Anidride solforosa. (

(1)

Anidride solforosa

1 (www.civiltadelbere.com)

(2)

Anidride solforosa

SO₂ libera

SO₂ combinata

SO₂attiva

bisolfito

Combinazioni instabili (zuccheri, acidi uronici, acidi chetonici, ecc)

Combinazioni stabile (aldeide)

2

aggiunta di SO₂ dopo

omogeneizzazione

costituenti del vino più o meno avidi di SO₂

SO₂libera SO₂combinata

SO₂totale = SO₂libera + SO₂combinata L’anidride solforosa nel vino

Nel vino l’anidride solforosa è presente nelle due forme libera e totale. La forma libera presenti nel vino sono: H₂SO₃ o solforosa molecolare (frazione non dissociata), HSO₃^- o ione bisolfito (frazione semidissociata); SO₃^-- o ione solfito (frazione completamente dissociata). La forma più attiva contro i microrganismi è la H₂SO₃. Lo ione bisolfito è la forma più rappresentativa nel vino, ma si lega facilmente ad acetaldeide, glucosio, chinoni, antocianine e cheto-acidi. La frazione di anidride solforosa totale è la somma delle due frazioni SO₂ libera e SO₂ combinata. Infatti la SO₂ forma dei legami con il gruppo carbonilico dei costituenti del vino passando alla forma combinata e perdendo quasi totalmente la sua azione antimicrobica.

(3)

3

le principali forme di anidride solforosa libera e le loro proprietà

Il SO₂ può essere aggiunto come antimicrobico nel vino e nel mosto sottoforma di diversi prodotti commerciali: i sali più comuni sono il bisolfito di potassio ed il metabisolfito di potassio rispettivamente con il 53,0% e con il 57,5% di anidride solforosa.

Proprietà SO₂ (molecolare) HSO₃^-(libera) R-SO₃^- (combinata)

Antilievito +++ + -

Antibatterica +++ + +

Antiossidante +++ +++ -

Antiossidasica +++ +++ -

Odore Piccante Nessuno Nessuno

Sapore Piccante Salato, amaro Nessuno

Giacomo cresta. Alternative all’uso dell’anidride solforosa. Anno accademico 2016/2017.

Alma Mater Studiorum, Università di Bologna Campus di Cesena Scuola di Agraria e Medicina Veterinaria. corso di laurea in Scienze e Tecnologie Alimentari

(4)

Chinone del GRP2

Acido

caftarico Acido

deidroascorbico

Acido ascorbico

Flavanoli

Chinoni

Chinone dell’acido caftarico

Acido caftarico

GRP

Chinone del GRP

PFO*

O₂ PFO*

O2

GSH

Laccasi O₂

GSH GRP2

Prodotti di condensazione

PFO*: Tirosinasi e/o Laccasi

Effetto dell’anidride solforosa sul colore delle antocianine

metabilsolfito di sodio

Reazioni reversibili

HSO₃^-

4

Gli effetti dell'SO₂ sono molteplici:

- effetto antiossidasica: inibisce le attività della polifenol ossidasi - effetto antiossidante: neutralizza il

H₂O₂

- effetto antisettica: contrasta la

proliferazione di diverse specie microbiche - effetto sul colore: favorisce l'estrazione dei pigmenti del vino.

(5)

5

Tipo di vino-Categorie come nel regolamento (CE) n 606/2009

Limiti di SO₂per il vino convenzionale come nel regolamento (CE) n 606/2009

Limiti di SO₂per il vino biologico 203/2012

Riduzione di SO₂nel vino biologico

Assoluto Relativo

Vini rossi (allegato I B-A)

Paragrafo 1a-zucchero residuo < 5g/L

150 mg/L 100 mg/L zucchero residuo < 2g/L 120 mg/mL zucchero residuo > 2g/L

-50 mg/mL -30 mg/mL

-33%

-20%

Vini rossi (allegato I B-A)

Paragrafo 2a-zucchero residuo > 5g/L

200 mg/mL 170 mg/mL -30 mg/mL -15%

Vini bianchi e rosé (allegato I B-A) Paragrafo 1b-zucchero residuo < 5g/L

200 mg/mL 150 mg/L zucchero residuo < 2g/L 170 mg/mL zucchero residuo > 2g/L e < 5g/L

-50 mg/mL -30 mg/mL

-25%

-15%

Vini bianchi e rosé (allegato I B-A) Paragrafo 2b-zucchero residuo > 5g/L

250 mg/mL 220 mg/mL -30 mg/mL -12%

Vini liquorosi (allegato I B-B) zucchero residuo < 5g/L

150 mg/mL 120 mg/mL -30 mg/mL -20%

Vini liquorosi (allegato I B-B) zucchero residuo > 5g/L

200 mg/mL 170 mg/mL -30 mg/mL -15%

Vini spumanti (allegato I B-C)

