alcuni aspetti molecolari e patogenetici di HCV. Ancora oggi infatti, non risulta chiaro

5. DISCUSSIONE

Sebbene HCV sia stato identificato da oltre vent’anni, la mancanza di sistemi

adeguati di propagazione in vitro del virus non ha permesso la piena conoscenza di

alcuni aspetti molecolari e patogenetici di HCV. Ancora oggi infatti, non risulta chiaro

il ruolo della risposta immunitaria durante l’infezione ed in particolare degli anticorpi

neutralizzanti che per molti virus si sono rivelati una componente fondamentale

dell’immunità protettiva. In considerazione della complessità dei sistemi di

coltivazione virali, per l’analisi dell’attività neutralizzante degli Ab anti-HCV, è stato

deciso di rifarci direttamente ad un metodo utilizzato per titolare NAb anti-HIV ideato

e messo a punto dal Dr. David C. Montefiori presso la Duke University Medical Center

di Durham, NC (Mascola et al., 2005). Basandoci quindi sullo stesso principio, è stato

sviluppato un sistema di vettori lentivirali FIV-derivati (vedi § 3.3) ideati e prodotti

nei nostri laboratori, che risultano difettivi nella replicazione e veicolanti un gene

reporter posto sotto il controllo di un promotore interno. Questi vettori virali sono

prodotti mediante un sistema split-component in cui i geni necessari per la

produzione della particella virale sono forniti da costrutti separati: packaging, vettore

ed envelope. In particolare il primo costrutto fornisce le proteine strutturali ed

enzimatiche di FIV, il secondo veicola GFP come gene reporter ed il terzo plasmide

esprime le glicoproteine E1 E2 di genotipo 1a di HCV. Quindi analogamente al

sistema Montefiori, l’envelope di HCV è stato fornito in trans. Un sistema di

pseudotipizzazione HCV è stato già descritto dal Dr. François-Loïc Cosset (Laboratoire

de Vectorologie Rètrovirale et Therapie Gènique, Ecole Normale Supèriere de Lyon)

(Bartosh et al., 2003) ed è basato sui vettori derivati da MLV utilizzati nel nostro

laboratorio come riferimento (vedi § 3.2). Analogamente al nostro sistema, le

pseudoparticelle MLV-derivate contenenenti le glicoproteine E1 E2 di HCV

(MLVgfpE1E2) sono state generate con un sistema a tre plasmidi in cellule 293T e

sono state impiegate come controllo positivo. Per mettere a punto il sistema di

trasduzione e valutarne l’efficienza, i virioni sono stati anche pseudotipizzati fornendo

un plasmide veicolante la proteina G di VSV con la quale il virus riesce ad entrare

nelle cellule indipendentemente dalla presenza del CD81. Tali particelle sono state

denominate FIVgfpVSV o MLVgfpVSV.

La percentuale di trasfezione è stata stimata come percentuale di cellule GFP positive. Come evidente in FIG. 4.1 tutti i costrutti anche se in modo un po’ più efficiente per MLV trasfettano 293T ed esprimono il gene reporter.

Al fine di verificare se il costrutto envelope pE1E2 esprime effettivamente la relativa proteina è stato allestito un western blot. Per questo saggio sono state quindi utilizzate cellule trasfettate o con il solo costrutto envelope esprimente E1 E2 o con i tre costrutti packaging, vettore ed envelope del sistema FIV o MLV. Per la detection è stato utilizzato l’anticorpo monoclonale AP33 capace di neutralizzare isolati HCV di genotipo 1-6 quando saggiati con il sistema di Cosset (Owsianka et al., 2005). Il risultato ottenuto ha mostrato un’efficiente espressione della glicoproteina E2 (FIG.

4.2).

Successivamente è stata testata la capacità degli pseudovirus HCV prodotti di trasdurre varie linee cellulari (293T, Huh-7 ed HepG2). Come controllo positivo sono state utilizzate le particelle virali MLV e FIV pseudotipizzate con la proteina G di VSV. La percentuale di cellule trasdotte è stata valutata contando le cellule fluorescenti con citofluorimetria a flusso. I dati hanno mostrato una sostanziale equivalenza dei sistemi basati su MLV e FIV. In particolare le pseudoparticelle VSV-G trasducono efficientemente le tre linee cellulari mentre le particelle virali pseudotipizzate con HCV trasducono solo la linea cellulare Huh-7 mentre 293T ed HepG2 sono sostanzialmente refrattarie. Quest’ultimo dato era atteso in considerazione del fatto che solo la linea Huh-7 possiede il CD81, uno dei recettori cellulari di HCV.

Al fine di verificare la corretta esposizione di E1-E2 sulla superficie del

virione, gli stessi vettori sono stati saggiati per suscettibilità alla neutralizzazione con

l’anticorpo AP33. I test sono stati condotti sia con particelle MLV (dati non mostrati),

sia con particelle FIV (FIG. 4.4). In breve le cellule Huh-7 sono state trasdotte con

le particelle FIV o MLV pre-incubate con diverse concentrazioni di AP33. La

neutralizzazione è stata valutata come riduzione dell’espressione di GFP nelle cellule

trasdotte. I risultati ottenuti con le pseudoparticelle MLV e FIV sono del tutto

paragonabili. Gli pseudovirus E1E2 pre-incubati con AP33 mostrano una riduzione di

infettività direttamente proporzionale alla concentrazione di Ab utilizzata. Tale

riduzione è invece assente per le pseudoparticelle VSV-G a riprova di un’inibizione

specifica anti E1-E2 e che quindi le glicoproteine di HCV sono correttamente esposte nella particella pseudotipizzata.

