LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Paulius Gibieža
TARPINIO KŪNELIO PAVELDĖJIMAS,
DEGRADACIJA IR FUNKCIJOS
Daktaro disertacija Gamtos mokslai, biofizika (N 011)
Disertacija rengta 2014–2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų laborato-rijoje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Rytis Prekeris (Kolorado universitetas, JAV, gamtos mokslai, biofizika – N 011).
Konsultantas
prof. dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lietuvos sveikatos mokslų uni-versitetas, gamtos mokslai, biofizika – N 011).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto biofizikos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkas
dr. Gytis Baranauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biofizika – N 011).
Nariai:
prof. dr. Artūras Kašauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biochemija – N 004);
prof. dr. Aidas Alaburda (Vilniaus universitetas, gamtos mokslai, bio-fizika – N 011);
prof. dr. Rimantas Daugelavičius (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biochemija – N 004);
prof. dr. Gintautas Grabauskas (Mičigano universitetas, JAV, gamtos mokslai, biofizika – N 011).
Disertacija ginama viešame biofizikos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. birželio 26 d. 14 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kar-diologijos instituto posėdžių salėje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES
MEDICAL ACADEMY
Paulius Gibieža
MIDBODY INHERITANCE,
DEGRADATION AND FUNCTIONS
Doctoral Dissertation Natural Sciences, Biophysics (N 011)
Dissertation has been prepared at the Institute of Cardiology of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2014–2019.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Rytis Prekeris (University of Colorado, USA, Natural Sciences, Biophysics – N 011).
Consultant
Prof. Dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biophysics – N 011).
Dissertation is defended at the Biophysics Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson
Dr. Gytis Baranauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biophysics – N 011).
Members:
Prof. Dr. Artūras Kašauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biochemistry – N 004);
Prof. Dr. Aidas Alaburda (Vilnius University, Natural Sciences, Biophysics – N 011);
Prof. Dr. Rimantas Daugelavičius (Vytautas Magnus University, Natural Sciences, Biochemistry – N 004);
Prof. Dr. Gintautas Grabauskas (University of Michigan, USA, Natural Sciences, Biophysics – N 011).
Dissertation is defended at the open session of the Biophysics Research Council at 2 pm on 26th of June, 2019, at the Auditorium of Institute of Cardiology, Lithuanian University of Health Sciences.
5
TURINYS
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI ... 7
ĮVADAS... 9
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. MB susiformavimas vėlyvosios citokinezės metu ... 13
1.2. MB paveldėjimo mechanizmai ... 15
1.3. Citokinezė ir jos metu vykstantys citoskeleto pokyčiai ląstelėje ... 17
1.4. Endosominių membranų transporto reguliavimas į tarpląstelinį tiltelį... 17
1.5. Tarpląstelinio tiltelio nukirpimas ... 20
1.6. MB kaupimasis ląstelėje ... 22
1.7. MB degradacija ... 23
1.8. MB skatinamas ląstelių onkogeniškumas... 24
1.9. Kitos MB funkcijos ... 25
2. TYRIMŲ METODIKA... 26
2.1. Tyrimų metodika panaudota tyrimų 3.1–3.4 skyriuose rezultatams gauti ... 26
2.1.1. Ląstelių kultūros ... 26
2.1.2. Minkšto agaro testas ... 26
2.1.3. Naviko kamieninių ląstelių analizė ... 27
2.1.4. Sferoidų formavimo tyrimas ... 27
2.1.5. Antikūnai ir plazmidės ... 28
2.1.6. Imunofluorescencija ... 28
2.1.7. Ilgalaikis izoliacinės membranos formavimosi registravimas .... 28
2.1.8. 3D invadopodijų formavimo tyrimas ... 29
2.1.9. RNR izoliavimas ir kiekybinė polimerazinė grandininė reakcija ... 29
2.1.10. Statistinė duomenų analizė ... 30
2.2. Tyrimų metodika panaudota tyrimų 3.5–3.8 skyriuose rezultatams gauti ... 30
2.2.1. Ląstelių kultūros ... 30
2.2.2. Daugiabranduolių ląstelių tyrimas ... 31
2.2.3. Tekmės citometrija ir ląstelių rūšiavimas ... 31
2.2.4. Ląstelių dauginimosi tyrimas ... 32
2.2.5. RNR izoliavimas ir kiekybinė PGR ... 32
2.2.6. RNR sekvenavimas ... 33
2.2.7. Bioinformacinė transkriptomos analizė ... 33
6
2.2.9. MB gryninimas ir MB „maitinimas“ kitoms ląstelėms ... 34
2.2.10. Proteominė išgrynintų MB analizė ... 34
2.2.11. Imunofluorescencija ... 35
2.2.12. Ilgalaikis ląstelių dinamikos registravimas ... 35
2.2.13. Tomografijos tyrimas ... 35
2.2.14. Koreliacinės šviesos ir elektronų mikroskopija ... 36
2.2.15. Augimo minkštame agare testas ... 36
2.2.16. Statistinė duomenų analizė ... 36
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 37
3.1. FYCO1 yra reikalingas degraduojančios ir LC3 turinčios membranos susidarymui aplink pomitozinį MB ... 37
3.2. FYCO1 kontroliuoja nuo LC3 priklausančią MB degradaciją ... 41
3.3. FYCO1 išveiklinimo poveikis navikinių ląstelių onkogeniškumui, kamieniškumui ir invazyvumui ... 44
3.4. FYCO1 kontroliuojamos degradacijos modelis ... 48
3.5. MB sudarantys baltymai ir jų funkcijos ląstelės dalijimesi ... 49
3.6. MB akumuliacijos įtaka ląstelių dauginimuisi ir onkogeniniam potencialui ... 55
3.7. Aktino ataugos vykdo ekstraląstelinio MB internalizaciją ... 59
7
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI
ArhGAP11b – Rho GTPazes aktyvuojantis baltymas 11b
B911 ir B931 – suragėjusios karcinomos ląstelės, išvestos iš genetiškai modifikuotos pelės su dvejomis mutacijomis (Kras aktyvuojanti mutacija ir Smad4 delecija)
B911-KD ir B931-KD – dvi skirtingos pėlės suragėjusios karcinomos ląstelių linijos su išveiklintu FYCO1 baltymu
bFGF – paprastas fibroblastų augimo faktorius (angl. basic fibroblast growth factor)
CLEM – koreliacinės šviesos ir elektronų mikroskopija (angl. Correlative Light and Electron Microscopy)
CD63 – žymuo žymintis lizosomas ir vėlyvasias endosomas CenpE – su centrosomomis susijės baltymas E
CCN1 – ciklino A2 baltymas
cDNR – koduojanti DNR
Cdca7 – su ląstelės dalijimosi ciklu asocijuojamas baltymas 7 (angl. cell division cycle associated 7 protein)
crRNR – CRISPR RNR (angl. CRISPR RNA) CQ – chlorokvinas (angl. chloroquine)
EGF – epiderminis augimo faktorius (angl. epidermal growth factor) EDIL3 – epiderminio augimo faktoriaus integrino ligandas
FACS – flourescencijos aktyvuojamas ląstelių rūšiavimas (angl. flourescence activated cell sorting)
FYCO1 – FYVE seką ir spiralinės spiralės domeną turintis baltymas 1 (angl. FYVE and coiled-coil domain-containing protein 1) GST – glutationo S-transferazė (angl. glutathione S-transferase) GFP – žaliai fluorescuojantis baltymas (angl. green fluorescent
protein)
HeLa – ląstelių linija išvesta iš Henrietta Lacks gimdos kaklelio naviko
HeLa-Rab14-KD1/KD2 – HeLa ląstelių linijos su išveiklintu Rab14 baltymu, naudojant skirtingas shRNR
Ki67 – antigenas Ki67
LC3 – su mikrotubulėmis susijusio autofagijos baltymo lengvoji grandinė (angl. microtubule-associated protein light chain 3), žyminti autofagosomas
LC3-I – citozolinė LC3 forma
8
Lamp1 – žymuo žymintis lizosomas (angl. lysosomal - associated membrane protein 1)
MB – tarpinis kūnelis (angl. midbody)
MKLP1 – mitozinis į kineziną panašus baltymas 1 (angl. mitotic kinesin-like protein 1)
MDCK – Madin Darby šuns inkstų ląstelės (angl. Madin Darby Canine Kidney)
MFG-E8 – pieno riebalų epiderminio augimo faktoriaus 8 baltymas mRNAseq – informacinės RNR sekvenavimas (angl. messenger RNA
sequencing)
NSP – centrinė populiacija (angl. non-side population) PBS – buferinis fosfato fiziologinis druskos tirpalas (angl.
phosphate buffered saline)
PS – fosfatidilserinas (angl. phosphatidylserine) Plk1 – serino/treonino baltymo kinazė
SIM – struktūrinis iliuminacinis mikroskopas (angl. structured illumination microscopy)
SCC – plokščialąstelinio naviko ląstelės (angl. squamous cell carcinoma)
SP – kraštinė populiacija (angl. side population)
shRNR – maža segtuko formos ribonukleino rūgštis (angl. small hairpin ribonucleic acid)
siRNR – maža blokuojanti RNR TT – tarpląstelinis tiltelis
TEM – elektronų perdavimo mikroskopas (angl. Transmission Electron Microscope)
9
ĮVADAS
Citokinezė – paskutinis ląstelės dalijimosi etapas, kurio metu įvyksta fizinis tarpląstelinio tiltelio (TT), jungiančio naujai susiformavusias duk-terines ląsteles, nukirpimas. Citokinezės metu centrinės verpstės mikro-vamzdeliai susispaudžia į įvairiais baltymais praturtintą struktūrą, žinomą MB (MB, pagal angl. midbody) pavadinimu. Nors MB pakankamai nuo-dugniai ištirti, ir žinomas jų vaidmuo citokinezės metu reguliuojant galutinį ląstelių atsidalijimą vykdančius baltymus [1-3], jų pomitozinės funkcijos vis dar nėra ištirtos. Dar visai neseniai buvo manoma, jog po dalijimosi MB yra išmetami į ekstraląstelinę erdvę arba sunaikinami autofagosominės degra-dacijos metu [4, 5]. Tačiau naujausi tyrimai parodė, jog pomitoziniai MB gali būti paveldėti ir yra linkę kauptis kamieninių ir navikinių ląstelių populiacijose [6–8]. Manoma, jog pomitoziniai MB gali atlikti itin svarbią signalų perdavimo funkciją ir nulemti ląstelių kamieniškumą bei navikinių ląstelių agresyvumą [6, 9, 10]. Taip pat, buvo nustatyta, jog MB gali regu-liuoti ląstelių poliškumą, neuronų augimą ir mitozinės verpstės orientaciją [11–13]. Nors pomitozinių MB funkcinė reikšmė šiuose procesuose yra aiški, vis dar nežinoma, kaip šie dariniai perduoda signalus. Taip pat, dėl keleto prieštaringai vertinamų tyrimų [14–16], nėra visiškai aišku, ar MB iš tikrųjų gali nulemti ląstelių kamieniškumą ir skatinti naviko progresavimą. Todėl vienas iš pagrindinių šio darbo uždavinių yra ištirti MB kaupimosi įtaką ląstelių dauginimuisi, invazyvumui, onkogeniniam potencialui ir kamieniškumui.