Paragrafo 1a –vini spumanti di qualità Paragrafo 1b –altri vini spumanti Paragrafo 2- condizioni meteorologiche

185 mg/mL 235 mg/mL +40 mg/mL

155 mg/mL 205 mg/mL

(la stessa CMO + 40 mg/mL)

-30 mg/mL -30 mg/mL

-16%

-13%

Legislazione europea

I dosaggi di SO₂ sono severamente regolamentati dalla legislazione europea (regolamenti CE n° 606/2009 e 479/2008). La stessa normativa prevede l´obbligo di scrivere in etichetta la dicitura “contiene solfiti”.

L´aggiunta di anidride solforosa nel vino è permessa dalla legislazione italiana per valori massimi che variano da 150 mg/L per i vini rossi a 200 mg/L per i vini bianchi e rosati.

(6)

6

Utilizzando dosi eccessive si possono avere:

- odore di SO₂

- odore di mercaptano (uova marce) - durezza del vino

- tossicità per il consumatore

Effetti indesiderati del biossido di zolfo sul vino

l´aggiunta sconsiderata di SO₂ va evitata non soltanto per il pericolo di incorrere in sanzioni economiche, ma anche perché provoca conseguenze sia a livello salutistico per i consumatori che riflessi negativi sulla qualità del prodotto.

L´aggiunta di solfiti ostacola la fermentazione del mosto ne risulta un allungamento del tempo di fermentazione.

(7)

7

La dosi giornaliera stabilita dall’ Organizzazione Mondiale per la Sanità (OMS) è di 0,7 mg di SO₂per kg di peso corporeo.

Un uomo di 75 kg ha una dose giornaliera ammissibile di 52,5 mg di SO₂ ed in teoria potrebbe bere nell´arco di 24 ore una bottiglia di un vino rosso di qualità, contenente al massimo 50 mg/litro di solforosa.

Tossicità del biossido di zolfo (SO₂) Il principale effetto negativo dell’anidride solforosa, in individui non affetti da ipersensibilità, avviene indirettamente a carico del metabolismo degli zuccheri (sviluppo del diabete) a causa dell´azione degradativa sulla tiamina (vitamina B1) e la conseguente carenza.

(8)

La determinazione della SO₂ si effettua utilizzando una titolazione acido-base oppure una titolazione redox.

Nella titolazione acido-base l’acido solforico formato viene dosato con una soluzione a titolo noto di NaOH. Questo metodo determina la SO₂ totale; la frazione libera viene estratta dal vino per trascinamento a freddo (10°C).

Nella titolazione redox la SO₂libera è dosata con titolazione iodometrica diretta:

H₂SO₃ + I₂  H₂SO₄ + 2HI

Si dosa quindi la SO₂ combinata dopo idrolisi alcalina e la SO₂ totale per somma delle due frazioni.

8

Vita in campagna 2/2013

(9)

9

(10)

Occorre evitare di agitare troppo per non disperdere la SO

₂

.

10

La determinazione dell'anidride solforosa con il metodo Ripper-Schmitt si basa sull'ossidazione dei solfiti (anidride solforosa) con lo iodio in presenza dell'indicatore «salda d'amido». Quando lo iodio non viene più neutralizzato dai solfiti presenti nel vino o mosto, la salda d'amido prende la colorazione blu-viola

(11)

Si effettua la lettura dello iodio consumato durante la titolazione guardando il livello raggiunto nella parte bassa del menisco, infine si eseguono i calcoli.

11

Metodo Ripper-Schmitt:

Per il calcolo dell'SO₂ sarà necessario applicare un coefficiente di moltiplicazione differente a seconda del titolo dello iodio utilizzato. La soluzione di iodio utilizzata è al 0,025N e la SO₂ totale viene calcolata:

SO₂ tot. mg/L = mL iodio 0,025N X 16 Se si utilizzano altre concentrazioni di iodio si impiegano i seguenti calcoli:

SO₂ tot. mg/L = ml iodio 0,01N x 6,4 SO₂ tot. mg/L = mi iodio 0,02N x 12,8 SO₂ tot. mg/L =ml iodio 0,016N x 10

La quantità di anidride solforosa libera consigliata va da 15 a 25 mg/L per i vini rossieda 20 a 30 mg/Lper i vini bianchi.

(12)

Ammine biogene

Sono presenti soprattutto negli

alimenti che hanno subito una

fermentazione ad opera di batteri

lattici.

(13)

13

per la formazione di ammine biogene sono necessarie:

- presenza di batteri decarbossilasi positivi - disponibilità di amminoacidi liberi

- condizioni ambientali favorevoli allo sviluppo microbico, alla sintesi e all’attività decarbossilasica

pH ottimali per la decarbossilazione compresi tra 5.0 e 6.5 (in relazione al tipo di decarbossilasi).

