SPSPEETTTTRROOSSCCOOPPIIA A DDII RRIISOSONNAANNZZAA MMAAGGNNEETTIICCAA AALL CCAARRBBOONNIIOO ((1133C)C)
La spettroscopia NMR riguarda l’assorbimento di radiazioni elettromagnetiche da parte di nuclei atomici magneticamente attivi immersi in un campo magnetico.
Ogni nucleo atomico che possiede o massa atomica A dispari o numero atomico Z dispari o entrambi dispari, è magneticamente attivo ossia possiede un momento angolare di spin P (e un momento magnetico nucleare μ).
Il momento angolare di spin (e il momento magnetico nucleare μ) di un nucleo posto in un campo magnetico può assumere due o più orientamenti ad ognuno dei quali è associato un diverso livello energetico.
Le transizioni tra i livelli energetici generate dall'interazione con una radiofrequenza opportunamente rilevate danno luogo ad uno spettro di risonanza magnetica.
Il numero di possibili orientamenti è quantizzato ed è pari a 2I+1 dove I è il numero quantico di spin del nucleo.
L’isotopo dell’idrogeno 1H ha spin = 1/2 e in un campo magnetico può assumere due orientamenti.
1H ha una abbondanza naturale quasi del 100%, per cui in pratica tutti i nuclei di idrogeno presenti in una molecola "contribuiscono" alla creazione del segnale NMR.
La frequenza di risonanza è data da:
L’isotopo più abbondante del carbonio è il 12C non è magneticamente attivo (I = 0).
L'isotopo 13C invece ha numero quantico di spin 1/2 come il protone e quindi si comporterà come l'idrogeno dal punto di vista della risonanza magnetica nucleare con alcune importanti ddiiffffeerreennzzee:
abbondanza naturale dell’isotopo attivo all’NMR rapporto giromagnetico
intervallo di osservazione
accoppiamenti scalari (accoppiamenti spin-spin) omo- e eteronucleare intensità relativa dei picchi di risonanza e tempi di rilassamento
sequenze particolari di registrazione degli spettri NMR (disaccoppiato, off-resonance e effetto NOE)
spostamenti chimici (chemical shift)
isotopo Abbondanza naturale (%)
Numero quantico di spin nucleare I
Stati di spin Frequenza di risonanza a 42.276 Gauss (MHz)
1H 99.88 1/2 ±1/2 180
13C 1.1 1/2 ±1/2 45.3
19F 100 1/2 ±1/2 169.2
31P 100 1/2 ±1/2 73.2
l'abbondanza naturale del 13C è solo dell'1.1% per cui solo questa piccola percentuale di nuclei “contribuisce” alla creazione del segnale NMR con una sensibilità molto inferiore rispetto all’idrogeno (in pratica occorrono più acquisizioni).
Inoltre anche il valore del rapporto giromagnetico γ del nucleo in esame influisce sulla sensibilità della tecnica:
ampiezza segnale NMR ∝ γ3 γ (13C)/ γ (1H) ≈ 1/4
γ (1H) = 26.75 x 107 rad s-1T-1 γ (13C) = 6.73 x 107 rad s-1T-1
Sperimentalmente l'ampiezza di un segnale NMR è proporzionale circa al cubo della costante giromagnetica. Poiché il rapporto giromagnetico γ del 13C è circa 1/4 di quello dell’1H (6.73 x 107 rad s-1 T-1 vs 26.75 x 107 rad s-1 T-1) il segnale di un 13C sarà (1/4)3 = 1/64 del segnale di un 1H, inoltre tenendo conto dell’abbondanza naturale pari a circa l’1.1%, si avrebbe un segnale per il 13C circa 6000 volte inferiore al segnale 1H a parità di quantità del campione. A causa della bassa sensibilità dell'esperimento NMR applicato al
13C solo strumenti a trasformata di Fourier possono registrare spettri significativi in tempi ragionevoli. Per questo motivo la tecnica 13C NMR è stata sviluppata sviluppata dopo a quella 1H NMR.
Nella tecnica a impulsi tutte le frequenze di interesse vengono messe in risonanza nello stesso istante, utilizzando un impulso della giusta radiofrequenza molto potente e molto breve. Dopo l’irraggiamento occorre attendere che l’eccesso di energia venga disperso dal sistema di spin attraverso vari processi di rilassamento prima di ripetere l’impulso di radiofrequenza. Questa tecnica permette di ottenere molti accumuli in poco tempo.
