali risospese in acqua di mare naturale a cui sono stati aggiunti Cd, Pb o Cu in concentrazioni note. Le barre corrispondono alla deviazione standard ottenuta per 2 repliche sperimentali.

3.3.2 Incubazioni in elutriati di sedimenti

Sulla base dei risultati ottenuti in acqua di mare arricchita di metalli le microalghe marine, P. tricornutum, T. weissflogii e S. costatum, sono state utilizzate in specifici biosaggi, che sono stati applicati ad elutriati ottenuti dai sedimenti prelevati alla Foce dello Scolmatore ed a Marina di Pisa, allo scopo di valutare lo stato di contaminazione dell’ambiente marino.

Gli esperimenti di esposizione a breve termine (5 h) sono stati condotti con cellule prelevate all’inizio della fase stazionaria di crescita e risospese negli elutriati seguendo il protocollo sperimentale riportato nella sezione “Materiali e metodi”.

La produzione di fitochelatine in funzione delle diverse concentrazioni di elutriato è riportata in figura 3.3.

I risultati mostrano che le tre specie di microalghe esaminate rispondono con la produzione di fitochelatine all’esposizione ad entrambi gli elutriati in modo crescente al crescere della percentuale di elutriato presente nel mezzo. L’unica eccezione è rappresentata da T. weissflogii che, negli elutriati della Foce dello Scolmatore diluiti al 25% ed al 50%, non sintetizza fitochelatine in quantità significativamente superiori a quelle del controllo. Un confronto delle risposte di produzione di fitochelatine nelle tre diatomee rivela anche che il P. tricornutum è la microalga che risponde con la maggiore quantità di fitochelatine all’esposizione ad entrambi gli elutriati (figura 3.3).

In generale, questi risultati indicano che gli elutriati contengono specie metalliche biodisponibili e potenzialmente tossiche tali da attivare un meccanismo di detossificazione. Le fitochelatine accumulate nelle cellule sono quindi un utile indice biologico di specie biodisponibili dei metalli in soluzione e possono essere efficacemente utilizzate per predire la tossicità dei sedimenti.

Inoltre il fatto che le alghe sintetizzino quantità apprezzabili di fitochelatine dopo solo 5 ore di incubazione, rende questo biomarker un segnale precoce della presenza di forme biodisponibili dei metalli nel mezzo di esposizione.

Figura 3.3: Confronto della produzione di fitochelatine in funzione delle diverse percentuali di elutriato diluito con acqua di mare naturale nelle tre diatomee (P. tricornutum, T.

weissflogii e S. costatum), incubate per 5 ore. Gli elutriati sono stati ottenuti dal sedimento

prelevato alla Foce dello Scolmatore (A) e a Marina di Pisa (B). Le barre corrispondono agli intervalli di confidenza mentre gli asterischi indicano le differenze statisticamente significative rispetto al controllo (p < 0.05). Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.

La misura chimica della quantità totale dei metalli presenti in soluzione, pur essendo utile, non può fornire informazioni sulla loro biodisponibilità, in quanto la presenza di sostanza organica in soluzione, che può complessare i metalli, altera la speciazione dei metalli rilasciati dal sedimento, rendendoli parzialmente inerti. Dato che le fitochelatine vengono sintetizzate in risposta al metallo tossico presente all’interno della cellula, la loro produzione rappresenta un biosaggio specifico per i metalli pesanti.

3.4 Esposizione a lungo termine

3.4.1 Incubazioni in elutriati di sedimenti

Allo scopo di valutare l’effetto dell’esposizione ai metalli pesanti in cellule microalgali in crescita, e non in fase stazionaria come nel caso degli esperimenti a breve termine, sono stati condotti test di esposizione a lungo termine (6 giorni). Questo permette di valutare se le cellule in fase esponenziale di crescita sono più o meno suscettibili alla presenza di metalli. È inoltre possibile valutare anche la relazione tra la produzione di fitochelatine e l’insorgenza di tossicità intesa come effetto sulla crescita.

Figura 3.4: Confronto della produzione di fitochelatine nelle tre diatomee (P. tricornutum, T.

weissflogii e S. costatum) esposte per 6 giorni a diverse percentuali di elutriato in acqua di

mare naturale. Gli elutriati sono stati ottenuti da sedimenti prelevati alla Foce dello Scolmatore (A) e a Marina di Pisa (B). Le barre corrispondono agli intervalli di confidenza mentre gli asterischi indicano le differenze statisticamente significative rispetto al controllo (p < 0.05). Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.

In analogia con le prove a breve termine, anche negli esperimenti a 6 giorni abbiamo trovato un generale andamento crescente dell’accumulo di fitochelatine rispetto alla percentuali di elutriato presente nel mezzo (figura 3.4). Questo indica che la presenza di fitochelatine in cellule esponenziali può essere efficacemente utilizzata come biomarker di esposizione a specie biodisponibili di metalli.