La temperatura ottimale per l’attività enzimatica è compresa tra 20° e 35° C.

La presenza di ossigeno inibiscono l’amino- biogenesi, ostacolando lo sviluppo batterico, mentre condizioni di anaerobiosi in alimenti fermentati sembrano favorire la sintesi di questi composti.

(14)

14

I batteri lattici utilizzano la decarbossilazione dell’istidina a istamina per generare una forza proton-motrice e conservare l’energia metabolica

Rosa d’ambrosio. Studio del profilo amminico in prodotti innovativi a base di thunnus thynnus. Anno accademico 2004/2007. Università degli studi di Napoli “Federico II” Facoltà di Medicina Veterinaria. Dottorato di ricerca in produzione e sanità degli alimenti di origine animale (xx ciclo). Modificato

His

Ist⁺ His

Ist⁺

H⁺

CO₂ alcalino

acido

Decarbossilasi

(Vit B6)

Quando le risorse energetiche si esauriscono, decresce la forza proton-motrice. In tale condizione i batteri assorbono l’istidina, insieme ad altri metabolici, per crescere e moltiplicarsi.

L’assorbimento intracellulare dell’istidina neutra avviene mediante un trasportatore che, dopo decarbossilazione dell’amminoacido, espelle l’istamina insieme ad una carica positiva.

La fuoriuscita di una carica positiva genera un potenziale di membrana e lo scambio istidina/istamina diventa un processo elettrogenico, che genera la forza proton- motrice e consente la conservazione dell’energia metabolica del batterio.

(15)

15

Istidina, tirosina, triptofano, lisina, fenilalanina e ornitina sono rispettivamente gli amminoacidi precursori delle ammine istamina, tiramina, triptamina, cadaverina, feniletilamina e putrescina. L’agmatina può essere prodotta attraverso il metabolismo dell’arginina, così come le poliammine, spermina e spermidina.

Oenococcus oeni, la specie più frequentemente responsabile della FML è capace di produrre AB con differenze qualitative e quantitative in funzione del ceppo considerato.

Lavinium dal 2000 la rivista di vino e cultura online

Ruolo dell’arginina nella sintesi delle ammine biogene

(16)

16

Un aminoacido può essere trasformato in una ammina biogena con la rimozione del suo gruppo carbossilico da parte degli enzimi decarbossilasi

La tossicità dell'istamina è l’effetto del suo legame ai recettori cellulari di membrana negli apparati respiratorio, cardiocircolatorio, gastroenterico, e del sistema immunitario.

www.psoriasimetodoapollo.com/istamina-quello-che-devi-sapere-parte-2/

Istamina

(17)

“è la dose che fa il veleno”

Paracelso

17

Individui sani dovrebbero essere in grado di gestire gli alimenti che contengono da 50 a 100 mg/kg di istamina, ma le persone con intolleranza all’istamina generalmente reagiscono a livelli molto più bassi.

I tipi di reazioni che si possono verificare dipendono dalla quantità di istamina e dalla zona del corpo è interessata.

www.psoriasimetodoapollo.com/istamina-quello-che-devi-sapere-parte-2/

(18)

Tratto respiratorio superiore

mitocondri

cervello e sistema nervoso

ammine biogene In circolo

disfunzione nella produzione di energia

sintomi neurologici

Sistema di difesa (contro Ab nel fegato e nelle pareti intestinali

Minori secrezioni Ridotta protezione

da microrganismi

Intestino tenue

amminoacidi Microrganismi

Ammine biogene

digestione

Proteine reflusso retronasale infiammatorio

Stress Virus

Adrenalina

Fattori inibenti i sistemi Di difesa (xenobiotici, stress, malattie, ecc.)

Alimenti

Infiammazione gastrica

Le ammine sono considerate composti mutageni/oncogeni, poiché o possono agire da precursori di composti capaci di formare nitrosammine o essere direttamente nitrosate in nitrosammine, composti ritenuti potenzialmente oncogeni in diverse specie animali e nell’uomo.

Il catabolismo delle AB avviene prevalentemente a livello intestinale e prevede reazioni ossidative catalizzate dai sistemi enzimatici monoammino-ossidasi (MAO) e diamminoossidasi (DAO).

Tesi di dottorato Dr.ssa Francesca Congiu. Studio della formazione di ammine biogene 18 e di altri composti azotati negli alimenti. Anno accademico 2012-2013. Università degli Studi di Cagliari. DOTTORATO DI RICERCA Tossicologia Ciclo XXVI

AB nel vino

Catabolismo delle amine

(19)

19

Detossificazione: La via catabolica delle AB è regolata dalle ossidasi

classificate come MAO

(monoamminoossidasi) e DAO (diamminoossidasi) catalizzanti la deamminazione delle AB con produzione di perossido di idrogeno.