10
uždavinys – ištirti molekulinius kelius, kuriais pomitoziniai MB iš ekstra-ląstelinės erdvės patenka į ląstelę.
11
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS
Darbo tikslas
Ištirti pomitozinių MB paveldėjimą, degradaciją ir funkcijas.
Darbo uždaviniai
1. Tirti FYCO1 vaidmenį, reguliuojant pomitozinių MB degradaciją ir nustatyti FYCO1 išveiklinimo įtaką ląstelių savybėms.
2. Nustatyti pomitozinius MB sudarančius baltymus ir ištirti Rab baltymų įtaką ląstelės dalijimuisi.
3. Tirti pomitozinių MB akumuliacijos įtaką ląstelių dauginimuisi, inva-zyvumui, kamieniškumui ir onkogeniniam potencialui.
4. Tirti aktino, fosfatidilserino ir integrinų vaidmenį ekstraląstelinių po-mitozinių MB internalizacijoje.
Mokslinio darbo naujumas
Naujausi tyrimai parodė, jog ląstelių dalijimosi metu susiformavę MB yra paveldimi naujai susiformavusių arba internalizuojami greta esančių ląstelių, o navikinės ir kamieninės ląstelės yra linkusios juos kaupti [7]. Neretai MB akumuliacija siejama su išaugusiu navikinių ląstelių onkoge-niniu potencialu ir ląstelių perprogravimu, į greitai besidalijančių naviko kamieninių ląstelių fenotipą [6, 8]. Vienas iš būdų, kuriuo ląstelės gali išvengti šių su MB akumuliacija siejamų pokyčių, – greita ir efektyvi MB degradacija. Jau yra nustatyta, jog MB yra degraduojami selektyvios makro-autofagijos metu [6], ir todėl šiame darbe tyrėme už didelių citozolinių struktūrų degradaciją atsakingo baltymo FYCO1 [23] funkciją, degraduojant po ląstelių dalijimosi susiformavusius MB. FYCO1 mutacijos yra asocijuo-jamos su genetinėmis ligomis, kurių atsiradimą skatina įvairių organelių ir citozolinių baltymų kaupimasis ląstelėse [24]. Savo tyrimuose atskleidėme naują FYCO1 funkciją, kontroliuojant autofaginę paveldėtų MB degra-daciją. Taip pat parodėme, jog dėl FYCO1 išveiklinimo sutrikusi MB de-gradacija lemia padidėjusią MB akumuliaciją, kuri skatina navikinių ląstelių onkogeninį potencialą ir naviko kamieninių ląstelių invazyvumą, bet neturi įtakos kamieniškumui.
12
baltymų „paletė“ [26, 27]. Nors proteominės analizės pagalba nustatyti daugiau nei 100 baltymų įeinančių į MB sudėtį [27], iki šiol, dar tik keleto iš jų funkcija yra išaiškinta. Savo tyrimuose ištobulinę ir atlikę ekstraląstelinių pomitozinių MB proteominę analizę, nustatėme apie 900 MB sudarančius baltymus, o tarp jų, gerai visiems žinomus, citokinezėje dalyvaujančius ir mažų GTPazių šeimai priskiriamus baltymus, – Rab11 ir Rab35. Parodėme, jog sustabdžius proteominės analizės metu nustatytų Rab baltymų funkciją į ląsteles įvedus SN mutacijas, Rab14 turėjo didžiausią įtaką ląstelės dali-jimuisi. Iki šiol, literatūroje buvo aprašyti tik keli atvejai, kuomet Rab14 lokalizavosi endosomose interfazės stadijoje ir citokinezės metu galėjo būti aptinkamas TT [28], bet nebuvo įrodymų, jog šis baltymas gali tiesiogiai įtakoti ląstelių dalijimąsi. Savo tyrimais parodėme, jog Rab14 yra svarbus citokinezę, per aktino reguliaciją kontroliuojantis baltymas, kurio išveikli-nimas ir visiškas išjungimas sutrikdė ląstelių dalijimąsi. Taip pat parodėme, jog Rab14 funkcijos praradimas gali būti kompensuojamas kitų, panašų veikimo principą turinčių Rab baltymų pagalba.
Nors literatūroje aptinkami duomenys teigia, jog pomitozinių MB akumuliacija dažnai siejama su išaugusiu ląstelių onkogeniniu potencialu [6, 8, 29], pomitozinė MB funkcija ir poveikis ląstelėms nėra visiškai aiškus. Savo tyrimais parodėme, jog simetriniu (internalizuoti MB) ir asimetriniu (paveldėti MB) ląstelių dalijimosi metu į ląstelę patekusių pomitozinių MB akumuliacija skatina ląstelių dauginimąsi, invazyvumą ir onkogeninį potencialą. Dar vienas labai svarbus aspektas, pomitozinių ir į ekstraląste-linę erdvę išmestų MB internalizacijos procesas, kuris literatūroje dar nėra aprašytas. Savo tyrimuose nustatėme, jog ekstraląsteliniai pomitoziniai MB yra apgaubti dalijimosi metu iš motininės ląstelės gauta plazmine membrana ir tik patekę į kitos ląstelės vidų, apgaubiami papildoma, internalizuojančios ląstelės membrana. Tokiu būdu susiformuoja dviguba membrana apgaubta organelė, kurią mes pavadinome MB-soma. Iki šiol dar nėra žinomas po-mitozinių ekstraląstelinių MB internalizavimo mechanizmas. Mes buvome pirmieji, kurie parodė, jog pomitoziniai MB internalizuojami iš ląstelės plazminės membranos susiformuojančių, daugybę receptorių turinčių ir iš aktino sudarytų ataugų pagalba. Taip pat nustatėme, jog ekstraląstelinių po-mitozinių MB atpažinimas ir paskyrimas internalizacijai vyksta per fosfa-tidilserino, esančio išoriniame ekstraląstelinių pomitozinių MB membranos sluoksnyje bei integrinų, esančių ant ląstelių, pasirengusių internalizuoti MB, tarpusavio sąveiką.
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. MB susiformavimas vėlyvosios citokinezės metu
Walther Flemming [25] buvo pirmasis mokslininkas, kuris ląstelės da-lijimosi metu, histocheminio metodo pagalba pastebėjo keistus ir dar nematytus struktūrinius darinius, kurie vėliau buvo pavadinti Flemingo kūneliais. Tik kur kas vėliau Flemingo kūneliai buvo atidžiau ištirti švie-siniu mikroskopu [30, 31], o detali Flemingo kūnelio struktūra, patvirtinta elektroninio mikroskopo pagalba [32, 33]. Šiandien, šie struktūriniai dariniai žinomi kaip MB, susiformuojantys ląstelės dalijimosi metu [25].
Nors proteominės analizės pagalba nustatyti daugiau nei 100 baltymų, įeinančių į MB sudėtį [27], iki šiol, dar tik keleto iš jų funkcija yra išaiš-kinta. Citokinezės pabaigoje MB tampa lengvai pastebimi, o juos sudarantys elementai aiškiai matomi. Priklausomai nuo lokalizacijos, MB sudarantys baltymai suskirstyti į tris grupes (1.1.1 pav. A): pagrindinis kūnas (pažy-mėtas rudai), centrinė zona (pažy(pažy-mėtas žaliai) ir pakraštinė zona (pažymėta geltonai) [34]. Pagrindinis MB kūnas sudarytas iš centrinės verpstės siūlų, mikrotubulių ir su jomis asocijuojamų baltymų bei įvairių motorinių bal-tymų. Visa tai suformuoja žiedo pavidalą turinčią struktūrą, kurios formą puikiai atskleidžia optiniu mikroskopu užfiksuotos ir imunofluorescencinės nuotraukos (1.1.1 pav. B–D) [34]. Šios struktūros funkcija nėra aiški, nors tai, jog čia aptinkamas RhoA (mažųjų GTPazių šeimai priklausantis baltymas) ir anilinas, leidžia manyti, jog ši MB dalis gali būti atsakinga už signalų perdavimą vėlyvosios citokinezės stadijoje. Iš persidengiančių antiparalelių mikrotubulių pluošto sudarytą centrinę MB zoną stabilizuoja PRC1 (angl. protein regulator of cytokinesis 1), o nuo mikrotubulių teigia-mų galų pratęsimo apsaugo KIF4 (su chromosomomis asocijuojamas kinesinas). Pakraštinėje MB zonoje esančių kinazių, tokių kaip Aurora B, sąveika su kitais, už mikrotubulių ir aktino (atitinkamai 1.1.1 pav. C, D) depolimerizaciją atsakingais baltymais, padeda nustatyti TT nukirpimo padėtį. Čia taip pat aptinkami ir RhoA su anilinu, kurie iš dalies, kontro-liuodami ESCRT (ESCRT, pagal angl. endosomal sorting complex required for transport) kompleksą, nustato tikslią TT nukirpimo vietą.
14
galutinį TT nukirpimą [8], vienoje (1.1.1 pav. B) arba abiejose (1.1.1 pav. C išdidintas vaizdas) MB pusėse.