I risultati riportati in figura 3.4 evidenziano che negli esperimenti a 6 giorni le tre diatomee rispondono all’esposizione agli elutriati con la sintesi di fitochelatine in modo molto diverso a seconda delle specie. A differenza dei risultati ottenuti nelle esposizioni a 5 ore, il P. tricornutum produce quantità di fitochelatine molto inferiori rispetto a T. weissflogii e a S. costatum. Inoltre si nota che T. weissflogii risponde in maniera più evidente rispetto alle altre diatomee, raggiungendo concentrazioni intracellulari di fitochelatine intorno a 500M quando le cellule sono esposte al 100% di elutriato della Foce dello Scolmatore (rispetto a 40M di fitochelatine prodotte da S. costatum e a 20 M di fitochelatine prodotte da P.tricornutum), e intorno a 2500 M di fitochelatine quando sono esposte al 100% di elutriato di Marina di Pisa (rispetto a 500 M di fitochelatine prodotte da S. costatum e a 10 M di fitochelatine prodotte da P.tricornutum). La più bassa risposta delle tre diatomee nell’elutriato ottenuto dal sedimento prelevato alla Foce dello Scolmatore è dovuta al fatto che questo è risultato essere contaminato essenzialmente da Cu, che è noto essere un induttore più debole rispetto al Cd, del quale è invece contaminato il sedimento prelevato a Marina di Pisa. È stato inoltre indagato l’effetto che l’esposizione agli elutriati ha sulla crescita cellulare.

Tabella 3.3: Confronto delle velocità di crescita (), espresse in raddoppiamenti al giorno, delle tre diatomee relativamente alle percentuali di elutriato della Foce dello Scolmatore e di Marina di Pisa. % Elutriato Foce dello Scolmatore P. tricornutum Velocità di crescita() raddoppiamenti al giorno T. weissflogii Velocità di crescita() raddoppiamenti al giorno S. costatum Velocità di crescita() raddoppiamenti al giorno 0 1.67±0.05 1.06±0.04 1.38±0.02 25 1.67±0.15 1.11±0.02 1.51±0.27 50 1.64±0.29 1.07±0.01 1.34±0.27 75 1.63±0.18 1.07±0.04 1.53±0.12 100 1.72±0.18 1.05±0.03 1.66±0.21

Dalla tabella 3.3 si evince che per entrambi gli elutriati la crescita non è significativamente alterata rispetto alle colture di controllo (0% Elutriato). Nonostante la crescita non sia influenzata le microalghe hanno sintetizzato fitochelatine suggerendo che le cellule mettono in atto meccanismi di detossificazione efficienti per proteggere la divisione cellulare. Dai nostri risultati appare quindi che la produzione di fitochelatine avviene prima che effetti tossici evidenti, come la riduzione della velocità di crescita, possano essere osservati. Quindi la loro presenza nelle cellule algali rappresenta una

% Elutriato Marina di Pisa P. tricornutum Velocità di crescita() raddoppiamenti al giorno T. weissflogii Velocità di crescita() raddoppiamenti al giorno S. costatum Velocità di crescita() raddoppiamenti al giorno 0 1.69±0.02 1.08±0.07 1.37±0.02 25 1.87±0.13 1.08±0.02 1.43±0.01 50 1.92±0.19 1.05±0.02 1.40±0.02 75 1.86±0.17 1.08±0.20 1.42±0.11 100 1.75±0.04 1.08±0.11 1.41±0.09

risposta precoce di difesa contro la tossicità dei metalli e ne fa un utile biomarker di esposizione a specie realmente biodisponibili dei metalli.

3.4.2 Effetto della velocità di crescita sulla produzione di fitochelatine

Al fine di evidenziare le differenze notate nelle risposte cellulari nel corso degli esperimenti a breve ed a lungo termine è stata indagata la produzione di fitochelatine in funzione della crescita. I risultati hanno mostrato che facendo inoculi a differenti concentrazioni cellulari, più basso è l’inoculo, maggiore risulta la crescita cellulare. Inoltre nel caso di T. weissflogii, all’aumentare della velocità di crescita aumenta anche la produzione di fitochelatine, quindi si deduce che la produzione di fitochelatine è una funzione di quanto le cellule si dividono. Invece nel caso di P. tricornutum la produzione di fitochelatine è indipendente dalla crescita e risulta scarsa da qualsiasi densità cellulare si parta. Ciò conferma che il P. tricornutum in fase esponenziale è poco sensibile alla tossicità dei metalli pesanti.

Figura 3.5: Andamento delle fitochelatine in funzione della velocità di crescita Le barre corrispondono agli intervalli di confidenza.