Il tratto gastrointestinale è la fonte più importante di AB esogene.

Infatti, la maggiore attività del sistema di detossificazione da AB è stata riscontrata nel lume intestinale e nel fegato.

In condizioni fisiologiche si ritiene che la barriera enzimatica, localizzata nelle cellule epiteliali intestinali, svolga un ruolo protettivo contro il riassorbimento delle AB alimentari.

(20)

Perpetuini G, Tittarelli F, Battistelli N, Arfelli G, Suzzi G, Tofalo R. 2020. Biogenic Amines in20 Global Beverages. Food Chemistry, Function and Analysis No. 20 pp. 133-156.

Ammine biogene nel vino:

Nel vino ci sono due diverse fonti di AB:

le materie prime (spermidina e putrescina sono normali costituenti dell'uva) e i processi di fermentazione.

In generale, l'accumulo di AB nel vino è influenzato dalla presenza di precursori, dalla varietà dell’uva e dal suo grado di maturazione, dai trattamenti antifungini in vigna, dal clima, dal suolo, dalle pratiche di coltivazione (es. grado di irrigazione), dall'aggiunta di starter di fermentazione, dal contenuto alcolico, dal biossido di zolfo, dal pH, dalla temperatura, dalla contaminazione microbica nelle cantine e dal tempo di contatto di mosto e bucce.

In tabella vediamo il contenuto di AB nei vini prodotti mediante fermentazioni alcoliche spontanee e controllate.

La formazione delle AB è correlata alla presenza dei loro precursori amminoacidici liberi, alla presenza di microrganismi decarbossilasi-positivi e a determinate condizioni favorevoli alla loro crescita e alla loro attività di decarbossilazione.

(21)

21

I livelli medi delle diverse AB nel vino sono dell’ordine di qualche mg/L o di qualche decina di mg/L. Alti livelli di AB possono anche avere effetti negativi sulla qualità sensoriale del vino in quanto possono mascherare alcune note aromatiche: con

>100 mg/L si possono avere sentori metallici, di carne o putridi.

L’Organizzazione internazionale della vigna e del vino (OIV) non ha ancora stabilito limiti legali per queste sostanze ma alcuni Paesi Europei hanno fissato per la concentrazione di istamina in vino valori massimi ammissibili compresi tra 2 e 10 mg/L a seconda del Paese.

Paese Istamina

(mg/mL)

Austria 10

Belgio 5/6

Finlandia 5

Francia 8

Germania 2

Olanda 3

Svizzera* 10

* Limite rimosso nel 2010

Valori di istamina in vino raccomandati da alcuni paesi europei

Enologia «Mille vigne» di SANDRA TORRIANI. Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Verona e Microbion s.r.l., spin-off dell’Università di Verona

(22)

22

I vini prodotti con fermentazioni spontanee possono contenere livelli elevati di AB

I vini rossi contengano quantità superiori rispetto ai bianchi.

I limiti massimi posti dai vari paesi europei e la quantità di AB totali va oltre i 25 mg/mL

(23)

Perpetuini G, Tittarelli F, Battistelli N, Arfelli G, Suzzi G, Tofalo R. 2020. Biogenic Amines in 23 Global Beverages. Food Chemistry, Function and Analysis No. 20 pp. 133-156.

L'istamina è considerata la più importante causa di intolleranza al vino, la liberazione di istamina varia molto tra i ceppi ed è associata alla presenza dell'istidina decarbossilasi.

Nei vini frizzanti naturali, si conosce poco sulla presenza di AB dove, un possibile incremento potrebbe verificarsi per il fatto che il vino di partenza è soggetto ad una seconda fermentazione ad opera dei lieviti.

Normalmente i vini rossi presentano valori di AB più alti rispetto ai vini bianchi, questa differenza non è evidente negli spumanti naturali bianchi e rosé.

(24)

24

- la maturità fenolica delle uve, sommata alle annate calde, porta ad avere mosti e vini con pH elevati, (ambiente ideale per lo sviluppo di batteri indesiderati). La correzione del pH già nei mosti con l’acidificazione o la sottrazione di cationi con resine sono le soluzioni praticabili secondo le attuali normative.

- La tendenza a ridurre o a evitare l’uso dei solfiti in vinificazione e affinamento dei vini a vantaggio della salubrità finale del prodotto. L’uso di solfiti preserva da microrganismi.

- La pratica dell’inoculo di batteri selezionati, è tra le tecniche che meglio rispondono al corretto svolgimento della fermentazione malolattica minimizzando la produzione di AB.