1.1.1 pav. MB struktūra vėlyvosios citokinezės metu
(A) MB susiformavimas iš persidengiančių centrinės verpstės mikrovamzdelių. MB sudarytas iš trijų zonų: pagrindinis kūnas (ruda), centrinė zona (žalia) ir pakraštinė zona (geltona). (B) MB lokalizuojasi viduryje TT. ESCRT komplekso kontroliuojamas TT nukirpimas vienoje (balta rodyklė) arba abiejose (C paveikslėlio išdidintas vaizdas, baltos
15
1.2. MB paveldėjimo mechanizmai
Paskutinio citokinezės etapo metu įvykstantis TT nukirpimas gali vykti vienoje (asimetrinis) arba abiejose (simetrinis) MB pusėse [9]. TT nukir-pimas prasideda kuomet į susiaurėjusią ir nukirpimui paruoštą TT vietą atkeliauja ESCRT kompleksas, kuris sąveikaudamas su kitais TT nukirpimo procese dalyvaujančiais baltymais, tokiais kaip spastinas, vykdo TT sudarančių membranų išardymą vienoje (1.2.1 pav. 5A) arba abiejose (1.2.1 pav. 5B) MB pusėse. Asimetrinio TT nukirpimo atveju, MB yra asimetriškai internalizuojamas vienos iš dukterinių ląstelių (1.2.1 pav. 6A-7A). Tik pa-tekęs į ląstelės vidų, MB yra įkapsuliuojamas FYCO1 izoliacinės membra-nos, kuriai susijungus su LC3 ir suformavus autofagolizosomą, MB – degraduojamas. Kitu atveju, kai TT nukerpamas simetriškai, MB išmetamas į ekstraląstelinę erdvę (1.2.1 pav. 6B–7B), kur vėliau savaime sunyksta arba yra internalizuojamas tų pačių, arba kitų, netoliese esančių ląstelių. Į eks-traląstelinę erdvę išmestas MB jau yra apgaubtas iš motininės ląstelės gautu plazminės membranos apvalkalu. Tai palengvina jo internalizavimą, kuomet MB įkapsuliuojančios ląstelės membrana susilieja su MB membrana. MB taip pat gali būti įkapsuliuotas ir į fagocitozę panašaus proceso metu, kai aplink MB suformuojama dviguba membrana, žinoma kaip MB-soma.
16
1.2.1 pav. TT nukirpimo ir MB paveldėjimo modeliai
(baltos rodyklės rodo į MB)
(7B) Viduląsteliniai MB gali būti įkapsuliuojami FYCO1 membrana
(rodyklė rodo į FYCO1 membraną).
17
asimetrinio ląstelių dalijimosi priklausantys mechanizmai, taip pat vaidina itin svarbų vaidmenį ir kitose ląstelių kultūrose bei audiniuose. Nors dau-geliu tyrimų įrodyta tiesioginė sąsaja tarp MB paveldimumo ir kamieninių ląstelių savybių atsiradimo, tikslūs mechanizmai, kuriais MB reguliuoja kamieniškumą, vis dar nėra iki galo išaiškinti.
1.3. Citokinezė ir jos metu vykstantys citoskeleto pokyčiai ląstelėje
Citokinezė yra paskutinis ląstelės dalijimosi etapas, kuris užsibaigia dviejų fiziškai susijungusių ląstelių atsiskyrimu. Citokinezė prasideda ankstyvoje anafazės stadijoje, kuomet chromatidės translokuojasi į verpstės polius, o TT-je formuojasi aktomiozino kontraktilinis žiedas, kuris suspau-džia mikrotubules į tankią struktūrą, žinomą kaip MB. MB yra TT viduryje, o TT nukirpimas ir yra paskutinis ląstelės dalijimosi etapas. Šio proceso metu atsiskiria dvi naujai susiformavusios dukterinės ląstelės. Nors atlikta daug tyrimų, siekiant išsiaiškinti molekulinius mechanizmus, reguliuojan-čius aktomiozino žiedo formavimąsi ir susitraukimą, tikslūs mechanizmai, atsakingi už TT nukirpimą, dar nėra iki galo nustatyti [37]. Naujausi tyrimai atskleidžia dramatiškus citoskeleto ir perdirbimo endosomų pokyčius, kurie yra neatsiejama TT nukirpimo proceso dalis [38, 39]. Dėl baltymų ir jų kompleksų gausos, mechaniniai procesai ir molekuliniai mechanizmai re-guliuojantys paskutinį plazminės membranos susiliejimą prieš pat TT nukirpimą, išlieka kontraversiški [37].
Iš pradžių, buvo manoma, jog augalų ir gyvūnų ląstelės dalijasi visiškai skirtingais būdais. Augalų ląstelės dalijasi suformuodamos naują ląstelės sienelę iš specializuotų fragmoplastų, kurie į dalijimosi vietą atgabenami tam tikrų specializuotų membranų pagalba [40]. Tuo tarpu, sėkmingam gyvūnų ląstelių dalijimuisi, specializuotų membranų nereikia, o visą darbą atlieka aktomiozino kontraktilinis žiedas. Tačiau naujausi tyrimai atskleidė, jog specializuotų membranų transportavimas į TT nutraukimo vietą yra reikalingas gyvūnų ląstelių atsiskyrimui. Specializuotos membranos kil-dinamos iš Goldžio aparato bei endosomų, pernešamos į TT ląstelės da-lijimosi metu ir yra būtinos ankstyvosios ir vėlyvosios citokinezės etapams [38].
1.4. Endosominių membranų transporto reguliavimas į tarpląstelinį tiltelį
18
savybės yra iki galo nustatytos [22, 41, 42]. Membranų transportavimas citokinezės metu pradėtas tirti C.elegans ir Drosophila embrionuose, kurie buvo veikiami vaistu brefeldinu A (BFA, pagal angl. brefeldin A), slopinan-čiu baltymų pernašą iš endoplazminio tinklo į Goldžio aparatą, ir iš Goldžio aparato į plazminę membraną. Buvo nustatyta, jog C.elegans ir Drosophila embrionuose BFA trukdė vykti procesams, reikalingiems užbaigti paskutinį citokinezės etapą [43]. Taip pat, Gromley [42] ir Goss [44], panaudojant flourescentiškai pažymėtus sekretorinius žymenis parodė, jog sekretorinės vezikulės transportuojamos į TT, kur citokinezės metu, susijungia su plaz-mine membrana. Įdomu tai, jog, nors sekretorinės vezikulės buvo aptin-kamos TT ankstyvojoje telofazės stadijoje, jos nebuvo aptinaptin-kamos TT nu-kirpimo etape [45]. Tai leidžia manyti, jog šis sekretorinis kelias nėra pa-grindinis veiksnys vėlyvajame citokinezės etape, bet yra ir kitas, papildo-mas, taip pat labai svarbus transportavimo būdas, kurį ląstelės naudoja da-lijimosi metu.
19
GTPazes ir tokiu būdu sumažina F aktino kiekį TT. Išveiklinus p50RhoGAP HeLa ląstelėse, padidėjo F aktino kiekis TT, ir tai nulėmė uždelstą ląstelių atsiskyrimą [2]. Žinduolių ląstelėse interfazės metu, Rab11/FIP3 atlieka ir kitą, nemažiau svarbią funkciją; Rab11/FIP3 endosomos kontroliuoja aktino citoskeleto dinamiką lamelipodijose, ir tokiu būdu reguliuoja ląstelės judėjimą [52].
1.4.1 lentelė. Mažosios GTPazės ir jų efektoriniai baltymai esantys TT
citokinezės metu. Modifikuota pagal [38]
Mažoji GTPazė Organelė Efektorinis baltymas (Citokinezė) Citavimas
Rab4 Endosoma ? 25
Rab8 Sekrecinė endosoma ? 10, 28
Rab11 Perdirbimo endosoma Fip3 11, 20–23
Fip4 20–22
Sec15 8, 21
Rab21 Perdirbimo endosoma ? 27
Rab35 Endosoma OCRL 9, 24
Arf6 Endosoma JIP3 55
JIP4 55
FIP3 20–22
FIP4 20–22
Sec10 8, 21
Ra1A/Ra1B Endosoma Sec5/Exo84 56, 57
? – nežinoma.
20
išaugusį PtdIns (4,5) P2 ir F aktino kiekį TT, kas sukėlė TT nukirpimo proceso sutrikimus [53]. Taigi, tikėtina, jog Rab11, Rab35 ir Arf6, sąvei-kaudami paskutinio ląstelės dalijimosi etapo metu, kuomet galutinai nuker-pamas TT, reguliuoja aktino citoskeleto dinamiką TT viduje.
Be visiems žinomų Rab11 ir Rab35 baltymų, atliekančių svarbias funk-cijas citokinezėje, yra nustatyti ir kiti, Rab GTPazių šeimai priklausantys ir TT sutinkami baltymai, tokie kaip Rab4, Rab8, Rab14 ir Rab21 (1.4.1 len-telė) [28, 54], kurie taip pat dalyvauja citokinezėje. Rab4 žymi ankstyvąsias endosomas ir yra aptinkamas centrinės verpstės siūluose, kur kolokalizuo-jasi su Arf6. Nustatyta, jog Rab4 išveiklinimas nesukėlė citokinezės defektų [55]. Panašiai kaip Rab4, Rab8 lokalizuojasi TT ankstyvojoje citokinezėje [56]. Rab8 sąveikauja su citoplazminiu motoriniu baltymu dineinu (angl. dynein) ir DCDC5 (DCDC5, pagal angl. doublecortin domain-containing protein 5). DCDC5 yra su mikrotubulėmis asocijuojamas baltymas, kurio iš-veiklinimas sutrikdo citokinezę ir Rab8 vezikulių dinamiką TT [57]. Tačiau pačio Rab8 išveiklinimas nedaro neigiamos įtakos citokinezei, ir šis balty-mas nėra aptinkamas TT jo nukirpimo metu [2]. Rab14 taip pat lokalizuojasi endosomose interfazės stadijoje ir citokinezės metu yra aptinkamas TT [28]. Rab14 funkcija ląstelės dalijimesi dar nėra pilnai nustatyta. Tuo metu Rab21 yra atsakingas už integrinų pernašą į TT [54].
1.5. Tarpląstelinio tiltelio nukirpimas
21
body (MVB) vesicles), o CHMP4B monomerinių darinių polimerizacija skatina skilimo raukšlės formavimąsi ir plazminės membranos susiaurėjimą iki tokio skersmens, jog ši galėtų susilieti, o TT nutrūkti vienoje MB pusėje [1]. Galutinį susiaurėjimą ir 1–3 μm pločio TT nukirpimą reguliuoja ESCRT-III oligomerų kompleksas, judantis iš MB į TT nukirpimo vietą [59]. Čia ESCRT-III kompleksas stabilizuoja iki ~ 100 nm FIP3-endosomų jau susiaurintą TT, ir tokiu būdu užbaigia TT nukirpimą (1.5.1 pav.). Šis modelis pagrįstas tuo, jog ESCRT-III kompleksas, prisijungdamas prie membranų, pirmenybę teikia išlinkusioms ar netaisyklingos formos mem-branoms (>100 nm) in vitro [60] ir nutraukia siaurus, 20–50 nm pločio vezi-kulių kaklelius, MVB biogenezės ar virusų pumpuravimosi metu [61, 62].