Tra due impulsi successivi, “si dovrebbe” ristabilire l’equilibrio di partenza tra gli spin di tutti gli atomi in esame attraverso processi di rilassamento di varia natura.
Un meccanismo di rilassamento importante per i nuclei di 13C è dovuto alle interazioni dipolo-dipolo tra due nuclei 1H e 13C e la sua velocità dipende da diversi fattori:
Numero di protoni legati al 13C: T1 (CH3) < T1 (CH2) < T1 (CH) < T1 (C) ossia il tempo di rilassamento T1 diminuisce all’aumentare del numero dei protoni direttamente legati al nucleo 13C.
Dimensioni e simmetria della molecola: molecole piccole o molto simmetriche hanno tempi di rilassamento T1 più lunghi di molecole grandi o complesse.
Intorno chimico: atomi di carbonio diversi hanno tempi di rilassamento diversi.
La variabilità del tempo di rilassamento T1 a seconda del tipo di atomi di carbonio è responsabile del fatto che l’integrazione dei picchi negli spettri 13C di routine NON è correlata al rapporto degli atomi di carbonio al contrario del protone che avendo tempi di rilassamento T1 brevi genera segnali con intensità proporzionali al numero di nuclei coinvolti.
NB negli spettri 13C:
se l’intervallo tra i vari impulsi è troppo breve rispetto ai tempi di rilassamento alcuni segnali possono scomparire del tutto.
se l’intervallo tra i vari impulsi è maggiore o uguale al trempo di rilassamento di tutti i nuclei 13C presenti nella molecola, l’intensità dei segnali è proporzionale al numero dei nuclei coinvolti. In tal caso però i tempi di acquisizione aumentano notevolmente: non adatto per analisi di routine.
Il rapporto giromagnetico γ del 13C è circa 1/4 di quello dell’1H (vedi prima) per cui a parità di campo magnetico esterno applicato la frequenza di risonanza del carbonio sarà circa 1/4 di quella dell’1H. (infatti come ricordato in precedenza ν = γ B0/2π)
L’'intervallo di osservazione è molto più ampio di quello dell’idrogeno e va comunemente da 0 a 240 ppm. Come composto di riferimento a δ=0 ppm si usa il TMS come per l’idrogeno.
Costanti di accoppiamento
C 13C H H
H H
OH
H 13C C
H H
H H
OH
H 13C 13C
H H
H H
OH H
1.1% del totale (probabilità: 0.011)
0.012% del totale (probabilità: 0.0112)
Gli accoppiamenti 13C-13C non sono in genere osservabili in quanto è estremamente improbabile che due nuclei 13C si trovino adiacenti nella stessa molecola data la bassa abbondanza isotopica (ovviamente ciò può non essere vero in sostanze arricchite isotopicamente).
Costanti di accoppiamento visibili in spettri di sostanze NON arricchite isotopicamente:
spettro 1H-NMR spettro13C-NMR J(H/H) sì JJ((CC//CC)) nono
J(H/F) sì J(C/F) sì
J(H/P) sì J(C/P) sì J(J(HH//CC)) nono J(C/H) sì
….…... …..
1J(13C-1H) ≈ 110–320 Hz; 2J(13C-1H) ≈ 0–60 Hz; 3J(13C-1H) ≈ 0–10 Hz
13C-H 13C-C-H 13C-C-C-H
Però rimangono gli accoppiamenti con i protoni ed eventuali altri nuclei magneticamente attivi. Poiché le costanti di accoppiamento 1J C-H hanno valori molto elevati (1JCH = 110–320 Hz, ma anche le 2JCH = 0-60 Hz e 3JCH = 0-10 Hz possono essere significative) spesso le linee relative ai vari segnali sono sovrapposte e lo spettro risulta molto complicato. Per semplificare gli spettri del carbonio si può utilizzare la tecnica della doppia risonanza in cui un canale supplementare irradia alla frequenza di risonanza dell'intero spettro protone annullando gli accoppiamenti con il carbonio (vedi dopo). In queste condizioni lo spettro finale risulta formato da soli singoletti uno per ogni atomo di carbonio non chimicamente equivalente nella molecola (a meno di casuali coincidenze di spostamento chimico).
SpSpoossttaammeennttii chchiimimiccii (c(chheemmiiccaall sshhiifftt))
scala 1H NMR ≈ 12–0 (TMS) ppm;
scala 13C NMR ≈ 220–0 (TMS) ppm
Gli spostamenti chimici nella spettroscopia del carbonio dipendono dagli stessi parametri che influenzano il protone, quali ibridazione del carbonio ed elettronegatività del sostituente, anche se si estendono per un maggior numero di ppm (da 0 a 240 ppm circa).