- Anche l’aggiunta di lisozima appare efficace ad inibire le attività dei batteri lattici. Trattandosi di un derivato dell’uovo, la sua presenza nei vini va però segnalata in etichetta ai sensi del Reg. UE 1169/2011.

- Tra le tecniche sperimentali di controllo delle proliferazioni batteriche più promettenti, troviamo l’applicazione dei raggi UV-C, efficace sia su mosto sia su vino.

- Analisi microbiologica mirata dei batteri produttori di ammine, utilizzando metodi molecolari.

- La possibilità di contaminazione attraverso gli strumenti di cantina, in primis i contenitori in legno.

Tra le applicazioni innovative si sta diffondendo l’uso dell’ozono anche in forma gassosa.

I fattori predisponenti e soluzioni attualmente in uso:

(25)

25

Ammine biogene nella Birra:

Questa bevanda viene prodotta con: acqua, grani di cereali maltati (solitamente orzo e grano), luppoli e lieviti. I due principali lieviti sono S. cerevisiae (lievito Ale) S. pastorianus (lievito Lager).

Le AB nella birra si generano prevalentemente durante la fermentazione, ma possono essere prodotti dai microrganismi anche nell’orzo, nel malto, nel mosto e nei luppoli.

La presenza delle AB nella birra dipende da diversi fattori, ad esempio dalla qualità delle materie prime, dalle tecniche di birrificazione, dalla contaminazione microbica durante la birrificazione e dalle condizioni di conservazione, inoltre, si formano spesso durante l’ammostamento (mashing) e la bollitura del mosto.

La contaminazione del mosto con batteri in grado di svolgere la decarbossilazione degli amminoacidi, come i LAB, potrebbe incrementare la produzione delle AB.

Il contenuto in AB nella birra non è influenzato dal contenuto in alcol. Le birre analcoliche non presentano livelli di AB significativamente più bassi.

Infine è importante sottolineare che birre prodotte in diversi birrifici possono differire in termini di AB, suggerendo che i livelli di alcune AB possono costituire un indicatore di igiene nei processi di birrificazione.

(26)

26

Ammine biogene nel sidro:

Il sidro è ottenuto dalla spremitura di frutti, ad esempio dalle mele, e dal successivo processo di fermentazione.

Il processo di produzione del sidro consta di tre fasi: schiacciamento delle mele, spremitura e a seguire fermentazione. Quest’ultima fase include la classica fermentazione alcolica degli zuccheri in etanolo ad opera di ceppi di lievito e la FML svolta dai LAB che possono intervenire durante la maturazione.

Prima dell’imbottigliamento, il sidro non viene stabilizzato microbiologicamente, dunque si possono sviluppare LAB eterofermentativi, responsabili della formazione delle AB.

Gli studi condotti su sidri commerciali spagnoli e francesi, hanno rivelato la presenza di

AB in quasi il 90% dei prodotti analizzati con un'elevata prevalenza di tiramina, istamina, putrescina e cadaverina.

Nei sidri spagnoli, la concentrazione di AB è molto più alta rispetto a quelle rinvenute nei sidri canadesi, in cui sono stati riscontrate concentrazioni di putrescina pari a 0.2 mg/l mentre istamina e tiramina non sono state pervenute.

I bassi valori di AB nei sidri canadesi possono essere spiegati dal fatto che il succo di mela viene normalmente pastorizzato prima della fermentazione, così da eliminare il microbiota responsabile delle attività di decarbossilazione.

(27)

Ammine biogene nell’aceto:

l’aceto è una soluzione diluita di acido acetico largamente diffusa e prodotta da lungo tempo.

Gode di numerose proprietà: è antibatterico, riduce la pressione sanguigna, è antiossidante, previene le malattie cardiovascolari e migliora la risposta glicemica del sangue.

Gli aceti possono essere classificati in tre categorie:

- di origine vegetale (aceto di riso, aceto di cipolla e aceto di pomodoro);

- derivanti dalla frutta (aceto di sidro, aceto di mango e aceto di ananas);

- di origine animale (aceto di miele, aceto di siero del latte).

In generale, la produzione di aceto richiede tre fasi: La prima è la saccarificazione dell’amido, seguita dalla fermentazione alcolica condotta dai lieviti e infine la fermentazione acetica, che è l’ossidazione dell’etanolo ad acido acetico da parte dei batteri acetici.

Sono disponibili pochi studi sulle AB nell’aceto, alcuni documentano che il contenuto totale di AB nell’aceto è più basso rispetto ai vini ed ha valori compresi tra 23,35 e 1445,2 μg/l.

Gli aceti di mele hanno una minore quantità totale di AB (circa 24 μg/l) probabilmente perché il sidro contiene una più bassa concentrazione di AB rispetto al vino.