1.5.1 pav. Endosomų ir ESCRT kontroliuojamas tarpląstelinio tiltelio
22
Papildant jau anksčiau aptartą TT nukirpimo reguliaciją, reikia paminėti ir SCAMP2/3, p50RhoGAP bei OCRL baltymus, kurie atlieka ne mažiau svarbią funkciją. Kaip ir FIP3 endosomos, kurios atgabena SCAMP2/3 bei p50RhoGAP, Rab35 endosomos į nustatytą aktino citoskeleto išardymo vietą TT pristato ir OCRL [53]. Tikėtina, jog aktino tinklo išardymas TT padeda susiformuoti zonai, kurioje visiškai nėra aktino. Tai pagerina plaz-minės membranos dinamiką, kurios reikia TT susiaurėjimui bei plazplaz-minės membranos susiliejimui TT nukirpimo atveju (1.5.1 pav.). Be FIP3 ir Rab35 endosomų, kurios į TT nukirpimo vietą pristato ESCRT-III komponentus, šiame procese dalyvauja ir PI3P (PI3P, pagal angl. phosphatidylinositol 3-phosphate) endosomos. Jos į nustatytą TT nukirpimo vietą atgabena FYVE-CENT [63], kuriam suformavus kompleksą su TTC19 ir CHMP4B [63], šis galimai reguliuoja ESCRT-III surinkimą, TT nukirpimo vietoje (1.5.1 pav.). Tuo metu, FIP3 endosomų į TT pristatytas SCAMP3, sąveikau-damas su TSG101 [64], nustato ESCRT-III komplekso poziciją TT nukir-pimo vietoje. Išveiklinus SCAMP3, padaugėja daugiabranduolių ląstelių ir sutrinka ląstelės dalijimasis [2]. Apibendrinant galima teigti, jog įvairių endosomų pristatymas ir susiliejimas su TT nukirpimo vietoje esančia plaz-mine membrana yra tiesiogiai susijęs su aktino citoskeleto išardymu. Tai lei-džia susiformuoti antriniam TT susiaurėjimui bei specifinei plazminei mem-branai, kuri pritraukia ESCRT-III oligomerus, reikalingus galutiniam TT nukirpimui (1.5.1 pav.).
1.6. MB kaupimasis ląstelėje
„moti-23
ninė“ centriolė slopina Rab11/FIP3 endosomų perkėlimą į skilimo raukšlės formavimosi vietą, ir dėlto TT yra nukerpamas toje pusėje, kurioje ląstelė turi jaunesnę centriolę. Taip pat nustatyta, jog baltymas Evi5 prisijungdamas prie centriolių galūnes sudarančių komponentų, kurių naujai susiforma-vusios dukterinės centriolės neturi, kaupiasi motininėje centriolėje [66]. Evi5 veikia kaip Rab11 GTPazę inaktyvuojantis baltymas, kuris taip pat tiesiogiai konkuruoja su FIP3, dėl prisijungimo prie Rab11 [67]. Kitu atveju teigiama, jog Evi5 galimai inaktyvuoja „motininėje“ centriolėje esantį Rab11, ir tokiu būdu neleidžia susiformuoti Rab11/FIP3 kompleksui. Visa tai uždelsia Rab11/FIP3 endosomų translokaciją iš „motininės“ centriolės į skilimo raukšlės formavimosi vietą, ir dėlto, įvyksta dukterinę centriolę tu-rinčios ląstelės pusėje esančio TT nukirpimas. Remiantis abejomis hipote-zėmis manoma, jog MB paveldi ląstelė, turinti senesnę „motininę“ centriolę [9].
MB asimetriškai gali būti paveldimas tik vienos iš dukterinių ląstelių, tačiau dažnai TT nukerpamas ir abiejose MB pusėse, o MB išmetamas į ekstraląstelinę erdvę kur vėliau sunyksta [7, 65] (1.2.1 pav. 6B). Tokiu būdu ląstelės gali išvengti su MB paveldėjimu siejamo signalų perdavimo diferenciacijos metu [17]. Tačiau naujausi mūsų ir kitų mokslinių grupių [7] tyrimai parodė, jog į tarpląstelinę erdvę išmestus MB gali internalizuoti kaimyninės ląstelės (1.2.1 pav. 6B-7B). Nors tokio MB įsisavinimo svarba nėra visiškai aiški, manoma, jog MB internalizacija yra vienas tarpląstelinės signalizacijos būdų. Alternatyviai, MB gali būti internalizuojami ir degra-duojami, siekiant pašalinti jų poveikį tolimesniam ląstelių vystymuisi [9].
1.7. MB degradacija
24
MB degradaciją [6]. Be p62 ir NBR1, dar yra žinomi ir daugelis kitų, MB degradacijoje galimai dalyvaujančių autofagijos receptorių, kurių tiksli funkcija, dar nėra iki galo išaiškinta [9].
1.8. MB skatinamas ląstelių onkogeniškumas
25
1.9. Kitos MB funkcijos
Keletas paskutinių metų tyrimų parodė, jog MB atlieka ir kitas, ne cito-kinezines funkcijas, tokias kaip poliškumo nustatymas [9, 72], tarpląstelinio komunikavimo [15] ir ląstelės lemties reguliacija [6, 9].
Nors mitozinis ląstelių dalijimasis ir poliarizacija dažniausiai yra laikomi vienas kitam prieštaraujančiais reiškiniais, naujausi tyrimai parodė, jog dalijimosi metu, kai kurios ląstelės visgi gali išlaikyti savo poliškumą. Vi-siems gerai žinomas poliarizuotas ląstelių dalijimosi pavyzdys yra epitelio ląstelių dalijimasis [72]. Nustatyta, jog ankstyvojoje embriogenezėje bei epitelio ir neuronų poliarizacijos metu, MB gali atlikti ekstraląstelinio ir viduląstelinio poliškumo nustatymo funkciją [72]. Tačiau molekuliniai me-chanizmai, reguliuojantys MB poziciją ir signalų perdavimą besidiferen-cijuojančiuose neuronuose ar epitelio ląstelėse vis dar išlieka nežinomi.
MB taip pat gali atlikti tarpląstelinių signalų perdavimo funkciją, kontro-liuojančią pomitozinių ląstelių dauginimąsi ir tolimesnę jų lemtį. Kadangi į ekstraląstelinę erdvę išmestus MB gali pasisavinti kitos, ne mitozinės ląs-telės, šie dariniai gali perduoti signalines molekules bei receptorius, ir tokiu būdu paveikti gretimai esančias ląsteles [6, 9].
26
2. TYRIMŲ METODIKA
2.1. Tyrimų metodika panaudota tyrimų 3.1–3.4 skyriuose rezultatams gauti
2.1.1. Ląstelių kultūros
Eksperimentai atlikti su HeLa (žmogaus gimdos kaklelio karcinoma, ATCC CCL-2) laukinio tipo (angl. wild type (wt)) ir B911 ir B931 (pelės suragėjusios karcinomos ląstelės) ląstelėmis. Ląstelių auginimui naudojama DMEM (DMEM, pagal angl. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Sigma – Aldrich, Vokietija) terpė, į kurią pridedama 10 proc. fetalinio ver-šelio serumo (angl. fetal bovine serum (FBS)) ir 1 proc. penicilino – strep-tomicino (100 U/ml penicilino ir 100 U/ml strepstrep-tomicino; Gibco Labora-tories) antibiotikų mišinio. Ląstelės buvo auginamos inkubatoriuje 37 °C temperatūroje bei 5 proc. CO2 aplinkoje. HeLa-MKLP1-GFP ląstelės buvo gautos kaip dovana iš Stephen Doxsey (University of Massachusetts Me-dical School, JAV) [6]. Panaudojus lentiviruso pelės FYCO1 trumposios segtuko formos RNR (angl. short hairpin RNA (shRNA)) plazmides (kat. nr. TRCN0000038916 ir TRCN0000038915), sukurtos stabilios HeLa ląstelių linijos su išveiklintu FYCO1 (atitinkamai FYCO1-KD1 ir FYCO1-KD2). Panaudojus lentiviruso pelės FYCO1 shRNR (kat. nr. TRCN0000047529 ir TRCN0000178746, Sigma-Aldrich) sukurtos stabilios B911 ir B931 ląstelių linijos su išveiklintu FYCO1 (atitinkamai B911-KD ir B931-KD). FYCO1 išveiklinimo funkcijai atstatyti lipofectamino 2000 (ThermoFisher Scien-tific, Waltham, MA) pagalba į ląsteles įvesta FYCO1-GFP koduojanti plaz-midė. Sferoidų tyrimui, ~ 5,000 išrūšiuotų ląstelių suspenduotos 2 ml sferoidų terpėje (DMEM/F12 su 10 ng/ml bFGF ir 20 ng/ml EGF) ir pasėtos itin mažu prisitvirtinimu paviršiumi pasižyminčiose lėkštelėse (Corning). Sferoidai analizuoti praėjus 10 dienų po pasėjimo.
2.1.2. Minkšto agaro testas
sa-27
vaites. Susiformavusios ląstelių kolonijos vizualizuotos pasitelkus nitro tetrazolio mėlynąjį chloridą, o kolonijų skaičius nustatytas panaudojus ImageJ programinę įrangą. Kolonijų skaičiaus vidurkis apskaičiuotas iš trijų skirtingų vieno eksperimento techninių pakartojimų. Pateiktas trijų atskirų eksperimentų duomenų vidurkis.