Fattori che influenzano il chemical shift:
Ibridazione degli atomi di C. I carboni ibridati sp3 risuonano a campi più alti (frequenze più basse) rispetto a quelli ibridati sp2. A metà strada di trovano i carboni ibridati sp, che risentono del fenomeno dell’anisotropia diamagnetica
Effetto induttivo. I sostituenti elettronegativi provocano una deschermatura sul carbonio in posizione α, in maniera proporzionale alla loro elettronegatività
Effetto mesomero. La delocalizzazione delle cariche nei sistemi insaturi (anelli aromatici, carbonili α,β insaturi) provoca delle variazioni dei chemical shift. Sostituenti elettron attrattori (COOR, COR, CN, NO2) riducono la densità di carica nelle posizioni orto
e para dell’anello benzenico, deschermando i corrispondenti atomi di carbonio. Sostituenti elettron donatori e con doppietti elettronici delocalizzabili sul sistema aromatico aumentano la densità di carica sulle posizioni orto e para, schermando i corrispondenti atomi di carbonio.
Effetti sterici. quando due atomi di C si trovano tra loro in posizione gauche o eclissata, la compressione sterica provoca la schermatura di entrambi i nuclei di 5–10 ppm
Il concetto di additività degli effetti del sostituente è valido anche per questo tipo di spettri.
Quando sono presenti più fattori si può ricorrere a delle tabelle di correlazione per prevedere l’entità del chemichal shift.
DiDissaaccccooppppiiaammeennttoo prproottoonniiccoo
A causa degli elevati valori degli accoppiamenti 1JC-H (110-320 Hz) e dei valori a volte significativi di 2JC-H (0-60 Hz) e 3JC-H (0-10 Hz) gli spettri 13C accoppiati con il protone spesso presentano multipletti complessi e sovrapposti, difficili da interpretare.
Per superare questo inconveniente si ricorre al disaccoppiamento protonico a banda larga, che permette di rimuovere l’accoppiamento con tutti i protoni presenti nella molecola. In tali condizioni ogni atomo di carbonio chimicamente non equivalente presente nel composto genera un unico segnale sottile, fatta eccezione per eventuali sovrapposizioni dovute a fortuite coincidenze di chemical shift. Si ottiene così una notevole semplificazione dello spettro accompagnata dalla perdita delle informazioni relative alla molteplicità dei segnali (struttura fine).
I
Ill ddiissaaccccooppppiiaammeennttoo didi ssppiinn
Se non è influenzato dell'esterno, un protone rimane nel suo stato di spin α o β. Se però viene irradiato con continuità alla sua frequenza di risonanza, la radiazione elettromagnetica causa un continua variazione del suo stato di spin da α a β e viceversa.
Si ha in pratica una serie continua di assorbimenti ed emissioni stimolate.
Consideriamo ora un sistema AX, e supponiamo di registrare uno spettro mentre si irradia costantemente il nucleo del protone A. In queste condizioni il nucleo X non si trova più nelle vicinanze di un protone nello stato α o nello stato β, ma nelle vicinanze di un protone
che cambia continuamente il suo stato di spin. Il nucleo X risente quindi dello momento magnetico medio del nucleo A, che è zero.
Senza disaccoppiamento, il nucleo X è schermato o deschermato e l’insieme di nuclei X genera un doppietto.
Con il disaccoppiamento ogni nucleo X è prima schermato, poi deschermato, e così via per cui risente di un valore di campo medio.
In definitiva, se si irradia con continuità sul nucleo A, il nucleo X non risente più dell’accoppiamento con il nucleo A, e risuona come singoletto, cioè come se il nucleo A non ci fosse (anche se eventuali accoppiamenti con altri nuclei continuano ad esistere!).
Nello stesso tempo, il segnale del nucleo A non è più presente nello spettro, poiché la continua irradiazione fa sì che le popolazioni degli stati α e β diventino identiche.
L’altezza relativa del singoletto sarà maggiore dell’altezza delle singole componenti del doppietto.
Con il disaccoppiamento è possibile stabilire quali protoni sono accoppiati ad un certo protone. Questa informazione si ricava oggi più facilmente dall'esperimento NMR bidimensionale COSY.