Le principali AB rilevate sono putrescina e istamina, che raggiungono valori rispettivamente fino a 525 e 309 μg/l.

Questi dati indicano che la concentrazione delle AB nell’aceto è più bassa di quella nel vino, suggeriscono che le AB non sono prodotte durante la fermentazione acetica.

(28)

Ammine biogene nei distillati:

I distillati sono bevande alcoliche zuccherate altamente aromatizzate (15-30% alcool;

>10% zucchero) a base di alcol etilico (cognac, rum e whisky) o distillati neutri di origine agricola aromatizzati con frutti, creme, erbe, spezie, fiori o nocciole e imbottigliate con aggiunta di zucchero, miele, o sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio.

Il valore complessivo di ammine nei liquori è basso con valori compresi tra 0,168 mg/l e 4,665 mg/l.

I liquori al caffè hanno valori medi contenuti (2,117 mg/l) seguiti da liquori al miele (1,932 mg/l), liquori alla frutta (1,254 mg/l), e liquori alle erbe (1,015 mg/l).

I liquori fatti in casa hanno un contenuto significativamente più elevato rispetto ai liquori industriali, per i liquori alla frutta (1,824 mg/l vs 0,780 mg/l) e alle erbe (1,225 mg/l vs 0,663 mg/l).

(29)

29

È il tiolo intracellulare non proteico più abbondante presente negli eucarioti e in molti organismi procarioti.

(30)

Il glutatione è un tripeptide composto da L-glutammato, L-cisteina e glicina

La sua importanza biologica è legata alla presenza del gruppo sulfidrilico sul residuo della cisteina, che gli conferisce potere riducente e proprietà nucleofile.

La concentrazione di glutatione nelle uve è molto variabile di conseguenza, anche il contenuto di glutatione nel mosto è molto variabile.

I fattori che influenzano la presenza di glutatione nel mosto sono molti, come la tipologia di raccolta e la maturazione delle uve, l’esposizione all’ossigeno, l’attività tirosinasica, la macerazione pre-fermentativa con le bucce e la pressatura, inoltre il contenuto di GSH viene modificato dall’azione dei lieviti.

In Saccharomyces cerevisiae, il GSH è naturalmente presente in concentrazioni elevate, rappresentando più del 90% dei tioli a basso peso molecolare.

30

L-Glutammato L-Cisteina Glicina

Mezzetti F. E de vero L. La selezione di lieviti migliorati per la produzione di glutatione. VQ numero quattro - luglio duemila14

(31)

31

La via dello zolfo può essere suddivisa in tre parti:

- la via di assimilazione del solfato, - il ciclo del metile

- la sintesi della cisteina e del GSH.

FEMS Microbiol Rev, Volume 34, Issue 6, November 2010, Pages 925–951

Metabolismo dello zolfo e del GSH in Saccharomyces cerevisiae.

(32)

32 Industrie delle Bevande - XL (2011) agosto ANNO 40 - N. 234

Metabolismo dei solfati in Saccharomyces cerevisiae

(33)

La biosintesi del GSH nei lieviti: metabolismo dello zolfo e degli amminoacidi solforati metionina e cisteina

Permeasi

(SUL1 e SUL2)

Glutammato-Cisteina Ligasi

Glutatione Sintetasi

Mezzetti F. E de vero L. La selezione di lieviti migliorati per la produzione di glutatione.

VQ numero quattro - luglio duemila14

33

Il solfato entra nelle cellule per mezzo di un sistema di trasporto attivo ed è poi ridotto a solfuro via solfito il cui passaggio finale viene mediato dall’enzima solfito riduttasi

(34)

• nel primo, l’intermedio g-glutamilcisteina (γ-EC) è sintetizzato a partire da glutammato e cisteina attraverso l'enzima γ-glutamilcisteina sintetasi. Questa reazione è il fattore limitante nella sintesi del glutatione.

• Nel secondo, la glicina viene aggiunta al C-terminale della γ-glutamylcisteina tramite l'enzima glutatione sintetasi

L’attività dell’enzima γ-EC sintetasi è regolata mediante feedback negativo dal glutatione

Il glutatione viene sintetizzato da due passaggi ATP dipendenti:

Lieviti inattivi specifici per la vinificazione in bianco (Salmon JM, Du Toit W.)

Lallemand Enologia: Un mondo di soluzioni naturali per valorizzare i vostri vini / www.lallemandwine.com 34

(35)

Il glutatione in Saccharomyces cerevisiae

35

Il metabolismo del GSH è presente nelle cellule vegetali e animali attraverso il ciclo della g-glutamil composto da sei reazioni. Sembra che questo ciclo non sia completo in Sacharomyces. Il catabolismo del GSH potrebbe essere mediato solo dalla g- glutamiltranspeptidasi e dalla cisteinil glicina dipeptidasi.