2.1.3. Naviko kamieninių ląstelių analizė
Siekiant atskirti kraštinę populiaciją (SP, pagal angl. side population), kurią sudaro naviko kamieninės ląstelės, nuo likusios populiacijos (NSP, pagal angl. non-side population), tripsinizuotos B911 ir B931 ląstelės su-spenduotos fluorescencinio aktyvinimo ląstelių rūšiavimo (FACS, pagal angl. flourescence activated cell sorting) buferyje (buferinis fosfato fizio-loginis druskos tirpalas (PBS, pagal angl. phosphate buffered saline) tirpalas su 3 proc. FBS), ląstelių ir tirpalo koncentracijos santykiu 106/ml. Tuomet ant ląstelių uždėtas 25 ng/ml koncentracijos Hoechst 33342 dažas (Sigma-Aldrich) ir ląstelės 1,5 val. inkubuots 37 °C temperatūrą ir 5 proc. CO2 pa-laikančiame inkubatoriuje. Kontrolinės ląstelės papildomai paveiktos 50 μM verapamiliu (Sigma-Aldrich), kuris slopina Hoechst 33342 dažo ištekėjimą iš ląstelių. Po inkubacijos ląstelės praplautos ir suspenduotos FACS buferyje bei prafiltruotos per 40 μm dydžio poras turintį ląstelių filtrą. Prieš FACS analizę gyvos ląstelės atrinktos ląsteles nudažius propidžio iodidu (10 μg/ml galutinė koncentracija). Ląstelių analizė pasitelkus MoFlo XDP70 tekmės citometrą (Beckman Coulter). Atsižvelgus į Hoechst 33342 dažo profilį su ir be pridėtinio verapamilio, ląstelės išrūšiuotos į SP ir NSP populiacijas. Duo-menys apdoroti panaudojus Summit programinę įrangą (v 6.2).
2.1.4. Sferoidų formavimo tyrimas
Sferoidų formavimo tyrimui, 5 × 103 išrūšiuotų ląstelių suspenduotos 2 ml sferoidų terpėje (DMEM/F12 su 10 ng/ml bFGF ir 20 ng/ml EGF) ir pasėtos itin mažu prisitvirtinimo paviršiumi pasižyminčiose lėkštelėse (Corning). Sferoidai analizuoti praėjus 10 dienų po pasėjimo.
mikrosko-28
pą su 40× objektyvu. Z sluoksnio (0,5 μm žingsnis) projekcijos analizuotos NIS-Elements Advanced Research (Nikon) ir ImageJ programine įranga.
2.1.5. Antikūnai ir plazmidės
Tyrimuose naudoti antikūnai: anti-alpha-tubulinas (IF 1:100, WB 1:1000, LI-COR, kat. nr. 926-42211), anti-CD63 (IF 1:100, dovana iš Dr. Andrew Peden, University of Sheffield, JK), anti-MKLP1 (IF 1:800, Santa Cruz Biotechnology, kat. nr. sc-867), anti-FYCO1 (IF 1:100, WB 1:250, Bethyl Laboratories, kat. nr. A302-796) ir anti-LC3 (IF 1:200, WB 1:2000, NB100-2220). Faloidinas sujungtas su Alexa Flour 568 buvo įsigytas iš Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, kat. nr. A1238). GFP bei FYCO1-FYVE ir FYCO1-LIR delecijų mutantų DNR konstruktai buvo gauti kaip dovana iš Terje Johansen (Institute of Medical Biology, University of Tromso, Norvegija). Lamp1-mCherry DNR konstruktas gautas iš Dr. Andrew Peden.
2.1.6. Imunofluorescencija
Užfiksuotos ląstelės vizualizuotos pasitelkus invertuotą Axiovert 200M mikroskopą (Carl Zeiss) naudojant 63× alyvinį objektyvą ir QE kamerą (Sensicam). Nuotraukos apdorotos naudojant tyrimams skirtą programinę įrangą Slidebook 5.0 (Intelligent Imaging Innovations).
Sferoidų imunofluorescencijos tyrimui sferoidai buvo kultivuojami su-spensijoje, o surinkti sferoidai pritvirtinti prie sintetiniu polimeru (poli-L-lizinas) padengto stikliuko, esančio specialioje kameroje. Sferoidai užfik-stuoti 3 proc. paraformaldehide ir 10 min. permeabilizuoti 0.5 proc. tritone X-100. Tuomet sferoidai tris kartus praplauti PBS/glicino praplovimo tir-palu (100 mM glicinas), 4 val. blokuoti PBS/10 proc. FBS tirpale ir nudažyti anti-MKLP1 (IF 1:800, Santa Cruz Biotechnology, kat. nr. sc-867) anti-kūnu. Sferoiduose esančių MB analizė atlikta naudojant Nikon TiE konfo-kalinį mikroskopą ir 40× objektyvą. 0,5 μm žingsnio Z sluoksnio projekcijos analizuotos NIS-Elements Advanced Research (Nikon) ir Image J progra-mine įranga.
2.1.7. Ilgalaikis izoliacinės membranos formavimosi registravimas
29
bei reikalingą drėgmę palaikančią kamerą. Ląstelės vizualizuotos naudojant 63× alyvinį objektyvą ir fotografuojant kas 20 min. ir 500 ms. Kiekvieno atskiro eksperimento metu užregistruota ~ 50 nuotraukų.
2.1.8. 3D invadopodijų formavimo tyrimas
Invadopodijų formavimo tyrimui, 2,7 × 103 ląstelių buvo suspenduotos matrigelio ir kolageno matrikse, santykiu 3:1. Tuomet šios ląstelės uždėtos ant specialioje kameroje esančių objektinių stiklelių ir 45 min. laikytos 37 °C temperatūroje, kad matrigelio/kolageno matriksas sukietėtų. Matrikse suspenduotos ląstelės augintos DMEM terpėje su priedais (10 proc. FBS ir 1 proc. penicilino – streptomicino (100 U/ml penicilino ir 100 U/ml strepto-micino)). Po 4–5 dienų ląstelėms suformavus sferoidus, šie užfiksuoti ir nudažyti Hoechst 33342 dažu, anti-tubulino antikūnu ir faloidinu, sujungtu su Alexa Flour 568. Kiekybinis invadopodijų formavimo įvertinimas atliktas atsitiktinai pasirinktuose sferoiduose. Pateiktas mažiausiai trijų atskirų eks-perimentų duomenų vidurkis. Daugiau informacijos apie 3D invadopodijų formavimo tyrimą galima rasti Jacob [74, 75] straipsnyje.
2.1.9. RNR izoliavimas ir kiekybinė polimerazinė grandininė reakcija
RNR izoliuota pasitelkus standartinį TriZol ekstrakcijos protokolą, nu-rodytą gamintojo instrukcijoje (Invitrogen, Carlsbad, CA). Komplemen-tarioji DNR (angl. complementary DNA (cDNA)) gauta panaudojus iScript atvirkštinę transkriptazę (Bio-Rad, Hercules, CA). Kiekybinė polimerazinė grandininė reakcija (PGR) atlikta panaudojus iTaq Universal SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, CA) rinkinį su pradmenimis, gautais iš PrimerDepot (Wenwu Cui, NIH). Pradmenys naudoti su SYBR green rinkiniu nurodyti apačioje (2 lentelė). Siekiant kiekybiškai įvertinti duomenis, Ct reikšmės normalizuotos pagal kontrolinį β-aktiną ar β-2 mikroglobiną.
2.1.9.1 lentelė. Pradmenys naudoti su SYBR green rinkiniu
Pradmenų pavadinimai Pradmenų sekos
30
2.1.10. Statistinė duomenų analizė
Visa statistinė duomenų analizė atlikta naudojant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) programinę įrangą. Kiekybiniam duo-menų įvertinimui buvo naudojamas Student t-testas. Duomenys pateikiami kaip mažiausiai trijų atskirai atliktų eksperimentų vidurkis ± standartinė paklaida. Skirtumai buvo laikomi statistiškai patikimais kai p < 0,05. Indi-vidualių ląstelių analizės metu visos ląstelės analizuotos 3–5 atsitiktinai pasirinktose srityse. Ląstelės vertintos pagal fenotipą ir fluorescencijos intensyvumo lygį, pasitelkus Intelligent Imaging Innovations (Denver, CO, JAV) vaizdavimo ir vaizdinės analizės programinę įrangą.
2.2. Tyrimų metodika panaudota tyrimų 3.5–3.8 skyriuose rezultatams gauti
2.2.1. Ląstelių kultūros
31
Rab11-GFP ir Rab35-GFP koduojančios plazmidės. Rab14-KO ląstelės paveiktos skirtinga (1 nM ir 4 nM galutinė koncentracijos) latrunkulino A (Sigma-Aldrich) koncentracija.
Cilengitido tyrime metu, HeLa-wt ląstelės inkubuotos su 40 μM cilengi-tidu (RGD) ir neaktyviu kontroliniu pepcilengi-tidu (RGE) 30 min 37 °C tempe-ratūroje. Tuomet, kad prisitvirtintų prie paviršiaus, ląstelės pasėtos kolagenu dengtose lėkštelėse.
Siekiant sutrikdyti aktino polimerizaciją, HeLa ląstelės, ekspresuojančios LifeAct-mCherry, paveiktos 10 μM citochalazinu D ar 100 μM Rac1 (NSC23766) aktino inhibitoriais.
2.2.2. Daugiabranduolių ląstelių tyrimas
Daugiabranduolių ląstelių tyrimui, 40 × 103 įvairius Rab-SN mutantus ekspresuojančių ląstelių, HeLa wt, Rab14-KD1, Rab14-KD2, Rab14-KO bei papildomai Rab14-GFP, Rab11-GFP ir Rab35-GFP plazmides ekspresuo-jančių ląstelių buvo pasėtos ant pirmo tipo kolagenu (50 ug/ml galutinė koncentracija, ThermoFisher Scientific) padengtų, 3 cm pločio plonadugnių lėkštelių. Po 48 val. inkubacinio periodo ląstelės užfiksuotos 4 proc. para-formaldehido tirpale ir nudažytos DAPI dažu bei faloidinu, sujungtu su Alexa Flour 568. Pasitelkus invertuotą OLYMPUS IX81 mikroskopą ir 10× objektyvą, nustatytas daugiabranduolių ląstelių skaičius kiekvienoje sąly-goje. Daugiabranduolių ląstelių skaičius kiekybiškai įvertintas atsitinktinai pasirinktose 4–5 skirtingose lėkštelės vietose.
2.2.3. Tekmės citometrija ir ląstelių rūšiavimas
32
2.2.4. Ląstelių dauginimosi tyrimas
Ki67 intensyvumas matuotas atsitiktinai pasirinktose zonose, kontro-linėse ir su MKLP1-GFP pažymėtais MB „pamaitintose“ ląstelėse. Siekiant išlaikyti vienodas sąlygas ir užtikrinti tyrimo vientisumą, kiekvieno atskiro eksperimento metu, net ir fotografuojant skirtingas ląstelių kolonijų sritis, naudota vienoda ekspozicija. Kiekybiniam mitozinio indekso nustatymui naudotos atsitiktinai užfiksuotos MKLP1-GFP signalą turinčios ląstelės.
