Indice
RIASSUNTO
I-IIIINTRODUZIONE
11 FARMACOGENOMICA DEI TUMORI DELLA VESCICA 1 1.1 Classificazione e stadiazione anatomo-patologica e clinica 1
1.2 Terapia 4
1.2.1 Studi clinici con monoterapia 4 1.2.2 Studi clinici con associazioni polichemioterapiche 6 1.3 Farmacogenetica e farmacogenomica 7 1.3.1 Determinanti genetici della chemiosensibilità nelle neoplasie 10 1.4 Applicazione della genomica alla ricerca medica 13 1.4.1 Analisi dell'espressione genica con PCR quantitativa 13 1.4.2 Ideazione di protocolli chemioterapici su base genetica 18
2 GEMCITABINA 19
2.1 Caratteristiche generali 19 2.2 Meccanismo d’azione 20 2.3 Determinanti molecolari dell’azione della gemcitabina 22 2.3.1 Ruolo dei trasportatori 24 2.3.2 Ruolo degli enzimi coinvolti nel metabolismo 26 2.3.2.1 Deossicitidina chinasi 26 2.3.2.2 Endo-5’-nucleotidasi 29 2.3.2.3 Citidina deaminasi 31 2.3.3 Inibizione della ribonucleotide reduttasi 33 2.3.4 Modulazione del ciclo cellulare 35 2.3.5 Induzione di apoptosi 37 2.4 Studi in vitro 41 2.4.1 Studi in monoterapia 41 2.4.2 Studi in associazione 43 2.4.3 Studi dell'associazione gemcitabina-pemetrexed 44
3 PEMETREXED 46 3.1 Caratteristiche generali 46 3.2 Meccanismo d’azione 47 3.3 Determinanti molecolari dell’azione del pemetrexed 49
3.3.1 Inibizione di enzimi del ciclo dei folati e della sintesi de novo delle purine
49
3.3.1.1 Timidilato sintasi 50 3.3.1.2 Diidrofolato reduttasi 53 3.3.1.3 Glicinamide ribonucleotide formiltransferasi 55 3.3.2 Poliglutammazione ad opera della folilpoliglutammato sintetasi 57 3.3.3 Modulazione del ciclo cellulare 59 3.3.4 Induzione di apoptosi 60 3.4 Studi in vitro 61 3.4.1 Studi in monoterapia 61 3.4.2 Studi in associazione 62
MATERIALI E METODI
64 4 STUDI IN VITRO 64 4.1 Linee cellulari tumorali di vescica T24 e J82 64 4.2 Analisi della citotossicità di gemcitabina e pemetrexed 64 4.3 Studiodell’interazione farmacologica tra gemcitabina e pemetrexed 66 4.4 Studio citofluorimetrico della modulazione del ciclo cellulare indotta dagemcitabina e pemetrexed
67
4.5 Analisi dell’apoptosi 68 4.5.1 Analisi immunoenzimatica di AKT 68 4.5.2 Valutazione dell’indice apoptotico con microscopia a fluorescenza 70 4.6 Valutazione del ruolo degli enzimi coinvolti nel meccanismo d’azione d’
azione e nel trasporto di gemcitabina
71
4.7 Analisi dell’espressione genica dei determinanti molecolari del
meccanismo d’azione di gemcitabina e pemetrexed nelle linee cellulari
71
4.7.1 Reazione di retrotrascrizione dell’RNA in cDNA 71 4.7.2 Reazione di amplificazione a catena della polimerasi (PCR) 72 4.7.3 Disegno ed ottimizzazione dei primers 73
4.7.4 Validazione e calibrazione della metodica di PCR quantitativa 77 4.7.5 Valutazione quantitativa dell'espressione genica 78 5 STUDI EX VIVO 78
5.1 Analisi dell’espressione genica degli enzimi del meccanismo d'azione di gemcitabina e pemetrexed in campioni tumorali di vescica
78
RISULTATI
806 STUDI IN VITRO 80 6.1 Citotossicità di gemcitabina e pemetrexed 80 6.2 Interazione farmacologica tra gemcitabina e pemetrexed 82 6.3 Modulazione del ciclo cellulare indotta da gemcitabina e pemetrexed 83 6.4 Inibizione di AKT indotta da gemcitabina e pemetrexed 85 6.5 Indice apoptotico di gemcitabina, pemetrexed e delle combinazioni 87 6.6 Citotossicità della gemcitabina in presenza di deossicitidina, dipiridamole
e NBMPR
88
6.7 Ottimizzazione dei primers per PCR 89 6.8 Validazione della PCR quantitativa 90 6.9 Espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione
di gemcitabina e pemetrexed nelle linee cellulari T24 e J82
93
7 STUDI EX VIVO 95
7.1 Caratteristiche dei pazienti 95 7.2 Espressione genica dei determinanti molecolari del meccanismo d'azione
di gemcitabina in campioni tumorali di vescica
95
7.3 Correlazione tra l’espressione e la risposta al trattamento chemioterapico 97