La g-glutamiltranspeptidasi è l'unico enzima, attualmente caratterizzato nel lievito, che degrada il GSH. Questo enzima catalizza il trasferimento della frazione g- glutamil del GSH agli amminoacidi con il rilascio del L-glutammato dal GSH.

Michel J. Penninckx. An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts. FEMS Yeast Research 2 (2002) 295-305 tutte le diapo

(36)

Nel S. cerevisiae la g-glutamiltranspeptidasi è stata identificata come una proteina glicosilata legata alla membrana vacuolare. Anche la cisteinil glicina dipeptidasi è presente in S. cerevisiae ed è associata alla membrana vacuolare.

La biosintesi della g-glutamiltranspeptidasi è regolata almeno da due percorsi distinti. Lo ione ammonio, come l’azoto, reprime la transpeptidasi, mentre il livello enzimatico cellulare è più alto in presenza di una varietà di altre fonti di azoto, come amminoacidi o urea. Questo enzima è fortemente attivato da carenze di azoto e l'espressione genomica in S. cerevisiae risponde ai cambiamenti ambientali.

È stato suggerito che la g-glutamiltranspeptidasi potrebbe svolgere il ruolo di trasportatore di aminoacidi e potrebbe intervenire nella mobilitazione del GSH come fonte alternativa di zolfo e azoto durante la fame.

(37)

37

In Saccharomyces cerevisiae esistono due sistemi di trasporto GSH cineticamente distinguibili:

GSH-P1 è un sistema regolato e guidato dall’ATP e risponde alla richiesta di zolfo, mentre il GSH-P2 non è regolato.

Il Saccharomyces cerevisiae può usare metionina, omocisteina, cisteina o GSH come unica fonte di zolfo

Quando le cellule di S. cerevisiae sono totalmente prive di qualsiasi fonte esterna di zolfo, il GSH è utilizzato come fonte endogena di zolfo

Oltre alla biosintesi endogena, il GSH può anche essere assorbito dall'ambiente extracellulare. Ci sono specifici trasportatori che mediano l'assorbimento di GSH nei microrganismi, piante e tessuti animali.

(38)

38

Quando il S. cerevisiae ha carenze di azoto, più del 90% del GSH cellulare si sposta verso il vacuolo centrale e si accumula nello spazio vacuolare dove esercita un effetto di feedback sul proprio ingresso. Il GSH immagazzinato nel vacuolo viene ulteriormente degradato. Sembra che la g-glutamiltranspeptidasi e una L- cisteinil glicina dipeptidasi catalizzino l'idrolisi completa di GSH prima del rilascio dei suoi amminoacidi costitutivi, L-Glu, Lcys, e Gly, nel citosol. Questo meccanismo può concedere al lievito «affamato» di utilizzare gli aminoacidi costituenti il GSH come fonte di azoto per compire la propria crescita.

(39)

SH HS

S S

glutatione reduttasi

NADP⁺ NADPH + H⁺

2H₂O₂ 2H₂O + O₂

Lo stato redox del Glutatione, ovvero l’alternarsi della forma ossidata (GS-SG) e di quella ridotta (GSH) è un indicatore per definire lo stato redox della cellula

(40)

40

Per sostenere il ciclo redox del GSH/GSSG indispensabile per la rimozione dei perossidi è necessario mantenere costante il livello di NADPH

Citoplasma: via dei pentosi fosfati

la catalisi dell’enzima G6PDH è la prima reazione che genera il NADPH e fornisce un potere riducente per la sintesi degli acidi grassi e lipidi così come la riduzione del glutatione

necessario per la

disintossicazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS).

Glucosio 6-fosfato → 6-fosfo-D-glucono-d-lattone GPDH

NADP⁺ NADPH + H⁺

Bertels, L.-K.; Fernández Murillo, L.; Heinisch, J.J.

The Pentose Phosphate Pathway in Yeasts–More Than a Poor Cousin of Glycolysis. Biomolecules 2021, 11, 725

(41)

41

Il deficit genetico di G6PDH si manifesta quando ci sono condizioni di stress ossidativo e non si produce abbastanza NADPH per mantenere il glutatione nel suo stato ridotto.

Lo stress ossidativo si verifica quando le cellule sono esposte ad alti livelli di ROS come i perossidi (H₂O₂), idroperossidi (ROOH) e l'anione superossido (O₂^●-).

Il GSH svolge un ruolo importante nella risposta allo stress ossidativo, in particolare per i ROOH come il cumene idroperossido, t-butil idroperossido o idroperossido lipidico endogeno (LOOH) generato nelle membrane biologiche dagli acidi grassi insaturi.