Ląstelių dauginimosi tyrimui panaudotos dvi skirtingos metodikos. Pirmu atveju, 3.6.2 pav. C duomenims gauti, HeLa mCherry-CAAX ląstelės ant plonadugnių lėkštelių pasėtos gana retai. MB išgryninti iš HeLa ląstelių, ekspresuojančių MKLP1-GFP, o mCherry-CAAX ekspresuojančios ląstelės „pamaitintos“ šiais MB. Po 3 val. ląstelės, kurios pradėjo internalizuoti MB, vizualizuotos, o ląstelių pozicija užregistruota. Po 7 dienų, iš ląstelių sufor-muotų kolonijų dydis dar kartą vizualizuotas. Antru atveju, 3.6.2 pav. F duomenims gauti, MDA-MB-231 ląstelės „pamaitintos“ MB ir jiems inter-nalizuoti skirtos 24 val. Po 24 val. ląstelės išrūšiuotos į GFP signalą turin-čias (+GFP) ir neturinturin-čias (–GFP) populiacijas. Vėliau išrūšiuotos ląstelės pasėtos į 24 šulinėlių lėkšteles, kurių kiekvienos plotas padalintas į keturis lygius kvadratus. Nustatytas ląstelių skaičius kiekviename iš šių kvadratų tik po pasėjimo ir po trijų dienų kultūroje, ląstelių skaičių fiksuojant kas 24 val.
2.2.5. RNR izoliavimas ir kiekybinė PGR
33
2.2.5.1 lentelė. Pradmenys naudoti su SYBR green rinkiniu
Pradmenų pavadinimai Pradmenų sekos
Beta-2-microglobin_FWD Beta-2-microglobin_REV 5ʹ-CGCTCCGTGGCCTTAGC-3ʹ 5ʹ-AATCTTTGGAGTACGCTGGATAGC-3ʹ Ki67_FWD Ki67_R V 5ʹ-TGGTCTGTTATTGATGAGCC-3ʹ 5ʹ-TGACTTCCTTCCATTCTGAAGAC-3ʹ AuroraA_FWD AuroraA_REV 5ʹ-TGGAAATGCACCCTTGGA-3ʹ 5ʹ-GGGCATTTGCCAATCTGT-3ʹ Plk1_FWD Plk1_REV 5ʹ-GCCCCTCACAGTCCTCAATA-3ʹ 5ʹ-AGTCGACCACCTCACCTGTC-3ʹ CenpE_FWD CenpE_REV 5ʹ-TGATTTGGATGAATTTGAGGC-3ʹ 5ʹ-CTTCTCGATGCTTAACTAAATTCTTT-3ʹ Arhgap11b_FWD Arhgap11b_REV 5ʹ-GGAGACATGAAACAGCAGCC-3ʹ 5ʹ-GGTACAGCAGAATGGGCAG-3ʹ CyclinD_FWD CyclinD_REV 5ʹ-TCCTCTCCAAAATGCCAGAG-3ʹ 5ʹ-GGCGGATTGGAAATGAACTT-3ʹ 2.2.6. RNR sekvenavimas
Paskutinėje RNR paruošimo sekvenavimui stadijoje RNR suspenduota RNR priemaišų neturinčiame vandenyje, o mėginių švarumas ir koncen-tracija išmatuoti su Agilent Bioanalyzer (Agilent Technol., Palo Alto, CA) prietaisu. Atsižvelgiant į TruSeq RNR rinkinio gamintojo instrukcijas, 200– 500 ng RNR buvo panaudota ruošiant Illumina HiSeq bibliotekas. Trys skirtingos bibliotekos buvo sukurtos iš atskirų išrūšiuotų ląstelių mėginių (–GFP ir +GFP) kiekvienai tiriamajai sąlygai. Sekvanavimui naudota naujos kartos sekvenavimo technologija (Illumina HiSeq2000 platforma). Sekve-navimas atliktas Kolorado universitetui priklausančiame Genomikos ir mik-ro matricos padalinyje (Denver, CO, JAV).
2.2.7. Bioinformacinė transkriptomos analizė
34
2.2.8. Antikūnai ir plazmidės
Imunofluorescencijos tyrime naudoti antikūnai: anti-Rab14 (Sigma-Aldrich), anti-acetilintas-tubulinas (Sigma-(Sigma-Aldrich), anti-CD63 (dovana iš dr. Andrew Peden) ir anti-Ki67 (Thermo Scientific). Su AlexaFlour-568 sujungtas faloidinas įsigytas iš Life Technologies (Carlsbad, CA).
WB analizėje naudoti antikūnai: anti-Rab14 (Sigma-Aldrich), anti-Cep55 (Abnova), anti-alpha-tubulinas (LiCor), anti-PDI (Cell Signalling). Su AlexaFlour-594 ir AlexaFlour-488 sujungti antriniai antikūnai prieš triušį ir prieš pelę įsigyti iš Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Su AlexaFlour-568 sujungtas faloidinas įsigytas iš Life Technologies (Carlsbad, CA). WB analizėje naudoti antriniai antikūnai: IRDye 680RD asilo prieš pelę ir IRDye 800CW asilo prieš triušį įsigyti iš Li-COR (Lincoln, NE).
Siekiant sukonstruoti pLVX:CAAX konstruktą, mCherry-CAAX buvo subklonuotas iš p3E-2A-mCherry-mCherry-CAAX ir įstatytas į pLVX. LifeAct-mCherry, kuris įsigytas iš Addgene (kat. nr. 54491, Michael Da-vidson).
2.2.9. MB gryninimas ir MB „maitinimas“ kitoms ląstelėms
MB iš ląstelių išgryninti naudojant Peterman [29] protokolą. Visuose MB „maitinimo“ eksperimentuose apie 90 000 izoliuotų MB buvo dedami ant 200 000 ląstelių, pasėtų 0,5 ml terpėje (0,45 MB dalis tenkanti vienai ląs-telei). Po 3 val. ląstelių nepasisavinti MB nuplauti DMEM terpe, o po 24 val. ląstelės užfiksuotos ir atlikta imunofluorescencijos analizė.
2.2.10. Proteominė išgrynintų MB analizė
35
2.2.11. Imunofluorescencija
Užfiksuotos ląstelės vizualizuotos pasitelkus invertuotą Axiovert 200M mikroskopą (Carl Zeiss), naudojant 63× alyvinį objektyvą ir QE kamerą (Sensicam). Nuotraukos apdorotos pasitelkus tyrimams skirtą programinę įrangą Slidebook 5.0 (Intelligent Imaging Innovations). Z sluoksnio projek-cijos užfiksuotos kas 500-1000 nm. 3D struktūriniam vizualizavimui su SIM aukštos rezoliucijos mikroskopu ląstelės nufotografuotos pasitelkus Nikon N-SIM aukščiausios rezoliucijos mikroskopą.
Imunofluorescencijos tyrimų metu duomenys surinkti iš 5–10 atsitiktinai pasirinktų sričių nuotraukoje. Kiekybinės imunofluorescencinės analizės metu, tam pačiam eksperimentui buvo taikoma vienoda ekspozicija.
2.2.12. Ilgalaikis ląstelių dinamikos registravimas
Gyvų ląstelių vizualizavimui, 40 x 103 HeLa wt, KD1, Rab14-KD2, Rab14-KO bei papildomai Rab14-GFP, Rab11-GFP ir Rab35-GFP ekspresuojančių ląstelių buvo pasėtos ant fibronektinu (30 ug/ml galutinė koncentracija) padengtų 3 cm pločio plonadugnių lėkštelių. Po 24 val. inku-bacinio periodo pradėtas ląstelių dalijimosi dinamikos registravimas. Regis-travimo metu lėkštelės patalpintos į prie mikroskopo prijungtą ir 37 °C tem-peratūrą, 5 proc. CO2 bei reikalingą drėgmę palaikančią kamerą. Ląstelės vizualizuotos naudojant 20× alyvinį objektyvą ir fotografuojant 10 min. in-tervalais. Kiekvieno atskiro eksperimento metu užregistruota ~ 30 besida-lijančių ląstelių, tuo pat metu ląstelių dalijimąsi registruojant 3–5 skirtingose lėkštelės vietose.
2.2.13. Tomografijos tyrimas
36
2.2.14. Koreliacinės šviesos ir elektronų mikroskopija
HeLa ląstelės užaugintos specialiose „CryoCapsules“ kapsulėse [79], buvo 24 val. inkubuojamos su išgrynintais GFP-MB. Po inkubacijos, gyvos ląstelės užšaldytos, naudojant aukšto slėgio šaldymo HPM-Live μ metodiką (CryoCapCell) [79]. Ląstelės įtvirtintos lovikrilo HM20 terpėje ir nustatytos flourescentiškai pažymėtų MB pozicijos, kurios leido atlikti tikslią MB mikrotomiją. Ląstelių mėginiai supjaustyti 70 nm plonumo pjūviais, uždėti ant specialiaus tinklelio ir 5 min. atskirai dažomi uranilo acetato (4 proc. vandeninis tirpalas) ir Reinoldo švino citratu. Mėginiai vizualizuoti pasi-telkus elektroninį mikroskopą (Tecnai Spirit, Thermo Scientific), o ridenti-fikuotų ląstelių duomenys apdoroti eC-CLEM programine įranga.
2.2.15. Augimo minkštame agare testas
Minkšto agaro testas atliktas remiantis Borowicz [73] sudarytu protokolu ir pritaikytas ištirti išrūšiuotas GFP signalą turinčias (+GFP) ir neturinčias (–GFP) ląstelių populiacijas. Tuo tikslu, 200–500 ląstelių suspenduotos agaro tirpale ir pasėtos lėkštelėse su jau sukietėjusiu baziniu agaro sluoks-niu. Toliau žiūrėti 2.1.2 skyrių.
