Elettroforesi proteine ed acidi
nucleici
Flavia Frabetti Tecnici di laboratorio 2010/2011
ELETTORFORESI
• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico
• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico
matrice di gel cella elettroforetica
alimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante) tamponi salini
si possono studiare sia gli
acidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine
Matrice di gel serve da “setaccio” molecolare e consente la separazione
può essere fatto di polimeri agarosio o poliacrilamide
Gel di agarosio:
pesare l’agarosio
misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l’agarosio in buffer
versare il gel nella vaschetta allestita Gel di acrilamide:
miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia*
Come si forma il gel?
Gel di acrilamide
• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine
• di solito in sistemi verticali, poiché se ne fanno “lastre” di 0,2-0,4 mm i cui pozzetti non sarebbero “caricabili” in un sistema orizzontale
• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del peptide concentrazione di acrilamide
conformazione della molecola (denaturata o meno) voltaggio
pozzetti con i campioni
campione
anodo catodo
supporto di plastica
tampone
tampone PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteine è di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistema verticale
SDS = detergente (sodio-dodecil-solfato) carico
-
Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE
well= pozzetto lane= corsia
SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico) BME = β- mercaptoetanolo (riducente)
proteina tetramerica proteina monomerica bollitura
bollitura
peptidi connessi da ponti disolfuro
peptidi separati DENATURAZIONE DELLE PROTEINE: preparazione del campione (sample) con proteine denaturate
Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi
(in kilodalton)
8 200 - 25
10 100 - 15
12.5 70 - 10
15 60 - 6
20 40 - 4
Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine
Dal Chieffi
riquadro 2.2 pag:44-48
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE SU GEL o ISOELECTROFOCUSING
punto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica netta di una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, qui La proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica
pH acido pH basico I fase:
separazione per
carica
II fase: separazione dimensionale
Rivelazione della separazione elettroforetica:
• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela (es. con comassie blue o silver-stain)
• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici di nitrocellulosa attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi
2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi
consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare il turn-over proteico (esperimenti di pulse-chaise)
l’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35S (emivita di 87gg) metionina
cisteina
2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
consente di riconoscere una specifica proteina di interesse
consta di diverse fasi schematizzabili in:
a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica)
a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa
trasferimento delle proteine
proteina di interesse
carta imbevuta di tampone
carta imbevuta di tampone
b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) - fasi procedurali
anticorpi I legano l’antigene
anticorpi II legano gli anticorpi I la membrana viene saturata da
proteine inerti
sviluppo della colorazione enzimatica
Verifica qualitativa e quantitativa acidi nucleici
Spettrofotometro
Analisi a λ= 260 nm Si misura la ssorbanza o densità ottica O.D.
1 O.D. ≈ 50 µg DNA 1 O.D. ≈ 40 µg RNA
1 O.D. ≈ 30 µg oligonucleotidi λ= 280 nm proteine
260/280 > 1,8 (≈2) è abbastanza puro
Nanodrop ®
Gel di agarosio
• utili per la separazione e caratterizzazione di acidi nucleici
• di solito in sistemi orizzontali
• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel di agarosio dipende principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del DNA o RNA concentrazione di agarosio
conformazione della molecola voltaggio
Allestimento della tecnica elettroforetica su gel orizzontali di agarosio (schema)
preparazione gel
caricamento campioni (Ø 5mm/well)
connessione ed accensione
rilevazione
Campione (sample)viene diluito in un tampone di caricamento (loading buffer) che contiene 2 coloranti per tracciare la corsa:
Blu di bromofenolo (Bb) 300 bp Xilene cianolo (Xc) 4.000 bp ed anche glicerolo per appesantire il campione
Corsa e rilevazione su gel orizzontali di agarosio - procedure
Riempire la vaschetta con il buffer
Caricare i campioni sul gel Accendere l’alimentatore (parte la corsa del gel)
Fine della corsa
Analisi del gel al transilluminatore
Risultato
Bande luminose per via del bromuro di etidio (intercalante del DNA) che “fluoresce” ai raggi UV e si vede banda giallo-arancio
Limite di sensibilità 1-5 ng di DNA
Le molecole più grandi hanno V minore, per > attrito e perché vengono intrappolate di più nelle maglie del gel
std molecolari o markers a dimensione nota
Taglia molecolare del DNA o RNA e migrazione
Agarosio (%) Intervallo di separazione di DNA lineare (in Kb)
0.3 60 - 5
0.6 20 - 1
0.7 10 - 0.8
0.9 7 - 0.5
1.2 6 - 0.4
1.5 4 - 0.2
2.0 3 - 0.1
Di norma si applica un voltaggio di 5 Volt /cm di lunghezza della vaschetta
Il voltaggio (V) tende a variare durante la corsa in rapporto alla variazione nella distribuzione delle cariche e del pH
Durante la corsa la resistenza (R) aumenta V= i x R
per avere una migrazione costante deve aumentare anche V
Uniformità di calore e pH:
le corsie periferiche sono più fredde (effetto smile) di norma evitato con tubicini che collegano parte negativa e positiva
I gel di poliacrilamide per separare acidi nucleici sono usati se:
• si devono separare piccoli oligonucleotidi < 100 basi, si possono risolvere anche oligo diversi anche per 1 nucleotide
• sono di solito a basse concentrazioni di acrilamide (<=6%) e contengono Urea (6M)
Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota
(questo vale anche per le proteine)
Il DNA è una molecola che ha un rapporto “carica/massa” costante e dunque uniformità nella separazione
Gel controllo DNA
pozzetti
markers a dimensione nota
La quantità di DNA attesa è di 7 pg per cellula umana diploide Es. globuli bianchi 6.000/µl ovvero 6.000.000/ml
6.000.000 x 7 pg= 42.000.000 pg = 42.000 ng= 42 µg
frammenti di
DNA genomico (50-100Kb)
GEL DNA APOPTOSI
ladder (scala) apoptotico
Gel controllo RNA
28S (5000 basi) 18S (2000 basi) 5S+tRNA(100 basi)
L’80-85% di RNA cellulare e costituito da rRNA, circa il 10% da tRNA E tra 1-5 % da decine di migliaia di mRNA diversi
Gel degradazione RNA, contaminazione DNA
effetto SMEAR striscia
