CAPITOLO
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Materiali e metodi
5.1 Metodi cromatografici
5.1.1 Cromatografia su strato sottile
Le cromatografie su strato sottile sono state eseguite su lastre di gel di silice Kiesel gel 60 F254
(Merck) di 0.25 mm di spessore, su supporto di vetro o di alluminio. Come fasi mobili sono state utilizzate molte miscele di solventi, scelte opportunamente a seconda del campione in esame. Le più comuni sono state le seguenti tre miscele:
BAW (n-BuOH-CH3COOH-H2O, 60:15:25)
CMW (CHCl3-MeOH-H2O, 70:30:3)
CMW (CHCl3-MeOH-H2O, 80:18:2)
La rivelazione delle macchie è stata effettuata sia con luce UV a 254 e 366 nm sia con il reattivo spray:
soluzione satura di solfato di cerio in acido solforico al 65%, seguita da riscaldamento a 120 °C per 15 minuti per rendere visibili le macchie.
1.1.2 Cromatografia su colonna
Cromatografia ad esclusione molecolare
Nella cromatografia di esclusione molecolare è stato impiegato come fase stazionaria gel di Sephadex LH-20 (25-100 µm, Pharmacia Fine Chemicals), utilizzando una colonna di 100 x 5 cm (i.d. = 5 cm, V =19.6 ml/cm) sia per l’estratto cloroformio-metanolo 9:1 (10 g), e sia per l’estratto
n-butanolico (5.7 g) ottenuto dalla ripartizione n-BuOH/H2O dell’estratto metanolico (Fig. 5.1).
Come fase mobile è stato utilizzato MeOH Infine è stata adoperata una pompa peristaltica Pharmacia Fine Chemicals P1, con un flusso costante di 0.8 ml/min per l’estratto cloroformio-metanolo 9:1, e flusso di 1.5 ml/min per l’estratto n-butanolico.
Fig. 5.2 Colonna Sephadex LH-20 ad esclusione molecolare
Cromatografia flash
La colonna flash è stata utilizzata per cromatografare l’estratto cloroformico (10 g) (Fig. 5.2). Come fase stazionaria è stato utilizzato il gel di silice 60 (230-410 mesh, Merck) impaccato su una colonna di 25 x 9 cm. Per ottenere un flusso di 75 ml/min è stata utilizzata aria compressa.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Le separazioni con HPLC (20-100 bar) sono state effettuate con un apparecchio Shimadzu, costituito da:
Pompa Shimadzu LC-8A
Rivelatore Shimadzu RID-10A
Colonna Waters C-18 µ-Bondapak (30 cm x 7.8 mm)
Fig. 5.4 Strumentazione HPLC
5.2 Metodi chimico-fisici
Potere ottico rotatorio
Le misure sono state effettuate con un polarimetro Perkin-Elmer modello 241, fornito di una lampada al sodio (589 nm), alla temperatura di 22 °C, in celle da 1 decimetro di lunghezza ed 1 ml di volume, utilizzando MeOH come solvente.
Spettri UV
Lo spettro ultavioletto del composto 3 è stato ottenuto in metanolo con uno spettrofotometro Perkin-Elmer Lambda 11.
Spettri di massa
Gli spettri di massa ESI-MS (modalità positiva e negativa) sono stati registrati con uno spettrometro Thermo Finningan LC-Q Advantage a trappola ionica equipaggiato con un software Xcalibur. I campioni sono stati sciolti in MeOH ed iniettati nella fonte ESI utilizzando una pompa a siringa. La velocità del flusso è stata di 5 µl/min.
Spettri di dicroismo circolare
Lo spettro di dicroismo circolare del composto 14 è stato registrato in MeOH su uno spettrofotometro JASCO J-810 con una cella di 0.1 cm, a temperatura ambiente e con le seguenti condizioni: velocità 50 nm/min, larghezza della banda 2.0 nm, time constant 1 s.
Spettri di risonanza magnetica nucleare
Per gli spettri NMR è stato utilizzato uno spettrometro Bruker DRX-600 (software UXNMR) operante a 599.19 MHz per 1H e 150.86 MHz per 13C e uno strumento Bruker AC-250 (software Topspin) operante a 250 MHz per 1H e 62.5MHz per 13C.
Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD3OD utilizzando come standard il segnale
Fig. 5.5 Strumentazione NMR
L'esperimento di correlazione diretta omonucleare (DQF-COSY, Double Quantum Filtered COSY) è stato eseguito usando la convenzionale sequenza di impulsi.
L'esperimento di correlazione diretta eteronucleare 1H-13C HSQC è stato realizzato su una matrice 512 x 1024, usando una costante di accoppiamento C-H di 135 Hz ed un relaxation delay di 1.5 sec (Kay et al., 1992; Palmer et al., 1991).
L'esperimento di correlazione eteronucleare long range (HMBC) è stato ottenuto utilizzando la sequenza di Bax² (Bax e Subramanian, 1986) ad una costante long range media di 6-8 Hz e una matrice 512 x 1024.
Gli esperimenti DEPT-135° sono stati eseguiti utilizzando trasferimenti di polarizzazione per mezzo liquido di impulsi a 90° per ottenere solo i gruppi CH e di 135° per ottenere segnali positivi per i gruppi CH e CH3 e negativi per i gruppi CH2 Il ritardo nel trasferimento di polarizzazione è stato
corretto ad un accoppiamento medio C-H di 135Hz.
Gli esperimenti 1D-TOCSY e 1D-ROESY sono stati ottenuti usando un software UX-NMR; in particolare 1D-TOCSY è stato eseguito utilizzando un generatore di impulsi gaussiani usando, durante il mixing time, la sequenza di impulsi di tipo MLEV-17 (mixing time 80-100 ms), secondo quanto riportato in letteratura (Davis e Bax, 1985).