BrBrooaaddbbaanndd pprroottoonn ddeeccoouupplleedd ((ddiissaaccccooppppiiaammeennttoo aa bbaannddaa llaarrggaa))
Negli spettri 13C NMR di routine viene applicato un segnale continuo con una banda larga di frequenze radio che eccita tutti i nuclei 1H e cancella così tutti gli accoppiamenti dovuti all’interazione 1H/13C. Per cui ogni carbonio genererà un linea singola a meno di eventuali eteronuclei o isotopi dell’idrogeno magneticamente attivi, quali 2H, 19F etc etc., che continueranno ad accoppiare con il carbonio.
OfOfff--rreessoonnaannccee ddeeccoouupplliinngg ((ddiissaaccccooppppiiaammeennttoo ppaarrzziiaallee))
Sequenza che permette di mantenere solo gli accoppiamenti 13C-1H che avvengono attraverso un solo legame anche se con valori della costante di accoppiamento 1JC-H minori del reale. In tali condizioni il tipo di segnale di ogni C dipende dal numero di protoni ad
esso legati in accordo con la regola n+1. Per cui un CH3 darà un quartetto (q), un CH2 un tripletto (t), un CH un doppietto (d) e un C quaternario un singoletto (s).
Effetto nucleare Overhauser (Nuclear Overhauser Effect, NOE)
L’effetto NOE è una variazione dell’intensità del segnale di un nucleo (es protone o carbonio) in seguito all’irradiazione di un protone che si trova spazialmente vicino al nucleo osservato.
Nel disaccoppiamento a banda larga si applica una forte sorgente di radiofrequenza che satura i livelli dei protoni e che, oltre a eliminare la struttura fine del 13C provoca un aumento dell’intensità dei segnali dei 13C spazialmente vicini a protoni
Nel caso di atomi di carbonio non legati a protoni l’incremento è praticamente zero
Per molecole organiche di dimensioni medio-piccole il rilassamento dipolare 13C-1H relativo agli atomi di carbonio legati a protoni è molto efficiente e può produrre incrementi dei segnali prossimi al 200%.
L’effetto NOE è molto utile perché aumenta la sensibilità dell’esperimento 13C, anche se, allo stesso tempo, contribuisce a rendere senza significato l’integrazione dei picchi.
DeDeuutteerriioo ((DD,, 22HH))
Composti marcati con deuterio vengono utilizzati per vari scopi nella spettroscopia NMR:
es nello spettro 1H NMR la marcatura può essere usata per identificare un particolare gruppo, semplificare lo spettro 1H di una sostanza, avere solventi “trasparenti” che non interferiscano con la misura e su cui fare il lock. …
Solventi per l'NMR
Il solvente più usato è il CDCl3, comuni sono anche D2O, CD3OD, C6D6, etc. Anche i solventi deuterati contengono una piccola percentuale di atomi di H, e danno luogo ad un segnale residuo (cfr tabelle nell’articolo allegato: J. Org. Chem. 1997, 62, 7153)
Il segnale residuo è sempre nella stessa posizione (per CDCl3 a δ 7.26 ppm), e può essere usato per calibrare lo spettro.
Altri solventi utilizzati sono:
δ del picco residuo del solvente
CDCl30 (CD3)2SO (d6-DMSO)
C6D60 CD3OD0 D2O0
1H NMR 7.260v 2.500v 7.160 3.310 4.790
13C NMR 77.000v 39.5000 128.100 49.000
Omogeneità del campo magnetico esterno
Negli spettri NMR i segnali possono e “devono” essere molto stretti (< 1Hz).
Poiché la frequenza di risonanza dipende dal campo magnetico, il campo magnetico deve essere estremamente uniforme in tutto il volume del campione e costante nel tempo specie nel caso di esperimenti lunghi:
Se il campo magnetico non è perfettamente uniforme e costante i segnali si slargano. in pratica occorre che la frequenza di risonanza non cambi nemmeno di 1 Hz (su centinaia di MHz!!).
Il magnete superconduttore non riesce da solo a produrre un campo magnetico così omogeneo.
Si usano allora delle bobine (anche più di 20) posizionate intorno al campione che producono dei piccoli campi magnetici non omogenei, e che possono essere regolate in modo da compensare ogni disomogeneità del campo magnetico. Questa regolazione si chiama shimming, e deve essere fatta per ogni singolo campione.
Per mantenere il campo magnetico costante nel tempo si usa .un sistema di lock a deuterio che sfrutta il deuterio dei solventi deuterati.
Durante l’acquisizione di uno spettro, oltre ad irraggiare alla frequenza di risonanza del nucleo di interesse, si irraggia il campione alla frequenza di risonanza del deuterio: per piccole fluttuazioni del campo magnetico, il deuterio va fuori risonanza, in tal caso lo strumento aggiusta l’intensità del campo in modo da riportare il deuterio in risonanza
Accoppiamenti con il deuterio (D, 2H) Il deuterio è un nucleo magneticamente attivo.