2.2.16. Statistinė duomenų analizė
37
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. FYCO1 yra reikalingas degraduojančios ir LC3 turinčios membranos susidarymui aplink pomitozinį MB
38
3.1.1 pav. FYCO1 aptinkamas MB degraduojančiose autofagosomose
(A) Asimetriniu būdu paveldėto pomitozinio MB degradacijos schema. (B) FYCO1 domeno struktūra. (C, D) Užfiksuotos HeLa ląstelės pažymėtos anti-MKLP1 ir anti-FYCO1 antikūnais. Skaičiai paveikslėlių apačioje dešinėje pusėje rodo procentą visų MB, kurie
nesikolokalizuoja (C) ir kolokalizuojasi (D) su FYCO1 membranomis. (E) FYCO1 ir MKLP1 kolokalizacija gyvose HeLa ląstelėse. Skaičius paveiklėlio apačioje dešinėje pusėje
rodo procentą visų MB, kurie kolokalizuojasi su FYCO1 membranomis. (F) FYCO1 ir LC3 kolokalizacija šiuos žymenis ekspresavusiose ir užfiksuotose HeLa ląstelėse.
subren-39
dusių endosomų žymuo). FYCO1-GFP transfekuotos HeLa ląstelės buvo pažymėtos anti-Lamp1 ir anti-CD63 antikūnais. Nors didžioji dalis FYCO1 turinčių organelių neturėjo Lamp1 ar CD63 (3.1.2 pav. D; žvaigždutė rodo į organelę, pažymėtą tik su FYCO1), kartais lizosomos buvo matomos visai šalia FYCO1 turinčių organelių (3.1.2 pav. A–D; rodyklės rodo į FYCO1, esantį greta Lamp1 ir CD63), galimai prieš pat autofagosomų susijungimą su lizosomomis (3.1.2 pav. D). Kadangi autofagosomų susijungimas su lizo-somomis įvyksta autofagosomų „brendimo“ metu, tikėtina, jog šios su Lamp1 ir CD63 nepažymėtos, bet FYCO1 turinčios organelės reprezentuoja ankstyvojoje formavimosi ir brandos stadijoje esančias autofagosomas.
3.1.2 pav. Dalinė FYCO1 ir Lamp1 bei CD63 kolokalizacija užfiksuotose
HeLa ląstelėse
(B) ir (D) paveiksluose parodytas padidintas atitinkamai paveiksluose (A) ir (C) stačiakampiu išskirtas vaizdas. (B) Rodyklės nurodo FYCO1 endosomų ir Lamp1 lizosomų
40
Registruojant HeLa ląstelių, transfekuotų FYCO1-GFP, prisijungimo prie autofagosomų procesą, FYCO1-GFP buvo pastebėtas ankstyvojoje autofa-ginio „puodelio“ formavimosi stadijoje (3.1.3 pav. A; žvaigždutė žymi kiau-rymę naujai besiformuojančioje autofagosomoje). Po 20–40 minučių, užsi-darius autofaginiam „puodeliui“, galutinai susiformavo autofaginė izoliuo-janti membrana (3.1.3 pav. A; paskutinis paveikslėlis dešinėje pusėje).
3.1.3 pav. FYCO1 prisijungia prie izoliacinės membranos ankstyvojoje
autofagocitinio „puodelio“ formavimosi stadijoje
41
Į autofaginį „puodelį“ pristatomos membranos jau turi FYCO1-GFP (3.1.3 B pav.; rodyklė rodo FYCO1-GFP turinčias mažas endocitines or-ganeles, o žvaigždutė žymi kiaurymę naujai besiformuojančioje autofago-somoje). Tai reiškia, kad FYCO1 turinčios endosominės membranos, rei-kalingos izoliacinės membranos pratęsimui ir galutiniam susidarymui, į besiformuojančią autofagosomą atkeliauja jau ankstyvojoje formavimosi stadijoje. Vėliau tyrėme ar po FYCO1-GFP prisijungimo lizosomos susi-jungia su autofagosomomis. Šiam tikslui HeLa ląsteles transfekavome su FYCO1-GFP ir Lamp1-mCherry, ir išanalizavome lizosomų ir autofago-somų dinamiką gyvose ląstelėse. Kaip ir ankstesniuose tyrimuose, kai kurios didelės FYCO1-GFP autofagosomos neturėjo Lamp1-mCherry (3.1.3 pav. C; pažymėta žvaigždute), ir todėl, manome, jog tai reprezentuoja ankstyvajį autofagosomų brandos etapą. Įdomu tai, jog lizosomos prisijungė tik prie FYCO1 turinčių autofagosomų, kurios taip pat turėjo lizosomų markerius ir galimai buvo vėlyvojoje autofagosomų brendimo stadijoje (3.1.3 pav. D, E; lizosomų ir autofagosomų susijungimas pažymėtas rodyklėmis).
Galima daryti išvadą, jog FYCO1 reikalingas autofaginio „puodelio“ for-mavimuisi ir izoliacinės membranos pratęsime autofagosomos formavimosi metu, kuomet yra degraduojamas pomitozinis MB.
3.2. FYCO1 kontroliuoja nuo LC3 priklausančią MB degradaciją
Kadangi mūsų atlikti tyrimai parodė, jog FYCO1 kolokalizuojasi su po-mitoziniais MB, nusprendėme nuodugniau ištirti FYCO1 vaidmenį regu-liuojant MB degradaciją. Tam tikslui sukūrėme HeLa ląstelių linijas, stabiliai ekspresuojančias dvi skirtingas FYCO1 shRNR (FYCO1-KD1 ir FYCO1-KD2) (3.2.1 pav. C). Panaudoję HeLa ląsteles, stabiliai ekspresuo-jančias MKLP1-GFP, nustatėme MB kiekį kontrolinėse ir FYCO1 išveik-lintose ląstelėse (3.2.2 pav. A). Išveiklinus FYCO1 statistiškai patikimai padaugėjo MB, tenkančių vienai ląstelei (3.2.2 pav. B). Žinant, jog FYCO1 galimai dalyvauja autofagosomų ir nuo LC3 priklausančių fagocitinių mem-branų formavimesi, papildomai nustatėme ir procentinę pomitozinių, LC3 ir CD63 lizosominėmis membranomis įkapsuliuotų, MB dalį. Dėl FYCO1 išveiklinimo procentiškai sumažėjo pomitozinių MB skaičius LC3 (3.2.2 pav. D) ir CD63 (3.2.2 pav. E) turinčiose organelėse.
42
3.2.1 pav. FYCO1 išveiklinimas neturi įtakos citokinezei ir bendram
autofaginiam aktyvumui
FYCO1 lokalizacija MB citokinezės metu tirta FIP3 (A) bei MKLP1 (B) ekspresuojančiose
HeLa ląstelėse (rodyklės rodo į MB). (C) FYCO1 iRNR lygis HeLa ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose skirtingas FYCO1 shRNR. (D) FYCO1 išveiklinimo įtaka citokinezei.
(E) FYCO1 išveiklinimo įtaka bendram autofaginiam aktyvumui ląsteles paveikus 40 μM
chlorokvinu (CQ).
43
ląstelės ciklą ar net pačią citokinezę. Priešingai, įrodėme, jog FYCO1 iš-veiklinimas nors ir neturėjo įtakos bendram autofaginiam aktyvumui, bet visgi prislopino autofagosomų ir LC3 fagocitinių membranų vykdomą MB degradaciją. Visa tai lėmė pomitozinių MB kiekio ląstelėse su išveiklintu FYCO1, padidėjimą.
3.2.2 pav. FYCO1 kontroliuoja autofaginę pomitozinių MB degradaciją
(A, B) Pomitozinių MB kiekis HeLa ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose skirtingas FYCO1
shRNR. (C) MB kiekis HeLa ląstelėse, ekspresuojančiose MKLP1 ir transfekuotose su
FYCO1-FYVE ir FYCO1-LIR mutantais. MB apgaubtų LC3 (D) ir CD63 (E) membrana
kiekis HeLa ląstelėse su išveiklintu FYCO1. (F) FYCO1 išveiklinimas skatina nuo prisitvirtinimo nepriklausomą ląstelių minkštame agare kolonijų formavimą
44
Sekančiame etape tyrėme, ar padidinta egzogeninė FYCO1 ekspresija gali paskatinti MB degradaciją ir įtakoti jų kiekį ląstelėse. Nustatėme, jog padidinta FYCO1-mCherry ekspresija HeLa ląstelėse su MKLP1-GFP žymeniu statistiškai patikimai sumažino vienai ląstelei tenkančių MB kiekį (3.2.2 pav. C). Šis padidintos FYCO1-mCherry ekspresijos sukeltas pomito-zinių MB sumažėjimas priklauso nuo FYCO1 sąveikos su LC3 ir PI3P, nes FYCO1-LIR ir FYCO1-FYVE domenų delecijų mutantai neturėjo įtakos viduląstelinei MB akumuliacijai (3.1.1 pav. B ir 3.2.2 pav. C).
3.3. FYCO1 išveiklinimo poveikis navikinių ląstelių onkogeniškumui, kamieniškumui ir invazyvumui
Jau anksčiau buvo parodyta, jog padidėjusi MB akumuliacija galimai skatina nuo prisitvirtinimo nepriklausomą kolonijų formavimą [6]. Sutinka-mai su šia hipoteze tyrėme navikinių ląstelių su išveiklintu FYCO1 gebė-jimą formuoti kolonijas minkšto agaro terpėje. Nustatėme, jog FYCO1 iš-veiklinimas paskatino MB akumuliaciją ląstelėse, ir dėlto išaugo šių ląstelių gebėjimas išgyventi ir formuoti kolonijas (3.2.2 pav. F). Tai yra vienas iš rodiklių, nusakančių dėl padidėjusios MB akumuliacijos išaugusį navikinių ląstelių onkogeninį potencialą.
45
3.3.1 pav. MB akumuliacija SP B911 ir SP B931 ląstelėse
Verapamiliu paveiktų B911 ląstelių rūšiavimas pagal Hoechst 33342 signalo stiprumą (A) ir kiekybinis įvertinimas - B911 (B) ir B931 (D). (C) Tekmės citometrijos metu atrinktų SP ir NSP B911 ląstelių gebėjimas formuoti sferoidus (paveikslėliai viršuje) ir sferoiduose esančių MB vizualizavimas (paveikslėliai apačioje) bei kiekybinis sferoiduose esančių MB įvertinimas (paveikslėlis dešinėje). (E) Kiekybinis MB, esančių SP ir NSP B931 ląstelių
46
Galiausiai ištyrėme, ar FYCO1 išveiklinimas turi įtakos MB akumulia-cijai navikinėse kamieninėse ląstelėse. Tuo tikslu sukūrėme stabilias SP B911 ir B931 ląstelių linijas, ekspresuojančias FYCO1 shRNR (atitinkamai B911-KD ir B931-KD) (3.3.2 pav. A). Kaip ir HeLa-FYCO1-KD ląstelėse, taip ir B911-KD ir B931-KD ląstelėse, FYCO1 išveiklinimas nulėmė išau-gusią MB akumuliaciją (3.3.2 pav. B). Tai neįtakojo bendro autofaginio aktyvumo (3.3.2 pav. C), nes citozolinio (LC3-I) ir aktyvuoto (LC3-II) LC3 lygis, ląsteles paveikus autofagijos inhibitoriu chlorokvinu (40 μM), lygi-nant su kontrole, nepakito. Dėl FYCO1 išveiklinimo pomitozinių MB aku-muliacija padidėjo du kartus B931-KD ląstelėse ir daugiau negu du kartus B911-KD ląstelėse (3.3.2 pav. B). Todėl galime daryti išvadą, jog FYCO1 reguliuoja MB degradaciją ir navikinėse kamieninėse ląstelėse.