È possibile che durante la fase riproduttiva P. tricornutum utilizzi altri meccanismi di detossificazione. Morelli et al (2002), facendo esperimenti di esposizione al Cd in colture di P.tricornutum in fase esponenziale di crescita, notarono che la concentrazione intracellulare di Cd mostrava bassi livelli durante la prima fase esponenziale mentre aumentavano in maniera consistente verso la fine della fase esponenziale. Durante la fase stazionaria, i livelli intracellulari di Cd si mantenevano costanti indicando che non avveniva un ulteriore ingresso del metallo nelle cellule. L’ipotesi da loro formulata è che il processo di divisione cellulare, molto attivo nella fase di crescita esponenziale, possa limitare i meccanismi di accumulo dello ione metallico all’interno della cellula. È noto dalla letteratura (Hall, 2002) che gli organismi vegetali hanno sviluppato dei meccanismi di difesa dai metalli potenzialmente tossici, che coinvolgono le superfici cellulari attraverso una riduzione dell’ingresso del metallo oppure l’aumento della velocità di efflusso. È probabile che in P.tricornutum esista un meccanismo di regolazione che mantiene bassi i livelli intracellulari dei metalli nelle cellule in fase esponenziale e che possa essere ridotto, o addirittura perso, nelle cellule in fase stazionaria di crescita. In accordo con tale ipotesi, Boisson et al (1995), riportarono l’esistenza di un meccanismo di esclusione del selenio presente nell’alga marina unicellulare Cricosphera elongata, durante la fase esponenziale, che viene perso durante la fase stazionaria di crescita.

Ahner el al (2002) notarono che alcune alghe, come Thalassiosira pseudonana, Dunaliella sp. ed E. huxleyi, producono più fitochelatine nella fase esponenziale rispetto a quella stazionaria, mentre altre come P. tricornutum si comportano diversamente. Il comportamento di T. weissflogii mostra analogie con quello osservato da alcuni autori che lavorano sulle cellule di pomodoro in coltura, le quali mostrano una produzione di

fitochelatine se esposte al Cd o ad altri ioni tossici. Misurando l’attività della fitochelatina sintetasi nella fase stazionaria ed esponenziale di crescita, questi autori hanno visto che durante la fase esponenziale l’attività della fitochelatina sintetasi è aumentata, mentre decresce quando ci si avvicina alla fase stazionaria (Inouhe, 2005; Inouhe et al, 2000; Chen et al, 1997). Ciò succede probabilmente perché durante la crescita le cellule sono più suscettibili, si difendono meglio perché è importante la fase riproduttiva e necessitano di avere la cellula pulita e non intossicata dato che devono assolvere a questo compito importante.

3.4.3 Applicazione del biosaggio in un’area costiera

Si può concludere che T. weissflogii è l’alga che, più delle altre risponde con la sintesi di fitochelatine all’esposizione agli elutriati. Per questo motivo, in un successivo esperimento di applicazione del biosaggio ad un’area costiera abbiamo scelto di utilizzare il test a 6 giorni con T. weissflogii. L’area scelta per questo studio applicativo è stata la zona tra la foce dell’Arno ed il fiume Serchio (contaminata dal pennacchio dell’Arno). Campione [Cd] nM [Pb] nM [Cu] nM St 1 26.5 b.d. 13.5 St 2 45 b.d. 11.6 St 3 50 0.3 10 St 4 312 0.3 19 St 5 47 0.5 6.7 St 6 6 b.d. 23 St 7 152 0.3 24 St 8 59 0.9 11 St 9 230 0.6 57

Tabella 3.4: Concentrazioni totali di Cd, Pb e Cu (nM), negli elutriati ottenuti dai sedimenti prelevati nelle stazioni scelte della fascia costiera che va dalla foce del fiume Arno (St 1) fino in prossimità del fiume Serchio (St 9) (vedi cartina in figura 2.1).

In tabella 3.4 sono riportate le concentrazioni totali dei metalli misurati tramite ASV (pH 2) negli elutriati dei sedimenti raccolti in nove stazioni. I dati mostrano che il Cd è il principale contaminante presente in questi campioni. I sedimenti più contaminati sono quelli prelevati in prossimità della foce del Fiume Morto (St 4) e della foce del Fiume Serchio (St 9).

In generale la distribuzione dei metalli negli elutriati non segue un andamento ben definito, data la presenza di numerose sorgenti di inquinamento presenti nella zona. Inoltre la capacità di rilasciare metalli da parte del sedimento nell’acqua può essere influenzata da molti parametri come la granulometria del sedimento o lo stato di ossidazione.

Uno studio sulle cause dello stato di inquinamento di questa fascia costiera va al di là dello scopo di questa tesi: questo esperimento è stato progettato per studiare la relazione tra contaminazione del sedimento e produzione di fitochelatine come risposta di esposizione a tale contaminazione da parte della microalga prescelta.

[Me], nM 0 50 100 150 200 250 300 350 0 2000 4000 6000 8000

Figura 3.6: Produzione di fitochelatine in funzione del grado di contaminazione del campione. Sull’asse delle ascisse è riportata la somma la concentrazione dei metalli misurata tramite ASV.

I risultati (figura 3.6) mostrano che la quantità di fitochelatine accumulate in cellule esponenziali di T. weissflogii aumenta in funzione della concentrazione totale dei metalli estraibili dai sedimenti.

Non è stata fatta l’analisi completa dei metalli in soluzione, avendo misurato soltanto Cd, Pb e Cu e neppure conosciamo l’esatta speciazione chimica, però, il fatto di trovare un generale aumento della produzione di fitochelatine in funzione del grado di contaminazione del campione conferma l’utilità dell’uso di questo indicatore biologico (biomarker) nello stabilire la biodisponibilità e la potenziale tossicità delle specie metalliche presenti in elutriati di sedimenti marini.

P

C

(

M