Ricordiamo che:
Numero quantico magnetico: m = 2I+1
m corrisponde al numero totale di spin che un nucleo con spin I può assumere Numero quantico di spin nucleare di 1H: IH = 1/2
molteplicità del segnale del nucleo accoppiato al 1H: n+1 Numero quantico di spin nucleare di 2H: ID = 1 molteplicità del segnale del nucleo accoppiato al D: 2n+1
n 0 molteplicità 0 intensità relative I = 1/2
molteplicità0 intensità relative
I = 1
0 s 1 s 1
1 d 1001 t 1001001
2 t 1002001 q 1002003002001
3 q 1003003001 settetto 1003006007006003001 4 quint 1004006004001 nonetto 1004010016019016010004001
JH-D ≈ 1-2 Hz JC-D ≈ 20-25 Hz
Per cui negli spettri 13C NMR registrati in CDCl3 il tripletto di intensità 1:1:1 che risuona a circa 77 ppm è il segnale dovuto al C del CDCl3 che accoppia con l’atomo di deuterio. Tale segnale NON va riportato nella descrizione dello spettro.
Conseguenze del disaccoppiamento protonico a banda larga:
collasso dei multipletti in singoletti guadagno in sensibilità
interpretazione più semplice (un segnale per ogni tipo di C presente nella molecola a parte coincidenze fortuite di chemical shift)
perdita di informazioni associata all’accoppiamento 1H-13C che possono però essere recuperate con opportune sequenze di acquisizione dello spettro
13C (es spettro disaccoppiato off-resonance, DEPT, APT, spettro bidimensionali come HMQC)
Effetto Overhauser nucleare (NOE)
aumento di intensità dei C legati o spazialmente vicini a idrogeni INTENSITA’ RELATIVE DEI SEGNALI NON PROPORZIONALI AL NUMERO DI NUCLEI CHE LI GENERANO
test del protone legato (APT, Attached Proton Test):
Impostando opportunamente i valori di alcuni intervalli nella sequenza d'impulso, è
possibile registrare gli atomi di carbonio quaternari e metilenici con fase positiva e i metili e i metini con fase negativa.
Poiché il segno della fase è arbitrario, l'ordine può essere invertito.
C ↓ (CHx5) ↑ CD ↓ ↓ CH2 ↑CH3 13C NMR (50 MHz, CDCl3) = δ 144.2 (s, Cipso), 128.4 (d, 2 C; Cmeta), 127.9 (d, 2 C; Corto), 125.7 (d, Cpara), 29.0 (t, CH2), 15.6 (q, CH3) ppm.
Descrizione dello spettro 13C NMR
13C NMR: Specificare a che frequenza è stato registrato lo spettro ed il solvente utilizzato.
Riportare nell’ordine:
i chemical shift approssimati alla prima cifra decimale,
se noto indicare che molteplicità avrebbe il segnale nello spettro disaccoppiato parziale (off-resonance decoupling)(s, d, t, q)
Se il segnale è dovuto alla risonanza di n carboni equivalenti (con n>1) scrivere nC parentesi.
e quando possibile
l’assegnazione indicando in modo univoco quali atomi di carbonio della molecola risuonano a quella data frequenza.
Far precedere il primo chemical shift dal simbolo δ e concludere la descrizione con ppm.
13C NMR (50 MHz, CDCl3) = δ 66.0 (t, 2 C; CH2), 15.4 (q, 2 C; CH3) ppm.
13C NMR (50 MHz, CDCl3) = δ 32.1 (t, 2 C; C-3 e C-5), 29.3 (t, C-4), 22.9 (t, 2 C; C-2 e C- 6), 14.1 (q, 2 C; C-1 e C-7) ppm.
13C NMR (50 MHz, CDCl3) = δ 149.9 (s, 3 C; Cipso), 119.4 (d, 3 C; CH), 35.0 (s, 3 C; CMe3), 31.6 (q, 9 C; CH3) ppm.
13C NMR (50 MHz, CDCl3) = δ 143.4 (d, 4 C; =C), 75.3 (d, 2 C; CH2CH), 50.3 (t, CH2) ppm.
EsEseemmppii didi vvaalloorrii ddii cchheemmicicaall sshhiiftft ee lolorroo ccaallccoolloo aapppprroossssiimmaattoo Alcani: δ ≤ 60 ppm