Sulla base di questi dati le pseudoparticelle FIV sono state utilizzate per valutare l’attività neutralizzante anti-HCV in sieri di pazienti in fase cronica d’infezione e positive per il genotipo 1a di HCV. I sieri utilizzati sono stati reperiti presso l’Unità Operativa Gastroenterologia dell’AUOP diretta dal Prof. S. Marchi (vedi Tab. 4.1). Il test è stato allestito sia con pseudovirus FIV che MLV. Per effettuare il test le pseudoparticelle purificate e titolate per capacità di trasduzione di Huh-7, sono state mescolate in quantità fisse con diluizioni scalari del siero e poi seminate su Huh-7.

Nel saggio tra i vari controlli sono state utilizzate anche cellule incubate con le pseudoparticelle mescolate con un siero HCV negativo per misurare eventuali inibizioni aspecifiche. La percentuale di cellule trasdotte, riconoscibili perché GFP positive, è stata valutata mediante lettura al citofluorimetro e quindi la percentuale di riduzione dell’entry virale è stata calcolata come diminuzione del numero di cellule fluorescenti rispetto al controllo positivo (cellule con solo virus) e quello negativo (solo cellule). I risultati ottenuti (FIG. 4.5) hanno dimostrato che in tutti i campioni c’è stata riduzione dell’entry virale dovuta alla presenza degli NAb che legandosi ad E1-E2 esposte sulla superficie della particella virale vanno ad inibire il virus. Al contrario, ciò non è stato osservato con il siero negativo in quanto privo di NAb.

Considerando solo la diluizione 1:50 e 1:100, nel 90% dei campioni è stato possibile osservare una riduzione scalare dell’entry virale. Lo pseudovirus infatti, incubato con la diluizione minore di siero mostra una percentuale di riduzione dell’infettività maggiore, rispetto a quando viene incubato con il campione maggiormente diluito.

Aggiungendo la diluizione 1:10 questo effetto scalare è stato mantenuto nell’80% dei campioni. I restanti casi, a questa minore diluizione mostrano una ridotta attività neutralizzante dovuta molto probabilmente ad un effetto tossico del siero quando utilizzato a basse diluizioni. In questi casi infatti si può ipotizzare la presenza nel siero di agenti interferenti che possano mascherare un possibile effetto neutralizzante.

Utilizzando però un cut-off molto restrittivo, ovvero il 50% di riduzione di

infettività virale, non tutti i campioni hanno mostrato attività neutralizzante (vedi

di transaminasi non è stato possibile, a questo stadio del lavoro, giungere a solide

conclusioni in merito al ruolo degli NAb nello stato infezione/malattia. Per capire il

significato biologico di tali Ab è necessario quindi ampliare lo studio prendendo in analisi sia più tempi dello stesso campione sia un numero maggiore di sieri.

E’ stato prodotto anche uno pseudovirus FIV-derivato esprimente come gene reporter la luciferasi (FIVlucE1E2). L’utilizzo di queste particelle virali renderebbe il saggio di neutralizzazione più rapido, sensibile e facilmente automatizzabile. A tal scopo, partendo dal costrutto vettore vΔenvGFP ho costruito un plasmide denominato vΔenvluc che possiede il gene codificante per la luciferasi al posto del gene per la GFP.

Per la produzione dello pseudovirus FIVlucE1E2, il costrutto vettore vΔenvluc, il costrutto di packaging pΔenv ed il costrutto envelope pE1E2 sono stati co-trasfettati su cellule 293T. Anche in questo caso sono state prodotte particelle FIV-derivate pseudotipizzate con la proteina G esprimenti la luciferasi (FIVlucVSV) da utilizzare come controllo. L’efficienza della trasfezione è stata valutata mediante lettura al luminometro e misurata come espressione di luciferasi. Dall’analisi risulta che i costrutti sono stati in grado di trasfettare la linea cellulare 293T e di esprimere il relativo gene reporter. Gli pseudovirus prodotti sono stati poi testati per capacità trasducente su Huh-7 e 293T. FIVlucVSV è stato capace di trasdurre le due linee cellulari mentre come atteso FIVlucE1E2 è stato capace di trasdurre solo la linea cellulare Huh-7 in quanto è l’unica ad avere CD81 .

Con questo studio è stato quindi possibile generare delle particelle virali FIV- derivate pseudotipizzate con E1 E2 infettanti che si sono dimostrate in grado di trasdurre la linea cellulare Huh-7. Questi pseudovirus sono suscettibili a neutralizzazione con l’anticorpo AP33 e capaci di verificare la presenza di NAb in sieri di pazienti infetti. Per questi motivi il sistema può rivelarsi utile per studi finalizzati a valutare il reale contributo degli NAb nel decorso della patologia. Infatti, un altro aspetto di primaria importanza è che il sistema FIV al contrario del sistema MLV, risulta svincolato da coperture brevettuali e limitazioni d’uso.

In futuro si prevede di utilizzare lo pseudovirus FIV-derivato esprimente

luciferasi in test di neutralizzazione in quanto potrebbe rendere il sistema applicabile

su larga scala. Infine poiché tutti gli esperimenti sono stati condotti con pseudovirus

esprimenti E1-E2 di HCV di genotipo 1a, un altro obiettivo dello studio sarà quello di

estendere la valutazione dell’attività neutralizzante verso altri genotipi e a tal scopo

verrà intrapreso uno studio per la definizione di strategie con cui effettuare il

clonaggio di E1 E2 da isolati clinici di HCV di sottotipo 1b, 2b e 3 che insieme al

genotipo 1a, costituiscono oltre il 70% dei ceppi HCV circolanti in questa area

geografica.