La glutatione perossidasi (GPx) è un enzima chiave nei meccanismi di difesa contro gli idroperossidi:

2 GSH + ROOH → GSSG + H₂O + ROH

In Saccharomyces cerevisiae esistono tre GPx, denominate Gpx1p, Gpx2p e Gpx3p

La GPX1 è indotta dalla richiesta di glucosio, la GPX2 è indotta da stress ossidativo, mentre la GPX3 è costitutiva. Apparentemente Gpx3 è la principale GPX che elimina i perossidi nel lievito.

(42)

È un forte antiossidante, intervenire inibendo l’azione di metaboliti tossici o di scarto che vengono prodotti in continuazione durante i normali processi metabolici.

È implicato in molti meccanismi di difesa contro gli stress ambientali durante la fermentazione alcolica, quali il pH basso, la carenza di nutrienti, lo shock da temperatura e da stress osmotico dovuto alla presenza di un’elevata concentrazione zuccherina, lo stress ossidativo e da prodotti tossici derivanti dalla fermentazione stessa.

l'interazione di GSH con sistemi biochimici cellulari

An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts, Michel J. Penninckx. FEMS Yeast Research 2 (2002) 295-305 42

(43)

43

Struttura del glutatione e sua reazione con i chinoni che derivano dall’ossidazione dei polifenoli

Incidenza della nutrizione azotata di un vigneto rispetto al tenore in GSH in mosti di uve bianche

Glutatione (GSH)

Polimerizzazione (casse bruna)

GRP₁

(44)

Il glutatione è presente in quantità importanti già nell’acino d’uva. I suoi meccanismi di accumulo nell’uva sono a tutt’oggi poco conosciuti. Sembra che l’alimentazione azotata ed idrica della pianta intervengano in modo significativo.

I mosti carenti in azoto contengano sistematicamente minor quantità di glutatione.

Nel mosto bianco è presente nella sua forma ridotta, il tenore riscontrato nei mosti varia da qualche mg fino ad una ventina di mg/L; questi valori, anche se lontani da quelli riscontrati nelle uve (2 – 300 mg/L) non sono da ritenersi trascurabili.

(45)

Il glutatione ridotto svolge

numerose funzioni nel mosto e nel vino

L’uva rappresenta la prima fonte potenziale del GSH la cui concentrazione nel succo può superare 100 mg/kg in relazione alla cultivar, alle condizioni ambientali e alle pratiche di coltivazione.

La quantità di GSH nel mosto è compresa tra 10 e 20 mg/L ed è influenzata dall’esposizione all’ossigeno e dall’attività ossidasica.

• Riduce gli o-chinoni prodotti dall’azione delle polifenolo ossidasi responsabili del colore bruno dei mosti e dei vini bianchi.

• Il GSH esercita un effetto protettivo nei confronti degli aromi tiolici.

• Il GSH rallenta la formazione del (3-idrossi-4,5-dimetil-2(5H) furanone) (sotolone) responsabile del difetto olfattivo caratteristico dell’invecchiamento atipico dei vini bianchi.

Fracassetti et al., Evoluzione del glutatione durante la vinificazione. Www.Infowine.Com – rivista internet di viticoltura 45

ed enologia, 2011, n. 11/2

(46)

Rivista internet tecnica del vino, 2003, n7 46

È stato dimostrato che il contenuto di GSH oscilla durante la fermentazione alcolica a seconda del ceppo di lievito e del contenuto di GSH iniziale del succo.

I livelli di glutatione nel vino vanno da valori non rilevabili a 70 mg/L, con una variabilità relativamente alta. Queste concentrazioni diminuiscono durante la conservazione e l'affinamento del vino. Il glutatione che rappresenta più del 95 % del pool intracellulare dei tioli a basso peso molecolare nelle cellule di lievito è indispensabile per la loro moltiplicazione.

(47)

la scelta del ceppo adeguato di Saccharomyces cerevisiae può influenzare positivamente il livello di GSH, che costituisce da 0,5% a 1% del peso secco della cellula.

Il rilascio di GSH nel vino è correlato alle condizioni di crescita del lievito in modo particolare alla carenza di azoto nel corso della fermentazione alcolica.

Nei mosti carenti in azoto (concentrazioni inferiori a 160 mg/L) il tenore in GSH risulta più basso.

47

C. Charpentier. 6. Ageing on lees (sur lies) and the use of speciality inactive yeasts during wine fermentation. Université de Bourgogne, France. Woodhead Publishing Limited, 2010

(qualità della schiuma)

(esaltatori di sapidità)

(aumento della sensazione delicata al palato) (qualità della schiuma)

(precursori dell'aroma) (dolce e amaro)

(qualità della schiuma e attività enzimatica)

Composti rilasciati durante l'autolisi