47
3.3.2 pav. FYCO1 išveiklinimas skatina SP B931 ląstelių invazyvumą
(A) WB analizės (paveikslėlis viršuje) ir kiekybinio PGR (paveikslėlis apačioje) pagalba nustatytas FYCO1 išveiklinimo efektyvumas B911 SP ir B931 SP ląstelių linijose. (B) Daugiau negu 2 MB turinčių B911-KD SP ir B931-KD SP ląstelių, kiekybinis įvertinimas. (C) FYCO1 išveiklinimo įtaka bendram autofaginiam aktyvumui (LC3-II), ląsteles paveikus
40 μM chlorokvinu (CQ). (D) FYCO1 išveiklinimas lemia padidėjusį B931 SP ląstelių invadopodijų (rodyklės) formavimąsi sferoiduose. (E) Sferoidų, turinčių bent vieną
48
3.4. FYCO1 kontroliuojamos degradacijos modelis
Mūsų duomenys rodo, jog FYCO1 tarpininkauja įvairių endosominių membranų pristatyme ir prijungime prie besiformuojančių autofaginių „puodelių“. Tokiu būdu pristatomos membranos, reikalingos izoliacinės membranos susiformavimui aplink MB jo degradacijos proceso metu (3.4.1 pav.). Svarbu paminėti, jog LC3 prisideda prie specializuoto fagocitinio ke-lio, kurio pagalba internalizuojami ir degraduojami ekstraląsteliniai MB, reguliacijos [18]. Taigi tikėtina, jog FYCO1 sąveikaudamas su Rab7 balty-mais ir LC3 [23], kontroliuoja abejus MB degradacijos kelius, t.y., specifinę autofaginę paveldėtų MB degradaciją (3.4.1 pav. A) ir su LC3 asocijuojamą iš ekstraląstelinės erdvės fagocitozės būdu internalizuotų MB degradaciją (3.4.1 pav. B).
3.4.1 pav. FYCO1 kontroliuojami pomitozinio MB degradacijos modeliai
49
3.5. MB sudarantys baltymai ir jų funkcijos ląstelės dalijimesi
Siekiant nustatyti MB sudarančius baltymus, atlikome pomitozinių į eks-traląstelinę erdvę simetrinio TT nukirpimo metu išmestų bei MKLP1-GFP ekspresuojančių MB (1.2.1 pav. 6B) proteominę analizę. Proteominė analizė patvirtino į MB sudėtį įeinančius baltymus, tokius kaip PLK1, MKLP1, Rab11, Rab14, Rab35 ir ESCRT-III kompleksas. Įdomu tai, jog nustatyti ir daugelis kitų, Rab GTPazių šeimai priklausančių monomerinių baltymų, kurių funkcija ląstelės dalijimesi dar nėra nustatyta (3.5.1 pav. A). Žinoma, jog kai kurie Rab baltymai, tiesiogiai arba netiesiogiai, per savo efektorinius baltymus, ląstelės dalijimosi metu atlieka itin svarbią endosomų transpor-tavimo funkciją. Rab35 ir Rab11 endosomos reguliuoja aktino citoskeleto dinamiką, kuomet TT susiaurėjimas ir nukirpimas vienoje ar abiejose MB pusėse užbaigia besidalijančių dukterinių ląstelių atsiskyrimą [85, 86]. Su FIP3, Rab35 ir PI3P endosomomis atkeliaujantys įvairūs baltymai ir balty-mų kompleksai, tokie kaip p50RhoGAP, Rab11, OCRL1 bei CHMP4B, koordinuoja iš aktino citoskeleto ir mikrotubulių sudaryto TT depolime-rizaciją. Galutinį TT nukirpimą reguliuoja ESCRT-III baltymų kompleksas, kuris prie šio proceso prisijungia vėlyvojoje telofazės stadijoje (1.1.1 pav. A). Nustatyti CCN1, EDIL3 ir MFG-E8 baltymai, kurie dalyvauja vykdant fagocitozę [87–89]. Jie prisijungia prie ląstelės išorėje esančio fosfatidil-serino (PS, pagal angl. phosphatidylserine) bei integrinų ir todėl dažnai yra tiesiog vadinami ląstelės išorėje esančiais receptoriais. Dėl PS ekspresijos apoptotinių ląstelių išorėje netoliese esantiems fagocitams perduodami signalai, skatinantys apoptotinių ląstelių fagocitozę [90, 91]. Tuo pat metu vykstantis ląstelės išorėje esančių receptorių sąveikavimas su PS (apopto-tiniai kūneliai) ir integrinais (fagocitai) leidžia atpažinti apoptotinius kūne-lius bei skatina aktino polimerizaciją, kurios metu apoptotiniai kūneliai yra įkapsuliuojami ir sunaikinami [87–89]. Įdomu tai, jog padidintas PS kiekis buvo aptiktas ir ant MB citokinezės metu, nors nėra aišku, ar PS ekspresuo-jamas vidiniame ar išoriniame plazminės membranos apvalkale [92].
Sekančiame etape nusprendėme nuodugniau ištirti proteominės analizės metu nustatytų Rab GTPazių šeimai priklausančių monomerinių baltymų funkciją ląstelės dalijimuisi (3.5.1 pav. A). Į HeLa-wt ląsteles įvedę domi-nuojančius neigiamus Rab-GFP mutantus (SN) (3.5.1 pav. C), atlikome dau-giabranduolių ląstelių tyrimą. Nustatėme, jog iš visų ištirtų Rab baltymų, Rab14 turėjo didžiausią įtaką ląstelės dalijimuisi, o daugiabranduolių ląste-lių skaičius Rab14-GFP-SN ląsteląste-lių populiacijoje išaugo net 15 kartų ir siekė 25 proc., lyginant su ~ 1,6 proc. kontrole (3.5.1 pav. B).
50
ląsteles (3.5.1 pav. D). Todėl tolimesnius tyrimus nusprendėme tęsti būtent su šiuo baltymu.
3.5.1 pav. MB proteominės analizės metu nustatytų Rab baltymų analizė
(A) MB proteominės analizės metu nustatyti ir Rab GTPazių šeimai priklausantys monomeriniai baltymai (tirti baltymai paryškinti). (B) Daugiabranduolių ląstelių skaičius kontrolinėse ir SN ląstelėse. (C) Rab14-GFP-SN lokalizacija interfazės stadijoje esančiose
51
Toliau tyrėme, kokią įtaką ląstelių dalijimuisi gali turėti Rab14 baltymo išveiklinimas (KD), panaudojus shRNR, ir visiškas išjungimas (KO), pa-naudojus CRISPR/Cas9 genų redagavimo sistemą. Tam tikslui sukūrėme stabilias HeLa ląstelių linijas Rab14-KD1, Rab14-KD2 (3.5.2 pav. A) ir Rab14-KO (3.5.2 pav. C). Nustatėme, jog Rab14-KD1, Rab14-KD2 bei Rab14-KO ląstelės pasižymėjo kur kas didesniu daugiabranduolių ląstelių skaičiumi (atitinkamai 9 proc., 13 proc. ir 17 proc.), lyginant su ~3 proc. kontrole (3.5.2 pav. B, D). Kadangi jau žinoma, jog citokinezės metu Rab11 ir Rab35 endosomos gali reguliuoti aktino citoskeleto dinamiką [46, 48, 53, 93], nusprendėme ištirti, ar šių baltymų įvedimas į ląsteles gali atstatyti Rab14-KD ir Rab14-KO poveikį. Nustatėme, jog į Rab14-KD2 ląsteles įvedus shRNR atsparias Rab14-GFP arba Rab11-GFP plazmides, daugia-branduolių ląstelių skaičius statistiškai patikimai sumažėjo, nuo 13 proc. iki atitinkamai 10 proc. ir 8 proc. (3.5.2 pav. B). Į Rab14-KO ląsteles įvedus Rab14-GFP, Rab11-GFP ir Rab35-GFP plazmides, daugiabranduolių ląste-lių skaičius statistiškai patikimai sumažėjo nuo 17 proc. iki atitinkamai 11 proc., 9 proc. ir 8.5 proc. (3.5.2 pav. D). Siekiant parodyti galimus Rab14, Rab11 ir Rab35 kompensacinius mechanizmus, Rab14-KO ląsteles transfekavome Rab21-GFP ir Rab29-GFP (3.5.2 pav. E), kurių SN mutantų įvedimas neįtakojo ląstelių dalijimosi (3.5.1 pav. B). Šių plazmidžių įve-dimas neturėjo įtakos Rab14-KO ląstelių dalijimuisi, o daugiabranduolių ląstelių skaičius nesiskyrė nuo Rab14-KO ląstelių (3.5.2 pav. E).
52
3.5.2 pav. Rab14-KD ir Rab14-KO įtaka ląstelių dalijimuisi
(A) Rab14-KD1 ir Rab14-KD2 WB analizė. (B) Rab14-KD1 ir Rab14-KD2 poveikis
daugiabranduolių ląstelių skaičiui ir poveikio kompensavimas, panaudojus shRNA atsparų
Rab14-GFP ar Rab11-GFP. (C) Rab14-KO WB analizė. (D) Rab14-KO poveikis
daugiabranduolių ląstelių skaičiui ir poveikio kompensavimas, panaudojus Rab14-GFP,
Rab11-GFP ir Rab35-GFP. (E) Daugiabranduolių ląstelių skaičius, į Rab14-KO ląsteles
53
3.5.3 pav. Rab14-KD ir Rab14-KO įtaka ląstelių dalijimosi ir atskirų
ląstelės ciklo stadijų trukmei
(A) Rab14-KD1, Rab14-KD2 ir Rab14-KO įtaka ląstelių dalijimosi trukmei bei
kompensa-vimas su Rab14-GFP, Rab11-GFP ir Rab35-GFP. (B) Rab14-KD1, Rab14-KD2 ir
Rab14-KO įtaka atskiroms ląstelės ciklo stadijoms bei kompensavimas su Rab14-GFP,
Rab11-GFP ir Rab35-GFP.
